CN117752773A - 一种膜锚定式dr-18复合物的研制及其在免疫细胞治疗中的应用 - Google Patents
一种膜锚定式dr-18复合物的研制及其在免疫细胞治疗中的应用 Download PDFInfo
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Landscapes
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Abstract
本发明涉及一种膜锚定式DR‑18复合物的研制及其在免疫细胞治疗中的应用。通过膜锚定式的设计，串联起信号肽、IL‑18突变体DR‑18、IL‑18受体IL‑18Rα膜蛋白，再将其与免疫细胞治疗技术联合，从而显著提高肿瘤免疫治疗过程中效应细胞对肿瘤细胞的杀伤活性，增强免疫细胞的增殖，促进细胞因子的分泌，降低细胞培养和患者用药的成本，具有更安全、高效的功能。
Description
技术领域
本发明涉及免疫细胞制备技术领域。涉及一种膜锚定式DR-18复合物的研制及其在免疫细胞治疗中的应用。
背景技术
近年来，过继性细胞免疫治疗(adoptive cell therapy，ACT)在恶性肿瘤治疗中发展如火如荼，包括CAR-T在内的众多免疫细胞技术在治疗中取得显著进展，并被视为最有望攻克肿瘤的技术之一，具有十分广阔的临床应用前景。以靶向CD19为代表的CAR-T，已经在血液肿瘤方面取得一定进展。自2017年美国FDA批准全球首个CAR-T治疗产品Kymriah以来，截止到今年4月，国内外共上市7款CAR-T药物，包括在中国获批的阿基仑赛和瑞基奥伦注射液。ACT是指从患者体内分离出具有活性的免疫细胞，在体外进行改造(或不改造)和扩增，重新输入到患者体内以达到治疗疾病(以肿瘤为主)的目的，主要包括自体淋巴因子激活的杀伤细胞(lymphokine active killer cell，LAK)、细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer cell，CIK)、自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)、肿瘤浸润性淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes，TIL)、树突细胞(dendritic cell，DC)疫苗、T细胞受体修饰的T细胞(T cell receptor-gene engineered T cell，TCR-T)、嵌合抗原受体修饰的T细胞(chimeric antigen receptor T-cell，CAR-T)和NK细胞(chimeric antigen receptor-NK，CAR-NK)。免疫细胞治疗虽然在血液及淋巴系统肿瘤中表现出良好的治疗效果，但其仍具有一定的局限性，其中就包括免疫细胞增殖能力弱、持久性差而导致对肿瘤细胞杀伤不足的问题，从而使得患者在接受治疗后出现复发。在实体瘤治疗领域也面临同样的问题。
IL-18，因其具有强烈的诱导细胞产生γ干扰素(IFN-γ)功能，开始被称为干扰素诱导因子(IFN-γInducing Factor,IGIF)，随后发现其还有促进粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的产生和降低IL-10的产生等功能，被重新命名为IL-18，归属于IL-1超家族。IL-18在细胞内以非活性前体方式(pro-IL-18)大量存在于上皮细胞、巨噬细胞和树突细胞中，在炎症发生时被重组的NLRP3炎症小体组分caspase-1切割成为活性IL-18迅速释放。IL-18通过结合其异源二聚体受体(IL-18Rα/Rβ)介导MyD88-NFκB信号通路，调节基因转录。由于其受体在免疫细胞上的高表达，IL-18因此能够刺激T、NK、TIL等免疫细胞分泌产生IFN-γ，特异性杀伤肿瘤细胞。有研究表明，IL-18作为一种重要的免疫调节细胞因子，可改善免疫细胞的功能，而不会造成严重的剂量限制性毒性。介于IL-18在免疫调控中的强大功能，其在肿瘤免疫方面中的应用被广泛研究。研究显示，将IL-18与免疫细胞疗法联合，与其他细胞因子相比，IL-18表现出了更强大的抗肿瘤效应，且毒副作用更低。
