JP2019519482A - 自己免疫系の活性化におけるｚ−ブチリデンフタリドの使用 - Google Patents

Abstract

医薬製剤を調製するためにＺ−ブチリデンフタリドを使用する用途。前記医薬製剤は、少なくとも先天性免疫系を活性化する効果を提供するか、または癌の治療効果を提供するために単球と一緒に使用することができる。

Description

本発明は、Ｚ−ブチリデンフタリド（Ｚ−ＢＰ）の使用に関し、特に自己免疫系を活性化する際のＺ−ＢＰの使用に関する。単核細胞と組み合わせてＺ−ＢＰを対象に投与することによって癌を治療する効果は、単核細胞のみを投与するよりもずっと良好である。

癌の治療に関しては、手術、化学療法、放射線療法、標的遺伝子治療等の一般的な治療法に加えて、近年最も進歩した抗癌戦略として免疫療法が検討されている。免疫療法は、自己免疫系が人工的に活性化され、癌細胞を認識して攻撃し、腫瘍を縮小または消失させ、患者の寿命を延ばすことを意味する。

臨床研究では、免疫療法はかなり良好な効果を示すが、一部の患者は免疫療法に対して感受性がないことが示されている。例えば、メラノーマの臨床研究では、免疫細胞は腫瘍の周りに集まるが、腫瘍に入ることはできないことが判明した。この点について、本庶佑博士とジェームス Ｐ．アリソン博士は、いくつかの癌細胞は、免疫細胞を誘導して、癌細胞の表面抗原（例えば、ＰＤＬ−１、ＣＴＬＡ−４）を介した免疫応答の抑制を開始することができ、そして自己および外来性免疫細胞の両方を活性化することはできないことを見出した。プログラム細胞死リガンド１（ＰＤＬ−１）および細胞傷害性Ｔリンパ球タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）等の癌細胞の表面抗原は、免疫チェックポイント抗原とも呼ばれる。

上記の問題を解決するために、本庶佑博士とジェームス Ｐ．アリソン博士は、Ｔ細胞の表面上のプログラム細胞死１（ＰＤ−１）を中和することができ、癌細胞の表面上のＰＤＬ−１が免疫細胞に結合するのを阻止するか、または免疫細胞を死滅させ、したがって治療に使用することができる抗体を共同開発した。しかしながら、試験において、Ｔ細胞のＰＤ−１発現のブロックは、患者における免疫細胞調節機構の不均衡を容易にもたらし、その結果、患者の死をもたらすことが分かった。したがって、治療に使用するための癌細胞の表面上の免疫チェックポイント抗原の発現を阻害することができる抗体を開発することについて逆の考えをする研究者もいる。

例えば、イピリムマブは免疫チェックポイント阻害剤である。フェーズ３臨床試験の結果は、イピリムマブ単独投与では、ステージ３または４のメラノーマ患者の全生存率が１０．１ヶ月増加し、これはまた、癌免疫療法のための免疫チェックポイントの重要性を証明した。しかしながら、免疫チェックポイント抗原の発現を阻害し得る抗体を開発する上での欠点は、コストが非常に高く、工程が複雑であることである。したがって、免疫チェックポイント抗原を効果的に阻害するための薬物または方法を継続的に開発する必要性および緊急性がある。

本発明者らは、Ｚ−ＢＰが、癌細胞の免疫チェックポイント抗原の発現を阻害すること、免疫系を活性化することができるケモカインを分泌するように癌細胞を促進すること、免疫細胞の量を増加させ、免疫細胞の腫瘍部位への侵入を促進することに有効であり、従って、自己免疫系を活性化するために使用できることを見出した。さらに、本発明者らは、癌対象にＺ−ＢＰおよび単核細胞を投与する治療効力は、単核細胞のみを投与することよりもずっと良好であることを予想外に見出した。

本発明の目的は、自己免疫系の活性化および癌の治療の少なくとも１つのために、単核細胞と組み合わせて使用される、医薬の製造におけるＺ−ＢＰの使用を提供することである。

前記単核細胞は、自己単核細胞、外来性単核細胞、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。

前記単核細胞は、リンパ細胞、骨髄細胞、食細胞、および抗原提示細胞の少なくとも１つである。

前記単核細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、肥満細胞、好塩基球顆粒球、好酸球顆粒球、好中球、マクロファージ、および樹状細胞の少なくとも１つである。

前記医薬は、経口投与、経皮投与、経鼻投与、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下移植、間質移植、または前記投与の２種以上により投与される。

