JP3454825B2 - 新規なマクロファージ、その製造方法、及び医薬組成物の活性物質としてのその用途 - Google Patents

新規なマクロファージ、その製造方法、及び医薬組成物の活性物質としてのその用途

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Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、新規なマクロファージ、その製造方法、及
び医薬組成物の活性物質としてのその用途に関する。
背景技術 細胞障害性白血球（NK、Ｔリンパ球、単球−マクロフ
ァージ）は、腫瘍に対する宿主側の防御において、強力
なエフェクターである。現在では、自己由来のエフェク
ター細胞の殺腫瘍効力の、in vitroにおける拡張及び亢
進、並びにそれに引き続く宿主側へのその再注入が、現
在、局所又は全身的養子免疫療法において用いられてい
る（Rosenberg et al.:進行ガン患者157人のLAK細胞及
びIL2又はIL3単独を用いた治療に関する推移報告N.Eng
l.J.Med.316:889,1990。Rosenberg et al.:転移性メラ
ノーマ患者の免疫療法における腫瘍浸潤性リンパ球及び
IL2の使用N.Engl.J.Med.319:1676,1990。Lacerna et a
l.:リンホカインにより活性化されたキラー細胞及びIFN
−γにより活性化されたキラーリンパ球を用いたガンの
養子免疫療法Pharm.Ther.38:453,1988）。
マクロファージは、抗腫瘍性反応において、中心的役
割を有し、免疫強化物質により、新生物細胞に対して活
性を有するように活性化することができる（Adams D.an
d Hamilton T.:腫瘍細胞傷害のためのマクロファージの
活性化：エフェクターのメカニズム及びその調節In Hep
pner ＆ Fulton（eds）,Macrophages and cancer.CRC P
ress,1988,p.27。Fidler I.:マクロファージ及び転移。
ガン療法への生物学的アプローチCancer Res.45:4714,1
985）。
ネズミのモデルでは、腫瘍に局所的に投与された活性
化マクロファージにより、腫瘍の成長が阻害され、転移
が減少することが、証明されている（Bartholeyns et a
l.:ガンの免疫療法：培地中で増殖した活性化マクロフ
ァージによる実験的アプローチCancer Detect. ＆ Pre
v.12:413,1988。Chokri et al.:LPS、TNF、IFN及び活性
化マクロファージの抗腫瘍効果：相乗作用及び組織分布
Anticancer Res.9:1185,1989）。ヒトの血液より単離し
た単球は、疎水性バッグ中で７日間培養することによっ
て、in vitroにおいてマクロファージに分化させること
ができる（Chokri et al.:LPS、TNF、IFN及び活性化マ
クロファージの抗腫瘍効果：相乗作用及び組織分布Anti
cancer Res.9:1185,1989）。これらのマクロファージ
は、IFN−γの存在下で培養後、活性化され、in vitro
では、多数のヒト腫瘍に対し、またはヌードマウスに移
植された腫瘍に対し、殺腫瘍性を示すようになる（活性
化マクロファージキラー:MAK）（Andreesen et al.:ヒ
ト単球のマクロファージへの分化に関する表面表現型の
分析J.Leuk.Biol.47;490,1990。Dumonto et al.:養子移
入に関し、多量に産生されたヒトマクロファージの抗腫
瘍活性の調節Eur.J.Cancer 24:1691,1988）。
MAKの養子移入は、異なる研究者達により、ストラス
ブルグ、フライブルグ及びパリにおいて、転移性ガン患
者を対象に、自己由来のMAK108〜２×109個を全身的又
は腹腔内に注入することによって、第Ｉ相臨床試験に供
された（Andreesen et al.:循環単球からin vitroにお
いて生成させた腫瘍細胞障害性マクロファージの養子移
入：ガン免疫療法に対する新しいアプローチCancer Re
s.50:7450,1990。Bartholeyns et al.活性化マクロファ
ージによる固形ガンの養子免疫療法：実験及び臨床結果
Anticancer Res.11:1201,1991。Lopez et al.:養子免疫
療法を考慮した、IFN−γ活性化マクロファージ産生の
ための、ガン患者の白血球搬出法生成物から得た単球の
エルトリエーションによる一段階分離J.Immunotherapy,
11:209,1992。Faradji et al.:非小細胞肺ガン患者にお
ける、ex−vivoにおいて活性化された血液由来マクロフ
ァージの静脈内注入の第Ｉ相試験：毒性及び免疫調節効
果Cancer Immunol.Immunother.33:319,1991）。
軽度の発熱及び寒けなど、軽微な副作用はあったが、
その臨床的耐性は優れていた。最大耐性投与量は、一回
の血球アフェレーシスから生成されたMAKの数が限られ
ているために、求めることはできなかった。
