WO2015075288A1 - Método de aislamiento de cuerpos apoptóticos - Google Patents

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Definitions

  • the present invention belongs to the field of apoptosis. Specifically, it refers to a method for the isolation of apoptotic bodies from body fluids and the use of said method and isolated apoptotic bodies for the evaluation of apoptotic processes, in particular in pathologies such as vascular, neurodegenerative and oncological diseases.
  • Apoptosis is a type of ordered cell death that depends on the start-up of a cascade of molecular events that culminate in the total disintegration of the cell. In the late stage of the apoptotic process, and as a consequence of cell fragmentation, small membranous vesicles called apoptotic bodies are generated.
  • apoptosis participates in the morphogenesis and remodeling of tissues during development, and in the regulation of the immune system and homeostasis.
  • this process also plays a fundamental role in cell and tissue death that takes place in various pathologies, such as vascular diseases, neurodegenerative diseases and oncological diseases.
  • the evaluation of apoptotic processes, specifically the determination of the degree of apoptosis or apoptotic index, in these diseases would be very useful in daily clinical practice, since it would allow an early and more accurate prognosis, a more effective monitoring of the evolution of the disease, and the selection of the most appropriate treatments for each patient.
  • tissue death in particular by obtaining and analyzing solid samples extracted by invasive methods such as biopsies (tissue samples).
  • the degree of apoptosis is determined by different techniques known to those skilled in the art, such as the detection of DNA fragmentation (TUNEL technique, for example) and the detection of phosphatidylserine present on the outside of the plasma membrane of the Apoptotic cells with Annexin V.
  • TUNEL technique the detection of DNA fragmentation
  • phosphatidylserine present on the outside of the plasma membrane of the Apoptotic cells with Annexin V.
  • patient samples are obtained by invasive methods.
  • apoptotic bodies are isolated under non-physiological conditions (artificial induction of apoptosis).
  • the authors of the present invention have developed a method to isolate apoptotic bodies by centrifugation from body fluid samples. That is, said apoptotic bodies are isolated under physiological conditions, without prior artificial induction of apoptosis.
  • WO 03/076589 A2 describes methods for detecting and analyzing apoptotic bodies of body fluids.
  • the apoptotic bodies of the cell fraction are separated by centrifugation.
  • the biological sample is blood and it is centrifuged at more than 500 g, preferably between 800 g and 1,200 g, the apoptotic bodies remaining in the plasma fraction.
  • the isolated apoptotic bodies according to the method described in WO 03/076589 A2 would have little or no utility for the prognosis and / or monitoring of the treatment of subjects with diseases associated with apoptosis, since the number of isolated apoptotic bodies would be very lower than what is really in the body fluid and the apoptotic bodies could be disintegrated and / or contaminated by other microvesicles resulting in an erroneous quantification of the apoptotic bodies.
  • the authors of the present invention have developed a method of isolating apoptotic bodies that maintain their integrity and can therefore be quantified.
  • the method of the invention minimizes the loss of apoptotic bodies during their isolation by isolating up to more than 90% of all apoptotic bodies present in the body fluid sample.
  • the authors of the present invention have developed a very useful tool for the clinical study of apoptosis.
  • the present invention also relates to a forecasting method based on the quantification of isolated apoptotic bodies following the method. of the invention and the use of said apoptotic bodies as a prognostic factor and as a marker of the efficacy of a therapeutic treatment.
  • Another important advantage of the integrity of apoptotic bodies isolated by the method of the present invention is its use to identify the cell type of the cell that has died from apoptosis, which provides information of exceptional utility in the clinical field. , in particular, of neurodegenerative, vascular and oncological diseases.
  • the present invention relates in a first aspect to a method for the isolation of apoptotic bodies (method of the invention) comprising the following steps: a) centrifuge a sample of body fluid taken from a subject, at a rate less than or equal to 300 g, and collect the supernatant,
  • step b) centrifuge the supernatant obtained in step a) at a speed between 400 g and 1,000 g and collect the supernatant
  • step b) centrifuge the supernatant obtained in step b) at a speed between 8,000 g and 40,000 g and remove the supernatant
  • step c) comprises the isolated apoptotic bodies.
  • a second aspect of the present invention relates to a method of prognosis of a vascular disease comprising the following steps: i) isolating apoptotic bodies from a first and a second body fluid sample taken from a patient with a vascular disease following the method of the invention, where the second sample is taken at least 48 h after the first sample,
  • a third aspect of the present invention relates to a method of determining the stage of a neurodegenerative disease comprising the following steps: I) isolating apoptotic bodies from a sample of body fluid taken from a patient with a neurodegenerative disease following the method of invention,
  • a fifth aspect of the present invention relates to a method for analyzing the efficacy of a treatment of an oncological and / or neurodegenerative disease characterized by comprising the following stages:
  • a sixth aspect of the present invention relates to a method for identifying the cell type of a cell that has died from apoptosis comprising the following steps: 1) isolate apoptotic bodies from a body fluid sample following the method of the invention,
  • a seventh aspect of the present invention relates to the use of the method of the invention for prognosis of a vascular and / or neurodegenerative disease.
  • An eighth aspect of the present invention relates to the use of the method of the invention to evaluate the efficacy of the treatment of an oncological, neurodegenerative and / or vascular disease.
  • a ninth aspect of the present invention relates to the use of the method of the invention to identify the cell type of a cell that has died from apoptosis.
  • FIG. 1 Graphical representation of the number of apoptotic bodies (also referred to as CA hereafter) per milliliter of plasma in patients with suspected ischemic stroke, versus time in hours. In particular, they are shown the data at 4 and 96 h post-stroke.
  • CAs from cell death of different cell types are represented: microglia (white), oligodendrocytes (vertical stripes), neurons (black) and astrocytes (oblique stripes).
  • Panel A patient with cerebral infarction of undetermined origin.
  • Panel B patient with cerebral infarction of cardioembolic origin.
  • Figure 2 Graphical representation of the number of CA per milliliter of plasma in two patients with suspected ischemic stroke. The analysis determined that patient 1 (1, on the abscissa axis) suffered a transient ischemic attack (TIA) and patient 2 (2, on the abscissa axis) had an ischemic stroke. CAs were isolated without dilution.
  • Figure 3 Graphical representation of the number of CA per milliliter of plasma in two patients with suspected ischemic stroke. The analysis determined that patient 1 (1) suffered an AIT and patient 2 (2) suffered an ischemic stroke.
  • Figure 4 Graphical representation of the number of CA per milliliter of plasma in two patients diagnosed with recurrent remitting multiple sclerosis.
  • Patient 1 (1) continues treatment with Interferon Beta and patient 2 (2) with Natalizumab.
  • Apoptotic bodies from cell death of different cell types are represented: microglia (white), oligodendrocytes (vertical stripes), neurons
  • Figure 5 Graphical representation of the number of CA per milliliter of plasma in four patients diagnosed with recurrent remitting multiple sclerosis, two patients in the early stage (P) and two patients in the advanced stage (A).
  • Figure 6 Graphical representation of the number of CA per milliliter of plasma in six patients diagnosed with Parkinson's disease, two patients in each of the first stages of the pathology (I, II and III).
  • Figure 7 Graphical representation of the number of CA per milliliter of plasma in three patients (1, 2 and 3) diagnosed with metastatic colon cancer. Patient 1 and patient 2 had received 6 cycles of chemotherapeutic treatment with Folfiri, while patient 3 did not undergo chemotherapy. Detailed description of the invention
  • the present invention relates in a first aspect to a method for the isolation of apoptotic bodies comprising the following steps: a) centrifuge a sample of body fluid taken from a subject, at a rate less than or equal to 300 g, and collect the supernatant,
  • step b) centrifuge the supernatant obtained in step a) at a speed between 400 g and 1,000 g and collect the supernatant
  • step b) centrifuge the supernatant obtained in step b) at a speed between 8,000 g and 40,000 g and remove the supernatant
  • the sediment obtained in step c) comprises the isolated apoptotic bodies.