但由于肿瘤细胞大量表达抑制性的IL-18decoy受体——IL-18BP，IL-18BP是一种分泌型拮抗剂，能以极高的亲和力(KD<1nM)结合IL-18，这种竞争性结合使得免疫细胞无法激活IL-18通路，从而限制免疫细胞分泌产生IFN-γ，无法特异性杀伤肿瘤细胞。DR-18是IL-18的一种突变体，仅结合IL-18Rα而对IL-18BP亲和力极低(KD＝10.5μM)，能够保持IL-18原有的信号激活功能而不被IL-18BP抑制。DR-18在多种小鼠肿瘤模型中均显示出良好的抗肿瘤活性，其单独疗效甚至优于抗PD-1单药治疗。与野生型IL-18相比，DR-18解除体内来自IL-18BP抑制，通过结合IL-18Rα激活下游通路，最终重塑TME，增强T和NK细胞肿瘤持续性杀伤功能。
利用DR-18作为一种治疗策略，已有相关药物在研发过程中，但仍存在一些问题，一是直接应用无法避免其他细胞的过度激活，具有潜在未知风险；二是增加药物治疗成本，加重患者负担。
本发明针对细胞疗法中免疫细胞增殖能力弱、持久性差而导致对肿瘤细胞杀伤不足的问题，以及野生型IL-18与IL-18BP高亲和力结合而无法激活下游通路的问题，提供一种膜锚定式DR-18复合物，从而更安全、有效地杀伤肿瘤细胞。
发明内容
本发明利用基因工程策略，设计了一种膜固定式DR-18复合物，串联起信号肽、IL-18突变体DR-18、IL-18受体IL-18Rα膜蛋白，再将其与免疫细胞治疗技术如CAR-T/CAR-NK/TIL等细胞疗法联合起来，从而进一步增强包括CAR-T细胞在内的免疫细胞的增殖与功能，更安全、有效的杀伤肿瘤细胞。本发明相较于DR-18单体药物，具有如下优势：(1)通过IL-18受体IL-18Rα膜蛋白，将DR-18锚定在细胞膜上，使其有效且特异性地靶向CAR-T/CAR-NK/TIL等免疫细胞及其周围肿瘤微环境，仅局限于肿瘤部位发挥作用，避免DR-18分泌扩散而过度激活其他不相关细胞；(2)不需要外源加入细胞因子IL-18，从而降低细胞培养和患者用药的成本。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种DR-18复合物，包含信号肽、IL-18突变体DR-18、IL-18受体IL-18Rα膜蛋白并按顺序连接。
所述的信号肽为CD4信号肽、CD8信号肽、CD28信号肽或轻链信号肽。
优选的，所述信号肽为CD8信号肽。
具体的，所述CD8信号肽，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1(DMWTWILFLVAAATRVHS)所示的序列；
具体的，所述IL-18突变体DR-18的氨基酸序列为SEQ ID NO：2
(HFGRLHCTTAVIRNINDQVLFVDKRQPVFEDMTDIDQSASEPQTRLIIYAYGDSRAR GKAVTLSVKDSKMSTLSCKNKIISFEEMDPPENIDDIQSDLIFFQKRVPGHNKMEFESS LYEGHFLACQKEDDAFKLILKKKDENGDKSVMFTLTNLHQS)所示的序列。
所述的DR-18复合物中的IL-18受体IL-18Rα膜蛋白去除自身信号肽片段，和IL-18突变体DR-18连接。
所述的DR-18复合物以IL-18受体IL-18Rα膜蛋白将其锚定在细胞膜上。
具体的，所述IL-18受体IL-18Rα膜蛋白的完整氨基酸序列为SEQ ID NO：3
(MNCRELPLTLWVLISVSTAESCTSRPHITVVEGEPFYLKHCSCSLAHEIETTTKSWY KSSGSQEHVELNPRSSSRIALHDCVLEFWPVELNDTGSYFFQMKNYTQKWKLNVIRRNKHSCFTERQVTSKIVEVKKFFQITCENSYYQTLVNSTSLYKNCKKLLLENNKNPTIKKNAEFEDQGYYSCVHFLHHNGKLFNITKTFNITIVEDRSNIVPVLLGPKLNHVAVELGKNVRLNCSALLNEEDVIYWMFGEENGSDPNIHEEKEMRIMTPEGKWHASKVLRIENIGESNLNVLYNCTVASTGGTDTKSFILVRKADMADIPGHVFTRGMIIAVLILVAVVCLVTVCVIYRVDLVLFYRHLTRRDETLTDGKTYDAFVSYLKECRPENGEEHTFAVEILPRVLEKHFGYKLCIFERDVVPGGAVVDEIHSLIEKSRRLIIVLSKSYMSNEVRYELESGLHEALVERKIKIILIEFTPVTDFTFLPQSLKLLKSHRVLKWKADKSLSYNSRFWKNLLYLMPAKTVKPGRDEPEVLPVLSES)所示的序列；