前記医薬は、ウェハー剤の形態である。

前記医薬は、癌細胞の免疫チェックポイント抗原の発現を阻害すること、免疫系を活性化することができるケモカインを分泌するように癌細胞を促進すること、免疫細胞の量を増加させること、免疫細胞の腫瘍部位への侵入を促進することの少なくとも１つのために使用される。

前記癌細胞は、悪性脳腫瘍細胞、膠芽細胞腫細胞、膵臓癌細胞、肺癌細胞、およびメラノサイトーマ細胞の少なくとも１つである。

前記医薬は、１日あたり約３０ｍｇ／ｋｇ体重〜約２，０００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の量で投与される。

本発明の別の目的は、
（１）Ｚ−ＢＰを含む第１の部分；および
（２）単核細胞を含む第２の部分、
を含み、前記第１の部分および第２の部分は対象に同時にまたは別々に投与される、自己免疫系を活性化するためのキットを提供することである。

第１の部分は、経口投与、経皮投与、経鼻投与、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下移植および／または間質移植に適した第１の形態として提供され、第２の部分は、皮質脊髄路注射、髄腔内注射、大脳内注射、静脈内注射、腹膜注射および／または皮下注射に適した第２の形態として提供される。

第１の部分はウェハー剤として提供される。

前記キットは、溶液を含む第３の部分をさらに含み、使用前に、前記溶液を第２の部分と混合して注射用溶液を提供する。

本発明のさらに別の目的は、有効量のＺ−ＢＰおよび有効量の単核細胞を必要な対象に投与することを含む、自己免疫系の活性化および癌の治療の少なくとも１つの方法を提供することである。

本発明の効果

Ｚ−ＢＰは、自己免疫系を効果的に活性化し、免疫細胞が癌細胞を正常に認識して死滅させることができるため、癌細胞免疫療法の効率を高めるために、癌治療において単核細胞と併用することができる。

本発明のために実施される詳細な技術およびいくつかの特定の実施形態を特許請求の範囲に記載された発明の特徴を十分に理解するために、当業者には以下の段落で説明する。

本発明を以下の段落によって、図面および実施される特定の実施形態と組み合わせてさらに説明する。
図１は、ＲＧ２細胞株、１ＸＭ細胞株、Ｐａｃａ２細胞株、Ｈ１６５０細胞株およびＢ１６細胞株のＰＤＬ−１タンパク質およびアクチンの発現を示す写真群であり、すべての細胞株を異なる濃度のＺ−ＢＰで処理し、発現をウエスタンブロッティングによって分析した。 図２は、異なる条件で処理されたラットの生存率を示す曲線図であり、「空のウェハー剤」は、活性成分を含まないウェハー剤のみで処理された対照群を指し、「空のウェハー剤＋ＰＢＭＣ」は、単核細胞と組み合わせて活性成分を含まないウェハー剤で処理した群を指し、「Ｃｅｒｅｂｒａｃａウェハー剤」はＺ−ＢＰ含有ウェハー剤のみで処理した群を指し、「Ｃｅｒｅｂｒａｃａウェハー剤＋ＰＢＭＣ」は単核細胞と組み合わせてＺ−ＢＰ含有ウェハー剤で処理した群を指す。 図３は、「空のウェハー剤」群、「Ｃｅｒｅｂｒａｃａウェハー剤」群および「Ｃｅｒｅｂｒａｃａウェハー剤＋ＰＢＭＣ」群のラットの脳組織を示す画像群であり、脳組織を免疫組織化学によって分析した。

以下、本発明のいくつかの実施形態を詳細に説明する。しかし、本発明は、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で種々の形態で実施することが可能であり、本明細書に記載された実施形態に限定されない。

加えて、本明細書中で特に断らない限り、本発明の明細書（特に特許請求の範囲）に記載される表現「前記（一、該）」等は、単数形および複数形の両方を含むことが意図される。本明細書で使用される「治療」という用語は、対象が完全に回復するまで対象を治療することを指すと解釈されるべきではなく、実質的に静的な状態の疾患の進行または症状の維持、対象の回復率の増加、特定の状態の重症度の緩和、および患者の生活の質の向上を含むべきである。本明細書に記載される疾患の発症の「遅延」は、特定の状態の発症を予防し、敏感な対象を健康な状態に維持すること、または疾患に対する対象の耐性を確立することを指す。本明細書において使用される「有効量」または「治療有効量」という用語は、対象に投与されたときに疑わしい対象において治療されている状態を少なくとも部分的に軽減し得る化合物の量を指す。本明細書において使用される「対象」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物を含む哺乳動物を指す。本明細書において使用される単位「ｍｇ／ｋｇ体重」とは、体重１ｋｇあたりに必要とされる投与量を指す。