従って、より多量のMAKを得ることが、臨床試験及び
療法において、最適な抗腫瘍効力を確認するために、求
められている。
通常の培地中で従来このようにして調製されてきたマ
クロファージは、約40％未満の収量で、得られる。
しかし、in vivoにおける有効性を高め、そして次回
のマクロファージ投与を遅らせるために、より高い細胞
障害活性を示すマクロファージが求められている。
発明の開示 本発明の目的の一つは、標準的なマクロファージを超
える、より高い細胞障害活性を有するマクロファージを
提供することである。
本発明の別の目的は、細胞障害活性の不活性化の速度
が、標準的マクロファージと比較して、より緩徐である
マクロファージを、提供することである。
本発明の更に別の目的は、標準的マクロファージと比
較して、改良された細胞障害活性を有し、その細胞障害
活性の不活性化速度がより緩徐である、マクロファージ
の調製を可能とする新規培地を提供することである。
本発明の目的は、以下の特性のうち少なくとも１つを
有するマクロファージにより達成される。
− IFN−γによる活性化を受けない状態での細胞障害
活性が、標準的マクロファージと比較して、約20〜30％
増強されており、そして好ましくは約70％である； − IFN−γによる活性化により、その細胞障害活性
が、標準的なマクロファージと比較して、約20〜約40％
増強されており、そして好ましくは約93％である； − IFN−γの活性化に応答する、細胞障害活性の不活
性化時間の延長が、IFN−γによる活性化の60時間後で
は、細胞障害活性が、IFN−γにより活性化された後の
マクロファージの示す最大細胞障害活性と比べて、その
30％又はそれ以上であり、好ましくは約55％であるよう
な割合である（該細胞障害活性は、標的腫瘍細胞、詳細
にはU937細胞による3Hチミジン取り込みの阻害のパーセ
ントとして測定する） 「標準的マクロファージ」との用語は、実施例の箇所
で定義するような標準培地中での単球の培養により得ら
れるものに相当する。
「細胞障害活性」は、標的腫瘍細胞、詳細にはU937細
胞による3Hチミジン取り込みの阻害のパーセントとして
測定するものであり、その測定のための試験について
は、以下に述べる： 分化したマクロファージを、0.2ml中、１ウエル当り1
04個の割合で、96ウエルのフラットマイクロタイタープ
レートに接種した。CO25％を含む加湿大気中、37℃で２
時間培養後、培地を除去し、rhuIFN−γ 250U/mlを含
有するか、又は含有しないIMDM＋５％ヒトAB血清と置換
し；プレートを更に一夜培養した。洗浄後、各ウエル
に、新しい培地（IMDM＋10％FCS）0.2ml中のU937腫瘍細
胞104個を加えた。24時間接触させた後、0.1μCiのトリ
チウム含有チミジンを、各ウエルに加え、更に24時間培
養した。
細胞を集め、ファイバーグラスフィルターを用い、取
り込まれた放射活性物質の測定を、β線を計数すること
によって行った。腫瘍細胞のチミジン取り込みの阻害パ
ーセントは、式： （式中、cpmT＝対照の腫瘍細胞中の放射活性 cpmTM＝腫瘍細胞＋マクロファージ混合培地中の放射活
性）に従って、計算することができた。
このような方法により、本発明記載のマクロファージ
の抗腫瘍活性の主要な３つの型、つまり細胞溶解、細胞
停止及び食作用を調べることができることは注目すべき
ことである。
マクロファージはヒト被験者由来のものであって、健
康な者、又は各種疾患に罹患している患者、のいずれか
ら由来したものでもよい。
例として、健康な被験者の単球の培養物に由来する標
準的マクロファージの、本来の細胞障害活性（つまりIF
N−γによる活性化は受けていない）は、約45％である
が、本発明マクロファージの場合では、約70％であり、
そしてIFN−γによる活性化後は、標準的マクロファー
ジの細胞障害活性は、約76％である一方、本発明のマク
ロファージの場合は、約93％である。
細胞障害活性の同様の増強が、患者より得られたマク
ロファージについても、得られる。
不活性化時間の動力学については、以降に記載する表
Ｉに、標準的マクロファージ及び本発明のマクロファー
ジの場合の、上述した活性測定に関する結果を要約す
る。
上述の特性により、該細胞障害活性から本発明のマク
ロファージの有利さを考慮すると、活性が50％以下であ
る場合には、治療においては有用でないと考えられる。
本発明マクロファージは、３日又は４日ごとの投与で
はなく、週１回の投与を可能にするものである。
好ましい実施態様によると、本発明のマクロファージ
は、以下の特徴： − その大きさが、約10〜約20μｍである； − プラスチック表面に付着する； − 生存率は、好ましくは約70％以上である； − 食作用特性を示す； − その表面に、CD64、CD68、MAX1、HLADRなどの分化
抗原を有する； − その細胞障害活性が、約50％以上である； − 本発明マクロファージは、好都合には、細菌及び生
物学的夾雑物を含まない； を有する。
マクロファージの大きさが、20μｍ以上である場合
は、相互に融合して、その役割が明確には理解されてい
