JP2002514408A - 新規アポトーシス小体、それを含有する単球由来細胞、それらの調製方法、及びワクチンとしてのそれらの使用 - Google Patents

新規アポトーシス小体、それを含有する単球由来細胞、それらの調製方法、及びワクチンとしてのそれらの使用

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JP2002514408A
JP2002514408A JP2000548437A JP2000548437A JP2002514408A JP 2002514408 A JP2002514408 A JP 2002514408A JP 2000548437 A JP2000548437 A JP 2000548437A JP 2000548437 A JP2000548437 A JP 2000548437A JP 2002514408 A JP2002514408 A JP 2002514408A
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tumor
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apoptotic bodies
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グレゴワル，マール
バルトラン，ジャック
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I.D.M.IMMUNO−DESIGNED MOLECULES
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、患者の腫瘍バイオプシーから回収されたヒト腫瘍細胞又は細胞系に由来しそしてアポトーシスを誘導するアポトーシス小体に関し、該アポトーシス小体は下記特徴、すなわち、それらは細胞膜完全性を維持し、それらは約０．１μmを超える小胞であり、それらは腫瘍細胞に起源する無傷のミトコンドリア及び切断された核のＤＮＡを含有し、それらはそれらの膜上にマスクされていない腫瘍抗原を提示し、それらは患者の特異的腫瘍及びＭＨＣ抗原を提示することを有する。本発明は、アポトーシス小体の組み込み後の抗腫瘍ワクチンとして用いるいことができる、新規単球由来細胞を提供もする。アポトーシス小体は、単球由来抗原提示細胞によってファゴサイトーシスされそして処理され、そして免疫系に対する有効な腫瘍抗原提示を可能にする。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、新規なアポトーシス小体、それを含有する単球由来細胞、それらの
調製法及びワクチンとしての使用に関する。
【０００２】 進行したがんにおいて、腫瘍細胞がインビボでは不十分な免疫原であることは
有名である。インビトロでは、免疫系は、腫瘍細胞を認識し死滅させることがで
きる。腫瘍細胞は、黒色腫に関して報告されているように1、Ｔ細胞に対する抗
原を有するが、インビボでは免疫原性を欠く。おそらく、腫瘍抗原は、マスクさ
れているか、特別な細胞により提示されていないか、又は腫瘍環境により抑制さ
れている。専門の抗原提示細胞（ＡＰＣ）4により提示されるペプチド2又は単一
形質移入3抗原からなるワクチンの使用は、特異性の狭さ、及び免疫回避のため
に、抗腫瘍療法において限定された利益をもたらした5,6。別の戦法は、免疫原
性腫瘍に限定されている、未分画の又は分画された腫瘍細胞7,8,9を使用するこ
とである。
【０００３】 プログラム細胞死（ＰＣＤ）は、最も多く見られる真核細胞の死の形態である
。ＰＣＤと同義に使用されることが多い、アポトーシスという用語は、死滅細胞
により示される形態学的変化をいう。壊死とは対照的に、アポトーシスは能動的
な過程である。アポトーシスは、正常な生理学的条件下及び病理学的な生理学的
条件下で起こり、細胞はそれ自身の「細胞自殺」に能動的に参与し、アポトーシ
スを受けている細胞は特徴的な形態学的特性及び生化学的特性を示す。
【０００４】 アポトーシス小体は、それらを特異的かつ迅速にマクロファージによってファ
ゴサイトーシスされるようにする表面マーカー14を発現している。従って、この
過程の重要な結果は、細胞質含有物が細胞間空間に放出されることのないアポト
ーシス小体の消失である。これは、細胞内細胞構成成分による炎症及び自己免疫
の両方を回避する15。
【０００５】 マクロファージは、抗腫瘍応答において主要な役割を果たし、がん細胞に対す
る免疫学的活性化因子により活性化されうる（Adams D.and Hamilton T.:「腫瘍
細胞殺傷のためのマクロファージの活性化：エフェクター・メカニズム及び制御
（Activation of macrophages for tumor cell kill:effector mechanism and r
egulation）」; Heppner & Fulton(eds.),Macrophages and cancer.CRC Press,1
988,p.27; Fidler M.マクロファージ及び転移 がん療法のための生物学的アプ
ローチ（Macrophages and metastasis.A biological approach to cancer thera
py.）Cancer Res.45:4714,1985）。
【０００６】 さらに、エンドサイトーシス、消化及び表面抗原提示の強力な能力を有する、
マクロファージ、又は単球もしくはそれらの前駆細胞に由来するその他の細胞は
、特異的な免疫応答を誘導することができる。このように、それらは、ワクチン
、より具体的には細胞自己ワクチンの調製のための適切な候補となる。
【０００７】 単球由来細胞（ＭＤＣ）は、３７℃、Ｏ2／ＣＯ2雰囲気で５から１０日間の、
非吸着性気体透過性プラスチック・バッグ又はテフロン・バッグにおける血液単
核細胞の培養により得られるような免疫細胞である。それらの培地（ＲＰＭＩ、
ＩＭＤＭ、ＡＩＭＶ（ギブコ（Gibco））又はＸ−ＶＩＶＯ（Biowhittaker））
は、最終的には、特許第ＰＣＴ／ＥＰ９３／０１２３２号、第ＷＯ９４／２６８
７５号又はＥＰ９７／０２７０３、又は下記の文献において定義されるサイトカ
イン又はリガンドを含有する。「自己リンパ球は、培養中の単球の死滅を防止し
、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３及びＭ−ＣＳＦと同様に、それらのマクロファージへ
の分化を促進する（Autologous lymphocytes prevent the death of monocytes
in culture and promote,as do GM-CSF,IL-3 and M-CSF,their differentiation
into macrophages）」（Lopez M.,Martinache Ch.,Canepa S.,Chokri M.,Scott
o F.,Bartholeyns J.; J.of Immunological Methods,159:29-38,1993）；「マク
ロファージを用いた免疫療法：現状及び実施のための重要な要件（Immune thera
py with macrophages:Present status and critical requirements for impleme
ntation）」（Bartholeyns J.,Romet-Lemonne J-L.,Chokri M.,Lopez M.;Immuno
biol.,195:550-562,1996）；「能動的な腫瘍免疫療法のためのＣＤ８３+ヒト血
液樹状細胞のインビトロ作製（In vitro generation of CD83+ human blood den
dritic cells for active tumor immunotherapy）」（Thurnher M.,Papesh C.,R
amoner R.,Gastlt G.and al.;Experimental Hematology,25:235-237,1997）；「
免疫により媒介される腫瘍に対する対抗のためのアジュバントとしての樹状細胞
（Dendritic cells as adjuvants for immune-mediated resistance to tumors
）」（Schuler G.and Steinman R.M.; J.Exp.Med.,186:1183-1187,1997）。これ
らの特許出願及び文献は全て参照のため本明細書に含まれる。
【０００８】 それらは、特に細胞障害性マクロファージを得るため、培養の最後にＩＮＦ−
γにより活性化されうる。それらは、等張溶液中に再懸濁される前に、濃縮され
精製されうる。
【０００９】 単球由来細胞（ＭＤＣ）は、分化の条件に応じて、キラー・マクロファージ、
ファゴサイトーシス細胞、増殖因子及びサイトカインを放出する細胞、又は樹状
細胞のいずれかでありうる。樹状細胞は、例えば、「能動的な腫瘍免疫療法のた
めのＣＤ８３+ヒト血液樹状細胞のインビトロ作製（In vitro generation of CD
83+ human blood dendritic cells for active tumor immunotherapy）」（Thur
nher M.,Papesh C.,Ramoner R.,Gastlt G.and al.;Experimental Hematology,25
:235-237,1997）及び「免疫により媒介される腫瘍に対する対抗のためのアジュ
バントとしての樹状細胞（Dendritic cells as adjuvants for immune-mediated
resistance to tumors）」（Schuler G.and Steinman R.M.; J.Exp.Med.,186:1
183-1187,1997）及びＥＰ第９７／０２７０３号に記載のようにして得られうる
。
【００１０】 成熟樹状細胞は、免疫応答を始動する極めて強力な抗原提示細胞である。樹状
細胞は、Ｔ細胞増殖の誘導及びそれらの表現型（膜上のＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｃ
Ｄ８３、ＭＨＣ−Ｉ、ＭＨＣ−IIの存在）によっても特徴づけられうる。
【００１１】 本発明の目的の一つは、抗腫瘍ワクチンとして使用されうる新規なアポトーシ
ス小体を提供することである。
【００１２】 本発明のもう一つの目的は、アポトーシス小体の取り込み後に抗腫瘍ワクチン
として使用されうる新規な単球由来細胞を提供することである。
【００１３】 本発明の目的の一つは、改良された免疫原性を有することができる抗腫瘍ワク
チンを提供することである。
【００１４】 本発明のもう一つの目的は、特定の患者にとって特異的であり、従ってより効
率的である潜在的な抗腫瘍ワクチンを提供することである。
【００１５】 本発明は、下記の特徴、すなわち、 −それらが、原形質膜完全性を維持し、 −それらが、約０．１μm超、特に約０．５μm超の小胞であり、 −それらが、無傷のミトコンドリア及び腫瘍細胞に起源する切断された核のＤＮ