本明細書で使用される数値範囲（例えば、５〜１００）は、範囲内の有理数のすべてと、範囲内の任意の有理数からなる範囲とを含むと解釈されるべきである。したがって、本明細書で使用される数値範囲は、そこに列挙されている最低値と最高値との間の可能な全ての数値の組み合わせを含むべきである。さらに、本明細書で使用される「約」という用語は、記載された値の±２０％以内、好ましくは±１０％以内、より好ましくは±５％以内の値を実質的に表す。

上記のように、癌細胞は、自身の表面上の免疫チェックポイント抗原を介して免疫細胞に結合して、免疫細胞の免疫応答の抑制を誘導し、自己および外来性免疫細胞の両方を活性化させず、免疫細胞を死滅させることもできる。したがって、癌細胞の免疫チェックポイント抗原の発現が効果的に阻害されれば、自己免疫系を効果的に活性化することができ、これは癌治療における免疫細胞療法の使用を容易にする。

本発明者らは、Ｚ−ＢＰが、癌細胞の免疫チェックポイント抗原の発現を阻害すること、免疫系を活性化することができるケモカインを分泌するように癌細胞を促進すること、免疫細胞の量を増加させ、免疫細胞の腫瘍部位への侵入を促進することに有効であり、従って、自己免疫系を活性化し、単核細胞と組み合わせて癌を治療するために使用することができることを見出した。本発明者らは、癌対象にＺ−ＢＰおよび単核細胞を投与する治療効力は、単核細胞のみを投与することよりもずっと良好であることを予想外に見出した。

以下に示す実施例に示すように、本発明によれば、Ｚ−ＢＰの使用は、癌免疫細胞療法で治療された対象（すなわち、単核細胞と共に投与された対象）、または癌免疫細胞療法で治療される準備ができている対象（すなわち、単核細胞と共に投与され得る対象）の自己免疫系を活性化することができると信じられており、したがって、免疫細胞療法の効率を高めることができる。

したがって、本発明は、自己免疫系の活性化におけるＺ−ＢＰの使用、単核細胞と組み合わせて使用するための医薬の製造におけるＺ−ＢＰの使用、Ｚ−ＢＰおよび単核細胞を含むキット、並びに必要とする対象にＺ−ＢＰおよび単核細胞を投与することを含む自己免疫系の活性化および癌の治療方法を提供する。

本発明の使用において、リンパ細胞、骨髄細胞、食細胞、抗原提示細胞等の自己および／または外来性単核細胞を使用することができる。特に、単核細胞の例としては、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、肥満細胞、好塩基球顆粒球、好酸球顆粒球、好中球、マクロファージ、および樹状細胞が挙げられるが、これに限定されない。

目的に応じて、本発明の使用により採用される単核細胞は、特定の制限なしに、任意の適切な形態で、必要とされる対象に投与され得る。例えば前記単核細胞は、皮質脊髄路注射、髄腔内注射、大脳内注射、静脈内注射、腹腔内注射および／または皮下注射によって必要とされる対象に投与することができるが、投与はこれに限定されない。本発明のいくつかの実施形態において、前記単核細胞は、静脈内注射の形態で投与され得る。

本発明の使用に従って提供される医薬は、免疫チェックポイント抗原を発現することができる任意の癌細胞に投与することができる。理論によって制限されることなく、前記医薬は、癌患者の免疫細胞の量を増加させ、癌細胞の表面上の免疫チェックポイント抗原の発現を阻害することにより、免疫細胞の腫瘍部位への侵入を促進することができ、従って、癌細胞を除去する効果を達成すると考えられている。

目的に応じて、本発明の使用に従った医薬は、特定の制限なしに、任意の適切な形態で提供され得る。例えば、前記医薬は、自己免疫系を活性化し、癌免疫細胞療法の効率を高める必要のある対象に経口または非経口（経皮投与、経鼻投与、皮下注射、静脈注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下移植または間質移植等）経路によって投与することができるがこれらに限定されない。形態と目的に応じて、Ｚ−ＢＰおよび／または単核細胞の所望の効果に悪影響を及ぼさない限りにおいて適切な担体を、選択・使用して前記医薬を提供することができる。そのような担体として、賦形剤、希釈剤、助剤、安定剤、吸収遅延剤、崩壊剤、ハイドロトロピー剤、乳化剤、酸化防止剤、接着剤、結合剤、粘着付与剤、分散剤、懸濁剤、潤滑剤、吸湿剤等を挙げることができる。