ない巨大細胞を形成する傾向にあることを、意味する；
大きさが、10μｍ以下である場合は、マクロファージ
が、十分には分化していないことを、意味する。
その大きさは、チャンネライサー（Channelyser:Coul
ter Margency、フランス）により、測定することができ
る。
プラスチック表面に対する付着性は、産生されたマク
ロファージを30分間培養後、ペトリ皿を用いて確認する
ことができる（付着％）。
生存率は、培養終了時の生存細胞数であり、この生存
率は、好ましくは約70％以上であり、トリパンブルー排
除により測定する。
食作用性は、Stevenson and Fauciが、Manual of Mac
rophages methodology;Marcel Dekker,N.Y.pp.75−80,1
981に記載したように、ラテックスビーズ又はデキスト
ラン粒子の摂取により、確認することができる。
CD64、CD68、MAX1、HLADRなどの表面分化抗原は、標
準的マクロファージと比較して、同様又は高レベルで、
発現される；これは、フローサイトメトリーにより測定
することができる。以降に記載する表IIには、異なる条
件下で得られた表現型の結果を示す。
この表から、本発明のマクロファージは、新しい特性
を有するが、マクロファージの主な機能は、細胞障害活
性の増加を除いて、変わっていないと結論することがで
きる。
しかし、トランスフェリン受容体であるCD71は、ビタ
ミンD3＋GM−CSF（顆粒球マクロファージコロニー刺激
因子）の存在下では低下し、これは、マクロファージの
活性化亢進状態と相関する。CD71の発現は、実施例の箇
所に記載したように、求める。
細胞障害活性は、U937細胞について測定し、マクロフ
ァージとU937の比率は、1/1とする。
本発明のマクロファージは、好都合には、ウイルス、
細菌、真菌及び生物学的夾雑物を含まない。
本発明は、また、上記において定義したようなマクロ
ファージを調製する方法であって、1,25−ジヒドロキシ
ビタミンD3及びGM−CSFを含有する培地中で、単球を培
養することからなる方法に関する。
より詳細には、本発明の方法は、単球及びリンパ球の
両方を、1,25−ジヒドロキシビタミンD3及びGM−CSFを
含有する培地中、分化マクロファージを得るのに十分な
時間、好ましくは約６〜７日間、培養し、可能であれ
ば、単球より得られるマクロファージ、及びリンパ球
を、IFN−γにより活性化し、そしてIFN−γによる活性
化の前又は後、好ましくはIFN−γによる活性化の後
に、リンパ球とマクロファージを分離して、マクロファ
ージを回収することからなる。
好ましい実施態様によると、本発明の方法は、以下の
工程： − 健康な被験者又はガン患者の血液から、血球アフェ
レーシスにより、白血球を単離して、血球アフェレーシ
ス生成物（つまり濃縮白血球）を得、 − 例えば血球アフェレーシス生成物の遠心分離によ
り、血小板を除去して、白血球を豊富に含む生成物を
得、 − 白血球を豊富に含む生成物中、単核細胞を一方に、
及び夾雑物である赤血球及び顆粒球をもう一方に分離
し、 − 単核細胞（単球＋リンパ球）を、1,25−ジヒドロキ
シビタミンD3及びGM−CSFを含有する培地中で、約６〜
７時間培養して、分化マクロファージを得、 − 該マクロファージ及びリンパ球を、IFN−γによ
り、約16時間〜約24時間活性化し、 − 活性化されたマクロファージを、リンパ球から、例
えばエルトリエーション（水簸:elutriation）により分
離する、 からなる。
リンパ球は、単球類から、培養工程前に分離してもよ
い。
リンパ球は、培養後及びIFN−γによる活性化前に、
マクロファージと分離してもよい。好都合には、マクロ
ファージとリンパ球は、IFN−γによる活性化後に、互
いに分離する。
本発明の方法においては、ビタミンD3を、10-10〜約1
0-7、好ましくは約10-8Mの濃度で使用する。
本発明の方法においては、GM−CSFを、約50〜約1000U
/ml、特に約100〜約500U/mlの濃度で使用する。
本発明の方法においては、培地は、RPMI、IMDM、MEM
又はDMEMである。
これらの培地は、市販されており、入手可能である。
好都合には、培地は、インドメタシン（又は別のシク
ロ−オキシゲナーゼ阻害剤）及び／又はシメチジン（ヒ
スタミンH2アンタゴニスト）を含有する。
本発明のマクロファージを調製する好都合な方法は、
以下のとおりである： 血球アフェレーシス Cobe2997又はDideco Vivacell持続フロー血球分離装
置を用い、血球アフェレーシスにより、健康な被験者又
はガン患者より得た末梢血から、白血球を単離する。夾
雑した血小板を減少させるために、血球アフェレーシス
生成物を、280gで10分間遠心分離する。血小板を豊富に
含む血漿を除去し、白血球ペレットを、グルコース0.1
％、PO3HNa2・2H2O 0.17％、PO3H2Na 0.27％、NH4Cl
0.14％、NaCl 0.78％を含有するリン酸緩衝液（PB
S）中（solution TS745、laboratoire Bruneau、Franc
e）に再懸濁する。