Ａを含有し、 −それらが、マスクされていない腫瘍抗原を提示し、 −それらが、患者の特異的な腫瘍抗原及びＭＨＣ抗原を提示すること を有する、患者の腫瘍バイオプシーから回収され、アポトーシスを誘導されたヒ
ト腫瘍細胞から単離されたアポトーシス小体に関する。
【００１６】 本発明は、以下の特徴、すなわち、 −それらが、細胞膜完全性を維持し、 −それらが、約０．５μmから約５μmの小胞であり、 −それらが、無傷のミトコンドリア及び腫瘍細胞に起源する切断された核のＤＮ
Ａを含有し、 −それらが、マスクされていない腫瘍抗原を膜上に提示し、 −それらが、患者の特異的な腫瘍抗原及びＭＨＣ抗原を提示すること を有する、患者の腫瘍バイオプシーから回収され、アポトーシスを誘導されたヒ
ト腫瘍細胞から単離されたアポトーシス小体に関する。
【００１７】 アポトーシス腫瘍細胞は、免疫系により認識される有効な抗原を提供する。本
発明において、アポトーシス細胞は、壊死腫瘍抽出物よりも免疫原性が高いこと
が示されている。アポトーシス小体由来細胞は、単球由来抗原提示細胞によりフ
ァゴサイトーシスされ、免疫系への有効な腫瘍抗原提示を可能にする（図１）。
【００１８】 がん細胞に起源するアポトーシス小体におけるマスクされていない抗原性物質
のプロセシング及び提示は、腫瘍に対する特異的な細胞性免疫応答及び体液性免
疫応答を増強するための抗がん免疫療法における新規な機会を提供する。
【００１９】 「アポトーシス小体」という表現は、アポトーシスを誘導された腫瘍に起源す
るミトコンドリア及びフラグメント化された核のＤＮＡを、無傷の膜内に含有す
る細胞フラグメント化小体をいう。
【００２０】 アポトーシス細胞は、特徴的な形態学的特性及び生化学的特性に従い、壊死細
胞（その他の死滅細胞）と区別されうる。アポトーシスは、細胞の萎縮、細胞核
、細胞膜及び細胞代謝の劇的な再組織化、活発な膜小胞化、並びに膜で囲まれた
小胞（アポトーシス小体）への最終的な細胞フラグメント化により特徴付けられ
る13。アポトーシスの核イベントは、核周縁部に対する、核内の一個又は数個の
凝集塊へのクロマチンの崩壊から始まる。核の特徴は、クロマチン凝集、それに
続くエンドヌクレアーゼ活性化後のＤＮＡフラグメント化（アポトーシス過程の
特異的マーカー）、それにより生じる約１８０bpの複数のＤＮＡサブユニットを
含む。細胞イベントは、細胞質凝縮、並びに無傷の細胞膜により包囲されたリボ
ソーム、無傷のミトコンドリア及び核材料を含有する膜結合小胞（アポトーシス
小体）への細胞質及び核の分割（壊死、その他の非生理学的細胞死過程と比較し
た場合のアポトーシス過程の特異的マーカー）を含む。
【００２１】 「アポトーシス小体」は、以下の方法に従い同定される。
【００２２】 １）エクソビボで処理された腫瘍フラグメントにおけるアポトーシスの検出 エクソビボ処理後のアポトーシス過程の適切な誘導を確実にするため、腫瘍及
び／又は腫瘍細胞懸濁液のフラグメントを、調製し、特異的に染色することがで
きる。これらのフラグメントは、ホルムアルデヒド４％で固定され、パラフィン
包埋される。アポトーシス過程の細胞毎の観察を有することが望ましいため、Ｄ
ＮＡ分解のその場所での分析のための方法が、製造業者により開発され、市販さ
れている。ＤＮＡ分解過程の初期段階の検出のための通常の方法は、分解過程と
関連したエンドヌクレアーゼ活性により生じた３′−ＯＨ末端にデオキシヌクレ
オチドを取り込ませるための末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼを使
用する。
【００２３】 ヒト腫瘍フラグメント又は腫瘍細胞懸濁液フラグメントに対する酪酸ナトリウ
ム（分化誘導剤）処理後のアポトーシス細胞の染色は、図２Ａに観察されうる。
腫瘍細胞の細胞小集合体はアポトーシスを受けているが、結合組織の繊維芽細胞
を含む周辺は受けていないことに注目されたい。
【００２４】 ２）クロマチン可視化： 上記の記載のようにして処理された培養物からプールされた浮遊細胞を、３７
℃で３０分間、５μg／mlのHoechst 33258で染色し、洗浄し、次にオリンパスＢ
Ｈ２蛍光顕微鏡を用いて観察する。この技術は、迅速かつ容易に用いられ、いか
なる場所においても達成されうる。ヘキストＤＮＡ染色は、アポトーシス細胞を
検出するために極めて特異的である（図２Ｂ参照）。
【００２５】 ３）超微細構造分析： 上記のようにして得られた浮遊細胞を、カコジル酸緩衝液で洗浄し、４℃で１
時間１．６％グルタルアルデヒドで固定し、室温で１時間四酸化オスミウムで後
固定する。次に細胞をカコジル酸緩衝液で洗浄し、一連の段階的なエタノール濃
度で脱水し、ペレットをエポン（Epon）８１２に包埋する。極薄の切片を酢酸ウ
ラニル及びクエン酸鉛により染色し、次にジェオル（Jeol）１００Ｂ電子顕微鏡
により検査する（図３参照）。この技術は、アポトーシス細胞を検出するために
極めて特異的かつ有効であるが、高価な設備及び資格のある使用者を必要とする
ため、いかなる場所でも可能というわけではない。
【００２６】 ４）ＤＮＡラダーアッセイ（図４）： ヌクレオソーム間ＤＮＡフラグメント化は、アガロースゲル電気泳動により決
定される。１０6個の処理された浮遊細胞のＤＮＡ抽出物を５０℃で２時間プロ
テイナーゼＫ（２０μg／ml）と共にインキュベートし、次にフェノール−クロ
ロホルム抽出の後、−７０℃で一晩エタノール沈殿させる。ＤＮＡをペレット化
し、トリス−ＥＤＴＡに溶解させ、次に１０μg／mlのＲＮａｓｅＡで処理する
。ＤＮＡ試料を試料緩衝液で希釈し、７０℃で５分間インキュベートし、次に１
．８％アガロースゲル上を泳動させる。移動は、試料緩衝液の先端が４〜５ｃｍ
移動するまで４０Ｖで行われた。ＤＮＡを臭化エチジウム染色後、ＵＶ光下で可
視化する。ＤＮＡ分子量（１ｋｂ）は、ファルマシア（St Quentin en Yvelines
, France）のマーカーを使用した。この技術は、いかなる場所においても達成で
き、アポトーシスの最終段階を検出するために極めて特異的である。
【００２７】 ５）その他の技術もアポトーシスを検出するために用いられ得る。 ａ）Ｃａ++及びＭｇ++酵素活性の活性化は、実験室にて容易に分析されうる。
カスパーゼ３（ＣＰＰ３２）：アポトーシス中の酵素活性が測定されうる。カス
パーゼ３はアポトーシス過程に関与しているため、この技術は、アポトーシス過
程に進入する細胞を検出するために通常使用される。しかし、この技術は、極め
て高感度ではあるが、処理の予備工程である。 ｂ）エンドヌクレアーゼ（市販のキットを使用）。 ｃ）細胞表面のマーカー：ホスファチジルセリン及びシアロアドヘシンは、正
常細胞又は壊死細胞と比較した場合の、アポトーシス小体の新たな構造的細胞表
面の潜在的な特異的マーカーである。これらのアポトーシス細胞は、特異的な抗
体又はマーカーで染色されうる。多数の製造業者より供給されているアネキシン
Ｖは、ホスファチジルセリンの特異的マーカーであり、ＦＡＣＳ（細胞蛍光分析
）分析によるアポトーシス小体の精製の方法（後に詳述）のためにも使用されう
る。 シアロアドヘシンに対する抗体は、ＥＤ３（SEROTECH, France）として市
販されている。
【００２８】 トリパンブルー又はヨウ化プロピジウムのような生体染色試薬の排除により示
されるように、膜の完全性は維持されているが、ホスファチジルセリン基により
示されるように、細胞膜の内部は、アポトーシス小体の外部を表すことに注意す
べきである。
【００２９】 腫瘍のアポトーシス小体は、膜上又は細胞内に自己の腫瘍抗原を提示している
という事実により、腫瘍細胞株のアポトーシス小体とは区別される。
【００３０】 「マスクされていない腫瘍抗原」という表現は、該抗原が元の腫瘍から自然に
は発現されないことをいう。
【００３１】 「患者の特異的な腫瘍抗原及びＭＨＣ抗原」という表現は、患者の腫瘍の抗原
が、患者の特異的ＭＨＣ分子上に提示されていることをいう。
【００３２】 本発明のアポトーシス小体は、有利には、切断された核のＤＮＡが複数の１８
０〜２００塩基対へと切断されているようなものである。
【００３３】 これは、前記のＤＮＡラダーアッセイに従い検出されうる。
【００３４】 本発明の有利な実施態様によれば、アポトーシス小体は実質的に精製された形
態である。
【００３５】 「実質的に精製された形態のアポトーシス小体」という表現は、それらが、例
えば遠心分離により、無傷の腫瘍細胞から、壊死腫瘍細胞から、及び腫瘍フラグ
メントから隔離されており、約１０％未満の壊死腫瘍細胞及び腫瘍フラグメント
を含有することをいう。
【００３６】 本発明の有利な実施態様によれば、アポトーシス小体は、特定のアポトーシス
マーカーを膜上に提示する。
【００３７】 特定のアポトーシスマーカーとは、正常細胞又は壊死細胞の原形質膜の外側に
は有意な量で発現していない、アネキシンの結合により検出されるホスファチジ
ルセリン分子、及び抗体ＥＤ３により検出されるシアロアドヘシンに相当する。
【００３８】 本発明の有利な実施態様によれば、アポトーシス小体において、マーカーは以
下の群、すなわち、 −アネキシンにより認識される外側膜上のホスファチジルセリン基、 −膜上のシアロアドヘシン、 −複数の１８０〜２００塩基対のＤＮＡ含有物 から選択される。
【００３９】 これらのマーカーは、フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）により検出され
うる。
【００４０】 アポトーシス小体は、 １）クロマチン可視化、又は ２）超微細構造分析、又は ３）ＤＮＡラダーアッセイ（図４）、 ４）又はＦＡＣＳ分析10 により同定されうる。
【００４１】 これらの技術は全て既述されている。
【００４２】 本発明は、凍結又は凍結乾燥されたアポトーシス小体のセットにより構成され
、異なる患者に起源する、アポトーシス小体バンクにも関する。
【００４３】 本発明の有利な実施態様によれば、アポトーシス小体バンクにおいて、アポト
ーシス小体は、異なる腫瘍タイプ、及び異なるヒト腫瘍細胞株、及び異なる患者
に起源する。
【００４４】 異なる患者又はヒト細胞株に由来するアポトーシス小体からなるアポトーシス
小体バンクの重要性は、それらが、容易に用いられ、自己腫瘍が利用可能でない
患者の単球由来細胞の調製物に添加され得るという点である。
【００４５】 異なる腫瘍タイプ及び患者に由来するアポトーシス小体からなるアポトーシス
小体バンクの重要性は、それらが、自己腫瘍バイオプシーを利用できない患者の
ための腫瘍関連ワクチンを調製するために用いるために、選択され組み合わせら
れ得るという点である。
【００４６】 本発明は、下記の工程、すなわち、 −バイオプシーからの腫瘍フラグメント又は腫瘍細胞の懸濁液の調製、 −アポトーシス小体を得るための、アポトーシス誘導手段による、該腫瘍細胞又
はフラグメントの懸濁液の処理 を含む、患者の腫瘍バイオプシーからのアポトーシス小体の調製のための方法に
も関する。
【００４７】 バイオプシーの腫瘍細胞又はフラグメントの懸濁液は、例えば下記、すなわち