  • the temperature and time conditions at which the centrifugations of the method of the present invention are carried out are easily determined by the person skilled in the art. In a particular embodiment, they are carried out at a temperature between 8 ° C and 41 ° C, more particularly between 12 ° C and 25 ° C, and for at least 5 minutes.
  • the method of the present invention is preferably carried out in the three hours following the collection of the body fluid sample. Preferably, the sample is kept under gentle agitation until the beginning of the isolation method.
  • apoptotic body refers to a membranous vesicle, of a size between 1 ⁇ and 4 that originates from death by apoptosis of the cells, and which contains nuclear fragments, genetic material and cytoplasmic constituents of apoptotic cell
  • body fluid refers to the extracellular fluid of the body.
  • the body fluid is selected from the group consisting of blood, plasma, urine, cerebrospinal fluid, ascites fluid, synovial fluid and amniotic fluid.
  • said body fluid is blood, plasma or urine.
  • said body fluid is blood or plasma, and in a preferred embodiment the body fluid is blood.
  • the use of serum samples to extract circulating apoptotic bodies is discouraged since blood serum is the resulting blood component after allowing blood clotting and excluding the fibrin clot and other components and during the formation of the Clot apoptotic bodies can be retained in the fibrin mesh and the removal of the same would involve the loss of a large number of apoptotic bodies.
  • the body fluid sample is blood
  • the sample is collected in a medium with anticoagulant.
  • the anticoagulant is selected from the group consisting of sodium citrate, sodium EDTA, potassium EDTA, sodium heparin, potassium heparin, lithium heparin, ammonium heparin, sodium fluoride and mixtures thereof.
  • the anticoagulant is sodium citrate.
  • step a) of the method of the invention the centrifugation speed cannot be greater than 300 g since that would result in sedimentation of all the cellular components of the blood, including platelets, dragging with them a large part of the apoptotic bodies of the sample, which would cause the loss of a large number of apoptotic bodies.
  • the centrifugation rate of step a) is between 160 g and 300 g. With this speed range a minimum loss of apoptotic bodies with sediment is achieved.
  • Step b) of the method of the invention is necessary to obtain a supernatant rich in apoptotic and platelet-free bodies and those cellular components that have not sedimented with the centrifugation of stage a).
  • step b) is carried out at a speed of between 500 g and 800 g.
  • the supernatant obtained in step b) also comprises apoptotic bodies, other circulating microvesicles such as my ero particles and exosomes.
  • Circulating microparticles are membranous vesicles secreted by the activation of different cell types, among which stand out; endothelial, epithelial cells, leukocytes and platelets. These microparticles have a size of 0.1 ⁇ - 1 ⁇ and are formed from the evacuation of the plasma membrane, while the exosomes have a smaller size (0.05 ⁇ - 0, 1 ⁇ ) and come from an intracellular compartment: multivesicular bodies (MVB).
  • the objective of step c) of the method of the invention is to sediment the apoptotic bodies with the minimum concentration of other circulating microvesicles.
  • centrifugation rate of less than 8,000 g would not cause sedimentation of all apoptotic bodies present in the supernatant obtained from stage b) and a speed greater than 40,000 g would cause the rupture of apoptotic bodies and sedimentation of other circulating microvesicles .
  • the centrifugation speed of step c) is between 11,000 g and 30,000 g, with which the sedimentation of other types of microvesicles is greatly reduced.
  • Bodies can be resuspended in TBS (Tris-buffered saline, 2 mM Tris, 150 mM NaCI, pH: 7.4), PBS ⁇ Phosphate-buffered saline, 10 mM phosphate, 137 mM NaCI, 2.7 mM KCI pH: 7 , 4), Hepes (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid) 10-50 mM, CHES (N-Cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic acid) 10-50mM, MOPS (3- (N-morpholino) propanesulfonic acid ) 10-50 mM and PIPES (piperazine-N, N'-bis (2-ethanesulfonic acid) 10-50 mM.
  • Resuspended apoptotic bodies can be stored up to twelve months, preferably up to six months. Resuspended apoptotic bodies in a
  • An important advantage of the method of the present invention is that in the sediment comprising the isolated apoptotic bodies the content of other microparticles is less than 20% (Table 1, example 1). This degree of purity of apoptotic bodies in the sediment obtained in step c) of the method of The invention is of great importance at the clinical level, as explained below.
  • another important advantage of the method of the present invention is its high isolation performance of apoptotic bodies.
  • the method of the present invention at least 75% of the apoptotic bodies present in the body fluid sample are isolated (Table 2, example 2).
  • a higher percentage of apoptotic bodies can even be isolated by diluting the supernatant obtained in step a) in a buffer or pH regulating solution before carrying out step b).
  • a step a1) is carried out in which the supernatant obtained in step a) is diluted in a buffer.
  • the number of isolated apoptotic bodies can be increased to a percentage greater than or equal to 80% of the apoptotic bodies present in the body fluid sample and even to a percentage greater than or equal to 90% (Table 2, example 2 ).
  • the buffer of step a1 is selected from the group consisting of TBS, PBS, 10-50 mM Hepes, 10-50mM CHES, MOPS 10-
  • the buffer is TBS. In another preferred embodiment, the dilution is 1: 3 supernatant: buffer.
  • whole apoptotic bodies are obtained.
  • whole apoptotic bodies refers to apoptotic bodies with the entire plasma membrane, without ruptures, that is, the apoptotic bodies are not broken or disintegrated. This allows the quantification of said apoptotic bodies, not only the analysis or detection of their components when broken as typically occurs in the methods of isolation of apoptotic bodies described in the state of the art.
  • the quantification of apoptotic bodies has great clinical utility as a prognostic method and as a method to evaluate the efficacy of a therapeutic treatment. Said clinical utility is reinforced by the high degree of purity of the isolated bodies following the method of the present invention, with which, as it has been indicated above, a sediment is obtained where more than 80% are apoptotic bodies. The presence of other microvesicles in said sediment hinders their clinical utility since it would result in an erroneous quantification of apoptotic bodies.
  • the detection and quantification of apoptotic bodies is based on the specific binding of annexin V to a lipid, phosphatidylserine, present on the outside of their plasma membrane. It has been described that the microparticles also possess said lipid, so they would be quantified as if they were apoptotic bodies and the number of the quantified apoptotic bodies would therefore be greater than the physiological one.
  • non-invasive method refers to a method in which injections are made (for the extraction of body fluids) or tools are used that are in contact with the patient superficially or to a certain extent. distance. Unlike invasive methods, in these non-invasive techniques it is not necessary to make an incision to reach the site or tissue of interest.
  • a second aspect of the present invention relates to a method of prognosis of a vascular disease characterized in that it comprises the following stages: i) isolating apoptotic bodies from a first and second body fluid sample taken from a patient with a disease vascular according to the method of the invention according to the first aspect of the invention, where the second sample is taken at least 48 h after the first sample,
  • ii) quantify the apoptotic bodies isolated in stage i), and iii) compare the number of apoptotic bodies isolated in the two samples, where a greater number of apoptotic bodies in the second sample than in the first is indicative of a poor prognosis.
  • poor prognosis also referred to as an unfavorable prognosis in the state of the art, refers to a low probability of recovery, and thus, greater risk or probability of death.
  • vascular disease refers to all types of pathology or disease caused or that involves the injury or compression of a blood vessel.
  • the vascular disease is selected from the group consisting of cardiovascular, cerebrovascular and thrombosis diseases.
  • vascular disease is a cerebrovascular disease.
  • the first and second samples are taken at least 72 hours apart, and more particularly, at least 92 hours apart. In a preferred embodiment said samples are taken 92 hours apart.
  • the use of the AC isolation method of the present invention according to the first aspect of the invention makes it possible to predict the prognosis of a subject affected by a vascular disease based on the quantification of apoptotic bodies, in a quick and simple manner. and from a sample of body fluid (see examples 3, 4 and 5, figures 1, 2 and 3, respectively).