白血球を豊富に含む得られたペレットは、白血球を平
均（７〜９）×109個含有する（単核細胞を50％含
む）。
単核細胞の単離 COBE2991又は比重1.077のFicoll Paque（Pharmacia）
を用いたStericell細胞処理装置を用いて、1000gで15分
間遠心分離することによって、ヒト単核細胞を、赤血球
及び夾雑物である顆粒球から分離する。リン酸緩衝食塩
水（カルシウム及びマグネシウムを含まない）中、３回
洗浄後、チャンネライサー分析（Coulter Margency、Fr
ance）により示されるように、純度約50％で単球が得ら
れる。
培養 単核細胞を、テフロン又はポリプロピレン製疎水性バ
ッグ（Dupont−J.BIO、life cell−Travenol stericell
−TERUMO）中、37℃で、５％CO2及び95％加湿大気中、
７日間培養することによって、分化ヒトマクロファージ
を得る。全単核細胞を、Iscove修飾培地（IMDM、Gibc
o）又は同等の、ペニシリン（100UI/ml）、ストレプト
マイシン（100μg/ml）、Ｌ−グルタミン（2mM、Gibc
o）、ピルビン酸（2mM、Gibco）、インドメタシン（５
×10-6M、Sigma）、シメチジン（10-6〜10-9M）、メル
カプトエタノール（３×10-5M、Gibco）、非必須アミノ
酸（１％、Gibco）、及び自己由来又はAB血清２〜５％
を補給した培地中、5x106個/mlの割合で接種する。GM−
CSF（500U/ml、Shering）及び／又は1,25−ジヒドロキ
シビタミンD3（コレカルシフェロール10-8M、Roche、Ba
sel、Swiss）を、比較実験において添加した。
マクロファージの細胞障害性の活性化は、IFN−γ（B
oehringer、Ingelheim、FRG）250U/mlの存在下で、更に
16〜18時間培養することによって行った。
エルトリエーション ７日間の培養及び活性化後に得られる分化マクロファ
ージを、550gで10分間遠心分離し、ペレットを、グルコ
ース0.1％、PO3HNa2・2H2O 0.17％、PO3H2Na 0.27
％、NH4Cl 0.14％、NaCl 0.78％を含有し、２％ヒト
血清アルブミン（HSA、CNTS−France）を添加したリン
酸緩衝食塩水（solution TS745、laboratoire Brunea
u、France）に再懸濁する。
次に細胞を、Andreesen et al.（Cancer Res.,50,199
0）により記載されたようなJ5.0ローター及び40mlのエ
ルトリエーションチャンバーを装備したBeckmann J6 ME
遠心分離機を用いて、エルトリエーションに付す。
分化マクロファージを、一定のローター速度で、流速
を増大させながら、集める。
本発明の方法により、約40％以上、そして好ましくは
約76％の収率で、マクロファージを得ることができる
が、この収率は、得られた生存しているマクロファージ
と出発時の単球の比率である。この収率は、細胞計数及
びチャンネライサーにより求めることができる。
好ましい実施態様によると、本発明の方法は、死んだ
腫瘍細胞を、単球と同時に培地中に加えるものであり、
両細胞とも、好ましくは、同一患者由来のものであり、
その比率は、好ましくは、1ml当り、死んだ腫瘍細胞約1
00万個であり、該死んだ腫瘍細胞は、マクロファージと
同時に処理される。
死んだ腫瘍細胞は、次に、白血球と同時に、約１×10
6/mlの量で、処理することができ、IFN−γによる活性
化後又は前、そして好ましくはIFN−γによる活性化後
に、例えばリンパ球と同時に、マクロファージから分離
することができる。
本方法により、腫瘍に対して特異的であり、これらの
特異的腫瘍細胞を、in vivoにおいて非常に効率よく殺
すマクロファージ及びリンパ球を得ることができる。
本発明は、また、上記において定義した方法により得
られるマクロファージに関する。
本発明は、また、上記において定義したマクロファー
ジを、活性物質として含有する医薬組成物に関する。
本発明は、また、単球が、成長及び分化して、本発明
のマクロファージとなるために必要である成分、並びに
ビタミンD3及びGM−CSFを含有する培地に関する。
本発明のマクロファージは： − 夾雑物を含まないリンパ球及び単球の回収のための
手段； − 適切な緩衝液及び洗浄液、そして可能であればマク
ロファージの保存に適切である手段； − 1,25−ジヒドロキシビタミンD3及びGM−CSFを含有
する、単球及び可能であればリンパ球のための培地を調
製する手段；及び − 可能であればIFN−γ； を含むキットの一部であることができる。
本発明の好都合な実施態様によると、本キットは、以
下： − 血液を回収及び遠心分離して、白血球濃縮物を得る
ための手段； − リンパ球及び単球を、その他の白血球細胞から分離
し、そして夾雑物である赤血球細胞を除去するための手
段； − 補助成分、特に1,25−ジヒドロキシビタミンD3及び
GM−CSF、並びに可能であればインドメタシン及び／又
はシチメジンを含む、マクロファージ及び可能であれば