、 ａ）腫瘍バイオプシーを、抗生物質を含む新しい培地又は緩衝液中で維持し、 ｂ）組織を、新しい無菌の培地又は緩衝液に移し、洗浄し、 ｃ）ペトリ皿に移し、脂肪、壊死材料及び周辺結合組織のような不要な組織を切
除し、 ｄ）第二の皿に移し、交差させたメス（crossed scalpels）で約１mm3に切り刻
み、 ｅ）大きなピペットで１５又は５０ml無菌遠心分離チューブに移す。切片を少な
くとも５分間沈降させる。切片を、培地又は緩衝液に再懸濁させ、切片を沈降さ
せ、上清を除去することにより、２〜３回洗浄し、 ｆ）切片を培養フラスコ（Ｆ25又はＦ75）に移し、アポトーシス過程を誘導する
ために処理し（*下記の実施例を参照）、組織学的分析の後に結合組織が示され
る場合には、腫瘍フラグメントの処理の前に、コラゲナーゼ含有培地を使用する
ことができ、 ｇ）毎日上清を収集し、１５ml遠心分離チューブ内で激しく分散させ、 ｈ）フラスコ内の培地を交換し、アポトーシスを誘導するための処理（工程ｆ）
を反復し、この工程を、少なくとも５日間反復し、最大５日間まで４℃で（工程
ｇの）上清を保存し、プールし、 ｉ）実験の最後に、腫瘍の静止している切片の機械的な脱凝集を行うことができ
、腫瘍切片を中程度（７０μm）のナイロン中の滅菌ふるい上に置き、使い捨て
プラスチックシリンジのピストンを用いて軽い圧力を加えることにより、メッシ
ュを通して組織を培地中に押し出し、細胞を洗浄するため、さらなる培地をふる
いに取り、工程を反復し、濾液を保存し、先の上清（工程ｇ）と共にプールし、
ｊ）培地を１３００〜１５００×ｇで１５分間遠心分離し、上清を捨て、ペレッ
トを培地に懸濁させ、細胞を４から６時間培養フラスコに移し、（プラスチック
への吸着によって）静止している生存細胞を除去し、３７℃における培養の後、
上清を除去し、プラスチックを軽く洗浄し、 ｋ）洗浄しながら上清をプールし、そして４℃で１５分間、３００×ｇで遠心分
離し、１部を保存し、上記のように壊死に対するアポトーシスを検出し定量する
の条件の下で調製することができる。
【００４８】 有利な実施態様によれば、本発明の方法において、アポトーシス誘導手段は、
化学的作用因、すなわちリガンド又は増殖因子である。
【００４９】 化学的作用因としては、酪酸塩誘導体16、スタウロポリン17、スリンダク誘導
体、炎症性サイトカイン18、糖質コルチコイド19、抗新生物ヌクレオシドアナロ
グ20のような分化誘導剤を挙げることもできる。
【００５０】 代表的な処理のための条件は、以下のとおりである。連続した３から５日、完
全培地中で、５から１０mM ＮａＢｕｔ又は０．１から０．５mMのスリンダクで
腫瘍フラグメントを処理する。分化誘導剤を含む培地を毎日交換する。アポトー
シス細胞及び／又は残骸を除去し、既に詳述されたようにして４℃で保存する。
【００５１】 大部分の型の腫瘍が、有利にも化学的作用因によって処理されアポトーシスを
開始することができる。結腸直腸がん、乳がん及び膵臓がんのような上皮由来の
腫瘍が、分化誘導剤に対して特に感受性が高い。
【００５２】 有利な実施態様によれば、本発明の方法において、アポトーシス誘導手段は物
理的作用因である。
【００５３】 全ての型の腫瘍が、有利には、物理的作用因によって処理される。
【００５４】 有利な実施態様によれば、本発明の方法において、物理的作用因は下記の手段
、すなわち、γ線照射のようなイオン化、ＵＶ照射、熱ショック、もしくは血清
飢餓のようなストレス、又は該手段の組み合わせの中から選択される。
【００５５】 イオン化は、例えば、Yamada T.,Ohyama H.Int.J.Radiat.Biol.53:65-75,1988
に記載されている。
【００５６】 ＵＶ照射は、例えば下記、すなわち、培養中の腫瘍フラグメント及び／又は腫
瘍細胞を、腫瘍細胞の性質に応じて、１から５分間、Ｕ．Ｖ．ランプ（２２０ｖ
、５０Hz、１８０Ｗ）で処理する のように行われる。
【００５７】 γ線照射は、例えば下記、すなわち、ガンマ線照射処理は、単独で、又はＵ．
Ｖ．もしくは熱ショックと相補的に行われうる。腫瘍フラグメントに、腫瘍細胞
の性質及び起源に応じて、３０分間３０グレイから１５０グレイを照射する ように行われる。
【００５８】 熱ショックは、例えば下記、すなわち、完全培地における培養中の腫瘍フラグ
メントを、腫瘍細胞の性質及び起源に応じて、３０から６０分間、約４０℃から
約４５℃で処理する。がん細胞又は腫瘍フラグメントは、懸濁液中、培地中で処
理されうる ように行われる。
【００５９】 固形腫瘍のための、有利な手段の組み合わせは、下記の組み合わせ、すなわち
、２分間のＵ．Ｖ．曝露（２２０ｖ、５０Hz、１８０Ｗ）及びそれに続く３０分
間の５０グレイのγ線照射である。
【００６０】 血清飢餓とは増殖因子の不在に相当する。
【００６１】 有利な実施態様によれば、本発明の方法において、アポトーシス誘導手段は、
物理的作用因と化学的作用因との組み合わせである。
【００６２】 大部分のヒト腫瘍が、有利には、物理的作用因と化学的作用因との組み合わせ
を用いて処理され、アポトーシスに入ることができる。
【００６３】 白血病細胞のための、物理的作用因と化学的作用因との組み合わせの例として
は、ＵＶランプによる処理と５Mm酪酸ナトリウムの添加との組み合わせを挙げる
ことができる。
【００６４】 有利な実施態様によれば、本発明の方法は、 −アポトーシスを受けた腫瘍細胞の懸濁液からのアポトーシス腫瘍細胞上清の回
収、 −特に水簸によって遠心分離し、アポトーシス小体の濃縮物を得ること による、アポトーシス小体の精製の工程をさらに含む。
【００６５】 アポトーシス腫瘍細胞上清の回収の有利な条件は下記のとおりである。アポト
ーシス小体を、上記で定義されたアポトーシス腫瘍細胞上清から得る。まず、わ
ずかな生存細胞、壊死細胞及びアポトーシス細胞を含有する上清を、プラスチッ
クに付着する生存細胞を除去するために、３７℃で２〜６時間培養フラスコ中で
沈積させる。次に、今や壊死細胞及びアポトーシス細胞を含有する得られた上清
を、遠心分離する。
【００６６】 アポトーシス小体の濃縮物を得るための遠心分離は、有利には、小体の純粋な
集団の回収を可能にする水簸により実施される。
【００６７】 本発明の有利な実施態様によれば、患者の腫瘍バイオプシーからのアポトーシ
ス小体の調製のための方法は、以下の工程、すなわち、 −予め不要な組織を除去され、切り刻まれる腫瘍バイオプシーの、腫瘍フラグメ
ント又は腫瘍細胞の懸濁液の調製 −目的の抗原又はタンパク質をコードするＤＮＡを取り込むことができること、 −該腫瘍細胞又は腫瘍フラグメントの懸濁液のアポトーシス誘導手段による処理
、及び毎日の上清の回収（該処理は少なくとも５日間繰り返され、上清は回収さ
れプールされる） −該上清を含有する培地の遠心分離、及び遠心分離から得られたペレットの適切
な培地への懸濁 −先の培地からの上清の回収、及びアポトーシス小体の懸濁液を得るための該上
清の遠心分離 −約０．５から約５μmの無傷の小胞によって構成されるアポトーシス小体の集
団を選択するための、特に水簸による、アポトーシス小体の懸濁液の遠心分離 を含む。
【００６８】 有利な実施態様によれば、本発明の方法において、アポトーシス小体の濃縮物
は、適切な培地に再懸濁され、約４℃から約１０℃で保存されるか、又は約−８
０℃で凍結されるか、又は凍結乾燥される。
【００６９】 本発明の有利な実施態様によれば、アポトーシス小体の調製のための方法にお
いて、アポトーシスの誘導は酪酸ナトリウム又はスリンダクスルフィドを用いて
実施される。
【００７０】 酪酸ナトリウム又はスリンダクスルフィドで有利に処理される腫瘍タイプは、
がん及び白血病である。
【００７１】 本発明の有利な実施態様によれば、アポトーシス小体の調製のための方法にお
いて、アポトーシスの誘導はＵ．Ｖ．を用いて実施される。
【００７２】 Ｕ．Ｖ．で有利に処理される腫瘍タイプは、黒色腫及び白血病である。
【００７３】 本発明の有利な実施態様によれば、アポトーシス小体の調製のための方法にお
いて、アポトーシスの誘導は熱ショックを用いて実施される。
【００７４】 Ｕ．Ｖ．照射と組み合わされた熱ショックにより有利に処理される腫瘍タイプ
は、中心部分の感受性が低い固形腫瘍フラグメントである。
【００７５】 本発明の有利な実施態様によれば、アポトーシス小体の調製のための方法にお
いて、アポトーシスの誘導はγ線照射を用いて実施される。
【００７６】 イオン化、特にγ線照射で有利に処理される腫瘍タイプは、白血病細胞である
。
【００７７】 本発明は、前記の方法により得られるようなアポトーシス小体にも関する。
【００７８】 本発明は、薬学的に適切な媒体と共に、前記のアポトーシス小体又は本発明に
従いバンクから引き出されたアポトーシス小体を活性物質として含有する薬学的
組成物にも関する。
【００７９】 有利な実施態様によれば、本発明の薬学的組成物は、無菌の注入可能な溶液の
形態である。
【００８０】 本発明は、前記のアポトーシス小体又は前記のバンクから引き出されたアポト
ーシス小体を活性物質として含有するワクチンにも関する。
【００８１】 本発明の有利な実施態様において、用いられるアポトーシス小体の用量は、タ
ンパク質含量の当量で表され、注射による約１０μgから約１０mg／kg、好まし
くは約１００μgから約１mg／kgである。注射は、１年以内に最大１０回反復す
ることができる。
【００８２】 本発明は、がんの治療のための薬物を調製するための、前記のアポトーシス小
体又は本発明に従いバンクから引き出されたアポトーシス小体の使用にも関する
。
【００８３】 本発明は、前記のアポトーシス小体又は本発明に従いバンクから引き出された
アポトーシス小体を含有し、細胞性免疫応答の誘導を可能にするコンホメーショ
ンで、ＭＨＣ及び共刺激分子と共に（アポトーシス小体の取り込み前のヒト単球
由来細胞の膜上には存在しない）腫瘍アポトーシス抗原を膜上に提示することを
特徴とするヒト単球由来細胞にも関する。
【００８４】 「アポトーシス小体の取り込み前のヒト単球由来細胞の膜上には存在しない腫
瘍抗原及びアポトーシス抗原を膜上に提示する」という表現は、抗原のマスク解
除を可能にするアポトーシス中の膜の再組織化をさす。
【００８５】 「細胞性免疫応答の誘導を可能にするコンホメーション」という表現は、Ｔ細
胞受容体との相互作用のための領域における特異的なリガンド及び受容体の刺激
性の発現をさす。
【００８６】 本発明は、以下の工程を含む、アポトーシス小体を含有するヒト単球由来細胞
の調製のための方法にも関する。 −ファゴサイトーシスされたアポトーシス小体を有する単球由来細胞を得るため
の、単球由来細胞によるアポトーシス小体のファゴサイトーシスを可能にする適
切な条件での、ヒト単球由来細胞と上記のアポトーシス小体又はバンクから引き
出されたアポトーシス小体との共培養（アポトーシス小体と樹状細胞との比率は
少なくとも１） −アポトーシス小体を含有し、細胞性免疫応答の誘導を可能にするコンホメーシ
ョンで、腫瘍抗原及びアポトーシス抗原を膜上に提示する単球由来細胞を得るた