経口投与に適した剤形として、キャリアは、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールまたはその類縁体、セルロース、デンプン、糖ベントナイト（糖膨潤土、sugar bentonite）およびこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。前記医薬は、経口投与のための任意の適切な形態、例えば固体形態（錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、パウダー剤等の形態）、または液体形態（経口液剤、シロップ剤、酒精剤、エリキシル剤、チンキ剤等の形態）等とすることができるが、これに限定されない。

皮下、静脈内、筋肉内または腹腔内投与に適した注射剤または点滴剤の形態としては、本発明によって提供される医薬は、１つ以上の成分、例えば、等張溶液、塩緩衝食塩水（例えばリン酸緩衝生理食塩水またはクエン酸緩衝生理食塩水）、ハイドロトロピー剤、乳化剤、５％砂糖溶液、および静脈内注射、乳化静脈内注射、注射用粉末、注射用懸濁液、または注射用粉末懸濁液として医薬を提供する他の担体等を含んでもよい。あるいは、前記医薬は注射用用時溶解固形製剤として調製されてもよい。注射用用時溶解固形製剤は、他の溶液または懸濁液に可溶な形態で、または乳化可能な形態で提供することができる。注射用用時溶解固形製剤を、必要とする対象に投与する前に、他の溶液、懸濁液、または乳化剤に溶解することにより注射剤を調製可能である。さらに、経鼻または経皮投与に適した外用剤の形態として、前記医薬は、例えばリニメント剤（エマルジョン、クリーム、ゲル、分散クリームおよび軟膏等）、スプレー、パッチまたは溶液（洗浄液および懸濁液等）の形態で提供することができる。

皮下移植または間質移植に適した剤形としては、本発明によって提供される医薬は１つ以上の成分、例えば賦形剤、安定化剤、緩衝剤、例えばウェハー剤、錠剤、丸剤、カプセル剤等の形態で医薬を調製するための他の担体等をさらに含むことができる。このため、医薬は対象に移植され、その中に含まれる活性成分をゆっくりと連続的に周囲の組織に放出することができ、従って、局所的に安定した高用量の医薬を達成することができ、自己免疫系を活性化する効果を提供することができる。例えば、本発明によって提供される医薬は、皮下移植または間質移植のためのウェハー剤の形態で医薬を調製するための生体適合性ポリマーを含むことができるが、これに限定されない。生体適合性ポリマーは、市販されているか、または本発明の分野における公知の合成方法によって調製することができる。本発明のいくつかの実施形態では、ビス（ｐ−カルボキシフェノキシ）プロパンおよびセバシン酸によって提供されるｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）コポリマーのようなポリ酸無水物が生体適合性ポリマーとして使用される。

本発明の使用に従って提供される医薬において、医薬中のＺ−ＢＰの含有比は、必要に応じて調整することができる。例えば、Ｚ−ＢＰの重量比は、医薬の総重量を基準として約１％〜約４０％、好ましくは約２％〜約３０％の範囲とすることができる。本発明のいくつかの実施形態では、医薬は、ウェハー剤（すなわち、Ｃｅｒｅｂｒａｃａウェハー剤）の形態で提供され、ウェハー剤中のＺ−ＢＰの重量比は、約２５％である。

本発明によって提供される医薬は、必要に応じて、さらに嗜好性および視覚性を高めるための風味剤、トナー、または着色剤等の適切な量の添加剤、および医薬の安定性および保存性を改善するための緩衝剤、保存剤、防腐剤、抗菌剤、または抗真菌剤をさらに含んでもよい。さらに、前記医薬は、前記医薬の効果をさらに高めるため、あるいは提供される組成物の適用順応性および適合性を高めるため、他の活性成分がＺ−ＢＰおよび／または単核細胞の所望の効果に悪影響を及ぼさない限り、必要に応じて一以上の他の活性成分をさらに含んでもよく、あるいは一以上の他の活性成分を含む医薬と組み合わせて使用してもよい。