リンパ球用の培地； − リンパ球をマクロファージから分離するための手
段； − マクロファージ保存のための適切な手段； − 適切な緩衝液及び洗浄液； − 可能であればIFN−γ； を含むものである。
実施例として、好都合なキットは、以下の要素： １−血球アフェレーシスキット（Fenwal）、 ２−移送バッグ（R 20−21−Fenwal）、 ３−Ficollグラジエント（グラジエント／洗浄処理装置
セット、Stericell−Terumo）又は血球処理装置（Cobe
912−647−819）による遠心分離キット、 ４−エルトリエーションキット（Macopharma） ５−移送パックユニット2L（Travenol−4R2041）、 ６−細胞培養用疎水性バッグ（Teflon,J.BIO−lifecel
l、Tranvenol−Stericell、Terumo）、 ７−インジェクションバッグ（Travenol）、 ８−リン酸緩衝食塩水（solution TS745 Laboratoires
Bruneau）、 ９−Ficoll−Paque（Pharmacia）、 10−ヒトアルブミン溶液（Biotransfusion）、 11−培地（IMDM−Gibco） 12−ペニシリン／ストレプトマイシン（Gibco）、 13−Ｌ−グルタミン（Gibco）、 14−非必須アミノ酸（Gibco）、 15−ピルビン酸（Gibco）、 16−インドメタシン（Sigma）、 17−メルカプトエタノール（Gibco）、 18−GM−CSF（Shering）、 19−1,25−ジヒドロキシビタミンD3（Roche、Basel、Sw
iss） 20−IFN−γバイアル（Boehringer） からなる。
本発明は、また、本発明によるマクロファージ、及び
リンパ球を含有する、養子免疫療法における同時、個別
又は連続的使用のための組み合わせ製剤としての製品に
関する。
好都合な実施態様によると、上記において定義した本
発明生成物は、マクロファージ及びリンパ球を、細胞数
で表して、少なくとも1/3〜2/3の比率で含有することを
特徴とする。
この実施態様においては、マクロファージ及びリンパ
球の両方を、患者に注射する。これは： − エルトリエーションの工程を省略して、マクロファ
ージ及びリンパ球を ＊ INF−γによる活性化後注射するか； ＊ 若しくはIFN−γ及びIL−２による同時活性化の後
に注射するか、又は − マクロファージ類を、培養後、しかし活性化前に互
いに分離し、マクロファージをその後にIFN−γにより
活性化し、リンパ球をその後にIL−２により活性化する
こと； を意味するものである。
本発明は、また、本発明のマクロファージの抗原、及
び該マクロファージにより標的とされる腫瘍細胞の抗原
を認識することのできる二重特異的抗体に関する。
二重特異的抗体は、Chokri et al.Res.Immunol.143
（1992）に記載されているように調製することができ
る。
二重特異的抗体は、また、本発明のマクロファージと
同時に注射することができ、又は注射前にマクロファー
ジと共に前培養することができる。
本発明は、また、ガンを治療するための方法であっ
て、本発明のマクロファージの適量、好ましくはマクロ
ファージ約２×109〜約５×109個を、投与することから
なる方法に関する。
本発明によるガン治療のための方法は、リンパ球約４
×109〜約10×109個を投与することからなる。
本発明のマクロファージは、また、核酸及び／又は薬
物のベクターとして使用することもできる。従って本発
明は、外来性核酸及び／又は薬物を含有するマクロファ
ージを含む。
外来性核酸を含有するマクロファージについては、マ
クロファージを調製する。トランスフェクションによ
り、サイトカイン若しくは欠損タンパク質、又は腫瘍抗
原をコードするDNAを、マクロファージ内に組み込み、
患者への注射前に、それがマクロファージに発現されて
いるかどうかを確認する。
マクロファージの生存期間が長いため、組み込まれた
タンパク質遺伝子のin vivoにおける発現が可能であ
る。
図面の説明 図１は、本発明のマクロファージの産生図を示す。
健康な被験者又は患者から採取した末梢血を、血球ア
フェレーシスに付し（Ｉ）、それにより血球アフェレー
シス生成物を得る。
該血球アフェレーシス生成物を、Ficollにより遠心分
離し、洗浄して（II）、単核細胞（単球＋リンパ球）を
得る。
該単核細胞を、ここに定義するような、健康な被験者
又は患者より採取した自己由来の血清を含有する適切な
培地中で培養する（III）。
単核細胞の培養により、細胞懸濁液を得、これを、活
性化し（IV）、活性化後に、エルトリエーション（Ｖ）
の工程を行い、それにより本発明のマクロファージを
得、次にこれを、患者又は健康な被験者に再注射する。
それぞれの工程に使用する材料は、以下のとおりであ