めの、アポトーシス小体の細胞内消化、並びに単球由来細胞膜上の腫瘍抗原及び
アポトーシス小体抗原の提示を可能にする適切な条件下での、先行工程で得られ
た該単球由来細胞のインキュベーション。
【００８７】 共培養の有利な条件は、下記、すなわち、１０6〜１０9細胞／ml、好ましくは
１０8細胞／mlの単球由来細胞の存在下での、１ml当たり１０μg／ml〜１００μ
g／ml、又は１０5〜１０8個／ml、好ましくは１０7個／mlのアポトーシス小体を
含む培地、３７℃で１〜２４時間である。
【００８８】 ファゴサイトーシスを可能にする有利な条件は下記、すなわち、ＲＰＭＩ中３
７℃で少なくとも４時間の共培養である。
【００８９】 細胞内消化を可能にする有利な条件は、下記、すなわち、ファゴサイトーシス
のための、ＲＰＭＩ中３７℃で４から１６時間の共培養、及び抗原の消化及び提
示のための、ファゴサイトーシス後の１６時間、最大９６時間（最適には４８か
ら７２時間）である。
【００９０】 有利な実施態様によれば、本発明の方法は、 −細胞保存を可能にする温度、例えば４℃でのアポトーシス小体含有単球由来細
胞の遠心分離、及び例えば自己血清を含有する等張培地への懸濁 の工程をさらに含む。
【００９１】 有利な実施態様によれば、本発明の方法は、 −細胞保存を可能にする温度、例えば４℃でのアポトーシス小体含有単球由来細
胞の遠心分離、及び例えば自己血清を含有する等張培地への懸濁、及び −先行工程で得られたアポトーシス小体含有単球由来細胞の、約１０℃未満の温
度での保存 の工程をさらに含む。
【００９２】 有利な実施態様によれば、本発明の方法は、 −細胞保存を可能にする温度、例えば４℃でのアポトーシス小体含有単球由来細
胞の遠心分離、及び例えば自己血清を含有する等張培地への懸濁、及び −ポリエチレングリコール、グリセロール又はＤＭＳＯのような凍結保護剤の添
加を用いた、先行工程で得られた刺激されたアポトーシス小体含有単球由来細胞
の一部の、少なくとも約−８０℃の温度での凍結 の工程をさらに含む。
【００９３】 有利な実施態様によれば、本発明の方法において、該単球由来細胞を下記の工程
、すなわち、 −以下の方法による単球由来細胞の調製 １）血液アフェレーシス又は血液バッグ収集からの直接的な血液由来単核細胞の
回収、必要であれば、それに続く実質的部分の赤血球、顆粒球及び血小板を排除
するための遠心分離、並びに末梢血白血球の収集、 ２）例えば遠心分離により、先行工程で得られた末梢血白血球を洗浄し、（血小
板、赤血球及び残骸の９０％を除去し）単核細胞を得、 ３）先行工程で得られた細胞を、サイトカイン及び／又は自家血清を補完するこ
とができる培地（ＲＰＭＩ又はＩＭＤＭタイプ）中に１０6〜２×１０7細胞／mL
で再懸濁させ、そして疎水性通気袋中で、Ｏ2／ＣＯ2雰囲気下、３７℃で５〜１
０日間培養し、免疫刺激性単球由来細胞及び混入するリンパ球を得、 ４）場合により目的のタンパク質をコードするＤＮＡを組み込むことができるこ
と によって調製する。
【００９４】 本発明の有利な実施態様によれば、用いられた単球由来細胞は、刺激され、そ
して下記の特性、すなわち、 １）− 下記のポリペプチド、タンパク質又は化合物、すなわち、 ・ＩＬ１２、ＩＦＮγ、ＩＬ−２、ＭＩＰ、ＧＭ−ＣＳＦ、 ・熱ショック又はストレスタンパク質、 ・補体成分、 ・生物活性脂質、 ・ホルモン ケモカイン及びモノカインの少なくとも１つの正常単球由来細胞に比べ増加した
放出、及び −下記活性化マーカー、すなわち、 ＣＤ１ａ、ＣＤ１１ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８３，ＣＤ８６，ＭＨＣクラスＩ及びＭ
ＨＣクラスII分子、Ｐ５５，ケモカインレセプター、ＩＣＡＭのようなアドヘシ
ン若しくは免疫刺激のためのアクセサリー分子、又はＣＤ４０ の少なくとも１つの、それらの膜上での、正常単球由来細胞に比べ増加した存在
、 及び／又は、 ２）単球由来細胞分裂の不在下で組み込まれている外来性核酸の少なくとも１つ
の、それらの核内での存在 を示す。このｃＤＮＡは目的のタンパク質をコードする。
【００９５】 特異的にストレスを受け、それゆえ免疫刺激タンパク質又は化合物を増加した
レベルで放出せず、そして同時にその膜上にＭＨＣ及びアクセサリー分子を顕著
に増加したレベルで発現しない、発現正常単球由来細胞は、規定の培地で培養し
た単球に相当する。 グルタチオンレベルも改変する。
【００９６】 単球由来細胞を例えばＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４又はＩＬ−１３のような別の
サイトカインの存在下で精製しそして培養した血液由来単球から得ることができ
る。
【００９７】 有利な実施態様によれば、活性化マーカーは、少なくとも約１０００分子／細
胞の量で存在する。
【００９８】 これをフローサイトメトリーによって測定することができる。
【００９９】 本発明の特定の実施態様では、上記のような単球由来細胞は、それらの細胞質
中に、目的の、薬剤、タンパク質、成長因子のような所定の外来性化合物を含有
する。
【０１００】 別の実施態様では、上記のような単球由来細胞は、その細胞質中に、目的のタ
ンパク質、例えばＩＮＦγ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２又は抗原をコードする外来性
ＤＮＡを含有する。
【０１０１】 有利な実施態様によれば、本発明に用いる刺激された単球由来細胞は、下記の
特徴、すなわち、 １）下記のポリペプチド又はタンパク質、すなわち、 ・ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、ＧＰ９６のような、熱ショックタンパク質又はスト
レスタンパク質、 ・ＩＬ１２、ＩＦＮγ、ＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＩＰのようなケモカイン及
びモノカイン、 の少なくとも１つの、正常単球由来細胞に比べ増加した放出 及び −下記の活性化マーカー、すなわち、 ＣＤ１α、ＣＤ１１ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８３，ＣＤ８６，ＭＨＣクラスＩ及びＭ
ＨＣクラスII分子、アドヘシンすなわちＩＣＡＭのような若しくは免疫刺激のた
めのアクセサリー分子、又はＣＤ４０、Ｐ５５、及びケモカインレセプターの少
なくとも１つのそれらの膜上での、正常単球由来細胞に比べ増加した存在 及び／又は ２）単球由来細胞分裂の不在下で組み込まれている外来性核酸の少なくとも１つ
がそれらの核内に存在すること を示す。
【０１０２】 本発明の有利な実施態様によれば、該活性化マーカーは少なくとも約１０００
分子／細胞の量で存在する。 これをフローサイトメトリーによって測定することができる。
【０１０３】 有利な実施態様によれば、上記ポリペプチド、タンパク質又は化合物は、約１
pg／細胞／時間より高率の量で存在し、そして上記活性化マーカーは、約１０3
〜約１０5分子／細胞の範囲内で存在する。 これをフローサイトメトリーによって測定することができる。
【０１０４】 有利な実施態様によれば、上記ポリペプチド、タンパク質又は化合物は、約１
pg／細胞／時間より高率の量で存在し、そして上記活性化マーカーは、約１０3
より高率の範囲内で、そして特に約１０3〜約１０5分子／細胞の範囲内で存在す
る。 これをフローサイトメトリーによって測定することができる。
【０１０５】 本発明で用いることができる該刺激された単球由来細胞は、単球由来細胞分裂
の不在下でそれらの核内に外来性核酸の少なくとも１つを組み込まれて有する特
徴を有することもできる。
【０１０６】 非ウイルス技術による細胞核内への外来性核酸の導入は、急速に分裂している
細胞内で効率的に達成することができることを注意すべきである。単球に由来す
る細胞のような非分裂細胞では、外来性核酸は小胞内又は細胞質内に内在化され
るが、極めて少量の、外来性核酸の組み込み及びコードされるペプチドの発現が
生じる（＜５％）。本発明の物理的刺激は、細胞質から核へと内在化された外来
性核酸の移入を可能にし、そしてそれゆえ導入遺伝子の増加した発現を可能にす
る。
【０１０７】 有利な実施態様によれば、上記ポリペプチド、タンパク質又は化合物は、約１
pg／細胞／時間より高率の量で存在し、そして上記活性化マーカーは約１０3〜
約１０5分子／細胞の範囲内で存在する。 これをフローサイトメトリーによって測定することができる。
【０１０８】 有利な実施態様によれば、上記ポリペプチド、タンパク質又は化合物は、約１
pg／細胞／時間より高率の量で存在し、そして上記活性化マーカーは、約１０3
より高率の範囲内で、そして特に約１０3〜約１０5分子／細胞の範囲内で存在す
る。
【０１０９】 ポリペプチド、タンパク質又は化合物の量をＥＬＩＳＡ法によって測定するこ
とができ、そして膜活性化マーカーの数をフローサイトメトリーによって測定す
ることができる。
【０１１０】 上記刺激された単球由来細胞を調製するために、熱ストレス（少なくとも３０
分間４０℃〜５０℃で加熱すること）、圧力変化（約１bar（１０5Ｐａ）から０
．０５barへ、又は約１barから１０barへ）、マイクロ波、電気ショック（約２
５０mVで約１〜約１０秒）、又はエレクトロパルセーションのような物理的手段
による該単球由来細胞の刺激工程を含む方法を使うことができる。
【０１１１】 温度ストレス又は熱ストレスを、“ストレスタンパク質の分化誘導及びヒト食
細胞における熱ショックの機能的効果”（Polla B.S., Stubbe H., Kantengwa S
., Maridonneau-Parini I., Jacquire-Sarlin M.R. -Inflammation, 19:363-378
, 1995）にか、又は“ストレス誘導性細胞性応答”（Feige U., Morimoto R.I.,
Yahara I., Polla B.S. -BirkhaeuserVerlag (Basel, Boston, Berlin), 492p.
, 1996）に記載されているように用いる。
【０１１２】 マイクロ波を下記条件、すなわち、５００〜７５０ワット（５秒〜５分）、１
〜５回反復下で用いる。
【０１１３】 エレクトロパルセーション（例えば、０．３〜０．８kV／cmで５ミリ秒の５〜
１０方形電気波）は、核孔を通じて細胞質からの、イオンの流動、及び核酸及び
／又はタンパク質輸送の流動を可能にする。この正の流動は、パルセーション後
に停止し、そして外来性核酸が核のＤＮＡ内に組み込まれる（“血液サンプル中
の白血球の特異的電気透過化処理及び大量細胞への適用”；S. Sixou and J. Te
issie; Elsevier, Biochimica et Biophysica Acta. 1028: 154-160, 1990）。
【０１１４】 電気ショックを“哺乳動物細胞内の電気的フィールド介在遺伝子導入のパルス
パラメーターによる制御”（Hendrick W. et al., Biophysical Journal, Vol.