本発明によって提供される医薬が対象において自己免疫系を活性化する所望の有効性を提供することを確実にするために、免疫細胞療法の効率を高めるため、対象に単核細胞を投与する前、後または同時に対象に医薬を投与することができる。上記免疫細胞療法において、単核細胞は、好ましくは約１×１０^２〜約１×１０^１０細胞／注射部位、より好ましくは毎回約１×１０^５〜約１×１０^７細胞／注射部位の量で投与することができる。対象の必要性、年齢、体重および健康状態に依存して、本発明によって提供される医薬および単核細胞は、１日１回、１日複数回または数日おきに１回等、様々な投与頻度で別々に投与することができる。

例えば、本発明によって提供される医薬が、免疫細胞療法で処置された対象または対象の自己免疫系を活性化するための免疫療法で処置される準備ができている対象に間質移植によって投与される場合、医薬の投与量は、約３０ｍｇ／ｋｇ体重〜約２０００ｍｇ／ｋｇ体重／日、好ましくは約１００ｍｇ／ｋｇ体重〜約１，０００ｍｇ／ｋｇ体重／日、より好ましくは約２００ｍｇ／ｋｇ体重〜約５００ｍｇ／ｋｇ体重／日であり、Ｚ−ＢＰの総重量に基づく。しかしながら、急性の患者では、本発明により提供される単核細胞および医薬の投与量は、必要に応じて、例えば、数倍または数十倍まで増加させることができる。

本発明のいくつかの実施形態では、本発明により提供される医薬は、脳癌の治療において単核細胞と組み合わせて使用され、前記医薬は、ウェハー剤の形態で、および間質移植によって投与され、前記単核細胞は、注射によって投与される。

本発明はまた、（１）Ｚ−ＢＰを含む第１の部分と、（２）単核細胞を含む第２の部分とを含む、免疫細胞療法におけるキットを提供する。このうち、第１の部分は、本発明により提供される上述の医薬である。第１および第２の部分の形態、適用頻度、投与量の範囲は、すべて上述の通りである。

本発明のキットは、使用前に、溶媒または溶液を第１の部分および／または第２の部分と混合して注射用溶液を提供することができる溶媒または溶液を含む、第３の部分をさらに含んでもよい。

第３の部分として使用するのに適した溶媒としては、水、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エタノール等の極性溶媒が挙げられるが、これららに限定されない。第３の部分として使用するのに適した溶液は、塩緩衝生理食塩水および注射剤を提供するために使用される任意の適切な注射溶液を含むが、これらに限定されない。塩緩衝生理食塩水の例には、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、クエン酸緩衝化生理食塩水、生理食塩水等が含まれるが、これらに限定されない。

本発明のキットのいくつかの実施形態において、キットは、第１の部分、第0２の部分、および第３の部分を含み、第１の部分はウェハー剤の形態として提供され、第２の部分（単核細胞を含む）は第３の部分と混合されて対象に投与される前に注射用溶液を提供し、第３の部分は好ましくはＰＢＳである。

本発明のキット中の各部分は、一般に、別々に包装され、保存され、輸送され、別々に、またはセットで販売され得る。本発明のキットの各部分を別々に包装して保管し、キットの各構成要素を別々に運搬して販売する場合には、第１の部分を４℃以下の遮光下で保存することが好ましく、第２の部分は−８０℃以下の温度で保存することが好ましい。また、本発明のキットの各構成要素をセットで輸送して販売する場合、第１の部分、第２の部分および第３の部分は、内部温度が４℃未満の容器、内部温度が−８０℃の容器（例えば、液体窒素タンク）、および内部温度が−２０℃の容器（例えば、アイスボックス）に別々に保持することができる。各容器の形状及び大きさは、各容器の内部が外気温から隔離されていれば、各部の保存温度に影響を与えることなく、全ての部品をセットで輸送して販売することができる限り特に限定されない。

凍結培地の組成が第２の部分（単核細胞を含む）の生存率を効果的に維持できる限り、第２の部分の保存には任意の適切な凍結培地を使用することができる。通常、凍結培地の組成は、対応する第２の部分（単核細胞を含む）に応じて調整される。一般に、凍結培地の組成には、ＤＭＳＯ、栄養成分（例えば、グルコース）、ｐＨ調整剤等が含まれる。

本発明によるキットは、適用される様式、適用される頻度および各部分の適用される用量を任意に調節するためのユーザ用取扱説明書をさらに含むことができる。

本発明はまた、有効量のＺ−ＢＰおよび有効量の単核細胞を必要な対象に投与することを含む、自己免疫系を活性化し癌を治療する方法を提供し、Ｚ−ＢＰの投与および単核細胞の投与は同時にまたは別々に実施することができる。好ましくは、本発明の方法は、悪性脳腫瘍、膠芽細胞腫、膵臓癌、肺癌およびメラノサイトーマのうちの少なくとも１つである癌を治療するための方法である。単核細胞の投与形態、適用頻度、および投与量の範囲は、すべて上述の通りである。Ｚ−ＢＰに関しては、本発明により提供される医薬の形態として使用することができるが、これに限定されない。