る： （Ｉ） :血球アフェレーシス用バッグ :ACD溶液 :カルシパリン :緩衝食塩水 （II） :血球処理装置−処理セット :Ficoll−Paque :移送バッグ （III） :培養バッグ :Iscove変性ダルベッコ培地 :L−グルタミン :非必須アミノ酸 :ピルビン酸 :GM−CSF :ジヒドロキシビタミンD3 :β−メルカプトエタノール :ストレプトマイシン :インドメタシン :CO2 （IV） :インターフェロン−γ （Ｖ） :ヒトアルブミン溶液 :注射バッグ 実施例 Ｉ）材料及び方法 単核細胞の単離 正常血小板を有する被験者より得た白血球を、（COBE
2997又はDideco Vivacell連続的細胞分離機を用いて）
末梢血液の血球アフェレーシスにより単離した。輸血用
血小板を集めた後、濃縮白血球であるアフェレーシス残
渣を、再懸濁した。ヒト単核細胞を、比重1.077のFicol
l Paque（Phamacia）を用いたCOBE 2921細胞処理装置に
より、1000gで15分間遠心分離することによって集め
た。カルシウム及びマグネシウムを含まないリン酸緩衝
食塩水中で３回洗浄後、チャンネライサー分析（Coulte
r Margency、France）に示されるように、単球含有率30
〜50％の単核細胞を得た。
培養 単核細胞を、テフロンバッグ（Dupont−J.BIO,Les Ul
is）中、37℃で、５％CO2、95％加湿大気中、７日間培
養することによって、分化ヒトマクロファージを得た。
ペニシリン（100u.i./ml）、ストレプトマイシン（100
μg/ml）、Ｌ−グルタミン（2mM、Gibco）、ピルビン酸
（2mM、Gibco）、インドメタシン（５×10-6M、Sigm
a）、メルカプトエタノール（３×10-5M、Gibco）、非
必須アミノ酸（２％、Gibco）及び５％AB血清を補給し
たIscove変性ダルベッコ培地（IMDM、Gibco）中に、単
核細胞全部を、1ml当り５×106個の割合で接種した。こ
の培地は、上記において既に述べたような「標準マクロ
ファージ」を得ることを可能にする標準培地と定義す
る。GM−CSF（500U/ml、Behring）及び／又は1,25−ジ
ヒドロキシ−ビタミンD3（コレカルシフェロール10
-8M、Roche、Basel、スイス）は、比較実験において添
加した。マクロファージの細胞障害活性の活性化は、IF
N−γ（Boehringer、Ingelheim、FRG）250U/mlの存在下
で更に18時間培養することによって行った。培地及び細
胞製剤は、LPSを、1ml当り0.02i.u.以下含んでいた。
エルトリエーション ７日間の培養及び活性化後に得られた単核細胞又は分
化マクロファージを、550gで遠心分離し、得られたペレ
ットを、グルコース0.1％、PO3HNa2・2H2O 0.17％、PO
3H2Na 0.27％、NH4Cl 0.14％、NaCl 0.7％（solutio
n TS745 Laboratoire Bruneau,92,France）を含有し、
ヒト血清アルブミン２％（HSA、CNTS−France）を含む
リン酸緩衝食塩水中に、再懸濁した。細胞を、次に、Lo
pez et alにより既に記載されているようにエルトリエ
ーションに付した（養子免疫療法のための、IFN−γ活
性化マクロファージ産生のための、ガン患者由来の白血
球搬出生成物より得た単球の、エルトリエーションによ
る一工程分離。J.Immunotherapy,11:209,1992）。「ロ
ーターオフ」分画として採取される、分化マクロファー
ジのために用いたエルトリエーション法は、Andreesen
により記載された、一定のローター速度で、流速を増加
させる方法である（Andreesen et al.、循環単球由来の
in vitroにおいて生成された腫瘍細胞障害性マクロファ
ージの養子移入：ガン免疫療法への新たなアプローチ。
Cancer Res.50:7450,1990）。
フローサイトメトリー マクロファージ集団の表現型の分析を、タンパク質に
対するネズミモノクローナル抗体を用いたフローサイト
メトリーにより行い、FITC複合体により検出した。CD
3、CD14、CD71抗体は、DAKO（Versailles,France）よ
り、抗HLADR抗体は、COULTER（Margency,France）より
得、抗CD64（CNTS,France）、及び分化マクロファージ
の膜抗原を認識するMax−１抗体（Andressen et al.,ヒ
ト単球のマクロファージへの分化に関する表面表現型分
析、J.Leuk.Biol.47:490,1990）は、Dr.Emmrich（Erlan
gen,Germany）から贈与されたものである。要約する
と、0.2％ウシ血清アルブミンのリン酸緩衝食塩水中、
細胞５×105〜106個を、FITC標識した、若しくは非標識
のモノクローナル抗体又はアイソタイプ免疫グロブリン
コントロールの存在下、氷上で30分間保った。洗浄後、
間接的蛍光抗体法のために、細胞を更に、FITC結合Ｆ
（ab′）２ヤギ抗ネズミIgG（Immunotech.）に、氷上、
25分間曝した。洗浄後、細胞を、フローサイトメトリー
（EPICS Profile、Coulter）により分析した。獲得ゲー
ト（acquisition gate）は、大きな細胞の主要集団周辺
に設定した。
腫瘍標的 ヒト組織球細胞系U937を、ウシ胎児血清（FCS,Gibc