66:524-531, February 1994）に記載されているように用いる。
【０１１５】 下記の工程、すなわち、 −１）血液アフェレーシスからか、又は血液バッグコレクションから直接的に血
液由来単球細胞を回収し、続いて、必要ならば遠心分離によって、赤血球、顆粒
球及び血小板の実質的部分を除去し、末梢血白血球をコレクションし、 ２）例えば遠心分離によって先行工程で得られた末梢血白血球を洗浄し（血小板
、赤血球及び細片の９０％を除去し）、単球細胞を得、 ３）先行工程で得られた細胞を、サイトカイン及び／又は自家血清を補完するこ
とができる培地（ＲＰＭＩ又はＩＭＤＭタイプ）中に１０6〜２×１０7細胞／mL
で再懸濁させ、そして疎水性通気袋中で、Ｏ2／ＣＯ2下、３７℃で５〜１０日間
培養し、免疫刺激性単球由来細胞及び混入するリンパ球を得ること による単球由来細胞の調製 ４）目的のタンパク質をコードするＤＮＡを組み込むことができる による単球由来細胞の調製 −熱ストレス（少なくとも３０分間４０℃〜５０℃で加熱すること）、圧力変化
（約１bar（１０5Ｐａ）から０．０５barへ、又は約１barから１０barへ）、マ
イクロ波、電気ショック（約２５０mVで約１〜約１０秒）、又は上記特徴を誘導
するために十分な時間のエレクトロパルセーションのような物理的手段による該
単球由来細胞の刺激 を含む本発明で用いることができる、刺激された単球由来細胞の調製のための方
法。
【０１１６】 単球の培養及び分化の期間内の単球由来細胞と共になった混入しているリンパ
球の存在は、よりよい刺激の制御及びパラクリン細胞性相互作用による細胞回収
を可能にする。
【０１１７】 リンパ球は、該方法の最後に刺激された単球由来細胞から分離される。
【０１１８】 該単球由来細胞を、例えば、特許番号PCT/EP93/01232, WO94/26875若しくはEP
97/02703に記載されているか、又は下記、すなわち、 ・"Autologous lymphocytes prevent the death of monocytes in culture and
promote, as do GM-CSF, IL-3 and M-CSF, their differentiation into macrop
hages". (Lopez M., Martinache Ch., Canepa S., Chokri M., Scotto F., Bart
holeyns J.; J. of Immunological Methods, 159:29-38, 1993); ・"Immune therapy with macrophages: Present status and critical requirem
ents for implementation" (Bartholeyns J., Romet-Lemonne J-L., Chokri M.,
Lopez M.; Immunobiol., 195: 550-562, 1996); ・"In vitro generation of CD83+ human blood dendritic cells for active t
umor immunotherapy" (Thurnher M., Papesh C., Ramoner R., Gastlt G. et al
., Experimental Hematology, 25:232-237, 1997); ・"Dendritic cells as adjuvants for immune-mediated resistance to tumors
" (Schuler G. and Steinman R.M.; J. Exp. Med., 186: 1183-1187, 1997) に示した論文に記載されているような方法によって調製することができる。
【０１１９】 単球由来細胞及び混入しているリンパ球を、薬剤、タンパク質又は抗原の存在
下で、２〜２４時間、該単球由来細胞及び混入している白血球を培養することに
よって、薬剤、タンパク質又は抗原を内在化するために処置することができ、こ
れらの化合物を該単球由来細胞に内在化することができる。
【０１２０】 特定の実施態様では、上記方法は、刺激の工程の前に、目的の、薬剤、タンパ
ク質、成長因子（例えば、飲作用、特定の凝集物の食作用、拡散によって）のよ
うな外来性化合物をか、又は目的のタンパク質をコードするＤＮＡを（すなわち
、グリコシル化ポリリシン−ＤＮＡの取り込みを介在する糖レセプターによって
か又は脂質ＤＮＡ取り込みによってＤＮＡプラスミドを）単球由来細胞に担荷さ
せる工程を含む。次に、担荷させた単球由来細胞を上記のような物理的手段によ
って、より具体的には細胞質から核（例えばそれらをＤＮＡ内に挿入することが
できるところ）に担荷された外来性化合物の輸送を生じるエレクトロパルセーシ
ョンによって刺激する。
【０１２１】 有利な実施態様において、上記“刺激”方法は、刺激の工程の後に、細胞保存
が可能な温度、例えば４℃で刺激された単球由来細胞の遠心分離、及び例えば自
家血清を含む等張培地中での再懸濁の付加的工程を含む。
【０１２２】 別の有利な実施態様による上記“刺激”方法は、 −細胞保存を可能にする温度で刺激された単球由来細胞の遠心分離、及び例えば
自家血清を含む等張培地中での再懸濁、及び −ポリエチレングリコール、グリセロール、又はＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシ
ド）のような凍結保存剤を添加しながら、先行工程で得られた刺激された単球由
来細胞のアリコートを少なくとも−８０℃の温度で凍結すること の付加的工程を刺激の工程の後に含む。
【０１２３】 有利な実施態様によれば、刺激された単球由来細胞の調製のための方法は、下
記の工程、すなわち、 − それらのマンノース及び／又はＦｃレセプターを標的とするエンドサイトー
シスによってか、又は高分子核酸凝集物の飲作用によって外来性核酸を、このよ
うに得られた単球由来細胞に担荷させること、及び − 先行工程で得られた単球由来細胞を、例えば約０．３〜約１kV／cmでの約５
ミリ秒の約１〜約１０パルスのエレクトロパルセーションのような物理的ストレ
スに付すこと を含む。
【０１２４】 別の有利な実施態様によれば、刺激された単球由来細胞の調製のための刺激方
法は、下記工程、すなわち、 − 下記方法、すなわち、 １）血液アフェレーシスからか、又は血液バッグコレクションから直接的に血液
由来単球細胞を回収し、続いて、必要ならば遠心分離によって、赤血球、顆粒球
及び血小板の実質的部分を除去し、末梢血白血球をコレクションし、 ２）例えば遠心分離によって先行工程で得られた末梢血白血球を洗浄し（血小板
、赤血球及び細片の９０％を除去し）、単球細胞を得、 ３）先行工程で得られた細胞を、サイトカイン及び／又は自家血清を補完するこ
とができる培地（ＲＰＭＩ又はＩＭＤＭタイプ）中に１０6〜２×１０7細胞／mL
で再懸濁させ、そして疎水性通気袋中で、Ｏ2／ＣＯ2雰囲気下、３７℃で５〜１
０日間培養し、免疫刺激性単球由来細胞及び混入するリンパ球を得ること による単球由来細胞の調製、 − それらのマンノース及び／又はＦｃレセプターを標的とするエンドサイトー
シスによってか、又は高分子核酸凝集物のピノサイトーシスを、外来性核酸でこ
のように得られた単球由来細胞に担荷させること、及び − 先行工程で得られた単球由来細胞をエレクトロパルセーションのような物理
的ストレスに付し、外来性核酸の核内への移動、そして核のＤＮＡ内への組み込
みを可能にすること を含む。
【０１２５】 有利な実施態様によれば、上記刺激方法は、エレクトロパスセーションの後に
、細胞保存を可能にする温度、例えば４℃における刺激された単球由来細胞の遠
心分離、そして例えば自家血清を含む等張培地中での懸濁の付加的工程を含む。
【０１２６】 別の有利な実施態様によれば、該刺激された方法は、エレクトロパルセーショ
ンの後に、付加的工程、すなわち、 − 細胞保存を可能にする温度、例えば４℃において刺激された単球由来細胞の
遠心分離、そして例えば自家血清を含む等張培地中での懸濁、及び − ポリエチレングリコール、グリセロール又はＤＭＳＯのような凍結保護剤を
添加しながら、少なくとも−８０℃の温度における先行工程で得られた刺激され
た単球由来細胞を凍結すること を含む。
【０１２７】 本発明は、上記のような方法によって得られたようなアポトーシス小体を含む
ヒト単球由来細胞にも関する。
【０１２８】 本発明は、薬学的媒体と組み合わせて、上記アポトーシス小体を含むヒト単球
由来細胞を活性物質として含有する、薬学的組成物にも関する。
【０１２９】 有利な実施態様によれば、本発明の薬学的組成物は、無菌注入可能な溶液の形
態である。
【０１３０】 本発明は、薬学的媒体と組み合わせて、上記アポトーシス小体を含むヒト単球
由来細胞を活性物質として含有する、ワクチン組成物にも関する。
【０１３１】 有利な実施態様では、用いられる単球由来細胞の用量は、注入による約１０6
〜約１０10細胞（全用量）、好ましくは約１０7〜約１０8細胞である。注入を１
年の期間内に１０回まで反復することができる。
【０１３２】 本発明は、がんの処置のための薬剤の調製のための、上記アポトーシス小体を
含有するヒト単球由来細胞の使用にも関する。
【０１３３】 アポトーシスの細胞は、腫瘍細胞に起源するそれらの対応抽出物に比べてより
免疫原性であり得ること、及びそれらの特異的ファゴサイトーシスが免疫システ
ムに対する抗原提示性を増強することが本発明中に示されている（下記実施例も
参照せよ）。
【０１３４】 抗がん処置を、患者の腫瘍バイオプシーからエクソビボで得られた自家アポト
ーシス小体を用いるワクチン接種で実現する。これらのアポトーシス小体は、ド
ナー患者から及びドナー患者のための抗がんワクチン接種で用いる自家単球由来
抗原提示細胞（ＭＤＣｓ）によってエクソビボでファゴサイトーシスされる。そ
れらの膜上に存在する種々の腫瘍抗原を有する種々の腫瘍タイプに特異的なアポ
トーシス小体のバンクを、特定の複数の腫瘍抗原のための情報源として構築する
こともできる。本発明の特定の実施態様では、腫瘍罹患患者の腫瘍細胞又は細胞
系のいずれかを、ワクチンすなわち目的の腫瘍抗原をコードするｃＤＮＡで形質
移入させる原料として用いる。得られたアポトーシス小体の細胞表面においてマ
スクされていない抗原に加えて、形質移入された抗原をアポトーシスの細胞によ
ってそして由来するアポトーシス小体によって今発現させる。これらのバンクの
種々のアポトーシス小体の凍結サンプルを調製し、ウイルス及び細菌の無菌性は
保証されている。マスター治療的アポトーシス小体バンクを主要ヒト腫瘍に特定