  • a third aspect of the present invention relates to a method of determining the stage of a neurodegenerative disease characterized in that it comprises the following stages: I) isolating apoptotic bodies from a sample of body fluid taken from a patient with a neurodegenerative disease following the method of the invention,
  • neurodegenerative disease refers to a group of chronic diseases of the nervous system, characterized by progressive neuronal (gray matter) and / or glial (white matter) loss.
  • Various genetic and environmental factors participate in the etiology of neurodegenerative diseases causing cognitive, sensory and motor system alterations.
  • neurodegenerative disease is selected from the group consisting of multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Alzheimer's, Parkinson's disease and
  • neurodegenerative disease is selected from the group consisting of multiple sclerosis, Alzheimer's and Parkinson's. With this method the stage of a neurodegenerative disease can be identified and with it the prognosis of said disease.
  • the levels of apoptotic bodies in the sample of a body fluid in early stages are higher than in advanced stages.
  • apoptotic body levels are more than 30,000 CA per mi of plasma and in advanced stages they are less than 30,000 CA per mi of plasma.
  • a number of CA per ml of plasma greater than 30,000, in particular 30,000 to 150,000 is indicative that neurodegenerative disease is in early stages and a number of CA per ml of Plasma less than 30,000, in particular 5,000 to 20,000, is indicative that neurodegenerative disease is in advanced stages.
  • a subject with Parkinson's and with a number of CAs per me of plasma greater than 30,000 would be in stage I or II, and with Multiple Sclerosis and a number of CAs per me of plasma less than 30,000 would be in an advanced stage of disease (see examples 7 and 8, figures 5 and 6 respectively).
  • the present invention also relates to a method for analyzing the efficacy of the treatment received by a subject with an oncological, neurodegenerative and / or vascular disease.
  • a fourth aspect of the present invention relates to a method for analyzing the efficacy of a treatment of a vascular disease characterized by comprising the following steps:
  • the samples from step A) are taken at least 72 hours apart, and more particularly, at least 92 hours apart and preferably 92 hours apart.
  • a fifth aspect of the present invention relates to a method for analyzing the efficacy of a treatment of an oncological and / or neurodegenerative disease characterized by comprising the following steps: A) isolating apoptotic bodies from two body fluid samples taken from a patient with an oncological and / or neurodegenerative disease following the method of the invention according to the first aspect of the invention, where a first sample is taken before treatment and a second sample is taken after treatment, or where the two samples are taken during treatment, a first sample after starting treatment and a second sample at least two weeks after the first,
  • C) compare the number of apoptotic bodies in the two samples, where in the oncological disease a greater number of apoptotic bodies in the second it shows that in the first one it indicates that the treatment is effective and in neurodegenerative disease a smaller number of apoptotic bodies in the second sample than in the first one it indicates that the treatment is effective.
  • antitumor treatments chemotherapy, radiotherapy and biological therapies, are aimed at killing tumor cells inducing apoptosis and consequently their disintegration. If the patient responds to the treatment, that is, the therapy works, it is effective, the death of the tumor occurs, and therefore higher levels of apoptotic bodies are detected in the second sample of body fluid than in the first (see example
  • oncological diseases refer to a group of diseases whose cause is the appearance of a tumor.
  • the tumor usually invades the surrounding tissue and can cause metastases at distant points of the organism.
  • the oncological disease is selected from the group consisting of colorectal, pancreas, stomach, esophagus, liver, lung, cancer. breast, ovarian, uterus, prostate, testis, thyroid, head and neck, brain tumors (gliomas and neuroblastomas) and melanomas.
  • the oncological disease is selected from the group consisting of colorectal cancer and liver cancer.
  • the integrity of the apoptotic bodies isolated by the method according to the first aspect of the present invention allows, in addition to their quantification, to identify the cell type from which they come, that is, it allows to identify what type of cell has died from apoptosis.
  • This information is very important at the clinical level in vascular, neurodegenerative and oncological diseases and, especially, in the field of neurodegenerative and cerebrovascular diseases.
  • the severity of the pathology will be and will influence its evolution or prognosis. For example, two patients with an ischemic infarction in which an increase in apoptotic bodies is detected in the second body fluid sample (at least 48 hours after the first sample is taken) have a poor prognosis.
  • the disease can be aggravated, or in other words, the prognosis may worsen if the number of apoptotic bodies from neurons is very high, since they have poor regeneration capacity compared to other nervous system cells, such as example, astrocytes.
  • astrocytes a nervous system cells
  • Oligodendrocytes are the cellular components responsible for the myelination of neuronal axons, a greater demyelination process is accompanied by a worsening of the disease.
  • the identification of the cell type that has died from apoptosis is clinically very relevant in cancer diseases, especially in the evaluation of the efficacy of antitumor treatment.
  • two patients diagnosed with colon cancer who have received chemotherapeutic treatment in which high plasma levels of apoptotic bodies are detected after therapy are indicative of the effectiveness of such treatment.
  • a sixth aspect of the present invention relates to a method for identifying the cell type of a cell that has died by apoptosis characterized by comprising the following steps:
  • cell type marker to a protein that is specific or is found only in one type of cell. Specifically, in the present invention said protein must be found on the outside of the cell's plasma membrane or it must be a transmembrane protein. In this method one or more cell-type markers can be detected.
  • the cell type marker is a neuronal marker, and more particularly said neuronal marker is selected from the group consisting of CD90 (Neural Adhesion Molecule L1), NGFR (Nerve Growth Factor Receptor) p75, PSA-NCAM, Efrina-A2, Efrina-A4, Efrina-A5, Efrina-B1, Efrina-B2, GAP-43, Laminin-1, NAP-22, Netrina-1, Neurophilin, Plexin-A1, Semaforin 3A, Semaforin 3F, Semaforin 4D, Trk A, Encephalin, GAD65 (glutamate decarboxylase), GAP-43 (growth-associated protein 43), LINGO-1, Na + subunit / K + ATPasa, Hill transporter, transporter
  • Dopamine (DAT), Norepinephrine transporter (NET), Serotonin transporter (SERT), GABA transporter 1, 2 and 3, Neuronal glutamate transporter, AMPA-binding protein (ABP), Complexin 1 (CPLX1), Contactina - 1, VAMP-2, vesicular transporter of acetylcholine (VAChT), vesicular transporter of GABA (VGAT; VIAAT), vesicular transporter of glutamate 1, 2, 3 (VGLUT), vesicular transporter of monoamine 1, 2 (VMAT) and N -cadherina, E-cadherina.
  • DAT Dopamine
  • NET Norepinephrine transporter
  • SERT Serotonin transporter
  • GABA transporter 1 2 and 3 Neuronal glutamate transporter
  • ABP AMPA-binding protein
  • CPLX1 Complexin 1
  • VAChT vesicular transporter of acetylcholine
  • the cell type marker is a glial marker, and more particularly said glial marker is selected from the group consisting of
  • the cell type marker is selected from the group consisting of CD90, GLAST, CD11 b and CD100. This identifies neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes, respectively (see examples 3 and 6, figures 1 and 4 respectively).
  • any tumor antigen described in the state of the art serves as a cell type marker.
  • the cell type marker is tumor antigen selected from the group consisting of carcinoembryonic antigen (CEA), prostate specific membrane antigen (PSMA), mucins, integrins and tyrosine kinase receptors.
  • CEA carcinoembryonic antigen
  • PSMA prostate specific membrane antigen
  • mucins include CA-125, CA-19-9 and CA-15-3
  • integrins include EpCAM
  • EGFR epidermal growth factor receptor
  • FGFR fibroblast growth factor receptor
  • VEGFR growth factor receptor vascular endothelial
  • PDGF platelet-derived growth factor receptor
  • the cell type marker is selected from the group consisting of CD90, GLAST, CD11 b, CD100 and tumor antigens.