o）10％を含むIMDM中で培養した持続系として、懸濁液
中に保持し、細胞障害性試験における標的として、指数
増殖の間使用した。
In vitro抗腫瘍性試験 分化マクロファージを、96ウエルのフラットマイクロ
タイタープレートに、１ウエル当り0.2ml中、104個の割
合で接種した。37℃で、CO25％を含む加湿大気中、２時
間培養後、培地を除去し、rhu IFN−γ250U/mlを含有す
るか、又は含有しないIMDM＋５％ヒトAB血清と置換し；
プレートを更に一夜培養した。洗浄後、新しい培地（IM
DM＋10％FCS）0.2mlに含有させたU937腫瘍細胞104個
を、それぞれのウエルに加えた。24時間の接触後、0.1
μCiのトリチウム処理チミジンをそれぞれのウエルに加
えて、更に24時間培養した。
細胞を集め、ファイバーグラスフィルター上で、取り
込まれた放射活性の測定を、β線を計数することによっ
て行った。腫瘍細胞によるチミジン取り込みの阻害パー
セントは、式： （式中、cpmT＝対照の腫瘍細胞中の放射活性 cpmTM＝腫瘍細胞＋マクロファージ混合培養物中の放射
活性）により算出した。
II）結果 単核細胞の７日間の分化後の、マクロファージの形態変
化を伴う巨大細胞の回収 １週間培養後の単核細胞の回収率は、GM−CSF又は（O
H）２ビタミンD3の添加による変性を、顕著には受けて
いなかった。対照的に、マクロファージの形態変化を伴
う巨大細胞の量は、GM−CSFの存在下で、著しく増大し
ていた（表III）。GM−CSFの添加により、マクロファー
ジの回収率が、有意に（ｐ＜0.001）増大した（12種類
の異なる培養標本の結果）。（OH）２ビタミンD3を培地
に添加しても、マクロファージの量は、増加しなかっ
た；しかし、GM−CSF＋ビタミンD3の組み合わせによ
り、再現可能な高収率で、マクロファージが得られた
（表III）。
表IIIは、収率及び細胞障害活性に関して得られた結
果をまとめて示すものであり；最後の欄は、本発明のマ
クロファージに対応する。
GM−CSF及び（OH）２ビタミンD3の存在下又は非存在
下において産生されるMAKの表現型。
７日間にわたる培養及びIFN−γによる活性化によ
り、特異的分化抗原（Max−１、CD64、HLA−DR）の主な
発現により示されるように、単核細胞を、マクロファー
ジに十分に分化させた（表II）。GM−CSF又はGM−CSF＋
（OH）２ビタミンD3の存在下で減少した（ｐ＜0.05）ト
ランスフェリン受容体（CD71）の発現以外は、抗原の表
現型に変化は観察されなかった。CD71のこの低下は、巨
大分化細胞と関連して観察された。直接的及び間接的蛍
光に用いた、対照非関連Igは、巨大細胞のそれぞれ５％
未満及び10％未満を標識した。
以降に記載する表IIは、各種条件下で得られたマクロ
ファージの表現型に関する結果をまとめて示すものであ
り；最後の欄は、本発明のマクロファージに対応する。
マクロファージの機能：抗腫瘍活性 培地中で分化したマクロファージは、IFN−γに曝さ
れない場合には（OH）２ビタミンD3＋GM−CSFの存在下
で産生されたマクロファージがU937細胞の増殖を自発的
に阻害した以外は、高度な自発的抗腫瘍活性を示さなか
った。IFN−γによる18時間の活性化後、MAK細胞は、異
なる培養条件下で、in vitroにおいて抗腫瘍作用を有す
るようになった。ビタミンD3＋GM−CSFの存在下で分化
させたマクロファージについては、高度な抗腫瘍活性
が、より再現可能に得られた（表III）。
IFN−γによるマクロファージ活性化の動力学 標準的条件下で分化させたマクロファージは、IFN−
γ250U/mlとの接触18時間後に、抗腫瘍能を呈するよう
に活性化された；この抗腫瘍活性は、時間と共に緩やか
に低下して、３〜４日後に対照値に達した。これらのマ
クロファージは、250U/mlのIFN−γに再び曝すことによ
って、高度の抗腫瘍活性を示すまで、十分に再活性化す
ることができた。
GM−CSF＋（OH）２ビタミンD3の存在下で分化させた
マクロファージは、対照群よりも高い抗腫瘍活性を示し
た;IFN−γ250U/mlによる活性化後、培地中２−３日後
経過しても、マクロファージは、その抗腫瘍活性を高レ
ベルに保持していた。活性化60時間後でさえも、U937腫
瘍細胞によるチミジン取り込みの阻害は、マクロファー
ジについて28±３％であったのに比して、GM−CSFと（O
H）２ビタミンD3に曝したマクロファージについては、5
4±２％であった（ｐ＜0.01、３回の実験の平均）。こ
のように培養したマクロファージを、rhIFN−γ250U/ml
に新たに曝すことによって、抗腫瘍効果が、エフェクタ
ー／腫瘍比1/1において、U937細胞によるチミジン取り
込みが80％以上阻害されるまで増大した（３種類の異な
る実験の平均値）。
以下に記載する表Ｉには、動力学と関連した結果をま
とめて示し、標準的マクロファージ及び本発明のマクロ
ファージを比較した。
示した結果は、３回の実験の平均である。
この表においては、 ０時間では、IFN−γによる活性化は認められない； 18時間:IFN−γによる活性化の開始から18時間後、す