して構築する。新しい又は解凍アポトーシス小体を、等張無菌溶液に懸濁し、そ
して関連する腫瘍に対する治療的ワクチン接種目的のためインビボで直接的に注
入するか、又は単球由来細胞（ＭＤＣｓ）の培地に、及び特にＭＡＫ（マクロフ
ァージ活性化キラー）若しくはＭＡＣ−ＤＣ（未成熟樹状）細胞にエクソビボで
優先的に添加するのいずれかである。
【０１３５】 ファゴサイト認識及びアポトーシス中の無傷細胞の摂取は細胞死のプログラム
において、鍵となる事象である。マクロファージは「専門ファゴサイト（profes
sional phatocytes）」であり、アポトーシス細胞及び小体を取り除くが、他の
型の細胞もまた加わることができる。それらのファゴサイト性の機能とは別に、
マクロファージは、よく特徴づけられた抗原提示細胞（ＡＰＣ）である。腫瘍ア
ポトーシス小体は単球由来抗原提示細胞に特異的にファゴサイトーシスされ、そ
して処理される（図５を参照せよ）。これらの細胞は、それらの活性化に応じて
、外来抗原をＴ細胞に提示することができる。ＭＤＣによるアポトーシス小体の
インビボ又は好ましくはエクソビボ処理は、ＭＤＣのＭＨＣＩ及びＭＨＣII分子
上での腫瘍抗原の提示を可能にしている。アポトーシス小体はマスクされていな
い腫瘍抗原（前もって腫瘍細胞表面においてマスクされる）であり、腫瘍源に結
合することができる。アポトーシスの処理は、細胞膜の完全な状態を維持する一
方で、その相対的位置を変えることにより、この膜の有意な変更を誘導し、ＭＤ
Ｃはさらに非常に効果的な抗原提示細胞（ＡＰＣ）になるために活性化される。
これはＭＬＲにおけるリンパ球の特異的増殖によって証明される。エクソビボで
調製され、処理されたアポトーシス小体を有するＭＤＣは、インビボにおいて特
異的な抗腫瘍反応を誘導するために、適切な処置において凍結し、又は直接注入
することができる。
【０１３６】 それと共に、これらのデータは、アポトーシス性の細胞及びＡＰＣ（ＭＤＣ、
ＭＡＣ−ＤＣ）は、腫瘍細胞抽出物又はペプチド−ＡＰＣワクチンと同等かまた
はより効果的であり得る。
【０１３７】 本発明の概念のスキームを以下に示す（図１）
【０１３８】 本発明は、アポトーシス小体が、その後効果的な抗原提示細胞に活性化される
「単球由来細胞」によってファゴサイトーシスされることの証明を利用するもの
である。この提示は、腫瘍細胞の溶解物のファゴサイトーシス後よりもアポトー
シス小体のファゴサイトーシス後の方が、より効果的である。
【０１３９】 後述する実施例において、ファゴサイトーシスされたアポトーシス小体を有す
る、及びラットに再注入されたラットマクロファージが、問題の腫瘍に対してそ
れらのラットを防御することが証明されている。この防御（予防ワクチン）は、
アポトーシス小体の注入後、壊死又はフラグメント化された腫瘍細胞が効力を有
しなくなったときに達成される。
【０１４０】 実施例： 本研究では、腫瘍ワクチンの有効性を専門の抗原提示細胞によって提示される
アポトーシスの腫瘍材料を用いて調べた。不十分な免疫性ラット結腸直腸腫瘍モ
デルを用いて、ＮａＢｕｔ処置腫瘍細胞系のアポトーシス小体（PROb - DHD K12
/Trb）がインビトロ及びインビボで免疫応答を誘導することを示した。これらの
効果は、もとの腫瘍細胞に由来するアポトーシス小体を用いる細胞性ワクチン接
種の後（図７及び８）か、ファゴサイトーシス性マクロファージに基づく養子ワ
クチン接種によるそれらの間接的な提示の後（図９）のいずれかに生ずる。ファ
ゴサイトーシス性マクロファージを上記のように回収し、そして脾細胞と共に播
種した。共培養４日後のＴ細胞増殖を図６に示した。アポトーシス小体ファゴサ
イトーシス性マクロファージは、分画された腫瘍細胞をファゴサイトーシスする
マクロファージに比べてＴ細胞増殖をより効果的に誘導することを本発明が示し
た（図９）。
【０１４１】 アポトーシス小体は、ファゴサイトーシス性細胞の抗原提示能力を増大させる
。ＭＨＣクラスＩ及びII、及びＩＣＡＭ１，Ｂ７．１及びＢ７．２そしてシアノ
−アドヘシンのような種々の共刺激性分子の発現を調べた。
【０１４２】 各抗体に対する染色細胞数及び蛍光の平均は、クラスＩＭＨＣ及びＢ７．１を
除き、アポトーシス小体のファゴサイトーシス後により高かった（下記表を参照
せよ）。
【０１４３】
【表１】
【０１４４】 表：アポトーシス小体ファゴサイトーシス性細胞の表現型。チオグリコラート
で誘導されたマクロファージを回収する２時間前に、アポトーシス小体のタンパ
ク質５００μgを腹腔内に注入した。数回洗浄後、細胞を再懸濁しそしてＦＡＣ
Ｓによるそれらの分析２４時間後まで懸濁で培養した。細胞を固定しそして染色
した。表１は染色細胞の百分率及び蛍光強度の平均を示す。
【０１４５】 これらの結果は、効率的ＡＰＣ内のマクロファージの分化が、抗原の提示に少
し前に結合した、それらの表面上のシアロ−アドヘシンの増加によって実証され
ることを示唆する27。
【０１４６】 アポトーシス小体又は分画された細胞のそれらのファゴサイトーシスの後に、
アポトーシス小体又は抗原提示細胞のいずれかのワクチンの可能性を評価するた
めに、我々は予防接種の研究として腫瘍細胞２５万細胞を皮下に注入した。アポ
トーシス小体だけが、有意な腫瘍成長を減少させた（図７）。４９日後、アポト
ーシス小体ワクチン接種ラットの腫瘍サイズは、コントロール、又は腫瘍細胞溶
菌液で処置したラットに比べて２倍縮小した。このアポトーシス小体のワクチン
有効性を多面的サイトカインであるＩＬ−２（図８）を用いてか又はマクロファ
ージによるファゴサイトーシス後に増強することができる（図９）。腫瘍罹患ラ
ットの治療的ワクチン接種は、腫瘍成長の有意な遅延を促進する部分的抗腫瘍応
答を誘導する。
【０１４７】 材料及び方法 １）腫瘍細胞培養物及びアポトーシスの誘導 我々の実験では、不十分な免疫原性であるラット大腸がん細胞系をEuropean C
ollection of Animal Cell Culture（DHD/K12/TRb(PEOb), Salisbury, UK）から
入手した。該細胞を、補体不活化ウシ胎児血清１０％、Ｌグルタミン２mM、ペニ
シリン１００単位／ml及びストレプトマイシン１００μgを添加したＲＰＭＩ１
６４０培地（Gibco BRL, Cergy Pontoise, France）で培養した。細胞をヘキス
ト３３２５８ラベリングによってマイコプラズマ汚染を日常的にチェックした。
プログラム細胞死を誘導するために、細胞を１０mMＮａＢｕｔで処理し、そして
Boisteau et alにしたがって精製した10。一時的に細胞を連続３日間処理した。
毎日、ＮａＢｕｔを有する培地を交換し、そして浮遊細胞を除去し、次いで４℃
で保存した。 ２）インビトロでのファゴサイトーシス（図５を参照せよ） マクロファージ５００００００個を２４ウェルプレートのＲＰＭＩ培地中に播
種した。
【０１４８】 ファゴサイトーシスを可視化するために、マクロファージをガラススライド上
で培養しそしてアポトーシス小体をヘキスト３３２５８で染色した。簡単には、
ＮａＢｕｔ処理の終わりに、プールした浮遊細胞をヘキスト３３２５８ ５μg
／mlで３０分間染色した。数回洗浄後、アポトーシス小体懸濁液をＲＰＭＩ培地
中で１００μgタンパク質／mlに調整した。マクロファージを蛍光アポトーシス
小体懸濁液中で１晩培養した。次の日、数回洗浄後、スライドをオリンパスＢＨ
２蛍光顕微鏡を用いて観察した。
【０１４９】 ファゴサイトーシスを定量するため、集密腫瘍ＰＲＯｂ細胞を上記のように、
〔3Ｈ〕チミジンで６時間染色し、次にＮａＢｕｔで３日間処理した。マクロフ
ァージを放射性アポトーシス小体で２、４、８、２４、又は４８時間インキュベ
ートした。数回洗浄後、マクロファージを溶解し、そしてファゴサイトーシスを
γ線シンチレーションカウンター（Beckman LS 6000 SC）でカウントするｄｐｍ
によって計測した。
【０１５０】 ３）単球／マクロファージ活性化 予め無菌Brewer's チオグリコラート（Difco）５mlを腹腔内投与したＢＤＩＸ
ラットの腹腔内をマクロファージを冷却ＰＢＳで洗浄することによって回収した
。簡単には、上記のように、腹腔滲出細胞を遠心分離し、冷却ＰＢＳで洗浄し、
ＲＰＭＩ培地に懸濁した。
【０１５１】 ４）インビボでのファゴサイトーシス 腹腔内のアポトーシス小体のマクロファージファゴサイトーシスを可視化する
ために、我々は製造者が記載しているように細胞リンカーＰＫＨ２６−ＧＬを用
いてアポトーシス小体を染色した。
【０１５２】 ５）フローサイトメトリー分析（表１のデータ） アポトーシス小体ファゴサイトーシス後のマクロファージの提示能力を分析す
るために、製造者が記載しているように、マクロファージをPolyMA１０mg/mlで
コートした６ウェルプレートに播種した。細胞をＲＰＭＩ培地のみでか又はアポ
トーシス小体（１００μgタンパク質相当量）を含有する培地で１晩培養した。
次の日、マクロファージを洗浄し染色した。
【０１５３】 フロサイトメトリー分析のためのラットｍＡｂはＯＸ１７（anti-CMHII、Sero
tec, France）、ＯＸ１８（anti-CMHI, Serotec, France）、ＥＤ３（anti-sial
oadhesin, Serotec, France）、ＯＸ−４１（anti-macrophage, Serotec, Franc
e）、３Ｈ５及び２４Ｆ（H. Yagita博士（順天堂大学、東京）より供与された、
それぞれanti-CD80 and CD86）。
【０１５４】 細胞外染色のため、マクロファージをホルムアルデヒドを用いて室温で１５分
間固定し、次にＢＳＡ０．１％を含有するＰＢＳで２度洗浄した。細胞をＰＢＳ
／ＢＳＡで２：１００に希釈したラット血清を用いて室温で３０分間浸させた。
細胞を洗浄し、そして９６ウェルＶ底プレートに１ウェル当たり２５００００細
胞で播種した。細胞をＰＢＳ／ＢＳＡで希釈したｍＡｂとともに３７℃で３０分
間インキュベートした。数回洗浄後、固定したｍＡｂをＦＩＴＣ（Serotec, Fra
nce）を結合した抗マウスＩｇＧ抗体を用いて検出した。染色の終わりに、細胞
を０．１％ＰＢＳ／ＢＳＡに懸濁しそしてＦＡＣＳａｎ（Becton Dickinson）で
分析した。
【０１５５】 細胞内分析のため、上記のように、マクロファージを固定し、浸漬した。次に
、これらをサポニン０．１％を含有する０．１％ＰＢＳ／ＢＳＡで洗浄した。細
胞をサポニン０．１％を含有する溶液中で上記で行ったように染色した。分析前
に、マクロファー所を０．１％ＰＢＳ／ＢＳＡに懸濁した。
