ES2540255B1 - Método de aislamiento de cuerpos apoptóticos - Google Patents

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Abstract

Método de aislamiento de cuerpos apoptóticos.#La presente invención pertenece al campo del estudio de la apoptosis, en particular al campo del pronóstico y monitorización de enfermedades que cursan con apoptosis. En concreto, se refiere a un método de aislamiento de cuerpos apoptótitos a partir de una muestra de fluido corporal y a métodos de pronóstico y de evaluación de la eficacia de un tratamiento de enfermedades vasculares, neurodegenerativas y/u oncológicas, basados en la utilización de dicho método de aislamiento de cuerpos apoptóticos.

Description

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DESCRIPCION
Metodo de aislamiento de cuerpos apoptoticos Campo de la invencion
La presente invencion pertenece al campo de la apoptosis. En concreto, se refiere a un metodo para el aislamiento de cuerpos apoptoticos a partir de fluidos corporales y al uso de dicho metodo y cuerpos apoptoticos aislados para la evaluacion de procesos apoptoticos, en particular en patologfas como enfermedades vasculares, neurodegenerativas y oncologicas.
Antecedentes de la invencion
La apoptosis es un tipo de muerte celular ordenada que depende de la puesta en marcha de una cascada de eventos moleculares que culminan en la total desintegracion de la celula. En la etapa tardfa del proceso apoptotico, y como consecuencia de la fragmentacion celular, se generan pequenas vesfculas membranosas llamadas cuerpos apoptoticos.
En condiciones fisiologicas, la apoptosis participa en la morfogenesis y remodelacion de tejidos durante el desarrollo, y en la regulacion del sistema inmunologico y homeostasis. Sin embargo, dicho proceso juega tambien un papel fundamental en la muerte celular y tisular que tiene lugar en diversas patologfas, tales como las enfermedades vasculares, enfermedades neurodegenerativas y enfermedades oncologicas. La evaluacion de los procesos apoptoticos, en concreto la determinacion del grado de apoptosis o fndice apoptotico, en estas enfermedades serfa muy util en la practica clfnica diaria, dado que permitirfa un pronostico precoz y mas exacto, una monitorizacion mas efectiva de la evolucion de la enfermedad, y la seleccion de los tratamientos mas adecuados para cada paciente.
Sin embargo, el analisis in vivo de la apoptosis que se produce en los tejidos tiene una clara limitacion ya que actualmente es necesario conseguir muestras histologicas de los pacientes mediante metodos intervencionistas, biopsia o cirugfa. Por lo tanto, hay una necesidad sanitaria urgente de disponer de procedimientos no invasivos que permitan el estudio de la apoptosis, preferentemente de una manera rapida, sencilla y cuantitativa.
En el estado de la tecnica pueden encontrarse un gran numero de estudios que se centran
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en la determinacion de la muerte de un tejido, en particular mediante la obtencion y analisis de muestras solidas extrafdas por metodos invasivos como biopsias (muestras de tejido). El grado de apoptosis se determina por diferentes tecnicas conocidas por el experto en la materia, como son la deteccion de la fragmentacion del ADN (tecnica TUNEL, por ejemplo) y la deteccion de la fosfatidilserina presente en la parte externa de la membrana plasmatica de las celulas apoptoticas con Anexina V. Sin embargo, en estos metodos las muestras de los pacientes se obtienen mediante metodos invasivos. Ademas en la mayona de los casos se obtienen cultivos primarios de las biopsias y posteriormente se induce apoptosis para aislar cuerpos apoptoticos (WO 99/58645 A1), es decir, los cuerpos apoptoticos son aislados en condiciones no fisiologicas (induccion artificial de apoptosis).
Sorprendentemente, los autores de la presente invencion han desarrollado un metodo para aislar mediante centrifugacion cuerpos apoptoticos a partir de muestras de fluidos corporales. Es decir, dichos cuerpos apoptoticos estan aislados en condiciones fisiologicas, sin induccion artificial previa de apoptosis. Asimismo, con dicho metodo se puede aislar hasta mas de un 90% de la totalidad de cuerpos apoptoticos de la muestra de fluido corporal y ademas, los cuerpos apoptoticos mantienen su integridad, siendo por tanto detectables y cuantificables. En este sentido, el documento WO 03/076589 A2 describe metodos para detectar y analizar cuerpos apoptoticos de fluidos corporales. Entre los distintos metodos descritos, hay uno en el que se separan los cuerpos apoptoticos de la fraccion celular mediante centrifugacion. En una realizacion preferida, la muestra biologica es sangre y la misma se centrifuga a mas de 500 g, de manera preferente entre 800 g y 1.200 g, quedando los cuerpos apoptoticos en la fraccion de plasma. Si se desea separar o aislar dichos cuerpos apoptoticos del plasma, se lleva a cabo otra centrifugacion a alta velocidad (no se define a cual, para el experto en la materia en el campo de la presente invencion, una alta velocidad corresponded a una velocidad mayor de 60.000 g), despues de la cual los cuerpos apoptoticos quedan en el sedimento. Sin embargo, a diferencia de lo que se consigue con el metodo de la presente invencion, con las condiciones descritas en WO 03/076589 no es posible aislar hasta un 90% de la totalidad de los cuerpos apoptoticos presentes en los fluidos corporales, ni mantener su integridad. Esto se debe, en primer lugar, a que la centrifugacion a una velocidad mayor de 500 g para obtener el plasma o suero provoca la sedimentacion de todos los componentes celulares de la sangre, entre los que se encuentran las plaquetas. Estas celulas tiene facilidad para formar agregados, especialmente en presencia de otro tipo de celulas sangumeas, como son los hematfes y los leucocitos. Si esto tiene lugar, los cuerpos apoptoticos quedanan retenidos en los agregados celulares y la centrifugacion a una velocidad mayor de 500 g provocana su sedimentacion
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con la fraccion celular, y por lo tanto, la perdida de un gran numero de ellos. Por otro lado, la centrifugacion a alta velocidad del plasma o suero obtenido en la primera centrifugacion, podrfa resultar en la ruptura de los cuerpos apoptoticos y en la contaminacion de los mismos con otras vesfculas membranosas de menor tamano. Por estos inconvenientes, los cuerpos apoptoticos aislados segun el metodo descrito en WO 03/076589 A2 tendrfan poca o ninguna utilidad para el pronostico y/o monitorizacion del tratamiento de sujetos con enfermedades asociadas a apoptosis, dado que el numero de cuerpos apoptoticos aislados serfa muy inferior al que realmente hay en el fluido corporal y los cuerpos apoptoticos podrfan estar desintegrados y/o contaminados por otras microvesfculas resultando en una cuantificacion erronea de los cuerpos apoptoticos.
Sorprendentemente, los autores de la presente invencion han desarrollado un metodo de aislamiento de cuerpos apoptoticos que mantienen su integridad y pueden ser por tanto cuantificados. Ademas, el metodo de la invencion minimiza al maximo la perdida de cuerpos apoptoticos durante su aislamiento llegandose a aislar hasta mas del 90% de la totalidad de cuerpos apoptoticos presentes en la muestra de fluido corporal. De esta manera, los autores de la presente invencion han desarrollado una herramienta de gran utilidad para el estudio clfnico de la apoptosis. Asf, la presente invencion se refiere tambien a metodo de pronostico basados en la cuantificacion de cuerpos apoptoticos aislados siguiendo el metodo de la invencion y al uso de dichos cuerpos apoptoticos como factor pronostico y como marcador de la eficacia de un tratamiento terapeutico. Por ultimo, otra importante ventaja de la integridad de los cuerpos apoptoticos aislados por el metodo de la presente invencion es su uso para identificar el tipo celular de la celula que ha muerto por apoptosis, lo que proporciona una informacion de excepcional utilidad en el campo clfnico, en particular, de enfermedades neurodegenerativas, vasculares y oncologicas.
Objeto de la invencion
La presente invencion se refiere en un primer aspecto a un metodo para el aislamiento de cuerpos apoptoticos (metodo de la invencion) que comprende las siguientes etapas:
a) centrifugar una muestra de fluido corporal tomada de un sujeto, a una velocidad menor o igual a 300 g, y recoger el sobrenadante,
b) centrifugar el sobrenadante obtenido en la etapa a) a una velocidad entre 400 g y 1.000 g y recoger el sobrenadante,
c) centrifugar el sobrenadante obtenido en la etapa b) a una velocidad entre 8.000 g y
40.000 g y eliminar el sobrenadante,
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donde el sedimento obtenido en la etapa c) comprende los cuerpos apoptoticos aislados.
Un segundo aspecto de la presente invencion se refiere a un metodo de pronostico de una enfermedad vascular que comprende las siguientes etapas:
i) aislar cuerpos apoptoticos de una primera y una segunda muestra de fluido corporal tomadas de un paciente con una enfermedad vascular siguiendo el metodo de la invencion, donde la segunda muestra es tomada al menos 48 h despues de la primera muestra,
ii) cuantificar los cuerpos apoptoticos aislados en la etapa i), y
iii) comparar el numero de cuerpos apoptoticos aislados en las dos muestras, donde un mayor numero de cuerpos apoptoticos en la segunda muestra que en la primera es indicativo de un mal pronostico.