  • the quantification of CAs carried out in any of the methods described in the second, third, fourth, fifth and sixth aspects of the present invention can be carried out by conventional techniques, widely known to those skilled in the art.
  • the quantification of CA is carried out by a method selected from the group consisting of flow cytometry, nanosight ® NTA "nanoparticle tracking analysis" technology and impedance technology.
  • the quantification of CA is carried out by flow cytometry or nanosight ® NTA technology.
  • a seventh aspect of the present invention relates to the use of the method of the invention according to the first aspect of the invention for forecasting.
  • a particular embodiment of this aspect refers to the use of the method of the invention for the prognosis of vascular and / or neurodegenerative diseases.
  • An eighth aspect of the present invention relates to the use of the method of the invention to evaluate the efficacy of the treatment of an oncological, neurodegenerative and / or vascular disease.
  • a ninth aspect of the present invention relates to the use of the method of invention to identify the cell type of a cell that has died from apoptosis.
  • Cell type markers are those described above in the sixth aspect of the present invention.
  • the present invention also relates to the apoptotic bodies insulated by the method of the invention according to the first aspect of the invention.
  • a particular embodiment refers to an insulated apoptotic body by the method of the invention, which comprises on the outer membrane CD90, GLAST, CD1 1b, CD100 or a tumor antigen.
  • a more particular embodiment relates to an insulated apoptotic body by the method of the invention, which comprises on the outer membrane CD90, GLAST, CD11 or CD100.
  • EXAMPLE 1 Isolation of apoptotic bodies. Purity.
  • the clinical study includes 6 patients, two diagnosed with ischemic stroke (patient 1: 85 year old woman, Patient 2: 59 year old man), two with multiple sclerosis (patient 3: 51 year old woman, Patient 4: 32 year old man ) and two of Parkinson's disease (Patient 5: 61 year old man, Patient 6: 68 year old woman).
  • Blood samples were subjected to centrifugation: 250 g for 10 min at 18 ° C.
  • the plasma phase of the sample from patient 1 was diluted in 1X TBS buffer in a 1: 3 ratio (step a1) and centrifuged at 850 g for 20 min at 18 ° C (step b).
  • the supernatant from the previous centrifugation was transferred to a clean polycarbonate tube and centrifuged at 12,000 g for 20 min at 9 ° C (step c).
  • the supernatant from the last centrifugation was removed and the sediment containing the apoptotic bodies was resuspended by pipetting in 1X TBS buffer.
  • MV microvesicles
  • MP my ero particles
  • EXO exosomes
  • EXAMPLE 2 Isolation of apoptotic bodies. Performance.
  • the clinical study includes 2 patients, two diagnosed with ischemic stroke (patient 1: 76 year old man, Patient 2: 58 year old man).
  • Plasma phase (containing the apoptotic bodies) of the sample from patient 2 was transferred to a sterile polypropylene tube (stage a) and centrifuged at 700 g for 30 min at 18 ° C (stage b).
  • the plasma phase of the sample from patient 1 was diluted in 1X TBS buffer in a 1: 3 ratio (step a1) and centrifuged at 700 g for 30 min at 18 ° C (step b).
  • the supernatant from the previous centrifugation was transferred to a clean tube of polycarbonate and centrifuged at 14,000 g for 30 min at 9 ° C (step c).
  • the supernatant from the last centrifugation was removed and the sediment containing the apoptotic bodies was resuspended by pipetting in 1X TBS buffer.
  • preparations of whole apoptotic bodies with a high degree of purity obtained by means of the previous protocol were analyzed by flow cytometry to determine the total number of apoptotic bodies per milliliter of plasma.
  • apoptotic bodies were incubated with Annexin-V and propidium lodide.
  • the results of this analysis are shown in Table 2.
  • the total number of apoptotic bodies isolated per milliliter of plasma represented 90% of the total apoptotic bodies present in the plasma if obtained by the method object of the invention including the step a1 (dilution), while if said stage was not performed the total number of isolated apoptotic bodies accounted for 78% of the total present in the plasma.
  • the clinical study includes two patients, a 78-year-old woman and a 70-year-old woman, who They were treated by the Neurology Department for suspected ischemic stroke.
  • a simple CT scan was performed with perfusion protocol that showed an ischemic lesion in the territory of the right middle cerebral artery in patient 1 and in the area of the left middle cerebral artery in patient 2.
  • the following are the registered clinical data of each patient;
  • Patient 1 Cerebral infarction of undetermined origin.
  • Patient 2 Cerebral infarction of cardioembolic origin.
  • Patient 1 volume of initial infarction: 22,310 mm 3 , volume of infarction at 96 h: 57,127 mm 3 .
  • the ischemic lesion increased 2.5 times during the first 96 hours.
  • Patient 2 initial infarction volume: 5,080 mm 3 , infarction volume at
  • Patient 1 Progressive infarction (increase of more than 4 points on the scale)
  • Patient 2 Regressive infarction (decrease of more than 4 points on the scale).
  • Plasma samples were subjected to centrifugation: 250 g for 10 min at 18 ° C.
  • the plasma phase was transferred to a sterile polypropylene tube and diluted in 1X TBS buffer in a 1: 3 ratio and centrifuged at 850 g for 20 min at 18 ° C.
  • the supernatant from the previous centrifugation was transferred to a clean polycarbonate tube and centrifuged at 12,000 g for 20 min at 9 ° C.
  • the supernatant from the last centrifugation was removed and the sediment containing the apoptotic bodies was resuspended by pipetting in 1X TBS buffer.
  • the whole CA preparations with a high degree of purity were analyzed by flow cytometry to determine the total number of CA per milliliter of plasma that comes from the death of cells of the nervous system (microglia, oligodendrocytes, neurons and astrocytes) of each patient.
  • the apoptotic bodies were incubated with Annexin-V, propidium lodide, and antibodies, anti-CD1 1b, anti-CD100, anti-CD90 and anti-GLAST
  • the clinical study includes two patients, 76-year-old man and 85-year-old man, who were treated by the Neurology department for suspected ischemic stroke.
  • the initial radiological evaluation showed that patient 1 had no cerebral ischemic lesions, and patient 2 had a cerebral infarction volume of 17,455 mm 3 .
  • the complete neurological examination determined that patient 1 suffered a TIA with full functional recovery, while patient 2 had an ischemic stroke of atherothrombotic origin.
  • Plasma samples were subjected to centrifugation: 160 g for 20 min at 18 ° C.
  • the plasma phase was transferred to a sterile polypropylene tube and centrifuged at 700 g for 30 min at 18 ° C.
  • the supernatant from the previous centrifugation was transferred to a clean polycarbonate tube and centrifuged at 14,000 g for 30 min at 9 ° C.
  • the supernatant from the last centrifugation was removed and the sediment containing the apoptotic bodies was resuspended by pipetting in 1X PBS buffer.
  • apoptotic bodies were prepared by flow cytometry to determine the total number of CA per milliliter of plasma. To do this, apoptotic bodies were incubated with Annexin-V and propidium lodide.
  • the clinical study includes two patients, 45-year-old man and 58-year-old man, who were treated by the Neurology department for suspected ischemic stroke.
  • the initial radiological evaluation showed that in patient 1 he did not have cerebral ischemic lesions, and patient 2 had a volume of cerebral infarction of 12,300 mm 3 .
  • the complete neurological examination determined that patient 1 suffered a TIA with full functional recovery, while patient 2 had an ischemic stroke of atherothrombotic origin.
  • Plasma samples were subjected to centrifugation: 160 g for 20 min at 18 ° C.
  • the plasma phase was transferred to a sterile polypropylene tube and diluted in 1X PBS buffer in a 1: 3 ratio and centrifuged at 700 g for 30 min at 18 ° C.
  • the supernatant from the previous centrifugation was transferred to a clean polycarbonate tube and centrifuged at 14,000 g for 30 min at 9 ° C.
  • the supernatant from the last centrifugation was removed and the sediment containing the apoptotic bodies was resuspended by pipetting in 1X PBS buffer.