【０１５６】 ６）リンパ球活性化（図６を参照せよ） − Ｔ細胞増殖 ＢＤＩＸラット脾細胞を吸引除去し、そして脾細胞をＲＰＭＩ培地（Gibco, C
ergy Pontoise, France）を用いる灌流によって抽出した。続いて、脾リンパ球
を２０℃で３０分間５００×ｇでの遠心分離によるFicoll Hypaque勾配（Serome
d）で単離した。この細胞を培地で２回洗浄し、そして培地中に１×１０6／mlで
懸濁した。上記のように単離した２０００細胞のマクロファージをアポトーシス
小体又は腫瘍細胞１００μgで、９６ウェル平底プレート内で１晩処理した。数
回洗浄後、Ｔ脾細胞１００００細胞を加えた。３日間の共培養後、増殖活性を液
体シンチレーション計数によって測定しながら、ＤＮＡ内への〔3Ｈ〕チミジン
（０．５μＣｉ／ウェル）の取り込みを１８時間にわたって測定した。各実験に
包含されたコントロールはマクロファージ単独又はＴ細胞単独である。
【０１５７】 ７）免疫療法 ＢＤＩＸラットは我々の研究室の近交系である。 − アポトーシス小体を用いるワクチン療法 ２月齢ラット（群当たり６匹）を、放射腫瘍細胞（１６０グレイ）若しくは分
画腫瘍細胞のタンパク質１００μgを含有するＲＰＭＩ２５０μlを用いてか、又
はＮａ−Ｂｕｔ処理したＰＲＯｂ細胞のアポトーシス小体１００μgを用いて合
計４回のワクチン接種のための、毎週のワクチン接種によって皮下に免疫化した
（図７を参照せよ）。サイトカインを併用した処理のために、ワクチン接種にＩ
Ｌ−２の１０００IU（Chiron, France）の皮下投与を加えた（図８を参照せよ）
。処理終了１週間後に、上記のようにラットに腫瘍細胞２．５×１０5細胞を皮
下投与し、
【０１５８】 − 活性化マクロファージを用いる養子免疫療法 マクロファージを、上記のように、予め無菌Brewer's チオグリコラート（Dif
co）５mlを腹腔内投与したＢＤＩＸラット腹腔内を、冷却ＰＢＳを用いて洗浄す
ることによって回収した。マクロファージ抽出２時間前に、分画された腫瘍細胞
のタンパク質又はＮａＢｕｔ処理された腫瘍細胞のアポトーシス小体５００μg
を含む等張バッファー１mlを腹腔内に注入した。マクロファージを上記のように
回収し、そして最終濃度５０万細胞／mlでＲＰＭＩ培地に懸濁した。マクロファ
ージを、製造者の記載しているように、ポリ（２−ヒトロキシ−エチルメタクリ
ラート）（Sigma, France）でコートしたＰ６ｐ内で培養した。ＩＮＦγ（１５
０IU／ml）を培養物に１晩加えた。次の日、マクロファージを４℃で１時間にわ
たってＰＢＳ／ＥＤＴＡ１０mMと共にインキュベートし、そして４℃で１０分間
、５００×ｇで遠心分離した。マクロファージを冷却ＰＢＳに懸濁し、そして５
００万細胞／mlに調整した。懸濁液１００μlをラットの足の裏に注入した。
【０１５９】 ラット６匹の５群が、放射アポトーシス小体、ＰＢＳ単独、マクロファージ単
独、又はファゴサイトースされたアポトーシス小体若しくは腫瘍細胞を有するマ
クロファージの足裏注入を３週間受けた。処置ラットは、もとの生存腫瘍細胞２
．５×１０5細胞の単回皮下注入を、最後の免疫化１週間後に受けた（図９を参
照せよ）。ファゴサイトーシスされたアポトーシス小体を有するマクロファージ
が最も効果的なワクチンであった。
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【図面の簡単な説明】
【図１】 組み込まれたアポトーシス小体を有する単球由来細胞の図式的な調製工程及び
働きを表したものである。 １）ヒト腫瘍又は腫瘍細胞（ＣＣで示した）をアポトーシスになるように処理
する；アポトーシス小体（ＡＢで示した）を単離する、 ２）それらをヒト血液単球由来細胞（ＭＤＣで示した）（単球由来細胞、マク
ロファージ又は未成熟樹状細胞）の存在下で培養する、 ３）単球由来細胞は、アポトーシス小体をファゴサイトーシスし、プロセスし
て、刺激される、 ４）それらは、それらの表面に腫瘍抗原を提示する、 ５）それらは、ヒトＴリンパ球（ＴＬで示した）の活性化及び増殖を誘導する
、 ６）得られた細胞傷害性リンパ球は、元のヒト腫瘍細胞を破壊する潜在的能力
を有する。
【図２Ａ】 図２Ａは、ＮａＢｕｔ中で３日間処理された腫瘍分子の経過を示し、特異的染
色によりアポトーシス性腫瘍細胞を表している。 腫瘍細胞の小塊は、アポトーシス性であるが、周辺は、連結する組織からの繊
維芽細胞を含んでいないことに気付くであろう。 （１）は、腫瘍のがん細胞の小塊に相当し、 （２）は、連結する組織に相当し、 （３）及び（４）は、腫瘍フラグメント中の小塊に相当する。
【図２Ｂ】 図２Ｂは、ＮａＢｕｔ３日後のヒト結腸の培地中に自然的に放出された浮遊細
胞の構造的観測に相当する。 ５mMで３日間のＮａＢｕｔ処理された培地をHoechst ３３２５８で染色し
、記載したＵ．Ｖ蛍光顕微鏡で評価した。完全な細胞膜を維持している、クロマ
チン凝集（→）は、アポトーシスプロセスにおけるＤＮＡの構造的マーカーであ
る〔×２５０〕。
【図２Ｃ】 図２Ｃは、ＮａＢｕｔ３日後のラット腫瘍細胞株の培地中に自然的に放出され
た浮遊細胞の構造的観測に相当する。 ５mMで３日間のＮａＢｕｔ処理された培地をHoechst ３３２５８で染色し、
記載したＵ．Ｖ蛍光顕微鏡で評価した。完全な細胞膜を維持している、クロマチ
ン凝集（→）は、アポトーシスプロセスにおけるＤＮＡの構造的マーカーである
〔×２５０〕。
【図３Ａ】 分化剤（ＮａＢｕｔ）で処理した後の、及び培地中に３日後に放出された細胞
中で起きているアポトーシスを示す電子顕微鏡可視化像を表す。印をつけた、細
胞質の濃縮は、アポトーシス小体を形成する細胞上でのオルガネラ及び小胞の完
全性の維持と共に気付かれる。 図３Ａにおいては、上部左側に壊死細胞がみられ、一方下部右側にアポトーシ
ス細胞がみられる。 （１）は、壊死細胞に相当し、（２）は、アポトーシス細胞に相当する。
【図３Ｂ】 図３Ｂは、アポトーシス細胞を高倍率（×３０００）にしたものに相当する。
【図４Ａ】 ＮａＢｕｔ処理又は血清欠乏状態の３日後の、培養した細胞から単離したＤＮ
Ａ（図４Ａ）又は培養した腫瘍フラグメント（図４Ｂ）の電気泳動パターンに相
当する。これは、アポトーシスの存在の指標であるＤＮＡ分解のヌクレオソーム
間パターンを説明する。 図４Ａにおいて、（１）はアポトーシス細胞のＤＮＡに、（２）は壊死細胞の
ＤＮＡに相当する。
【図４Ｂ】 ＮａＢｕｔ処理又は血清欠乏状態の３日後の、培養した細胞から単離したＤＮ
Ａ（図４Ａ）又は培養した腫瘍フラグメント（図４Ｂ）の電気泳動パターンに相
当する。これは、アポトーシスの存在の指標であるＤＮＡ分解のヌクレオソーム
間パターンを説明する。
【図５】 粘着性単球由来細胞によるエキソビボファゴサイトーシスされたアポトーシス
小体の運動論を表す。培養細胞のアポトーシスプロセスの誘導前は、それらは３
Ｈ−チミジンの存在下に２４時間維持された。アポトーシスはＮａＢｕｔ処理に
よって誘導した。浮遊アポトーシス細胞は、異なる回数に渡って、プールされ、
単球由来細胞上に播種した。数回洗浄した後、単球由来細胞を溶解し、放射能を
測定した。
【図６】 実験の初めだけに培地に混合される、増加する用量のＩＬ−２での９６時間の
刺激後のＴ細胞の増殖を表す。脾臓細胞は、アポトーシス小体又はフラグメント
化した細胞をファゴサイトーシスしているマクロファージの存在下においてイン
キュベートした。この実験のために、コントロールは、単独で又はファゴサイト
ーシスしているマクロファージなしで培養したリンパ球である（固定化細胞）。
Ｔ細胞の増殖は、培養の最後の１８時間の３Ｈ−チミジン体内化（縦軸はdpmに
よる放射能を示す）によって解析した。 横軸は、ＩＬ−２の濃度を単位／mlで示す： 丸印の曲線は、マクロファージ＋アポトーシス小体を示し、 太字十字印の曲線は、マクロファージ単独を示し、 十字印の曲線は、コントロールを示し、 三角印の曲線は、マクロファージ＋細胞抽出物を示す。
【図７】 死亡腫瘍細胞又はＮａＢｕｔで処理した腫瘍細胞からのアポトーシス小体を用
いたワクチン治療の結果を示す。 ４つの曲線はそれぞれ以下に相当する：（＋）コントロール；（中抜き四角）
アポトーシス小体；（中抜きひし形）放射線照射コントロール細胞；（塗りつぶ
しひし形）溶解した細胞。 縦軸は、mm3で示した自然腫瘍成長に相当する。 横軸は、腫瘍細胞注入後日数に相当する。
【図８】 抗腫瘍ワクチン処理においてアポトーシス小体とＩＬ−２の組み合わせで得ら
れた結果を示す。（＋）コントロール；（中抜き四角）アポトーシス小体でのワ
クチン処理又は（塗りつぶし四角）アポトーシス小体／ＩＬ−２組み合わせ、後
の腫瘍成長。 縦軸は、mmで示した、皮下腫瘍成長に相当する。 横軸は、腫瘍細胞注入後日数に相当する。
【図９】 応用免疫治療で得られた結果を示す：（中抜き丸）マクロファージ、（中抜き
四角）アポトーシス小体、又は（塗りつぶし丸）マクロファージによってファゴ
サイトーシスされたアポトーシス小体、でのワクチン処理の効果。（＋）コント
ロール。ワクチンは、ラットのフットパッド内に注射し、リンパ球系に直接流し
た。 縦軸は、mm3で示した、腫瘍成長に相当する。 横軸は、腫瘍細胞注入後日数に相当する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (71)出願人 イ・デ・エム・イミュノ−デジネ・モレキ ュル Ｉ．Ｄ．Ｍ．ＩＭＭＵＮＯ−ＤＥＳＩＧＮ ＥＤ ＭＯＬＥＣＵＬＥＳ フランス国、エフ−75011 パリ、リュ・ ドゥ・シャロン、172 (72)発明者 グレゴワル，マール フランス国、エフ−44300 ナント、リ ュ・ゴーディニエル 40 (72)発明者 バルトラン，ジャック フランス国、エフ−91440 ビュレ−シュ ール−イベット、リュ・デュ・ロイヨーム 10 Ｆターム(参考） 4B065 AA94X CA45 4C085 AA03 BB01 DD22 DD23 GG01 4C087 AA01 DA18 MA02 NA05 ZB26

Claims (36)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 患者の腫瘍バイオプシーから回収され、そしてアポトーシス
    へ誘導されるヒト腫瘍細胞に由来するアポトーシス小体（ここで、該アポトーシ
    ス小体は、下記特徴、すなわち、 − それらが、細胞膜完全性を維持しており、 − それらが、約０．１μmを超える、特に約０．５μmを超える小胞であり、 − それらが、腫瘍細胞を起源とする、無傷のミトコンドリア及び切断された核