なわち活性化の終了時に相当する；マクロファージは、
IFN−γの影響下にはない； 40時間:IFN−γによる活性化開始後40時間； 65時間:IFN−γによる活性化開始後65時間。
IFN−γによる活性化の後に、最大の細胞障害活性が
得られ、これは約16時間から約24時間の間持続すること
が認められた。
フロントページの続き (72)発明者 バルトラン，ジャック フランス国、エフ―91440 ビュレ―シ ュール―イベット、リュー・ロクイヨー ム、10 (56)参考文献 Ｒｅｓ．ｌｍｍｕｎｏｌ．，143 （１），95−99（1992) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 5/00 - 5/28 A61K 34/14 - 35/18 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (12)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】以下の特性： − IFN−γの非存在下での細胞障害活性が、標準的マ
    クロファージと比較して、約20〜30％増強され、そして
    71％±５％である； − IFN−γの存在下での細胞障害活性が、標準的なマ
    クロファージと比較して、約20〜約40％増強され、そし
    て54％±２％から93％±２％である； − IFN−γの活性化に応答する、細胞障害活性が不活
    性化されるまでの時間の延長が、IFN−γによる活性化
    の60時間後に、マクロファージの細胞障害活性が、IFN
    −γによる活性化に起因してそれが示す最大細胞障害活
    性と比べて、その30％から約55％であるような比率であ
    る（該細胞障害活性は、標的腫瘍U937細胞による3Hチミ
    ジン取り込み阻害のパーセントとして測定する）； の少なくとも一つを有するマクロファージ。
  2. 【請求項２】以下の特徴： − その大きさが、約10〜約20μｍである； − プラスチック表面に付着する； − 食作用特性を示す； − その表面に、CD64、CD68、MAX1、HLADRの分化抗原
    を有する；及び − その細胞障害活性が、50％以上である； を有する請求項１記載のマクロファージ。
  3. 【請求項３】活性物質として、請求項１または２記載の
    マクロファージを含有する、医薬組成物。
  4. 【請求項４】− 夾雑物を含まないリンパ球及び単球の
    回収のための手段； − 適切な緩衝液及び洗浄液； − 単球のための、1,25−ジヒドロキシビタミンD3及び
    GM−CSFを含有する培地を調製する手段； を含有するキット。
  5. 【請求項５】− 夾雑物を含まないリンパ球及び単球の
    回収のための手段； − 適切な緩衝液及び洗浄液、並びにマクロファージの
    保存に適切である手段； − 単球のための、1,25−ジヒドロキシビタミンD3及び
    GM−CSFを含有する培地を調製する手段； − IFN−γ を含有するキット。
  6. 【請求項６】− 血液を回収及び遠心分離して、白血球
    濃縮物を得るための手段； − リンパ球及び単球を、その他の白血球細胞から分離
    し、そして夾雑物である赤血球細胞を除去するための手
    段； − 1,25−ジヒドロキシビタミンD3及びGM−CSFを含
    む、マクロファージ及びリンパ球のための培地； − リンパ球をマクロファージから分離するための手
    段； − マクロファージ保存のための適切な手段； − 適切な緩衝液及び洗浄液； を含有するキット。
  7. 【請求項７】− 血液を回収及び遠心分離して、白血球
    濃縮物を得るための手段； − リンパ球及び単球を、その他の白血球細胞から分離
    し、そして夾雑物である赤血球細胞を除去するための手
    段； − 1,25−ジヒドロキシビタミンD3及びGM−CSFを含
    む、マクロファージ及びリンパ球のための培地； − リンパ球をマクロファージから分離するための手
    段； − マクロファージ保存のための適切な手段； − 適切な緩衝液及び洗浄液； − FIN−γ； を含有するキット。
  8. 【請求項８】細胞停止療法において、同時に、個別に又
    は連続して使用するための組み合わせ製剤としての、請
    求項１または２記載のマクロファージ、及びリンパ球を
    含有する製品。
  9. 【請求項９】マクロファージ及びリンパ球を、細胞数で
    表わして、1/3〜2/3の比率で含有することを特徴とする
    請求項８記載の製品。
  10. 【請求項１０】請求項１又は２記載のマクロファージ約
    ２×109〜約５×109個を含むガン治療用組成物。
  11. 【請求項１１】リンパ球約４×109〜約10×109個を含む
    請求項10記載のガン治療用組成物。
  12. 【請求項１２】外来性核酸及び／又は薬物を含有する請
    求項１又は２記載のマクロファージ。
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