Un tercer aspecto de la presente invencion se refiere a un metodo de determinacion del estadio de una enfermedad neurodegenerativa que comprende las siguientes etapas:
I) aislar cuerpos apoptoticos de una muestra de fluido corporal tomada de un paciente con una enfermedad neurodegenerativa siguiendo el metodo de la invencion,
II) cuantificar los cuerpos apoptoticos aislados en la etapa I), y
III) comparar el numero de cuerpos apoptoticos aislados de la muestra con unos valores de referencia.
Un cuarto aspecto de la presente invencion se refiere a un metodo para analizar la eficacia de un tratamiento de una enfermedad vascular caracterizado por que comprende las siguientes etapas:
A) aislar cuerpos apoptoticos de dos muestras de fluido corporal tomadas de un paciente con una enfermedad vascular siguiendo el metodo de la invencion, donde una primera muestra es tomada antes del tratamiento y una segunda muestra es tomada despues del tratamiento, o donde las dos muestras son tomadas durante el tratamiento, una primera muestra una vez comenzado el tratamiento y una segunda muestra al menos 48 horas despues de la primera,
B) cuantificar los cuerpos apoptoticos aislados en la etapa A), y
C) comparar el numero de cuerpos apoptoticos en las dos muestras, donde un menor numero de cuerpos apoptoticos en la segunda muestra que en la primera indica que el tratamiento es eficaz.
Un quinto aspecto de la presente invencion se refiere a un metodo para analizar la eficacia de un tratamiento de una enfermedad oncologica y/o neurodegenerativa caracterizado por
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que comprende las siguientes etapas:
A) aislar cuerpos apoptoticos de dos muestras de fluido corporal tomadas de un paciente con una enfermedad oncologica y/o neurodegenerativa siguiendo el metodo de la invencion, donde una primera muestra es tomada antes del tratamiento y una segunda muestra es tomada despues del tratamiento, o donde las dos muestras son tomadas durante el tratamiento, una primera muestra una vez comenzado el tratamiento y una segunda muestra al menos dos semanas despues de la primera,
B) cuantificar los cuerpos apoptoticos aislados en la etapa A), y
C) comparar el numero de cuerpos apoptoticos en las dos muestras, donde en la enfermedad oncologica un mayor numero de cuerpos apoptoticos en la segunda muestra que en la primera indica que el tratamiento es eficaz y en la enfermedad neurodegenerativa un menor numero de cuerpos apoptoticos en la segunda muestra que en la primera indica que el tratamiento es eficaz.
Un sexto aspecto de la presente invencion se refiere a un metodo para identificar el tipo celular de una celula que ha muerto por apoptosis que comprende las siguientes etapas:
1) aislar cuerpos apoptoticos de una muestra de fluido corporal siguiendo el metodo de la invencion,
2) detectar en la parte externa de la membrana plasmatica del cuerpo apoptotico un marcador de tipo celular.
Un septimo aspecto de la presente invencion se refiere al uso del metodo de la invencion para pronostico de una enfermedad vascular y/o neurodegenerativa.
Un octavo aspecto de la presente invencion se refiere al uso del metodo de la invencion para evaluar la eficacia del tratamiento de una enfermedad oncologica, neurodegenerativa y/o vascular.
Un noveno aspecto de la presente invencion se refiere al uso del metodo de la invencion para identificar el tipo celular de una celula que ha muerto por apoptosis.
Breve descripcion de las figuras
Figura 1: Representacion grafica del numero de cuerpos apoptoticos (tambien referidos como CA de aquf en adelante) por mililitro de plasma en pacientes con sospecha de ictus isquemico, frente al tiempo en horas. En particular, se muestran los datos a las 4 y 96 h
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post-ictus. Se representan los CA procedentes de la muerte celular de distintos tipos celulares: microgka (blanco), oligodendrocitos (rayas verticales), neuronas (negro) y astrocitos (rayas oblicuas). Panel A: paciente con infarto cerebral de origen indeterminado. Panel B: paciente con infarto cerebral de origen cardioembolico.
Figura 2: Representacion grafica del numero de CA por mililitro de plasma en dos pacientes con sospecha de ictus isquemico. El analisis determino que el paciente 1 (1, en el eje de abscisas) sufrio un ataque isquemico transitorio (AIT) y el paciente 2 (2, en el eje de abscisas) un ictus isquemico. Los CA fueron aislados sin dilucion.
Figura 3: Representacion grafica del numero de CA por mililitro de plasma en dos pacientes con sospecha de ictus isquemico. El analisis determino que el paciente 1 (1) sufrio un AIT y el paciente 2 (2) un ictus isquemico.
Figura 4: Representacion grafica del numero de CA por mililitro de plasma en dos pacientes diagnosticados de esclerosis multiple remitente recurrente. El paciente 1 (1) sigue tratamiento con Interferon Beta y el paciente 2 (2) con Natalizumab. Se representan los cuerpos apoptoticos provenientes de la muerte celular de distintos tipos celulares: microglfa (blanco), oligodendrocitos (rayas verticales), neuronas (negro) y astrocitos (rayas oblicuas).
Figura 5: Representacion grafica del numero de CA por mililitro de plasma en cuatro pacientes diagnosticados de esclerosis multiple remitente recurrente, dos pacientes en estadio precoz (P) y dos pacientes en estadio avanzado (A).
Figura 6: Representacion grafica del numero de CA por mililitro de plasma en seis pacientes diagnosticados de enfermedad de Parkinson, dos pacientes en cada uno de los primeros estadios de la patologfa (I, II y III).
Figura 7: Representacion grafica del numero de CA por mililitro de plasma en tres pacientes (1, 2 y 3) diagnosticados de cancer de colon metastasico. El paciente 1 y el paciente 2 habfan recibido 6 ciclos de tratamiento quimioterapico con Folfiri, mientras que la paciente 3 no fue sometida a quimioterapia.
Descripcion detallada de la invencion
La presente invencion se refiere en un primer aspecto a un metodo para el aislamiento de
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cuerpos apoptoticos que comprende las siguientes etapas:
a) centrifugar una muestra de fluido corporal tomada de un sujeto, a una velocidad menor o igual a 300 g, y recoger el sobrenadante,
b) centrifugar el sobrenadante obtenido en la etapa a) a una velocidad entre 400 g y 1.000 g y recoger el sobrenadante,
c) centrifugar el sobrenadante obtenido en la etapa b) a una velocidad entre 8.000 g y
40.000 g y eliminar el sobrenadante,
donde el sedimento obtenido en la etapa c) comprende los cuerpos apoptoticos aislados.
Las condiciones de temperatura y tiempo a las que se llevan a cabo las centrifugaciones del metodo de la presente invencion son facilmente determinables por el experto en la materia. En una realizacion particular, se llevan a cabo a una temperatura entre 8°C y 41°C, de manera mas particular entre 12°C y 25°C, y durante al menos 5 minutos. El metodo de la presente invencion se lleva a cabo, preferentemente, en las tres horas siguientes a la recogida de la muestra de fluido corporal. Preferentemente, la muestra se mantiene en suave agitacion hasta el comienzo del metodo de aislamiento.
En la presente invencion el termino "cuerpo apoptotico" se refiere a una vesfcula membranosa, de un tamano de entre 1 pm y 4 pm que se origina por la muerte por apoptosis de las celulas, y que contiene fragmentos nucleares, material genetico y constituyentes citoplasmicos de la celula apoptotica. El termino “fluido corporal” se refiere al lfquido extracelular del cuerpo.
En una realizacion particular del metodo de la presente invencion, el fluido corporal se selecciona del grupo que consiste en sangre, plasma, orina, lfquido cefalorraqufdeo, lfquido ascftico, lfquido sinovial y lfquido amniotico. En otra realizacion particular, dicho fluido corporal es sangre, plasma u orina. En una realizacion mas particular, dicho fluido corporal es sangre o plasma, y en una realizacion preferente el fluido corporal es sangre.
En la presente invencion, se desaconseja el empleo de muestras de suero para extraer cuerpos apoptoticos circulantes ya que el suero sangufneo es el componente de la sangre resultante tras permitir la coagulacion de esta y excluir el coagulo de fibrina y otros componentes y durante la formacion del coagulo los cuerpos apoptoticos pueden quedar retenidos en la malla de fibrina y la eliminacion de la misma implicarfa la perdida de un gran numero de cuerpos apoptoticos. Asf, en una realizacion particular, cuando la muestra de fluido corporal es sangre, la muestra se recoge en un medio con anticoagulante. En una
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realizacion particular, el anticoagulante se selecciona del grupo formado por citrato sodico, EDTA sodico, EDTA potasico, heparina sodica, heparina potasica, heparina de litio, heparina de amonio, fluoruro sodico y mezclas de los mismos. En una realizacion preferida el anticoagulante es citrato sodico.