以下、具体例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。ただし、以下の実施例は、本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の範囲はこれに限定されるものではない。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲に示される。

［実施例１］：癌細胞の免疫チェックポイント抗原の発現阻害に及ぼすＺ−ＢＰの影響
上記のように、ＰＤＬ−１は、癌細胞の表面上に発現する免疫チェックポイント抗原であり、免疫細胞に結合し、免疫細胞を誘発して免疫応答の抑制を開始することができ、したがって、自己および外来性免疫細胞の両方が活性化されることを不可能にし、さらには免疫細胞を死滅させることも可能である。

ＲＧ２細胞株（ラット悪性神経膠腫細胞）、１ＸＭ細胞株（神経膠芽細胞腫幹細胞）、Ｐａｃａ２細胞株（ヒト膵臓癌細胞）、Ｈ１６５０細胞株（ヒト非小細胞肺癌細胞）、またはＢ１６細胞株（マウスメラノサイトーマ細胞）を、種々の濃度のＺ−ＢＰで２４時間、単独で処理した。次に、細胞内のタンパク質を抽出し、Ｚ−ＢＰで処理した癌細胞におけるＰＤＬ−１タンパク質の発現をウエスタンブロット法で検出した。さらに、アクチンの発現を検出し、内部対照として使用した。結果を図１に示す。

図１に示すように、ＲＧ２細胞株、１ＸＭ細胞株、Ｐａｃａ２細胞株、Ｈ１６５０細胞株、およびＢ１６細胞株におけるＰＤＬ−１タンパク質の発現は、Ｚ−ＢＰの濃度の増加とともに有意に減少した。これらの結果は、Ｚ−ＢＰが癌細胞の免疫チェックポイント抗原の発現を抑制するのに有効であり、癌細胞と免疫細胞との結合を阻害することができ、癌免疫細胞療法の効率を高めるために使用できることを示している。

［実施例２］：癌を治療するためのＺ−ＢＰと単核細胞の組み合わせの使用
（２−１）単核細胞の調製
心臓穿刺により実験用ラットから１０ｍｌの全血を採取し、採血管（ＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒから購入、番号：３６７９８８）に入れ、５００−１８００ｇで１５分間遠心分離した。次いで、上清を除去し、単核細胞層を別の遠心チューブに入れた。その後、以下の実験のために、単核細胞（すなわち、末梢血単核球、ＰＢＭＣ）をＰＢＳで１×１０^６細胞／１００μｌの濃度に希釈した。

（２−２）動物モデルの確立
２４匹のＦ３４４ラットに、１．５〜２％のイソフルランガスを用いた吸入麻酔を施した後、各ラットの脳に２ｍｍの穴を穿孔した。その後、ＲＧ２細胞液（１×１０^５細胞／１０μｌ／ラット）をラットの線条体に注射して縫合し、その場で悪性脳膠芽細胞腫動物モデルを樹立した。３日後、以前の穿孔を中心とし半径１０ｍｍの穴を穿孔した後、ラットを無作為に４群（各群６匹）に分け、以下のように処理して次の実験を行った。
（１）「空のウェハー剤」群：活性成分を含まないウェハー剤（ＥＶＥＲＦＲＯＮＴ ＢＩＯＴＥＣＨ社製）を各ラットの脳に入れた。
（２）「空のウェハー剤＋ＰＢＭＣ」群：各ラットの脳に活性成分を含まないウェハー剤を入れ、（２−１）で得られた１×１０^６個のＰＢＭＣを尾静脈内注射により各ラットに投与した。
（３）「Ｃｅｒｅｂｒａｃａウェハー剤」群：各ラットの脳に、Ｚ−ＢＰ（７．５ｍｇＺ−ＢＰ／ウェハー剤；ＥＶＥＲＦＲＯＮＴ ＢＩＯＴＥＣ社製）を入れたウェハー剤を入れた。
（４）「Ｃｅｒｅｂｒａｃａウェハー剤＋ＰＢＭＣ」群：各ラットの脳にＺ−ＢＰ（７．５ｍｇＺ−ＢＰ／ウェハー剤）を入れたウェハー剤を入れ、（２−１）で得られた１×１０^６個のＰＢＭＣを尾静脈注射により投与した。