  • apoptotic bodies were prepared by flow cytometry to determine the total number of apoptotic bodies per milliliter of plasma. To do this, apoptotic bodies were incubated with Annexin-V and propidium lodide.
  • the clinical study includes two patients, a 38 year old man and a 44 year old woman diagnosed with Recurrent Remitting Multiple Sclerosis (RRMS) with 2 and 3 years of evolution and a score on the EDSS scale (disability measurement scale) of 1 and 0 respectively.
  • RRMS Recurrent Remitting Multiple Sclerosis
  • Plasma samples were subjected to centrifugation: 200 g for 15 min at 18 ° C.
  • the plasma phase was transferred to a sterile polypropylene tube and diluted in 10 mM Hepes buffer in a 1: 3 ratio and centrifuged at 600 g for 40 min at 18 ° C.
  • the supernatant from the previous centrifugation was transferred to a clean polycarbonate tube and centrifuged at 13,000 g for 30 min at 9 ° C.
  • the supernatant from the last centrifugation was removed and the sediment containing the apoptotic bodies was resuspended by pipetting in 10 mM Hepes buffer.
  • the clinical study includes 4 patients diagnosed with multiple sclerosis, 1 man and 3 women, with a mean age of 30.5 years (range 21-41). Patient 1 and 2 were in the early stage or stage, while patients 3 and 4 were in the advanced stage of the disease.
  • the clinical study includes 6 patients diagnosed with Parkinson's disease, 4 men and 2 women, with a mean age of 68 years (range 49-81).
  • the whole CA preparations and with a high degree of purity were analyzed by flow cytometry to determine the total number of CA per milliliter of plasma.
  • the CAs were incubated with Annexin-V and propidium loduro.
  • the results of this analysis are shown in Figure 6.
  • the plasma CA concentration in stage I patients (81,513 ⁇ 7,000 CA / mi plasma) is clearly higher than that detected in stage II patients ( 35,277 ⁇ 2,255 CA / mi plasma) and stage III (7,565 ⁇ 3,000 CA / mi plasma).
  • the clinical study includes 3 patients diagnosed with metastatic colon cancer
  • the whole CA preparations with a high degree of purity were analyzed by flow cytometry to determine the total number of CA per milliliter of plasma.
  • the CAs were incubated with Annexin-V and propidium loduro.

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Abstract

La presente invención pertenece al campo del estudio de la apoptosis, en particular al campo del pronóstico y monitorización de enfermedades que cursan con apoptosis. En concreto, se refiere a un método de aislamiento de cuerpos apoptótitos a partir de unamuestra de fluido corporal y a métodos de pronóstico y de evaluación de la eficacia de un tratamiento de enfermedades vasculares, neurodegenerativas y/u oncológicas, basados en la utilización de dicho método de aislamiento de cuerpos apoptóticos.

Description

MÉTODO DE AISLAMIENTO DE CUERPOS APOPTÓTICOS
DESCRIPCIÓN Campo de la invención
La presente invención pertenece al campo de la apoptosis. En concreto, se refiere a un método para el aislamiento de cuerpos apoptóticos a partir de fluidos corporales y al uso de dicho método y cuerpos apoptóticos aislados para la evaluación de procesos apoptóticos, en particular en patologías como enfermedades vasculares, neurodegenerativas y oncológicas.
Antecedentes de la invención La apoptosis es un tipo de muerte celular ordenada que depende de la puesta en marcha de una cascada de eventos moleculares que culminan en la total desintegración de la célula. En la etapa tardía del proceso apoptótico, y como consecuencia de la fragmentación celular, se generan pequeñas vesículas membranosas llamadas cuerpos apoptóticos.
En condiciones fisiológicas, la apoptosis participa en la morfogénesis y remodelación de tejidos durante el desarrollo, y en la regulación del sistema inmunológico y homeostasis. Sin embargo, dicho proceso juega también un papel fundamental en la muerte celular y tisular que tiene lugar en diversas patologías, tales como las enfermedades vasculares, enfermedades neurodegenerativas y enfermedades oncológicas. La evaluación de los procesos apoptóticos, en concreto la determinación del grado de apoptosis o índice apoptótico, en estas enfermedades sería muy útil en la práctica clínica diaria, dado que permitiría un pronóstico precoz y más exacto, una monitorización más efectiva de la evolución de la enfermedad, y la selección de los tratamientos más adecuados para cada paciente.
Sin embargo, el análisis in vivo de la apoptosis que se produce en los tejidos tiene una clara limitación ya que actualmente es necesario conseguir muestras histológicas de los pacientes mediante métodos intervencionistas, biopsia o cirugía. Por lo tanto, hay una necesidad sanitaria urgente de disponer de procedimientos no invasivos que permitan el estudio de la apoptosis, preferentemente de una manera rápida, sencilla y cuantitativa.
En el estado de la técnica pueden encontrarse un gran número de estudios que se centran en la determinación de la muerte de un tejido, en particular mediante la obtención y análisis de muestras sólidas extraídas por métodos invasivos como biopsias (muestras de tejido). El grado de apoptósis se determina por diferentes técnicas conocidas por el experto en la materia, como son la detección de la fragmentación del ADN (técnica TUNEL, por ejemplo) y la detección de la fosfatidilserina presente en la parte externa de la membrana plasmática de las células apoptóticas con Anexina V. Sin embargo, en estos métodos las muestras de los pacientes se obtienen mediante métodos invasivos. Además en la mayoría de los casos se obtienen cultivos primarios de las biopsias y posteriormente se induce apoptosis para aislar cuerpos apoptóticos (WO 99/58645 A1), es decir, los cuerpos apoptóticos son aislados en condiciones no fisiológicas (inducción artificial de apoptosis). Sorprendentemente, los autores de la presente invención han desarrollado un método para aislar mediante centrifugación cuerpos apoptóticos a partir de muestras de fluidos corporales. Es decir, dichos cuerpos apoptóticos están aislados en condiciones fisiológicas, sin inducción artificial previa de apoptosis. Asimismo, con dicho método se puede aislar hasta más de un 90% de la totalidad de cuerpos apoptóticos de la muestra de fluido corporal y además, los cuerpos apoptóticos mantienen su integridad, siendo por tanto detectables y cuantificables. En este sentido, el documento WO 03/076589 A2 describe métodos para detectar y analizar cuerpos apoptóticos de fluidos corporales. Entre los distintos métodos descritos, hay uno en el que se separan los cuerpos apoptóticos de la fracción celular mediante centrifugación. En una realización preferida, la muestra biológica es sangre y la misma se centrifuga a más de 500 g, de manera preferente entre 800 g y 1.200 g, quedando los cuerpos apoptóticos en la fracción de plasma. Si se desea separar o aislar dichos cuerpos apoptóticos del plasma, se lleva a cabo otra centrifugación a alta velocidad (no se define a cuál, para el experto en la materia en el campo de la presente invención, una alta velocidad correspondería a una velocidad mayor de 60.000 g), después de la cual los cuerpos apoptóticos quedan en el sedimento. Sin embargo, a diferencia de lo que se consigue con el método de la presente invención, con las condiciones descritas en WO 03/076589 no es posible aislar hasta un 90% de la totalidad de los cuerpos apoptóticos presentes en los fluidos corporales, ni mantener su integridad. Esto se debe, en primer lugar, a que la centrifugación a una velocidad mayor de 500 g para obtener el plasma o suero provoca la sedimentación de todos los componentes celulares de la sangre, entre los que se encuentran las plaquetas. Estas células tiene facilidad para formar agregados, especialmente en presencia de otro tipo de células sanguíneas, como son los hematíes y los leucocitos. Si esto tiene lugar, los cuerpos apoptóticos quedarían retenidos en los agregados celulares y la centrifugación a una velocidad mayor de 500 g provocaría su sedimentación con la fracción celular, y por lo tanto, la pérdida de un gran número de ellos. Por otro lado, la centrifugación a alta velocidad del plasma o suero obtenido en la primera centrifugación, podría resultar en la ruptura de los cuerpos apoptóticos y en la contaminación de los mismos con otras vesículas membranosas de menor tamaño. Por estos inconvenientes, los cuerpos apoptóticos aislados según el método descrito en WO 03/076589 A2 tendrían poca o ninguna utilidad para el pronóstico y/o monitorización del tratamiento de sujetos con enfermedades asociadas a apoptosis, dado que el número de cuerpos apoptóticos aislados sería muy inferior al que realmente hay en el fluido corporal y los cuerpos apoptóticos podrían estar desintegrados y/o contaminados por otras microvesículas resultando en una cuantificación errónea de los cuerpos apoptóticos.