En la etapa a) del metodo de la invencion la velocidad de la centrifugacion no puede ser mayor de 300 g ya que eso resultana en la sedimentacion de todos los componentes celulares de la sangre, incluidas las plaquetas, arrastrando con ellos a una gran parte de los cuerpos apoptoticos de la muestra, lo que provocarfa la perdida de un gran numero de cuerpos apoptoticos. En una realizacion particular de la invencion, la velocidad de la centrifugacion de la etapa a) es entre 160 g y 300 g. Con este rango de velocidad se consigue una perdida minima de cuerpos apoptoticos con el sedimento.
La etapa b) del metodo de la invencion es necesaria para obtener un sobrenadante rico en cuerpos apoptoticos y libre de plaquetas y aquellos componentes celulares que no hayan sedimentado con la centrifugacion de la etapa a). Sin embargo, una velocidad superior a
1.000 g resultana en la perdida de cuerpos apoptoticos que sedimentan junto con las plaquetas y aquellos componentes celulares que no hayan sedimentado con la centrifugacion de la etapa a). La condicion preferida para aislar el mayor numero posible de cuerpos apoptoticos del sobrenadante obtenido en la etapa a) es una centrifugacion a una velocidad entre 500 g y 800 g. Asf, en una realizacion particular de la invencion, la etapa b) se lleva a cabo a una velocidad de entre 500 g y 800 g.
El sobrenadante obtenido en la etapa b) comprende ademas de cuerpos apoptoticos, otras microvesfculas circulantes como son micropartfculas y exosomas. Las micropartfculas circulantes son vesfculas membranosas secretadas por la activacion de distintos tipos celulares, entre los que destacan; celulas endoteliales, epiteliales, leucocitos y plaquetas. Estas micropartfculas tienen un tamano de 0,1 pm - 1pm y se forman de la evaginacion de la membrana plasmatica, mientras que los exosomas tienen un tamano menor (0,05 pm - 0,1 pm) y proceden de un compartimento intracelular: los cuerpos multivesiculares (MVB).
El objetivo de la etapa c) del metodo de la invencion es sedimentar los cuerpos apoptoticos con la minima concentracion de otras microvesfculas circulantes. Una velocidad de centrifugacion menor de 8.000 g no lograrfa la sedimentacion de la totalidad de los cuerpos apoptoticos presentes en el sobrenadante obtenido de la etapa b) y una velocidad superior a
40.000 g provocarfa la ruptura de los cuerpos apoptoticos y la sedimentacion de otras
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microvesiculas circulantes. En una realizacion particular de la invencion, la velocidad de la centrifugacion de la etapa c) es entre 11.000 g y 30.000 g, con la cual se reduce considerablemente la sedimentacion de otros tipos de microvesiculas. Al eliminar el sobrenadante, queda un sedimento que comprende los cuerpos apoptoticos aislados. Estos cuerpos apoptoticos pueden ser resuspendidos y almacenados a una temperatura entre 4°C y 8°C. Los cuerpos pueden resuspenderse en TBS (Tris-buffered saline, 2 mM Tris, 150 mM NaCl, pH:7,4), PBS (Phosphate-buffered saline, 10 mM fosfato, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl pH:7,4), Hepes (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid ) 10-50 mM, CHES (N- Cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic acid) 10-50mM, MOPS (3-(N-morpholino)propanesulfonic acid) 10-50 mM y PIPES (piperazine-N,N'-bis(2-ethanesulfonic acid) 10-50 mM. Los cuerpos apoptoticos resuspendidos pueden ser almacenados hasta doce meses, preferiblemente hasta seis meses. Los cuerpos apoptoticos resuspendidos en un tampon se refieren de aquf en adelante como preparacion de cuerpos apoptoticos.
Una importante ventaja del metodo de la presente invencion es que en el sedimento que comprende los cuerpos apoptoticos aislados el contenido de otras micropartfculas es inferior al 20% (Tabla 1, ejemplo 1). Este grado de pureza de cuerpos apoptoticos en el sedimento obtenido en la etapa c) del metodo de la invencion tiene una gran importancia a nivel clfnico, tal y como se explica mas adelante.
Ademas, otra importante ventaja del metodo de la presente invencion es su alto rendimiento de aislamiento de cuerpos apoptoticos. Con el metodo de la presente invencion se afslan al menos un 75% de los cuerpos apoptoticos presentes en la muestra de fluido corporal (Tabla 2, ejemplo 2). Sorprendentemente, puede incluso aislarse un mayor porcentaje de cuerpos apoptoticos mediante la dilucion del sobrenadante obtenido en la etapa a) en un tampon o solucion reguladora del pH antes de llevar a cabo la etapa b). Asf, en una realizacion particular del metodo de la invencion, entre las etapas a) y b) se lleva a cabo una etapa a1) en la que se diluye el sobrenadante obtenido en la etapa a) en un tampon. Con esta realizacion particular se puede aumentar el numero de cuerpos apoptoticos aislados a un porcentaje mayor o igual al 80% de los cuerpos apoptoticos presentes en la muestra de fluido corporal e incluso a un porcentaje mayor o igual al 90% (Tabla 2, ejemplo 2).
Los tampones compatibles con los fluidos corporales son conocidos por el experto en la materia. En una realizacion particular, el tampon de la etapa a1 se selecciona del grupo constituido por TBS, PBS, Hepes 10-50 mM, CHES 10-50mM, MOPS 10-50 mM y PIPES
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10-50 mM. En una realizacion preferente, el tampon es TBS. En otra realizacion preferente, la dilucion es 1:3 sobrenadante:tampon.
Inesperadamente, con el metodo de la presente invencion se obtienen cuerpos apoptoticos fntegros. En el contexto de la presente invencion “cuerpos apoptoticos fntegros” se refiere a cuerpos apoptoticos con la membrana plasmatica Integra, sin rupturas, es decir, los cuerpos apoptoticos no estan rotos o desintegrados. Esto permite la cuantificacion de dichos cuerpos apoptoticos, no unicamente el analisis o deteccion de sus componentes cuando se rompen como ocurre tfpicamente en los metodos de aislamiento de cuerpos apoptoticos descritos en el estado de la tecnica. La cuantificacion de los cuerpos apoptoticos tiene gran utilidad clfnica como metodo de pronostico y como metodo para evaluar la eficacia de un tratamiento terapeutico. Dicha utilidad clfnica se ve reforzada por el alto grado de pureza de los cuerpos aislado siguiendo el metodo de la presente invencion, con el cual, tal y como se ha indicado anteriormente, se obtiene un sedimento donde mas de un 80% son cuerpos apoptoticos. La presencia de otras microvesfculas en dicho sedimento dificulta su utilidad clfnica ya que resultana en una cuantificacion erronea de los cuerpos apoptoticos. La deteccion y cuantificacion de los cuerpos apoptoticos se basa en la union especffica de la anexina V a un lfpido, la fosfatidilserina, presente en la parte externa de la membrana plasmatica de los mismos. Se ha descrito que las micropartfculas tambien poseen dicho lfpido, por lo que serfan cuantificadas como si fueran cuerpos apoptoticos y el numero de los cuerpos apoptoticos cuantificados serfa por tanto superior al fisiologico.
Todas estas ventajas hacen del metodo de la presente invencion una herramienta de extremado valor en la practica clfnica diaria como metodo no invasivo para determinar el grado de muerte celular que ha tenido lugar en un sujeto, lo que permitirfa un pronostico precoz y mas exacto, una monitorizacion mas efectiva, y la seleccion de los tratamientos mas adecuados y por tanto una terapia personalizada en diversas patologfa, incluyendo enfermedades neurodegenerativas, vasculares y oncologicas. En el contexto de la presente invencion, el termino “metodo no invasivo” hace referencia a un metodo en el que se realizan inyecciones (para la extraccion de fluidos corporales) o se emplean herramientas que esten en contacto con el paciente de forma superficial o a cierta distancia. A diferencia de los metodos invasivos, en estas tecnicas no invasivas no es necesario realizar una incision para llegar al sitio o tejido de interes.
Asf, un segundo aspecto de la presente invencion se refiere a un metodo de pronostico de una enfermedad vascular caracterizado por que comprende las siguientes etapas:
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i) aislar cuerpos apoptoticos de una primera y una segunda muestra de fluido corporal tomadas de un paciente con una enfermedad vascular siguiendo el metodo de la invencion segun el primer aspecto de la invencion, donde la segunda muestra es tomada al menos 48 h despues de la primera muestra,
ii) cuantificar los cuerpos apoptoticos aislados en la etapa i), y
iii) comparar el numero de cuerpos apoptoticos aislados en las dos muestras, donde un mayor numero de cuerpos apoptoticos en la segunda muestra que en la primera es indicativo de un mal pronostico.