具体的，所述IL-18受体IL-18Rα膜蛋白去除自身信号肽后的序列为SEQ ID NO：4
(AESCTSRPHITVVEGEPFYLKHCSCSLAHEIETTTKSWYKSSGSQEHVELNPRSSSR IALHDCVLEFWPVELNDTGSYFFQMKNYTQKWKLNVIRRNKHSCFTERQVTSKIVEVKKFFQITCENSYYQTLVNSTSLYKNCKKLLLENNKNPTIKKNAEFEDQGYYSCVHFLHHNGKLFNITKTFNITIVEDRSNIVPVLLGPKLNHVAVELGKNVRLNCSALLNEEDVIYWMFGEENGSDPNIHEEKEMRIMTPEGKWHASKVLRIENIGESNLNVLYNCTVASTGGTDTKSFILVRKADMADIPGHVFTRGMIIAVLILVAVVCLVTVCVIYRVDLVLFYRHLTRRDETLTDGKTYDAFVSYLKECRPENGEEHTFAVEILPRVLEKHFGYKLCIFERDVVPGGAVVDEIHSLIEKSRRLIIVLSKSYMSNEVRYELESGLHEALVERKIKIILIEFTPVTDFTFLPQSLKLLKSHRVLKWKADKSLSYNSRFWKNLLYLMPAKTVKPGRDEPEVLPVLSES)
所述的DR-18复合物通过2A连接肽与免疫细胞胞内结构域连接。
所述的2A连接肽为选自T2A、P2A、E2A、F2A。
优选地，所述2A连接肽为P2A，其氨基酸序列为SEQ ID NO：5(GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP)所示的序列。
所述的信号肽通过接头1与IL-18突变体DR-18连接。
所述的IL-18突变体DR-18通过接头2与IL-18受体IL-18Rα膜蛋白连接。
具体的，所述柔性接头为(GxSy)n，其中：G为甘氨酸，S为丝氨酸，x为1、2、3或4，y为1、2、3或4，n为1、2、3、4、5或6。
具体的，所述接头氨基酸序列可以为SEQ ID NO：6(GGGGS)、SEQ ID NO：7(GGGSGGGG)、SEQ ID NO：8(GGGGSGGGGSGGGGS)、SEQ ID NO：9(SGGGGS)。
优选的，所述接头1的氨基酸序列为SEQ ID NO：6(GGGGS)。
优选的，所述接头2的氨基酸序列为SEQ ID NO：9(SGGGGS)。
与现有技术相比，本发明效果为：
设计了一种膜固定式DR-18复合物，将其与免疫细胞治疗技术联合，膜固定式的设计将DR-18锚定在在细胞膜上，使其分泌仅作用于免疫细胞及其周围肿瘤微环境，从而显著提高肿瘤免疫治疗过程中效应细胞对肿瘤细胞的杀伤活性，增强免疫细胞的增殖，促进细胞因子的分泌，具有更安全、高效的功能。且不需要外源加入细胞因子IL-18，降低细胞培养和患者用药的成本。
附图说明
图1DR-18复合物结构示意图
图2荧光定量PCR检测病毒滴度
图3流式细胞术检测CAR-T细胞表面DR18的表达
图4流式检测CAR-T细胞阳性率
图5CD19-aDR18 CAR-T细胞增殖倍数图
图6CD19-aDR18 CAR-T细胞24h杀伤率
图7细胞表型
图8流式多因子检测CD19-aDR18-CAR-T细胞IFN-γ分泌
图9流式多因子检测CD19-aDR18-CAR-T细胞TNF-α分泌
具体实施方式
下面将以CAR-T细胞为例，对本发明实施例中的技术方案做进一步完整详细描述。免疫细胞选用CD19 CAR-T细胞作为实施例，此实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。
具体的，所述嵌合抗原受体CAR包括CD19抗原结合结构域、跨膜结构域、胞内信号传导结构域和DR-18复合物，DR-18复合物包括信号肽、IL-18突变体DR-18、IL-18受体IL-18Rα膜蛋白。如无特殊说明，本发明中所涉及到的实验试剂和材料，均可通过商业市售购买所得。
实施例一DR-18复合物的基因合成与载体构建