Sorprendentemente, los autores de la presente invención han desarrollado un método de aislamiento de cuerpos apoptóticos que mantienen su integridad y pueden ser por tanto cuantificados. Además, el método de la invención minimiza al máximo la pérdida de cuerpos apoptóticos durante su aislamiento llegándose a aislar hasta más del 90% de la totalidad de cuerpos apoptóticos presentes en la muestra de fluido corporal. De esta manera, los autores de la presente invención han desarrollado una herramienta de gran utilidad para el estudio clínico de la apoptosis. Así, la presente invención se refiere también a método de pronóstico basados en la cuantificación de cuerpos apoptóticos aislados siguiendo el método de la invención y al uso de dichos cuerpos apoptóticos como factor pronóstico y como marcador de la eficacia de un tratamiento terapéutico. Por último, otra importante ventaja de la integridad de los cuerpos apoptóticos aislados por el método de la presente invención es su uso para identificar el tipo celular de la célula que ha muerto por apoptosis, lo que proporciona una información de excepcional utilidad en el campo clínico, en particular, de enfermedades neurodegenerativas, vasculares y oncológicas.
Objeto de la invención
La presente invención se refiere en un primer aspecto a un método para el aislamiento de cuerpos apoptóticos (método de la invención) que comprende las siguientes etapas: a) centrifugar una muestra de fluido corporal tomada de un sujeto, a una velocidad menor o igual a 300 g, y recoger el sobrenadante,
b) centrifugar el sobrenadante obtenido en la etapa a) a una velocidad entre 400 g y 1.000 g y recoger el sobrenadante,
c) centrifugar el sobrenadante obtenido en la etapa b) a una velocidad entre 8.000 g y 40.000 g y eliminar el sobrenadante,
donde el sedimento obtenido en la etapa c) comprende los cuerpos apoptóticos aislados.
Un segundo aspecto de la presente invención se refiere a un método de pronóstico de una enfermedad vascular que comprende las siguientes etapas: i) aislar cuerpos apoptóticos de una primera y una segunda muestra de fluido corporal tomadas de un paciente con una enfermedad vascular siguiendo el método de la invención, donde la segunda muestra es tomada al menos 48 h después de la primera muestra,
ii) cuantificar los cuerpos apoptóticos aislados en la etapa i), y
iii) comparar el número de cuerpos apoptóticos aislados en las dos muestras, donde un mayor número de cuerpos apoptóticos en la segunda muestra que en la primera es indicativo de un mal pronóstico. Un tercer aspecto de la presente invención se refiere a un método de determinación del estadio de una enfermedad neurodegenerativa que comprende las siguientes etapas: I) aislar cuerpos apoptóticos de una muestra de fluido corporal tomada de un paciente con una enfermedad neurodegenerativa siguiendo el método de la invención,
II) cuantificar los cuerpos apoptóticos aislados en la etapa I), y
III) comparar el número de cuerpos apoptóticos aislados de la muestra con unos valores de referencia.
Un cuarto aspecto de la presente invención se refiere a un método para analizar la eficacia de un tratamiento de una enfermedad vascular caracterizado por que comprende las siguientes etapas:
A) aislar cuerpos apoptóticos de dos muestras de fluido corporal tomadas de un paciente con una enfermedad vascular siguiendo el método de la invención, donde una primera muestra es tomada antes del tratamiento y una segunda muestra es tomada después del tratamiento, o donde las dos muestras son tomadas durante el tratamiento, una primera muestra una vez comenzado el tratamiento y una segunda muestra al menos 48 horas después de la primera,
B) cuantificar los cuerpos apoptóticos aislados en la etapa A), y
C) comparar el número de cuerpos apoptóticos en las dos muestras, donde un menor número de cuerpos apoptóticos en la segunda muestra que en la primera indica que el tratamiento es eficaz.
Un quinto aspecto de la presente invención se refiere a un método para analizar la eficacia de un tratamiento de una enfermedad oncológica y/o neurodegenerativa caracterizado por que comprende las siguientes etapas:
A) aislar cuerpos apoptóticos de dos muestras de fluido corporal tomadas de un paciente con una enfermedad oncológica y/o neurodegenerativa siguiendo el método de la invención, donde una primera muestra es tomada antes del tratamiento y una segunda muestra es tomada después del tratamiento, o donde las dos muestras son tomadas durante el tratamiento, una primera muestra una vez comenzado el tratamiento y una segunda muestra al menos dos semanas después de la primera,
B) cuantificar los cuerpos apoptóticos aislados en la etapa A), y
C) comparar el número de cuerpos apoptóticos en las dos muestras, donde en la enfermedad oncológica un mayor número de cuerpos apoptóticos en la segunda muestra que en la primera indica que el tratamiento es eficaz y en la enfermedad neurodegenerativa un menor número de cuerpos apoptóticos en la segunda muestra que en la primera indica que el tratamiento es eficaz.
Un sexto aspecto de la presente invención se refiere a un método para identificar el tipo celular de una célula que ha muerto por apoptosis que comprende las siguientes etapas: 1) aislar cuerpos apoptóticos de una muestra de fluido corporal siguiendo el método de la invención,
2) detectar en la parte externa de la membrana plasmática del cuerpo apoptótico un marcador de tipo celular. Un séptimo aspecto de la presente invención se refiere al uso del método de la invención para pronóstico de una enfermedad vascular y/o neurodegenerativa.
Un octavo aspecto de la presente invención se refiere al uso del método de la invención para evaluar la eficacia del tratamiento de una enfermedad oncológica, neurodegenerativa y/o vascular.
Un noveno aspecto de la presente invención se refiere al uso del método de la invención para identificar el tipo celular de una célula que ha muerto por apoptosis.
Breve descripción de las figuras
Figura 1 : Representación gráfica del número de cuerpos apoptóticos (también referidos como CA de aquí en adelante) por mililitro de plasma en pacientes con sospecha de ictus isquémico, frente al tiempo en horas. En particular, se muestran los datos a las 4 y 96 h post-ictus. Se representan los CA procedentes de la muerte celular de distintos tipos celulares: microglía (blanco), oligodendrocitos (rayas verticales), neuronas (negro) y astrocitos (rayas oblicuas). Panel A: paciente con infarto cerebral de origen indeterminado. Panel B: paciente con infarto cerebral de origen cardioembólico.
Figura 2: Representación gráfica del número de CA por mililitro de plasma en dos pacientes con sospecha de ictus isquémico. El análisis determinó que el paciente 1 (1 , en el eje de abscisas) sufrió un ataque isquémico transitorio (AIT) y el paciente 2 (2, en el eje de abscisas) un ictus isquémico. Los CA fueron aislados sin dilución.
Figura 3: Representación gráfica del número de CA por mililitro de plasma en dos pacientes con sospecha de ictus isquémico. El análisis determinó que el paciente 1 (1) sufrió un AIT y el paciente 2 (2) un ictus isquémico.
Figura 4: Representación gráfica del número de CA por mililitro de plasma en dos pacientes diagnosticados de esclerosis múltiple remitente recurrente. El paciente 1 (1) sigue tratamiento con Interferon Beta y el paciente 2 (2) con Natalizumab. Se representan los cuerpos apoptóticos provenientes de la muerte celular de distintos tipos celulares: microglía (blanco), oligodendrocitos (rayas verticales), neuronas
(negro) y astrocitos (rayas oblicuas).