En el contexto de la presente invencion, el termino “mal pronostico”, tambien referido como pronostico desfavorable en el estado de la tecnica, se refiere a una baja probabilidad de recuperacion, y con ello, mayor riesgo o probabilidad de muerte. El termino “enfermedad vascular” se refiere a todo tipo de patologfa o enfermedad provocada o que cursa con la lesion o compresion de un vaso sangufneo. En una realizacion particular de la invencion, la enfermedad vascular se selecciona del grupo constituido por enfermedades cardiovasculares, cerebrovasculares y trombosis. En una realizacion mas particular de la invencion, la enfermedad vascular es una enfermedad cerebrovascular. En otra realizacion particular las muestras primera y segunda son tomadas con al menos 72 h de diferencia, y de manera mas particular, con al menos 92 h de diferencia. En una realizacion preferente dichas muestras son tomadas con 92 h de diferencia.
Asf, el uso del metodo de aislamiento de CA de la presente invencion segun el primer aspecto de la invencion, permite predecir el pronostico de un sujeto afecto de una enfermedad vascular en base a la cuantificacion de los cuerpos apoptoticos, de una manera rapida y sencilla y a partir de una muestra de fluido corporal (ver ejemplos 3, 4 y 5, figuras 1, 2 y 3, respectivamente).
La cuantificacion de los cuerpos apoptoticos aislados por el metodo segun el primer aspecto de la invencion tambien sirve para determinar el estadio de una enfermedad neurodegenerativa. Asf, un tercer aspecto de la presente invencion se refiere a un metodo de determinacion del estadio de una enfermedad neurodegenerativa caracterizado por que comprende las siguientes etapas:
I) aislar cuerpos apoptoticos de una muestra de fluido corporal tomada de un paciente con una enfermedad neurodegenerativa siguiendo el metodo de la invencion,
II) cuantificar los cuerpos apoptoticos aislados en la etapa I), y
III) comparar el numero de cuerpos apoptoticos aislados de la muestra con unos valores de
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referenda.
En el contexto de la presente invencion, el termino “enfermedad neurodegenerativa” se refiere a un grupo de enfermedades cronicas del sistema nervioso, caracterizadas por perdida neuronal (sustancia gris) y/o glial (sustancia blanca) progresiva. Diversos factores geneticos y ambientales participan en la etiologfa de las enfermedades neurodegenerativas produciendo alteraciones de los sistemas cognoscitivos, sensitivos y motores. En una realizacion particular de la invencion, la enfermedad neurodegenerativa se selecciona del grupo constituido por esclerosis multiple, esclerosis lateral amiotrofica (ELA), Alzheimer, Parkinson y enfermedad de Huntington. En una realizacion mas particular de la invencion, la enfermedad neurodegenerativa se selecciona del grupo constituido por esclerosis multiple, Alzheimer y Parkinson.
Con este metodo se puede identificar el estadio de una enfermedad neurodegenerativa y con ello el pronostico de dicha enfermedad. En el caso de enfermedades neurodegenerativas, los niveles de cuerpos apoptoticos en la muestra de un fluido corporal en estadios iniciales son mayores que en estadios avanzados. En particular, en el caso de enfermedades neurodegenerativas en estadios iniciales los niveles de cuerpos apoptoticos son de mas de 30.000 CA por ml de plasma y en estadios avanzados son de menos de
30.000 CA por ml de plasma. Asf, en una realizacion particular del metodo de la invencion, un numero de CA por ml de plasma mayor de 30.000, en particular de 30.000 a 150.000, es indicativo de que la enfermedad neurodegenerativa esta en estadios iniciales y un numero de CA por ml de plasma menor de 30.000, en particular de 5.000 a 20.000, es indicativo de que la enfermedad neurodegenerativa esta en estadios avanzados. Por ejemplo, un sujeto con Parkinson y con un numero de CA por ml de plasma mayor de 30.000 estarfa en estadio I o II, y con Esclerosis Multiple y un numero de CA por ml de plasma menor de 30.000 estarfa en un estadio avanzado de la enfermedad (ver ejemplos 7 y 8, figuras 5 y 6 respectivamente).
La presente invencion se refiere tambien a un metodo para analizar la eficacia del tratamiento recibido por un sujeto con una enfermedad oncologica, neurodegenerativa y/o vascular.
Asf, un cuarto aspecto de la presente invencion se refiere a un metodo para analizar la eficacia de un tratamiento de una enfermedad vascular caracterizado por que comprende las siguientes etapas:
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A) aislar cuerpos apoptoticos de dos muestras de fluido corporal tomadas de un paciente con una enfermedad vascular siguiendo el metodo de la invencion segun el primer aspecto de la invencion, donde una primera muestra es tomada antes del tratamiento y una segunda muestra es tomada despues del tratamiento, o donde las dos muestras son tomadas durante el tratamiento, una primera muestra una vez comenzado el tratamiento y una segunda muestra al menos 48 horas despues de la primera,
B) cuantificar los cuerpos apoptoticos aislados en la etapa A), y
C) comparar el numero de cuerpos apoptoticos en las dos muestras, donde un menor numero de cuerpos apoptoticos en la segunda muestra que en la primera indica que el tratamiento es eficaz.
En una realizacion mas particular de este metodo, las muestras de la etapa A) se toman con al menos 72 h de diferencia, y de manera mas particular, con al menos 92 h de diferencia y de manera preferente con 92 h de diferencia.
Un quinto aspecto de la presente invencion se refiere a un metodo para analizar la eficacia de un tratamiento de una enfermedad oncologica y/o neurodegenerativa caracterizado por que comprende las siguientes etapas:
A) aislar cuerpos apoptoticos de dos muestras de fluido corporal tomadas de un paciente con una enfermedad oncologica y/o neurodegenerativa siguiendo el metodo de la invencion segun el primer aspecto de la invencion, donde una primera muestra es tomada antes del tratamiento y una segunda muestra es tomada despues del tratamiento, o donde las dos muestras son tomadas durante el tratamiento, una primera muestra una vez comenzado el tratamiento y una segunda muestra al menos dos semanas despues de la primera,
B) cuantificar los cuerpos apoptoticos aislados en la etapa A), y
C) comparar el numero de cuerpos apoptoticos en las dos muestras, donde en la enfermedad oncologica un mayor numero de cuerpos apoptoticos en la segunda muestra que en la primera indica que el tratamiento es eficaz y en la enfermedad neurodegenerativa un menor numero de cuerpos apoptoticos en la segunda muestra que en la primera indica que el tratamiento es eficaz.
En el caso de las enfermedades oncologicas, los tratamientos antitumorales: quimioterapia, radioterapia y terapias biologicas, estan dirigidos a matar las celulas tumorales induciendo apoptosis y por lo consiguiente su desintegracion. Si el paciente responde al tratamiento, es decir, la terapia funciona, es eficaz, se produce la muerte del tumor, y por lo tanto se detectan niveles mas altos de cuerpos apoptoticos en la segunda muestra de fluido corporal
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que en la primera (ver ejemplo 9, figura 7).
En el caso de una enfermedad neurodegenerativa y/o vascular si el paciente responde al tratamiento (la terapia es eficaz), se detectan niveles mas bajos de cuerpos apoptoticos en la segunda muestra de fluido corporal que en la primera (ver el ejemplo 6, figura 4, para una enfermedad neurodegenerativa).
En el contexto de la presente invencion, las enfermedades oncologicas se refieren a un grupo de enfermedades cuya causa es la aparicion de un tumor. El tumor suele invadir el tejido circundante y puede provocar metastasis en puntos distantes del organismo En una realizacion particular, la enfermedad oncologica se selecciona del grupo que consiste en cancer colorectal, de pancreas, de estomago, de esofago, de hfgado, de pulmon, de mama, de ovario, de utero, de prostata, de testfculo, de tiroides, de cabeza y cuello, tumores cerebrales (gliomas y neuroblastomas) y melanomas. En una realizacion mas particular, la enfermedad oncologica se selecciona del grupo que consiste en cancer colorectal y cancer de hfgado.