（２−３）生存状況の観察
各群のラットの生存状況を毎日観察し、記録した。結果を図２および表１に示す。
［表１］

図２および表１に示すように、「空のウェハー剤」群と比較して、「空のウェハー剤＋ＰＢＭＣ」群、「Ｃｅｒｅｂｒａｃａウェハー剤」群および「Ｃｅｒｅｂｒａｃａウェハー剤＋ＰＢＭＣ」群のラットの寿命はそれぞれ約６日、１５日および２４日延長した。これらの結果は、単核細胞単独で投与された悪性脳腫瘍の対象の寿命を延長させることができ、Ｚ−ＢＰを単核細胞と共に投与した悪性脳腫瘍の対象をより効果的に延命することができることを示す。

（２−４）免疫細胞の観察
（２−３）のラットが死亡した後、脳を採取して病理組織切片を調製した。次いで、病理組織切片の腫瘍部位においてＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、およびＣＣＬ２０抗体（Ｇｅｎｅｔｅｘ社から購入）を用いて免疫組織染色（ＩＨＣ）を行い、顕微鏡で観察した。結果を図３に示す。

図３に示すように、「空のウェハー剤」群と比較して、「Ｃｅｒｅｂｒａｃａウェハー剤」群のラットの腫瘍部位におけるＣＣＬ２０（癌細胞によって分泌され、免疫細胞を誘引する機能を有するケモカイン）が増加傾向にあり、Ｃｅｒｅｂｒａｃａウェハー剤＋ＰＢＭＣ」群のラットの腫瘍部位におけるＣＣＬ２０の増加傾向はより顕著であった。

一方、「空のウェハー剤」群と比較して、「Ｃｅｒｅｂｒａｃａウェハー剤」群のラットの腫瘍部位におけるＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＣＤ８^＋Ｔ細胞およびＣＤ１１ｂ^＋細胞（すなわち、樹状細胞）の数も増加傾向にあり、「Ｃｅｒｅｂｒａｃａウェハー剤＋ＰＢＭＣ」群のラットの腫瘍部位におけるＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＣＤ８^＋Ｔ細胞およびＣＤ１１ｂ^＋細胞の数の増加傾向はより有意であった。

上記の結果は、Ｚ−ＢＰが、免疫系を活性化することができるケモカインを分泌するように癌細胞を活性化すること、免疫細胞の量を増加させること、および免疫細胞の腫瘍部位への侵入を促進することに有効であること示している。さらに、Ｚ−ＢＰと単核細胞の組み合わせは、上記の効果の効率をさらに高めることができる。

上記の細胞および動物実験で示された結果として、Ｚ−ＢＰは、自己免疫系を効果的に活性化し、免疫細胞に首尾よく認識させ、癌細胞を殺すことができ、癌免疫細胞療法の効率を高めるために、癌の治療において単核細胞と組み合わせて使用することができる。

前記医薬は、１日あたり３０ｍｇ／ｋｇ体重〜２，０００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の量で投与される。

本明細書で使用される数値範囲（例えば、５〜１００）は、範囲内の有理数のすべてと、範囲内の任意の有理数からなる範囲とを含むと解釈されるべきである。したがって、本明細書で使用される数値範囲は、そこに列挙されている最低値と最高値との間の可能な全ての数値の組み合わせを含むべきである。

本発明の使用に従って提供される医薬において、医薬中のＺ−ＢＰの含有比は、必要に応じて調整することができる。例えば、Ｚ−ＢＰの重量比は、医薬の総重量を基準として１％〜４０％、好ましくは２％〜３０％の範囲とすることができる。本発明のいくつかの実施形態では、医薬は、ウェハー剤（すなわち、Ｃｅｒｅｂｒａｃａウェハー剤）の形態で提供され、ウェハー剤中のＺ−ＢＰの重量比は、２５％である。

本発明によって提供される医薬が対象において自己免疫系を活性化する所望の有効性を提供することを確実にするために、免疫細胞療法の効率を高めるため、対象に単核細胞を投与する前、後または同時に対象に医薬を投与することができる。上記免疫細胞療法において、単核細胞は、好ましくは１×１０^２〜１×１０^１０細胞／注射部位、より好ましくは毎回１×１０^５〜１×１０^７細胞／注射部位の量で投与することができる。対象の必要性、年齢、体重および健康状態に依存して、本発明によって提供される医薬および単核細胞は、１日１回、１日複数回または数日おきに１回等、様々な投与頻度で別々に投与することができる。