Figura 5: Representación gráfica del número de CA por mililitro de plasma en cuatro pacientes diagnosticados de esclerosis múltiple remitente recurrente, dos pacientes en estadio precoz (P) y dos pacientes en estadio avanzado (A).
Figura 6: Representación gráfica del número de CA por mililitro de plasma en seis pacientes diagnosticados de enfermedad de Parkinson, dos pacientes en cada uno de los primeros estadios de la patología (I, II y III).
Figura 7: Representación gráfica del número de CA por mililitro de plasma en tres pacientes (1 , 2 y 3) diagnosticados de cáncer de colon metastásico. El paciente 1 y el paciente 2 habían recibido 6 ciclos de tratamiento quimioterápico con Folfiri, mientras que la paciente 3 no fue sometida a quimioterapia. Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere en un primer aspecto a un método para el aislamiento de cuerpos apoptóticos que comprende las siguientes etapas: a) centrifugar una muestra de fluido corporal tomada de un sujeto, a una velocidad menor o igual a 300 g, y recoger el sobrenadante,
b) centrifugar el sobrenadante obtenido en la etapa a) a una velocidad entre 400 g y 1.000 g y recoger el sobrenadante,
c) centrifugar el sobrenadante obtenido en la etapa b) a una velocidad entre 8.000 g y 40.000 g y eliminar el sobrenadante,
donde el sedimento obtenido en la etapa c) comprende los cuerpos apoptóticos aislados. Las condiciones de temperatura y tiempo a las que se llevan a cabo las centrifugaciones del método de la presente invención son fácilmente determinables por el experto en la materia. En una realización particular, se llevan a cabo a una temperatura entre 8°C y 41 °C, de manera más particular entre 12°C y 25°C, y durante al menos 5 minutos. El método de la presente invención se lleva a cabo, preferentemente, en las tres horas siguientes a la recogida de la muestra de fluido corporal. Preferentemente, la muestra se mantiene en suave agitación hasta el comienzo del método de aislamiento.
En la presente invención el término "cuerpo apoptótico" se refiere a una vesícula membranosa, de un tamaño de entre 1 μιτι y 4 que se origina por la muerte por apoptosis de las células, y que contiene fragmentos nucleares, material genético y constituyentes citoplásmicos de la célula apoptótica. El término "fluido corporal" se refiere al líquido extracelular del cuerpo. En una realización particular del método de la presente invención, el fluido corporal se selecciona del grupo que consiste en sangre, plasma, orina, líquido cefalorraquídeo, líquido ascítico, líquido sinovial y líquido amniótico. En otra realización particular, dicho fluido corporal es sangre, plasma u orina. En una realización más particular, dicho fluido corporal es sangre o plasma, y en una realización preferente el fluido corporal es sangre.
En la presente invención, se desaconseja el empleo de muestras de suero para extraer cuerpos apoptóticos circulantes ya que el suero sanguíneo es el componente de la sangre resultante tras permitir la coagulación de ésta y excluir el coágulo de fibrina y otros componentes y durante la formación del coágulo los cuerpos apoptóticos pueden quedar retenidos en la malla de fibrina y la eliminación de la misma implicaría la pérdida de un gran número de cuerpos apoptóticos. Así, en una realización particular, cuando la muestra de fluido corporal es sangre, la muestra se recoge en un medio con anticoagulante. En una realización particular, el anticoagulante se selecciona del grupo formado por citrato sódico, EDTA sódico, EDTA potásico, heparina sódica, heparina potásica, heparina de litio, heparina de amonio, fluoruro sódico y mezclas de los mismos. En una realización preferida el anticoagulante es citrato sódico.
En la etapa a) del método de la invención la velocidad de la centrifugación no puede ser mayor de 300 g ya que eso resultaría en la sedimentación de todos los componentes celulares de la sangre, incluidas las plaquetas, arrastrando con ellos a una gran parte de los cuerpos apoptóticos de la muestra, lo que provocaría la pérdida de un gran número de cuerpos apoptóticos. En una realización particular de la invención, la velocidad de la centrifugación de la etapa a) es entre 160 g y 300 g. Con este rango de velocidad se consigue una pérdida mínima de cuerpos apoptóticos con el sedimento. La etapa b) del método de la invención es necesaria para obtener un sobrenadante rico en cuerpos apoptóticos y libre de plaquetas y aquellos componentes celulares que no hayan sedimentado con la centrifugación de la etapa a). Sin embargo, una velocidad superior a 1.000 g resultaría en la pérdida de cuerpos apoptóticos que sedimentan junto con las plaquetas y aquellos componentes celulares que no hayan sedimentado con la centrifugación de la etapa a). La condición preferida para aislar el mayor número posible de cuerpos apoptóticos del sobrenadante obtenido en la etapa a) es una centrifugación a una velocidad entre 500 g y 800 g. Así, en una realización particular de la invención, la etapa b) se lleva a cabo a una velocidad de entre 500 g y 800 g. El sobrenadante obtenido en la etapa b) comprende además de cuerpos apoptóticos, otras microvesículas circulantes como son mi ero partículas y exosomas. Las micropartículas circulantes son vesículas membranosas secretadas por la activación de distintos tipos celulares, entre los que destacan; células endoteliales, epiteliales, leucocitos y plaquetas. Estas micropartículas tienen un tamaño de 0,1 μητι - 1 μητι y se forman de la evaginación de la membrana plasmática, mientras que los exosomas tienen un tamaño menor (0,05 μηι - 0, 1 μηι) y proceden de un compartimento intracelular: los cuerpos multivesiculares (MVB). El objetivo de la etapa c) del método de la invención es sedimentar los cuerpos apoptóticos con la mínima concentración de otras microvesículas circulantes. Una velocidad de centrifugación menor de 8.000 g no lograría la sedimentación de la totalidad de los cuerpos apoptóticos presentes en el sobrenadante obtenido de la etapa b) y una velocidad superior a 40.000 g provocaría la ruptura de los cuerpos apoptóticos y la sedimentación de otras microvesículas circulantes. En una realización particular de la invención, la velocidad de la centrifugación de la etapa c) es entre 11.000 g y 30.000 g, con la cual se reduce considerablemente la sedimentación de otros tipos de microvesículas. Al eliminar el sobrenadante, queda un sedimento que comprende los cuerpos apoptóticos aislados. Estos cuerpos apoptóticos pueden ser resuspendidos y almacenados a una temperatura entre 4°C y 8°C. Los cuerpos pueden resuspenderse en TBS (Tris-buffered saline, 2 mM Tris, 150 mM NaCI, pH:7,4), PBS {Phosphate-buffered saline, 10 mM fosfato, 137 mM NaCI, 2,7 mM KCI pH:7,4), Hepes (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid ) 10-50 mM, CHES (N-Cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic acid) 10-50mM, MOPS (3-(N-morpholino)propanesulfonic acid) 10-50 mM y PIPES (piperazine-N,N'- bis(2-ethanesulfonic acid) 10-50 mM. Los cuerpos apoptóticos resuspendidos pueden ser almacenados hasta doce meses, preferiblemente hasta seis meses. Los cuerpos apoptóticos resuspendidos en un tampón se refieren de aquí en adelante como preparación de cuerpos apoptóticos.
Una importante ventaja del método de la presente invención es que en el sedimento que comprende los cuerpos apoptóticos aislados el contenido de otras micropartículas es inferior al 20% (Tabla 1 , ejemplo 1). Este grado de pureza de cuerpos apoptóticos en el sedimento obtenido en la etapa c) del método de la invención tiene una gran importancia a nivel clínico, tal y como se explica más adelante.