La integridad de los cuerpos apoptoticos aislados por el metodo segun el primer aspecto de la presente invencion permite, ademas de su cuantificacion, identificar el tipo celular del que provienen, es decir, permite identificar que tipo de celula ha muerto por apoptosis. Esta informacion es muy importante a nivel clfnico en enfermedades vasculares, neurodegenerativas y oncologicas y, en especial, en el campo de las enfermedades neurodegenerativas y cerebrovasculares. Dependiendo del tipo de celula del sistema nervioso que haya muerto asf sera la severidad de la patologfa e influira en su evolucion o pronostico. Por ejemplo, dos pacientes con un infarto isquemico en los que se detecta un incremento de los cuerpos apoptoticos en la segunda muestra de fluido corporal (al menos 48 h despues de la toma de la primera muestra) tienen un mal pronostico. Ademas, la enfermedad puede agravarse, o en otras palabras, el pronostico puede empeorar si el numero de cuerpos apoptoticos procedentes de neuronas es muy alto, ya que estas tienen escasa capacidad de regeneracion en comparacion con el resto de celulas del sistema nervioso, como por ejemplo, los astrocitos. Otro ejemplo, dos pacientes con esclerosis multiple, con el mismo numero de cuerpos apoptoticos en la muestra de fluido corporal, el sujeto cuyo numero de cuerpos apoptoticos procedentes de oligodendrocitos sea mayor tendra un pronostico mas desfavorable. Los oligodendrocitos son los componentes celulares encargados de la mielinizacion de los axones neuronales, un mayor proceso de desmielinizacion va acompanado de un empeoramiento de la enfermedad. Asimismo, la
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identificacion del tipo celular que ha muerto por apoptosis es cifnicamente muy relevante en las enfermedades oncologicas, en especial, en la evaluacion de la eficacia del tratamiento antitumoral. Por ejemplo, dos pacientes diagnosticados de cancer de colon que han recibido tratamiento quimioterapeutico en los que se detectan niveles plasmaticos altos de cuerpos apoptoticos tras la terapia es indicativo de eficacia del dicho tratamiento. En este contexto, un numero de cuerpos apoptoticos (CA por ml de muestra) procedente de celulas tumorales mas elevada indicara una mayor eficacia de dicho tratamiento.
Asf, un sexto aspecto de la presente invencion se refiere a un metodo para identificar el tipo celular de una celula que ha muerto por apoptosis caracterizado por que comprende las siguientes etapas:
1) aislar cuerpos apoptoticos de una muestra de fluido corporal siguiendo el metodo de la invencion,
2) detectar en la parte externa de la membrana plasmatica del cuerpo apoptotico un marcador de tipo celular.
En el contexto de la presente invencion se entiende por “marcador de tipo celular”, a una protefna que es especffica o se encuentra unicamente en un tipo de celula. En concreto, en la presente invencion dicha protefna se debe encontrar en la parte externa de la membrana plasmatica de la celula o debe ser una protefna transmembrana. En este metodo se pueden detectar uno o varios marcadores de tipo celular.
En una realizacion particular del metodo para identificar el tipo celular de una celula que ha muerto por apoptosis, el marcador de tipo celular es un marcador neuronal, y de manera mas particular dicho marcador neuronal se selecciona del grupo constituido por CD90 (Molecula de adhesion neuronal L1), NGFR (Receptor del factor de crecimiento nervioso) p75, PSA-NCAM, Efrina-A2, Efrina-A4, Efrina-A5, Efrina-B1, Efrina-B2, GAP-43, Laminina-1, NAP-22, Netrina-1, Neurofilina, Plexina-A1, Semaforina 3A, Semaforina 3F, Semaforina 4D, Trk A, Encefalina, GAD65 (glutamato descarboxilasa), GAP-43 (protefna asociada al crecimiento 43), LINGO-1, subunidad de la Na+/K+ ATPasa, transportador de Colina, transportador de Dopamina (DAT), transportador de Norepinefrina (NET), transportador de Serotonina (SERT), Transportador 1,2 y 3 de GABA, Transportador neuronal de glutamato,, Protefna de union a AMPA (ABP), Complexina 1 (CPLX1), Contactina-1, VAMP-2, transportador vesicular de acetilcolina (VAChT), transportador vesicular de GABA (VGAT; VIAAT), transportador vesicular de glutamato 1, 2, 3 (VGLUT), transportador vesicular de monoamina 1, 2 (VMAT) y N-cadherina, E-cadherina.
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En una realizacion particular del metodo para identificar el tipo celular de una celula que ha muerto por apoptosis, el marcador de tipo celular es un marcador glial, y de manera mas particular dicho marcador glial se selecciona del grupo constituido por GLAST, CD11b, CD100, CD104 y NG2 proteoglicano sulfato de condroitina. En una realizacion mas particular del metodo para identificar el tipo celular de una celula que ha muerto por apoptosis, el marcador de tipo celular se selecciona del grupo constituido por CD90, GLAST, CD11b y CD100. Asf se identifican neuronas, astrocitos, la microglia y oligodendrocitos, respectivamente (ver ejemplos 3 y 6, figuras 1 y 4 respectivamente).
En cuanto a las enfermedades oncologicas, sirve como marcador de tipo celular cualquier antfgeno tumoral descrito en el estado de la tecnica. En una realizacion particular del metodo para identificar el tipo celular de una celula que ha muerto por apoptosis, el marcador de tipo celular es antfgeno tumoral seleccionado del grupo constituido por antfgeno carcinoembrionario (CEA), antfgeno de membrana especffico de prostata (PSMA), mucinas, integrinas y receptores tirosina quinasa. Las mucinas incluyen CA-125, CA-19-9 y CA-15-3, las integrinas incluyen EpCAM (molecula de adhesion epitelial), CD24, CD44, CD49, CD100 y CD104 y los receptores tirosina quinasa incluyen EGFR (receptor del factor de crecimiento epidermico), FGFR (receptor del factor de crecimiento de fibroblastos), VEGFR (receptor del factor de crecimiento endotelial vascular) PDGF (receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas) y el receptor de insulina
Asf, en otra realizacion particular del metodo para identificar el tipo celular de una celula que ha muerto por apoptosis, el marcador de tipo celular se selecciona del grupo constituido por CD90, GLAST, CD11b, CD100 y antfgenos tumorales.
La cuantificacion de los CA llevada a cabo en cualquiera de los metodos descritos en los aspectos segundo, tercero, cuarto, quinto y sexto de la presente invencion, se puede llevar a cabo mediante tecnicas convencionales, ampliamente conocidos por el experto en la materia. En una realizacion particular, la cuantificacion de CA se lleva a cabo por un metodo seleccionado del grupo constituido por citometrfa de flujo, tecnologfa de nanosight ® NTA “nanoparticle tracking analysis” y tecnologfa de impedancia. En una realizacion preferente la cuantificacion de CA se lleva a cabo por citometrfa de flujo o tecnologfa de nanosight ® NTA.
Un septimo aspecto de la presente invencion se refiere al uso del metodo de la invencion
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segun el aspecto primero de la invencion para pronostico. Una realizacion particular de este aspecto se refiere al uso del metodo de la invencion para pronostico de enfermedades vasculares y/o neurodegenerativas.
Un octavo aspecto de la presente invencion se refiere al uso del metodo de la invencion para evaluar la eficacia del tratamiento de una enfermedad oncologica, neurodegenerativa y/o vascular.
Un noveno aspecto de la presente invencion se refiere al uso del metodo de la invencion para identificar el tipo celular de una celula que ha muerto por apoptosis. Los marcadores del tipo celular son aquellos descritos anteriormente en el sexto aspecto de la presente invencion.
Por ultimo, la presente invencion se refiere tambien a los cuerpos apoptoticos aislables por el metodo de la invencion segun el primer aspecto de la invencion. Una realizacion particular, se refiere a un cuerpo apoptotico aislable por el metodo de la invencion, que comprende en la membrana externa CD90, GLAST, CD11b, CD100 o un antfgeno tumoral. Una realizacion mas particular, se refiere a un cuerpo apoptotico aislable por el metodo de la invencion, que comprende en la membrana externa CD90, GLAST, CD11 b o CD100.
Todas estas ventajas hacen del metodo de aislamiento de cuerpos apoptoticos de la presente invencion una herramienta de extremado valor en la practica clfnica diaria como metodo no invasivo para determinar el grado de muerte celular que ha tenido lugar en los pacientes, lo que permitirfa un pronostico precoz y mas exacto, una monitorizacion mas efectiva de la evolucion del paciente, y la seleccion de los tratamientos mas adecuados en diversas patologfas, incluyendo enfermedades neurodegenerativas, vasculares y oncologicas. Se proporciona asf una terapia mas personalizada que puede alertar de un pronostico desfavorable a pesar de que otros parametros clfnicos puedan ser favorables. Asimismo, como ya se ha mencionado anteriormente, es un metodo que puede llevarse a cabo a partir de distintos fluidos corporales lo que le convierte en un metodo de rapida y facil aplicacion, siendo ademas un metodo de interpretacion sencilla, facilmente reproducible y de bajo coste economico.
Ejemplos
A continuacion se detallan unos ejemplos concretos de realizacion de la invencion que sirven para ilustrar la invencion sin limitar el alcance de la misma.
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EJEMPLO 1: Aislamiento de cuerpos apoptoticos. Pureza.
El estudio cifnico incluye 6 pacientes, dos diagnosticados de ictus isquemico (paciente 1: mujer de 85 anos, Paciente 2: hombre de 59 anos), dos de esclerosis multiple (paciente 3: Mujer de 51 anos, Paciente 4: Hombre de 32 anos) y dos de enfermedad de Parkinson (Paciente 5: Hombre de 61 anos, Paciente 6: Mujer de 68 anos).