DR-18复合物质粒委托通用生物系统(安徽)有限公司构建。按照信号肽(SEQ IDNO：1)、IL-18突变体DR-18(SEQ ID NO：2)、IL-18受体IL-18Rα膜蛋白(SEQ ID NO：4)的顺序进行序列组装。密码子优化后合成基因，并克隆至质粒载体上。DR-18复合物模式图见图1。
实施例二CAR质粒的构建
CAR质粒委托通用生物系统(安徽)有限公司构建。(1)CD19-CAR质粒，为CD19 CAR；(2)按照CD19-CAR、信号肽、IL-18突变体DR-18、IL-18受体IL-18Rα膜蛋白基因的顺序进行序列组装，为CD19-aDR18CAR。
实施例三慢病毒的包装及浓缩
如下所述产生慢病毒载体颗粒。将800万个293T细胞接种到10cm2培养皿中，24小时后细胞进入对数生长期，即细胞密度达到70-80％左右时，进行慢病毒包装。将培养皿中旧的完全培养基更换为新鲜的完全培养基，取一个洁净无菌1.5ml EP管，加入750μl不含抗生素和血清的DMEM培养基，按照4:3:1的比例依次加入11.25μg主质粒、8.4375μg psPAX2、2.8125μg pMD2.G质粒，用枪轻轻吹打混匀，再加入24μl Lipo8000TM转染试剂，轻轻混匀。将Lipo8000TM转染试剂-DNA混合物均匀滴加到整个培养皿中，随后轻晃混匀，不可吹打，防止将细胞吹打漂浮起来，放入细胞培养箱中继续培养。6小时后更换细胞培养液。转染48小时后第一次收取上清培养液，4℃冰箱保存，并补加新鲜培养基。72小时第二次收取上清液，将两次收集到的上清液合并，3000rpm/min，4℃离心10min，弃沉淀，上清用0.45μm的滤膜过滤。按照1:4的比例依次加入病毒浓缩液和上述病毒上清滤液，10000g/min，4℃离心10min，进行病毒浓缩。弃上清，留病毒沉淀，按照病毒上清滤液：培养基为250:1的比例加入不含抗生素和血清的DMEM培养基，溶解沉淀，分装-80℃保存备用。
实施例四慢病毒滴度检测
利用基于SYBRGreen的荧光定量PCR方法，PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。病毒感染1天前，48孔板接种293T细胞。每孔细胞为5×104个。接种细胞24小时后，取两个孔的细胞计数，确定感染时细胞的实际数目，记为N。弃去培养板中的培养基，更换为含有5μg/mlpolybrene的新鲜培养基。将浓缩病毒用培养基稀释200倍，也就是取1μl病毒加入到199μl的培养基中。在3个培养孔中分别加入0.5μl，5μl和50μl的稀释病毒。感染开始后20小时，除去培养上清，换为500μl含DNaseI的新鲜培养基。在37℃消化15分钟，这一步是要除去残余的质粒DNA。然后换为2ml正常的培养基，继续培养48小时。用0.5ml 0.25％胰酶-EDTA溶液消化细胞，在37℃放置1分钟。用培养基吹洗下，离心收集细胞。按照DNeasy试剂盒的说明抽提基因组DNA。每个样品管中加入200μl洗脱液洗下DNA。用DNA定量试剂盒定量(Bio-Rad)。基因组DNA可以稳定保存在-20℃至少2个月。准备PCR所需的试剂和样品，根据试剂盒说明书配制PCR体系。数据分析：测得的DNA样品中整合的慢病毒载体拷贝数用基因组数加以标定，得到每基因组整合的病毒拷贝数。滴度(integration units per ml，IU/ml)的计算公式如下：IU ml-1＝(C×N×D×1000)/V。其中：C＝平均每基因组整合的病毒拷贝数；N＝感染时细胞的数目(约为1×105)；D＝病毒载体的稀释倍数；V＝加入的稀释病毒的体积数。如图2所示，对照组和实验组的病毒滴度均能达到108以上。
实施例五T细胞的分离与扩增
外周血单个核细胞(PBMC)来自健康供体，用Ficoll密度梯度离心法分离。具体操作为，在50ml离心管中预先加入恢复至室温的20ml淋巴细胞分离液Ficoll，取肝素抗凝血与无菌1×PBS按比例1:1稀释混匀，用移液管将20ml稀释后的血沿管壁缓慢流加于淋巴细胞分离液之上，650g/min，20℃，水平离心20min，为保证分离效果，需将离心机的升速、降速调至最低。离心后可看见管内分为四层，自上而下依次为血浆、白膜层PBMC、淋巴细胞分离液、粒细胞和红细胞，将最上层血浆层吸弃，余下约1ml，用吸管沿管壁旋转吸出白膜层的PBMC，移入另一50ml离心管，重悬于5倍体积的PBS中，470g/min，离心10min。洗涤细胞两次。末次离心后，弃上清，加入红细胞裂解液，室温孵育2min，裂解红细胞。裂解之后加入PBS，300g/min，离心10min。弃上清，加入37℃预热含有10％FBS的RPMI1640培养基，重悬细胞，计数并计算细胞活力。加入终浓度为200ng/ml的细胞刺激因子CD3、CD28激活T细胞，24h后加入100IU/mL的IL-2继续扩增培养。