例えば、本発明によって提供される医薬が、免疫細胞療法で処置された対象または対象の自己免疫系を活性化するための免疫療法で処置される準備ができている対象に間質移植によって投与される場合、医薬の投与量は、３０ｍｇ／ｋｇ体重〜２０００ｍｇ／ｋｇ体重／日、好ましくは１００ｍｇ／ｋｇ体重〜１，０００ｍｇ／ｋｇ体重／日、より好ましくは２００ｍｇ／ｋｇ体重〜５００ｍｇ／ｋｇ体重／日であり、Ｚ−ＢＰの総重量に基づく。しかしながら、急性の患者では、本発明により提供される単核細胞および医薬の投与量は、必要に応じて、例えば、数倍または数十倍まで増加させることができる。

図２および表１に示すように、「空のウェハー剤」群と比較して、「空のウェハー剤＋ＰＢＭＣ」群、「Ｃｅｒｅｂｒａｃａウェハー剤」群および「Ｃｅｒｅｂｒａｃａウェハー剤＋ＰＢＭＣ」群のラットの寿命はそれぞれ６日、１５日および２４日延長した。これらの結果は、単核細胞単独で投与された悪性脳腫瘍の対象の寿命を延長させることができ、Ｚ−ＢＰを単核細胞と共に投与した悪性脳腫瘍の対象をより効果的に延命することができることを示す。

Claims (18)

1. 医薬の製造におけるＺ−ブチリデンフタリド（Ｚ−ＢＰ）の使用であって、前記医薬が自己免疫系を活性化するために使用される、使用。
2. 前記医薬が単核細胞と組み合わせて使用される、請求項１に記載の使用。
3. 前記単核細胞が、自己単核細胞、外来性単核細胞、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項２に記載の使用。
4. 前記単核細胞が、リンパ細胞、骨髄細胞、食細胞および抗原提示細胞の少なくとも１つである、請求項２に記載の使用。
5. 前記単核細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、肥満細胞、好塩基球顆粒球、好酸球顆粒球、好中球、マクロファージ、および樹状細胞の少なくとも１つである、請求項２に記載の使用。
6. 前記医薬が、経口投与、経皮投与、経鼻投与、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下移植、間質移植、または前記投与形態の２つ以上によって投与される、請求項１に記載の使用。
7. 前記医薬が、ウェハー剤の形態である、請求項６に記載の使用。
8. 前記医薬が、癌細胞の免疫チェックポイント抗原の発現を阻害すること、免疫系を活性化することができるケモカインを分泌するように癌細胞を促進すること、免疫細胞の量を増加させること、および免疫細胞の腫瘍部位への進入を促進することのいずれか１つに使用される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用。
9. 前記癌細胞が、悪性脳腫瘍細胞、神経膠芽腫細胞、膵臓癌細胞、肺癌細胞、およびメラノサイトーマ細胞のうちの少なくとも１つである、請求項８に記載の使用。
10. 前記医薬が１日あたり約３０ｍｇ／ｋｇ体重〜約２，０００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の量で投与される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用。
11. 前記医薬が１日あたり約３０ｍｇ／ｋｇ体重〜約２，０００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の量で投与される、請求項９に記載の使用。
12. （１）Ｚ−ＢＰを含む第１の部分；および
    （２）単核細胞を含む第２の部分、
    を含む自己免疫系を活性化するためのキットであって、前記第１の部分および第２の部分は、対象に同時にまたは別々に投与される、キット。
13. 前記単核細胞が、自己単核細胞、外来性単核細胞、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１２に記載のキット。
14. 前記単核細胞が、リンパ球、骨髄細胞、食細胞および抗原提示細胞の少なくとも１つである、請求項１２に記載のキット。
15. 前記単核細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、肥満細胞、好塩基球顆粒球、好酸球顆粒球、好中球、マクロファージ、および樹状細胞の少なくとも１つである、請求項１２に記載のキット。
16. 前記第１の部分が、経口投与、経皮投与、経鼻投与、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下移植、および／または間質移植に適した第１の形態として提供され、前記第２の部分は、皮質脊髄路注射、髄腔内注射、脳内注射、静脈内注射、腹腔内注射および／または皮下注射に適した第２の形態として提供される、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載のキット。
17. 前記第１の部分がウェハー剤として提供される、請求項１６に記載のキット。
18. 溶液を含む第３の部分をさらに含み、使用前に、前記溶液を前記第２の部分と混合して注射用溶液を提供する、請求項１７に記載のキット。