Se recogio sangre (20 ml) de cada paciente en el servicio de neurologfa y se deposito en tubos con citrato sodico. Transcurridos menos de 2 horas desde la extraccion se procedio al aislamiento de cuerpos apoptoticos mediante centrifugaciones seriadas segun el metodo del primer aspecto de la invencion, tal y como se indica a continuacion:
Las muestras sangufneas fueron sometidas a centrifugacion: 250 g durante 10 min a 18°C. La fase de plasma de la muestra procedente del paciente 1 fue diluida en tampon TBS 1X en una relacion 1:3 (etapa a1) y centrifugado a 850 g durante 20 min a 18°C (etapa b). El sobrenadante de la centrifugacion anterior fue traspasado a un tubo limpio de policarbonato y centrifugado a 12.000 g durante 20 min a 9°C (etapa c). El sobrenadante de la ultima centrifugacion fue eliminado y el sedimento que contiene los cuerpos apoptoticos, fue resuspendido mediante pipeteo en tampon TBS 1X.
Posteriormente, las preparaciones de CA fueron analizadas mediante citometrfa de flujo para determinar el numero total de microvesfculas (MV)(vesfculas positivas para Anexina V), incluyendo cuerpos apoptoticos (CA), micropartfculas (MP) y exosomas (EXO), por mililitro de plasma. Para ello, las muestras fueron incubadas con Anexina-V e loduro de propidio (IP).
Los resultados de este analisis se muestran en la tabla 1. Sorprendentemente, el numero total de CA (positivos para Anexina V e loduro de propidio en analisis por citometrfa de flujo) aislados por mililitro de plasma, representaba mas del 80% del total de microvesfculas obtenidas por el procedimiento objeto de la invencion, mientras que el numero de micropartfculas y exosomas (positivos para Anexina V y negativos para loduro de propidio en analisis por citometrfa de flujo) fue inferior al 20% del total de microvesfculas. Estos hallazgos demuestran que el sedimento y las preparaciones de CA obtenidas por el procedimiento objeto de la presente invencion tienen un alto grado de pureza, es decir, estan mfnimamente contaminados con otras microvesfculas.
Tabla 1Pureza del sedimento que comprende los CA.
n° MV/ml plasma n° CA/ml plasma n° MP+EXO/ml plasma
(Anexina V+)
(Anexina V+/IP+) (Anexina V+/IP-)
Paciente 1
142.530 124.000 (87%) 18.530
Paciente 2
93.902 77.000 (82%) 16.902
Paciente 3
35.164 32.000 (91%) 3.764
Paciente 4
44.705 38.000 (85%) 6.705
Paciente 5
40.588 34.500 (85%) 6.088
Paciente 6
44.681 42.000 (94%) 2.681
EJEMPLO 2: Aislamiento de cuerpos apoptoticos. Rendimiento.
5 El estudio clfnico incluye 2 pacientes, dos diagnosticados de ictus isquemico (paciente 1: Hombre de 76 anos, Paciente 2: hombre de 58 anos).
Se recogio sangre (20 ml) de cada paciente en el servicio de neurologfa y se deposito en tubos con citrato sodico. Transcurridos menos de 2 horas desde la extraccion se procedio al aislamiento de cuerpos apoptoticos segun se indica a continuacion:
10 Las muestras sangufneas fueron sometidas a centrifugacion: 160 g durante 20 min a 18°C. La fase de plasma (que contiene los cuerpos apoptoticos) de la muestra procedente del paciente 2 fue traspasada a un tubo esteril de polipropileno (etapa a) y centrifugado a 700 g durante 30 min a 18°C (etapa b). La fase de plasma de la muestra procedente del paciente 1 fue diluida en tampon TBS 1X en una relacion 1:3 (etapa a1) y centrifugado a 700 g durante 15 30 min a 18°C (etapa b). El sobrenadante de la centrifugacion anterior fue traspasado a un
tubo limpio de policarbonato y centrifugado a 14.000 g durante 30 min a 9°C (etapa c). El sobrenadante de la ultima centrifugacion fue eliminado y el sedimento que contiene los cuerpos apoptoticos, fue resuspendido mediante pipeteo en tampon TBS 1X.
20 En ambos casos, antes de proceder al aislamiento de cuerpos apoptoticos, se retiro una parte (1 ml) de la fase de plasma para determinar el numero de cuerpos apoptoticos por mililitro mediante citometrfa de flujo (incubacion con Anexina-V e loduro de propidio).
Asimismo, las preparaciones de cuerpos apoptoticos fntegros y con un alto grado de pureza 25 (mfnimamente contaminados con otras microvesfculas) obtenidas mediante el protocolo anterior fueron analizadas mediante citometrfa de flujo para determinar el numero total de cuerpos apoptoticos por mililitro de plasma. Para ello, los cuerpos apoptoticos fueron incubados con Anexina-V e loduro de propidio.
Los resultados de este analisis se muestran en la tabla 2. El numero total de cuerpos apoptoticos aislados por mililitro de plasma, representaba el 90% del total de cuerpos apoptoticos presentes en el plasma si se obtenfan mediante el procedimiento objeto de la 5 invencion incluyendo la etapa a1 (dilucion), mientras que si dicha etapa no era realizada el numero total de cuerpos apoptoticos aislados suponfa el 78% del total presente en el plasma.
Tabla 2.- Rendimiento del aislamiento
n° TOTAL CA/ml plasma n° CA/ml plasma (aislamiento sin dilucion) n° CA/ml plasma (aislamiento con dilucion)
Paciente 1
94.445 85.000 -
Paciente 2
173.075 - 135.000
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EJEMPLO 3: Ictus isquemico
El estudio clfnico incluye dos pacientes, mujer de 78 anos y mujer de 70 anos, que fueron atendidas por el servicio de Neurologfa por sospecha de Ictus isquemico. Se les realizo un 15 TC-simple con protocolo de perfusion que mostro una lesion isquemica en el territorio de la arteria cerebral media derecha en la paciente 1 y en el area de la arteria cerebral media izquierda en la paciente 2. A continuacion, se muestran los datos clfnicos registrados de cada paciente;
- etiologfa segun clasificacion TOAST:
20 Paciente 1: Infarto cerebral de origen indeterminado.
Paciente 2: Infarto cerebral de origen cardioembolico.
- valoracion radiologica: (i) inicial (determinacion del volumen de infarto inicial, obtenido de la prueba de TC- perfusion) y (ii) final, a las 96 h desde el inicio de los sfntomas (se realizo un TC-simple para determinar el volumen de infarto final).
25 Paciente 1: volumen de infarto inicial: 22.310 mm3, volumen de infarto a las 96 h:
57.127 mm3. La lesion isquemica aumento 2,5 veces durante las primeras 96 h.
Paciente 2: volumen de infarto inicial: 5.080 mm3, volumen de infarto a las 96h: 5.500 mm3. No se registro un aumento de la region infartada durante las primeras 96 h.
- situacion funcional segun la escala NIHSS: (i) inicial y (ii) final, a las 96 h post-ictus, lo que 30 permite determinar la evolucion del infarto cerebral:
Paciente 1: Infarto progresivo (aumento de mas de 4 puntos en la escala)
Paciente 2: Infarto regresivo (descenso de mas de 4 puntos en la escala).
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Se recogio sangre (20 ml) de cada paciente y se deposito en tubos con citrato sodico durante la evolucion inicial y posteriormente a las 96 h desde el inicio de los smtomas del ictus. Transcurridos menos de 2 h desde la extraccion, se procedio al aislamiento de cuerpos apoptoticos como se indica a continuacion:
Las muestras sangumeas fueron sometidas a centrifugacion: 250 g durante 10 min a 18°C. La fase de plasma fue traspasada a un tubo esteril de polipropileno y fue diluida en tampon TBS 1X en una relacion 1:3 y centrifugado a 850 g durante 20 min a 18°C. El sobrenadante de la centrifugacion anterior fue traspasado a un tubo limpio de policarbonato y centrifugado a 12.000 g durante 20 min a 9°C. El sobrenadante de la ultima centrifugacion fue eliminado y el sedimento que contiene los cuerpos apoptoticos, fue resuspendido mediante pipeteo en tampon TBS 1X.
Posteriormente, las preparaciones de CA mtegros y con un alto grado de pureza fueron analizadas mediante citometna de flujo para determinar el numero total de CA por mililitro de plasma que procede de la muerte de celulas del sistema nervioso (microglfa, oligodendrocitos, neuronas y astrocitos) de cada paciente. Para ello, los cuerpos apoptoticos fueron incubados con Anexina-V, loduro de propidio, y anticuerpos, anti-CD11b, anti- CD100, anti-CD90 y anti-GLAST
Los resultados de este analisis se exponen en la figura 1. En la paciente 1, con un infarto progresivo y que experimento un aumento de la lesion isquemica durante las primeras 96 horas desde el inicio de los smtomas del ictus, se detecto un incremento significativo de los niveles de CA procedentes de la muerte de tejido nervioso, mientras que en la paciente 2, con un infarto regresivo y sin aumento de la region isquemica, la concentracion de CA disminuyo considerablemente transcurridas 96 horas post-infarto.