    のＤＮＡを含有し、 − それらが、マスクされていない腫瘍抗原を提示し、 − それらが、患者の特定の腫瘍及びＭＨＣ抗原を提示する を有する）。
  2. 【請求項２】 切断された核のＤＮＡが、複数の１８０〜２００塩基対に切
    断されている、請求項１記載のアポトーシス小体。
  3. 【請求項３】 実質的に純粋な形態の、請求項１記載のアポトーシス小体。
  4. 【請求項４】 それらの膜上に特定のアポトーシスマーカーを提示している
    、請求項１〜３のアポトーシス小体。
  5. 【請求項５】 該マーカーが、下記の群、すなわち、 − アネキシンによって認識される外側膜上のホスファチジルセリン基、 − 膜上のシアロアドヘシン、 − 複数の１８０〜２００塩基対のＤＮＡ含有物 から選択される、請求項４記載のアポトーシス小体。
  6. 【請求項６】 請求項１〜５のいずれか１項記載の凍結又は凍結乾燥アポト
    ーシス小体のセットからなり、そして種々の患者を起源とするアポトーシス小体
    バンク。
  7. 【請求項７】 アポトーシス小体が、種々の腫瘍タイプ及び／又は種々のヒ
    ト腫瘍細胞系及び／又は種々の患者を起源とする、請求項６記載のアポトーシス
    小体バンク。
  8. 【請求項８】 下記工程、すなわち、 − バイオプシーからの腫瘍フラグメント又は腫瘍細胞の懸濁液の調製、 − アポトーシス小体を得るためのアポトーシスを誘導する手段を用いる腫瘍フ
    ラグメント又は腫瘍細胞の該懸濁液の処置 を含む、患者の腫瘍バイオプシーからのアポトーシス小体の調製方法。
  9. 【請求項９】 該アポトーシスを誘導する手段が、化学的作用因又はリガン
    ド又はＴＧＦβもしくはＴＮＦαのような成長因子である、請求項８記載の方法
    。
  10. 【請求項１０】 化学的作用因が、ブチラート誘導体、スタウロスポリン、
    スリンダク誘導体、炎症性サイトカイン、グルココルチコイド又は抗新生物性ヌ
    クレオシドアナログのような分化剤である、請求項９記載の方法。
  11. 【請求項１１】 アポトーシスを誘導する手段が、物理的作用因である、請
    求項８記載の方法。
  12. 【請求項１２】 物理的作用因が、下記手段、すなわち、イオン化、例えば
    γ線照射、ＵＶ照射、熱ショック、又は血清飢餓のようなストレス、あるいは該
    手段の組合わせの中から選択される、請求項８記載の方法。
  13. 【請求項１３】 アポトーシスを誘導する手段が、物理的及び化学的作用因
    である、請求項８記載の方法。
  14. 【請求項１４】 − 腫瘍フラグメントからか、又はアポトーシスを受けた
    腫瘍細胞からのアポトーシス小体の回収、 − 特に水簸によって遠心分離し、アポトーシス小体の濃縮物を得ること によるアポトーシス小体の精製の付加的工程を含む、請求項８〜１３いずれか１
    項記載の方法。
  15. 【請求項１５】 下記工程、すなわち、 − 予め不要な組織を除去し、そして切り刻まれる、目的の抗原又はタンパク質
    をコードするＤＮＡを組み込むことができる、腫瘍バイオプシーの腫瘍フラグメ
    ント又は腫瘍細胞懸濁液の調製、 − アポトーシスを誘導する手段を用いる腫瘍フラグメント又は腫瘍細胞の該懸
    濁液の処置（ここで、該処置を少なくとも５日間反復する）及び日毎の上清の収
    集、回収及び上清をプールすること、 − 該上清、及び適切な培地中の、遠心分離から得たペレットの懸濁液を含有す
    る培地の遠心分離、 − 上記の培地からの上清の回収、及び該上清を遠心分離しアポトーシス小体を
    得ること、 − アポトーシス小体の懸濁液の遠心分離、特に、約０．１μmを超える、特に
    約０．５μmを超える無傷の小胞からなるアポトーシス小体の集団の水簸 を含む、患者の腫瘍バイオプシーからのアポトーシス小体の調製のための、請求
    項８〜１４いずれか１項記載の方法。
  16. 【請求項１６】 アポトーシス小体の濃縮物が、適切な培地に再懸濁され、
    そして約４℃〜約１０℃に保たれるか、又は約−８０℃若しくは約−８０℃未満
    で凍結されるか、又は凍結乾燥される、請求項１５記載の方法。
  17. 【請求項１７】 アポトーシスの誘導が、酪酸ナトリウム又は硫化スリンダ
    クで行われる、請求項８〜１５いずれか１項記載のアポトーシス小体の調製方法
    。
  18. 【請求項１８】 アポトーシスの誘導が、ＵＶで行われる、請求項８〜１５
    いずれか１項記載のアポトーシス小体の調製方法。
  19. 【請求項１９】 アポトーシスの誘導が、熱ショックで行われる、請求項８
    〜１５いずれか１項記載のアポトーシス小体の調製方法。
  20. 【請求項２０】 アポトーシスの誘導が、γ線照射で行われる、請求項８〜
    １５いずれか１項記載のアポトーシス小体の調製方法。
  21. 【請求項２１】 請求項８〜２０いずれか１項記載の方法によって得られる
    ようなアポトーシス小体。
  22. 【請求項２２】 薬学的に適切な媒体と組み合わせて、請求項１〜５いずれ
    か１項記載のアポトーシス小体、又は請求項６又は７記載のバンクから引き出さ
    れたアポトーシス小体を活性物質として含有する薬学的組成物。
  23. 【請求項２３】 無菌の注入可能な溶液の形態である、請求項２２記載の薬
    学的組成物。
  24. 【請求項２４】 請求項１〜５いずれか１項記載のアポトーシス小体、又は
    請求項６又は７記載のバンクから引き出されたアポトーシス小体を活性物質とし
    て含有するワクチン。
  25. 【請求項２５】 請求項１〜５いずれか１項記載のアポトーシス小体、又は
    請求項６又は７記載のバンクから引き出されたアポトーシス小体の、がんの処置
    のための薬剤の調製のための使用。
  26. 【請求項２６】 請求項１〜４いずれか１項記載の組み込まれたアポトーシ
    ス小体、又は請求項６又は７記載のバンクから引き出されたアポトーシス小体を
    有し、そしてそれらが刺激され、そしてそれらが細胞性免疫応答の誘導を可能に
    するコンホメーションで、ＭＨＣ及び共刺激分子と共に、腫瘍特異的抗原及びマ
    スクされていない抗原（ここで、これらは、アポトーシス小体の組み込み前には
    ヒト単球由来細胞に存在しない）をそれらの膜上に提示するヒト単球由来細胞。
  27. 【請求項２７】 工程、すなわち、 − 単球由来細胞によるアポトーシス小体のファゴサイトーシスを可能にする適
    切な条件で、ヒト単球由来細胞と、請求項１〜５いずれか１項記載のアポトーシ
    ス小体、又は請求項６若しくは７記載のバンクから引き出されたアポトーシス小
    体とを共培養し（ここで、アポトーシス小体と樹状細胞の比率は少なくとも１で
    ある）、ファゴサイトーシスされたアポトーシス小体を有する細胞由来の単球を
    得ること、 − アポトーシス小体の細胞内消化、及び単球に由来する細胞膜上の、腫瘍及び
    マスクされていない抗原の提示を可能にする適切な条件下で、先行工程で得られ
    た該単球由来細胞をインキュベーションし、アポトーシス小体を含みそして細胞
    性免疫応答の誘導を可能にするコンホメーションでその膜上に腫瘍及びマスクさ
    れていない抗原を提示する刺激された単球由来細胞を得ること を含むアポトーシス小体を含有するヒト単球由来細胞の調製方法。
  28. 【請求項２８】 付加的工程、すなわち、 − 細胞保存を可能にする温度、例えば４℃で、アポトーシス小体を含有する単
    球由来細胞の遠心分離、そして例えば自家血清を含有する等張培地中での再懸濁
    を含む、請求項２７記載の方法。
  29. 【請求項２９】 付加的工程、すなわち、 − 細胞保存を可能にする温度、例えば４℃で、アポトーシス小体を含有する単
    球由来細胞の遠心分離、そして例えば自家血清を含有する等張培地中での再懸濁
    、及び − 約１０℃未満の温度での先行工程で得られたアポトーシス小体を含有する単
    球由来細胞の保存 を含む、請求項２７記載の方法。
  30. 【請求項３０】 付加的工程、すなわち、 − 細胞保存を可能にする温度、例えば４℃で、アポトーシス小体を含有する単
    球由来細胞の遠心分離、そして例えば自家血清を含有する等張培地中での再懸濁
    、及び − ポリエチレングリコール、グリセロールもしくはＤＭＳＯのような凍結保存
    剤を加えて、約−８０℃又は−８０℃未満の温度で、先行工程で得られたアポト
    ーシス小体を含有する刺激された単球由来細胞のアリコートを凍結すること を含む、請求項２７記載の方法。
  31. 【請求項３１】 該単球由来細胞が、下記工程、すなわち、 − 下記方法、すなわち、 １）血液アフェレーシスからか、又は血液バッグコレクションから直接的に血液
    由来単球細胞を回収し、続いて、必要ならば遠心分離によって、赤血球、顆粒球
    及び血小板の実質的部分を除去し、末梢血白血球をコレクションし、 ２）例えば遠心分離によって、先行工程で得られた末梢血白血球を洗浄し（血小
    板、赤血球及び細片の９０％を除去し）、単球細胞を得、 ３）先行工程で得られた細胞を、サイトカイン及び／又は自家血清を補完するこ
    とができる培地（ＲＰＭＩ又はＩＭＤＭタイプ）中に１０6〜２×１０7細胞／mL
    で再懸濁させ、そして疎水性通気袋中で、Ｏ2／ＣＯ2雰囲気下、３７℃で５〜１
    ０日間培養し、免疫刺激性単球由来細胞及び混入するリンパ球を得、 ４）場合により目的のタンパク質をコードするＤＮＡを組み込むことができる による単球由来細胞の調製 によって調製された、請求項２７〜３０いずれか１項記載の方法。
  32. 【請求項３２】 請求項２７〜３１いずれか１項記載の方法によって得られ
    るようなアポトーシス小体を含有するヒト単球由来細胞。
  33. 【請求項３３】 薬学的担体と組み合わせて、請求項２６記載のアポトーシ
    ス小体を含有するヒト単球由来細胞を活性物質として含有する、薬学的組成物。
  34. 【請求項３４】 無菌の注入可能な溶液の形態の、請求項３３記載の薬学的
    組成物。
  35. 【請求項３５】 薬学的担体と組み合わせて、請求項２６記載のアポトーシ
    ス小体を含有するヒト単球由来細胞を活性物質として含有する、ワクチン組成物
    。
  36. 【請求項３６】 がんの処置のための薬剤の調製のための、請求項２６記載
    のアポトーシス小体を含有するヒト単球由来細胞の使用。
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