实施例六CD19-aDR18 CAR-T细胞的制备
将激活的T细胞加入MOI＝10的慢病毒浓缩液进行病毒转导，并加入5μg/mlPolybrene助染剂，24小时后换液继续培养。
实施例七CD19-aDR18 CAR-T细胞表达的检测
选用慢病毒载体本身携带的绿色荧光蛋白(GFP)作为筛选标记，流式细胞术检测三种不同病毒感染后的CAR-T细胞表面IL-18的表达。收集细胞，每管2×105个，PBS洗涤后加入相应抗体，4℃孵育20-40分钟。用冷的PBS洗涤细胞2次，后将细胞重悬在200μl PBS中，Beckamn流式细胞仪上机收样，Kaluza软件分析结果。图3、图4所示。
实施例八CD19-aDR18 CAR-T细胞的扩增
分别在转导后第2、6、10、14天，利用细胞计数仪，对CAR-T细胞进行计数，GraphPadPrism绘制增值曲线。图5结果显示。
实施例九检测CD19-aDR18 CAR-T细胞杀伤功能
感染96h后，进行细胞杀伤实验。Raji-luc细胞作为靶细胞。将5000个靶细胞接种于96孔板中，依次设置效靶比为1:1、2:1、5:1、10:1、10:1的梯度，共培养。每组3复孔。24h后，离心，上清用来后续测细胞因子。细胞沉淀加入198μL培养基，加入2μL底物D-Luciferin工作液，37℃细胞培养箱避光孵育5min，酶标仪检测荧光强度。空白培养基和空白靶细胞孔作为对照。杀伤率计算公式如下。结果如图6所示。
细胞毒性(Cytoxicity％)＝1-(实验组-空白培养基组)/(空白靶细胞组-空白培养基组)
实施例十细胞因子分泌的检测
使用Biolegend的LEGENDplexTM多因子检测试剂盒检测IFN-γ、TNF-α的分泌。流式上机操作后使用LEGENDplex v8.0软件进行分析(如图8-图9所示)。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (10)
1.一种膜锚定式DR-18复合物，其特征在于，其由信号肽、IL-18突变体DR-18和IL-18受体IL-18Rα膜蛋白通过接头依次串联连接，其中，IL-18突变体DR-18的氨基酸序列为SEQ IDNO：2所示的序列，IL-18受体IL-18Rα膜蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：4所示的序列。
2.根据权利要求1所述的DR-18复合物，其特征在于，所述信号肽选自CD4信号肽、CD8信号肽、CD28信号肽或轻链信号肽。
3.根据权利要求1-2任一项所述的DR-18复合物，其特征在于，信号肽为CD8信号肽，如SEQ ID NO：1所示。
4.根据权利要求3所述的DR-18复合物，其特征在于，所述信号肽通过接头1与IL-18突变体DR-18连接，接头1的氨基酸序列为SEQ ID NO：6；所述的IL-18突变体DR-18通过接头2与IL-18受体IL-18Rα膜蛋白连接，接头2的氨基酸序列为SEQ ID NO：9。
5.一种工程改造免疫细胞，其特征在于，包括权利要求1-4任一项所述的DR-18复合物。
6.权利要求5所述的工程改造免疫细胞，其特征在于，其为CAR-T、CAR-NK或TCR-T
细胞。
7.权利要求5-6任一项所述的工程改造免疫细胞，其特征在于，将DR-18复合物通过P2A连接肽与工程改造免疫细胞胞内结构域连接，P2A的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。
8.权利要求1-4任一项所述的DR-18复合物、权利要求5-7任一项所述的工程改造免疫细胞在制备肿瘤免疫药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，所述肿瘤为血液瘤或实体瘤。
10.根据权利要求9所述的应用，所述肿瘤为人淋巴瘤。
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