Por lo tanto, estos resultados indican que la cuantificacion de los cuerpos apoptoticos de origen neuronal y glial aislados mediante el procedimiento objeto de la presente invencion es un marcador de muerte cerebral que permite la monitorizacion efectiva de la isquemia cerebral, asf como, la determinacion precisa del pronostico o evolucion del paciente infartado. Esta informacion ayudana enormemente al desarrollo y seleccion de tratamientos adecuados para cada paciente (terapia personalizada).
EJEMPLO 4: Ictus isquemico
El estudio clmico incluye dos pacientes, Hombre de 76 anos y Hombre de 85 anos, que
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fueron atendidos por el servicio de Neurologfa por sospecha de Ictus isquemico. La evaluacion radiologica inicial mostro que el paciente 1 no presentaba lesiones isquemicas cerebrales, y el paciente 2 tenia un volumen de infarto cerebral de 17.455 mm3. La exploracion neurologica completa determino que el paciente 1 sufrio un AIT con recuperacion funcional completa, mientras que el paciente 2 tuvo un ictus isquemico de origen aterotrombotico.
Se recogio sangre (20 ml) de cada paciente y se deposito en tubos con citrato sodico durante la evolucion inicial. Transcurridos menos de 2 horas desde la extraccion, se procedio al aislamiento de cuerpos apoptoticos como se indica a continuacion:
Las muestras sangufneas fueron sometidas a centrifugacion: 160 g durante 20 min a 18°C. La fase de plasma fue traspasada a un tubo esteril de polipropileno y centrifugado a 700 g durante 30 min a 18°C. El sobrenadante de la centrifugacion anterior fue traspasado a un tubo limpio de policarbonato y centrifugado a 14.000 g durante 30 min a 9°C. El sobrenadante de la ultima centrifugacion fue eliminado y el sedimento que contiene los cuerpos apoptoticos, fue resuspendido mediante pipeteo en tampon PBS 1X.
Posteriormente, las preparaciones de cuerpos apoptoticos fntegros y con un alto grado de pureza fueron analizadas mediante citometrfa de flujo para determinar el numero total de CA por mililitro de plasma. Para ello, los cuerpos apoptoticos fueron incubados con Anexina-V e Ioduro de propidio.
Los resultados de este analisis se exponen en la figura 2. La cuantificacion de CA revelo que el paciente 1, que no sufrio un ictus isquemico sino un AIT, tenia inicialmente unos niveles plasmaticos once veces inferiores a los detectados en el paciente 2, con un ictus isquemico establecido. Estos hallazgos demuestran que la cuantificacion de CA aislados mediante el procedimiento objeto de la presente invencion tiene utilidad clfnica en el establecimiento de un diagnostico precoz y exacto de la enfermedad cerebrovascular.
EJEMPLO 5: Ictus isquemico
El estudio clfnico incluye dos pacientes, Hombre de 45 anos y Hombre de 58 anos, que fueron atendidos por el servicio de Neurologfa por sospecha de Ictus isquemico. La evaluacion radiologica inicial mostro que en el paciente 1 no presentaba lesiones isquemicas cerebrales, y el paciente 2 tenia un volumen de infarto cerebral de 12.300 mm3. La exploracion neurologica completa determino que el paciente 1 sufrio un AIT con recuperacion funcional completa, mientras que el paciente 2 tuvo un ictus isquemico de
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origen aterotrombotico.
Se recogio sangre (20 ml) de cada paciente y se deposito en tubos con citrato sodico durante la evolucion inicial. Transcurridos menos de 2 horas desde la extraccion, se procedio al aislamiento de cuerpos apoptoticos mediante centrifugaciones seriadas. A continuacion se detalla el protocolo de extraccion de cuerpos apoptoticos, objeto de la presente invencion:
Las muestras sangufneas fueron sometidas a centrifugacion: 160 g durante 20 min a 18°C. La fase de plasma fue traspasada a un tubo esteril de polipropileno y fue diluida en tampon PBS 1X en una relacion 1:3 y centrifugado a 700 g durante 30 min a 18°C. El sobrenadante de la centrifugacion anterior fue traspasado a un tubo limpio de policarbonato y centrifugado a 14.000 g durante 30 min a 9°C. El sobrenadante de la ultima centrifugacion fue eliminado y el sedimento que contiene los cuerpos apoptoticos, fue resuspendido mediante pipeteo en tampon PBS 1X.
Posteriormente, las preparaciones de cuerpos apoptoticos fntegros y con un alto grado de pureza fueron analizadas mediante citometrfa de flujo para determinar el numero total de cuerpos apoptoticos por mililitro de plasma. Para ello, los cuerpos apoptoticos fueron incubados con Anexina-V e loduro de propidio.
Los resultados de este analisis se exponen en la figura 3. La cuantificacion de cuerpos apoptoticos revelo que el paciente 1, que no sufrio un ictus isquemico sino un AIT, tenia inicialmente unos niveles plasmaticos quince veces inferiores a los detectados en el paciente 2, con un ictus isquemico establecido. Estos hallazgos demuestran que la cuantificacion de cuerpos apoptoticos aislados mediante el procedimiento objeto de la presente invencion tiene utilidad clfnica en el establecimiento de un diagnostico precoz y exacto de la enfermedad cerebrovascular.
EJEMPLO 6: Esclerosis Multiple
El estudio clfnico incluye dos pacientes, Hombre de 38 anos y Mujer de 44 anos diagnosticados de Esclerosis Multiple Remitente Recurrente (EMRR) con 2 y 3 anos de evolucion y una puntuacion en la escala EDSS (escala de medicion de discapacidad) de 1 y 0 respectivamente. El paciente 1 estaba en tratamiento con Interferon Beta y el paciente 2 con Natalizumab.
Se recogio sangre (20 ml) de cada paciente (en situacion de ausencia de brote, clfnicamente
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estables) y se deposito en tubos con citrato sodico. Transcurridos menos de 2 horas desde la extraccion, se procedio al aislamiento de CA como se indica a continuacion:
Las muestras sangufneas fueron sometidas a centrifugacion: 200 g durante 15 min a 18°C. La fase de plasma fue traspasada a un tubo esteril de polipropileno y fue diluida en tampon Hepes 10 mM en una relacion 1:3 y centrifugado a 600 g durante 40 min a 18°C. El sobrenadante de la centrifugacion anterior fue traspasado a un tubo limpio de policarbonato y centrifugado a 13.000 g durante 30 min a 9°C. El sobrenadante de la ultima centrifugacion fue eliminado y el sedimento que contiene los cuerpos apoptoticos, fue resuspendido mediante pipeteo en tampon Hepes 10 mM.
Posteriormente, las preparaciones de CA fntegros y con un alto grado de pureza fueron analizadas mediante citometrfa de flujo tal y como se ha indicado en el ejemplo 3.
Los resultados de este analisis se exponen en la figura 4. En el paciente 1, en terapia con Interferon Beta, el numero de CA plasmaticos procedentes de la muerte de neuronas, astrocitos y oligodendrocitos fue aproximadamente dos veces superior al detectado en el paciente 2, que estaba en tratamiento con Natalizumab.
Por lo tanto, estos resultados indican que la cuantificacion de los CA de origen neuronal y glial aislados mediante el procedimiento objeto de la presente invencion permite evaluar la eficacia de farmacos en la enfermedad de esclerosis multiple, lo que facilita la seleccion de los tratamientos mas adecuados para cada paciente (terapia personalizada).
EJEMPLO 7: Esclerosis Multiple
El estudio clfnico incluye 4 pacientes diagnosticados de esclerosis multiple, 1 hombre y 3 mujeres, con una edad media de 30.5 anos (rango 21-41). El paciente 1 y 2 se encontraban en la fase o estadio precoz, mientras que los pacientes 3 y 4 estaban en el estadio avanzado de la enfermedad.
Se recogio sangre (20 ml) de cada paciente en el servicio de neurologfa y se deposito en tubos con citrato sodico. Transcurridos menos de 2 horas desde la extraccion se procedio al aislamiento de CA mediante centrifugaciones seriadas, tal y como se ha indicado en el ejemplo anterior.
Posteriormente, las preparaciones de CA fntegros y con un alto grado de pureza fueron analizadas mediante citometrfa de flujo para determinar el numero total de cuerpos
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apoptoticos por mililitro de plasma. Para ello, los cuerpos apoptoticos fueron incubados con Anexina-V e Ioduro de propidio.
Los resultados de este analisis se exponen en la figura 5. Como muestra la figura 5, la concentracion plasmatica de cuerpos apoptoticos en pacientes en fase o estadio precoz (41.765±7.300 CA/ml plasma) es claramente superior a la detectada en pacientes en estadio mas avanzados (8.585±726 CA/ml plasma). Estos resultados apoyan el valor clfnico de la concentracion plasmatica de CA aislados mediante el procedimiento objeto de la presente invencion (metodo no invasivo para el aislamiento de cuerpos apoptoticos fntegros y que estan mfnimamente contaminados con otras microvesfculas) en la deteccion precoz y estadiaje de la Esclerosis Multiple.
EJEMPLO 8: Enfermedad de Parkinson
El estudio clfnico incluye 6 pacientes diagnosticados de enfermedad de Parkinson, 4 hombres y 2 mujeres, con una edad media de 68 anos (rango 49-81). La cohorte de sujetos del estudio se distribuyo homogeneamente en los tres primero estadios de la patologfa (I, n=2; II, n=2 y III, n=2).
Se recogio sangre (20 ml) de cada paciente en el servicio de neurologfa y se deposito en tubos con citrato sodico. Transcurridos menos de 2 horas desde la extraccion se procedio al aislamiento de CA siguiendo el metodo descrito en el ejemplo 3.
Posteriormente, las preparaciones de CA fntegros y con un alto grado de pureza (mfnimamente contaminados con otras microvesfculas) fueron analizadas mediante citometrfa de flujo para determinar el numero total de CA por mililitro de plasma. Para ello, los CA fueron incubados con Anexina-V e Ioduro de propidio.
Los resultados de este analisis se exponen en la figura 6. Como se muestra en la figura, la concentracion plasmatica de CA en pacientes en estadio I (81.513±7.000 CA /ml plasma) es claramente superior a la detectada en pacientes en estadio II (35.277±2.255 CA /ml plasma) y en estadio III (7.565±3.000 CA /ml plasma). Estos resultados apoyan el valor clfnico de la concentracion plasmatica de CA aislados mediante el procedimiento objeto de la presente invencion en la deteccion precoz y estadiaje de la enfermedad de Parkinson.
EJEMPLO 9: Cancer de colon metastatico
El estudio clfnico incluye 3 pacientes diagnosticados de cancer de colon metastatico
(metastasis localizadas en el hfgado) y atendidos en el servicio de cirugfa general. El paciente 1, mujer de 70 anos, y el paciente 2, Hombre de 72 anos, habfan recibido 6 ciclos de tratamiento quimioterapeutico con Folfiri (Irinotecan, 5-Fluoruracilo y acido polfnico), mientras que la paciente 3, mujer de 71 anos, no fue sometida a quimioterapia.
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Se recogio sangre (20 ml) de cada paciente una vez finalizado el tratamiento antitumoral y se deposito en tubos con citrato sodico. Transcurridos menos de 2 h desde la extraccion, se procedio al aislamiento de CA mediante el metodo descrito en el ejemplo 5.
10 Posteriormente, las preparaciones de CA fntegros y con un alto grado de pureza fueron analizadas mediante citometrfa de flujo para determinar el numero total de CA por mililitro de plasma. Para ello, los CA fueron incubados con Anexina-V e loduro de propidio.
Los resultados de este analisis se exponen en la figura 7. La cuantificacion de CA revelo que 15 el paciente 1, una vez finalizada la terapia antineoplasica, tenia una concentracion plasmatica de CA 10 veces superior a la detectada en el paciente 2, despues del tratamiento, y a la encontrada en el paciente 3, que no habfa recibido quimioterapia. De manera interesante, las exploraciones radiologicas de los pacientes mostraron que unicamente, el paciente 1, experimento una reduccion del tamano tumoral de las metastasis 20 hepaticas, indicando una buena respuesta al tratamiento antitumoral. Estos datos demuestran que la determinacion de los niveles plasmaticos de CA aislados mediante el procedimiento objeto de la presente invencion permiten evaluar la respuesta a la quimioterapia de los pacientes con cancer de colon metastatico.

Claims (15)

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    REIVINDICACIONES
    1. Metodo de aislamiento de cuerpos apoptoticos a partir de una muestra de fluido corporal caracterizado por que comprende las siguientes etapas:
    a) centrifugar una muestra de fluido corporal tomada de un sujeto, a una velocidad menor o igual a 300 g, y recoger el sobrenadante,
    b) centrifugar el sobrenadante obtenido en la etapa a) a una velocidad entre 400 g y 1.000 g y recoger el sobrenadante,
    c) centrifugar el sobrenadante obtenido en la etapa b) a una velocidad entre 8.000 g y 40.000 g y eliminar el sobrenadante,
    donde el sedimento obtenido en la etapa c) comprende los cuerpos apoptoticos aislados.
  2. 2. Metodo segun la reivindicacion 1, donde el fluido corporal se selecciona del grupo constituido por sangre, plasma, orina, lfquido cefalorraqufdeo, lfquido ascftico, lfquido sinovial y lfquido amniotico.
  3. 3. Metodo segun la reivindicacion 1 o 2, donde el fluido corporal es sangre.
  4. 4. Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la velocidad de la etapa b) es de entre 500 g y 800 g.
  5. 5. Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la velocidad de la etapa c) es de entre 11.000 g y 30.000 g.
  6. 6. Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde entre las etapas a) y b) se lleva a cabo una etapa a1) en la que el sobrenadante obtenido en la etapa a) se diluye en un tampon.
  7. 7. Metodo de pronostico de una enfermedad vascular caracterizado por que comprende las siguientes etapas:
    i) aislar cuerpos apoptoticos de una primera y una segunda muestra de fluido corporal tomadas de un paciente con una enfermedad vascular siguiendo el metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde la segunda muestra es tomada al menos 48 h despues de la primera muestra,
    ii) cuantificar los cuerpos apoptoticos aislados en la etapa i), y
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    iii) comparar el numero de cuerpos apoptoticos aislados en las dos muestras, donde un mayor numero de cuerpos apoptoticos en la segunda muestra que en la primera es indicativo de un mal pronostico.
  8. 8. Metodo de determinacion del estadio de una enfermedad neurodegenerativa caracterizado por que comprende las siguientes etapas:
    I) aislar cuerpos apoptoticos de una muestra de fluido corporal tomada de un paciente con una enfermedad neurodegenerativa siguiendo el metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-6,
    II) cuantificar los cuerpos apoptoticos aislados en la etapa I), y
    III) comparar el numero de cuerpos apoptoticos aislados de la muestra con unos valores de referencia.
  9. 9. Metodo para analizar la eficacia de un tratamiento de una enfermedad vascular caracterizado por que comprende las siguientes etapas:
    A) aislar cuerpos apoptoticos de dos muestras de fluido corporal tomadas de un paciente con una enfermedad vascular siguiendo el metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde una primera muestra es tomada antes del tratamiento y una segunda muestra es tomada despues del tratamiento, o donde las dos muestras son tomadas durante el tratamiento, una primera muestra una vez comenzado el tratamiento y una segunda muestra al menos 48 horas despues de la primera,
    B) cuantificar los cuerpos apoptoticos aislados en la etapa A), y
    C) comparar el numero de cuerpos apoptoticos en las dos muestras, donde un menor numero de cuerpos apoptoticos en la segunda muestra que en la primera indica que el tratamiento es eficaz.
  10. 10. Metodo para analizar la eficacia de un tratamiento de una enfermedad oncologica y/o neurodegenerativa caracterizado por que comprende las siguientes etapas:
    A) aislar cuerpos apoptoticos de dos muestras de fluido corporal tomadas de un paciente con una enfermedad oncologica y/o neurodegenerativa siguiendo el metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde una primera muestra es tomada antes del tratamiento y una segunda muestra es tomada despues del tratamiento, o donde las dos muestras son tomadas durante el tratamiento, una primera muestra una vez comenzado el tratamiento y una segunda muestra al menos dos semanas despues de la primera,
    B) cuantificar los cuerpos apoptoticos aislados en la etapa A), y
    C) comparar el numero de cuerpos apoptoticos en las dos muestras, donde en la
    enfermedad oncologica un mayor numero de cuerpos apoptoticos en la segunda muestra que en la primera indica que el tratamiento es eficaz y en la enfermedad neurodegenerativa un menor numero de cuerpos apoptoticos en la segunda muestra que en la primera indica que el tratamiento es eficaz.
    5
  11. 11. Metodo para identificar el tipo de celula que ha muerto por apoptosis caracterizado por que comprende las siguientes etapas:
    1) aislar cuerpos apoptoticos de una muestra de fluido corporal siguiendo el metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-6,
    10 2) detectar en la parte externa de la membrana plasmatica del cuerpo apoptotico un
    marcador de tipo celular.
  12. 12. Metodo segun la reivindicacion anterior, donde el marcador de tipo celular se selecciona del grupo constituido por CD90, GLAST, CD11 b, CD100 y antfgenos tumorales.
    15
  13. 13. Uso del metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, para pronostico de una enfermedad vascular y/o neurodegenerativa.
  14. 14. Uso del metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, para evaluar la 20 eficacia del tratamiento de una enfermedad oncologica, neurodegenerativa y/o vascular.
  15. 15. Uso del metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, para identificar el tipo celular de una celula que ha muerto por apoptosis.
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