Además, otra importante ventaja del método de la presente invención es su alto rendimiento de aislamiento de cuerpos apoptóticos. Con el método de la presente invención se aislan al menos un 75% de los cuerpos apoptóticos presentes en la muestra de fluido corporal (Tabla 2, ejemplo 2). Sorprendentemente, puede incluso aislarse un mayor porcentaje de cuerpos apoptóticos mediante la dilución del sobrenadante obtenido en la etapa a) en un tampón o solución reguladora del pH antes de llevar a cabo la etapa b). Así, en una realización particular del método de la invención, entre las etapas a) y b) se lleva a cabo una etapa a1) en la que se diluye el sobrenadante obtenido en la etapa a) en un tampón. Con esta realización particular se puede aumentar el número de cuerpos apoptóticos aislados a un porcentaje mayor o igual al 80% de los cuerpos apoptóticos presentes en la muestra de fluido corporal e incluso a un porcentaje mayor o igual al 90% (Tabla 2, ejemplo 2).
Los tampones compatibles con los fluidos corporales son conocidos por el experto en la materia. En una realización particular, el tampón de la etapa a1 se selecciona del grupo constituido por TBS, PBS, Hepes 10-50 mM, CHES 10-50mM, MOPS 10-
50 mM y PIPES 10-50 mM. En una realización preferente, el tampón es TBS. En otra realización preferente, la dilución es 1 :3 sobrenadante:tampón.
Inesperadamente, con el método de la presente invención se obtienen cuerpos apoptóticos íntegros. En el contexto de la presente invención "cuerpos apoptóticos íntegros" se refiere a cuerpos apoptóticos con la membrana plasmática íntegra, sin rupturas, es decir, los cuerpos apoptóticos no están rotos o desintegrados. Esto permite la cuantificación de dichos cuerpos apoptóticos, no únicamente el análisis o detección de sus componentes cuando se rompen como ocurre típicamente en los métodos de aislamiento de cuerpos apoptóticos descritos en el estado de la técnica.
La cuantificación de los cuerpos apoptóticos tiene gran utilidad clínica como método de pronóstico y como método para evaluar la eficacia de un tratamiento terapéutico. Dicha utilidad clínica se ve reforzada por el alto grado de pureza de los cuerpos aislado siguiendo el método de la presente invención, con el cual, tal y como se ha indicado anteriormente, se obtiene un sedimento donde más de un 80% son cuerpos apoptóticos. La presencia de otras microvesículas en dicho sedimento dificulta su utilidad clínica ya que resultaría en una cuantificación errónea de los cuerpos apoptóticos. La detección y cuantificación de los cuerpos apoptóticos se basa en la unión específica de la anexina V a un lípido, la fosfatidilserina, presente en la parte externa de la membrana plasmática de los mismos. Se ha descrito que las micropartículas también poseen dicho lípido, por lo que serían cuantificadas como si fueran cuerpos apoptóticos y el número de los cuerpos apoptóticos cuantificados sería por tanto superior al fisiológico.
Todas estas ventajas hacen del método de la presente invención una herramienta de extremado valor en la práctica clínica diaria como método no invasivo para determinar el grado de muerte celular que ha tenido lugar en un sujeto, lo que permitiría un pronóstico precoz y más exacto, una monitorización más efectiva, y la selección de los tratamientos más adecuados y por tanto una terapia personalizada en diversas patología, incluyendo enfermedades neurodegenerativas, vasculares y oncológicas. En el contexto de la presente invención, el término "método no invasivo" hace referencia a un método en el que se realizan inyecciones (para la extracción de fluidos corporales) o se emplean herramientas que estén en contacto con el paciente de forma superficial o a cierta distancia. A diferencia de los métodos invasivos, en estas técnicas no invasivas no es necesario realizar una incisión para llegar al sitio o tejido de interés.
Así, un segundo aspecto de la presente invención se refiere a un método de pronóstico de una enfermedad vascular caracterizado por que comprende las siguientes etapas: i) aislar cuerpos apoptóticos de una primera y una segunda muestra de fluido corporal tomadas de un paciente con una enfermedad vascular siguiendo el método de la invención según el primer aspecto de la invención, donde la segunda muestra es tomada al menos 48 h después de la primera muestra,
ii) cuantificar los cuerpos apoptóticos aislados en la etapa i), y iii) comparar el número de cuerpos apoptóticos aislados en las dos muestras, donde un mayor número de cuerpos apoptóticos en la segunda muestra que en la primera es indicativo de un mal pronóstico. En el contexto de la presente invención, el término "mal pronóstico", también referido como pronóstico desfavorable en el estado de la técnica, se refiere a una baja probabilidad de recuperación, y con ello, mayor riesgo o probabilidad de muerte. El término "enfermedad vascular" se refiere a todo tipo de patología o enfermedad provocada o que cursa con la lesión o compresión de un vaso sanguíneo. En una realización particular de la invención, la enfermedad vascular se selecciona del grupo constituido por enfermedades cardiovasculares, cerebrovasculares y trombosis. En una realización más particular de la invención, la enfermedad vascular es una enfermedad cerebrovascular. En otra realización particular las muestras primera y segunda son tomadas con al menos 72 h de diferencia, y de manera más particular, con al menos 92 h de diferencia. En una realización preferente dichas muestras son tomadas con 92 h de diferencia.
Así, el uso del método de aislamiento de CA de la presente invención según el primer aspecto de la invención, permite predecir el pronóstico de un sujeto afecto de una enfermedad vascular en base a la cuantificación de los cuerpos apoptóticos, de una manera rápida y sencilla y a partir de una muestra de fluido corporal (ver ejemplos 3, 4 y 5, figuras 1 , 2 y 3, respectivamente).
La cuantificación de los cuerpos apoptóticos aislados por el método según el primer aspecto de la invención también sirve para determinar el estadio de una enfermedad neurodegenerativa. Así, un tercer aspecto de la presente invención se refiere a un método de determinación del estadio de una enfermedad neurodegenerativa caracterizado por que comprende las siguientes etapas: I) aislar cuerpos apoptóticos de una muestra de fluido corporal tomada de un paciente con una enfermedad neurodegenerativa siguiendo el método de la invención,
II) cuantificar los cuerpos apoptóticos aislados en la etapa I), y
III) comparar el número de cuerpos apoptóticos aislados de la muestra con unos valores de referencia.
En el contexto de la presente invención, el término "enfermedad neurodegenerativa" se refiere a un grupo de enfermedades crónicas del sistema nervioso, caracterizadas por pérdida neuronal (sustancia gris) y/o glial (sustancia blanca) progresiva. Diversos factores genéticos y ambientales participan en la etiología de las enfermedades neurodegenerativas produciendo alteraciones de los sistemas cognoscitivos, sensitivos y motores. En una realización particular de la invención, la enfermedad neurodegenerativa se selecciona del grupo constituido por esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), Alzheimer, Parkinson y enfermedad de
Huntington. En una realización más particular de la invención, la enfermedad neurodegenerativa se selecciona del grupo constituido por esclerosis múltiple, Alzheimer y Parkinson. Con este método se puede identificar el estadio de una enfermedad neurodegenerativa y con ello el pronóstico de dicha enfermedad. En el caso de enfermedades neurodegenerativas, los niveles de cuerpos apoptoticos en la muestra de un fluido corporal en estadios iniciales son mayores que en estadios avanzados. En particular, en el caso de enfermedades neurodegenerativas en estadios iniciales los niveles de cuerpos apoptoticos son de más de 30.000 CA por mi de plasma y en estadios avanzados son de menos de 30.000 CA por mi de plasma. Así, en una realización particular del método de la invención, un número de CA por mi de plasma mayor de 30.000, en particular de 30.000 a 150.000, es indicativo de que la enfermedad neurodegenerativa está en estadios iniciales y un número de CA por mi de plasma menor de 30.000, en particular de 5.000 a 20.000, es indicativo de que la enfermedad neurodegenerativa está en estadios avanzados. Por ejemplo, un sujeto con Parkinson y con un número de CA por mi de plasma mayor de 30.000 estaría en estadio I o II, y con Esclerosis Múltiple y un número de CA por mi de plasma menor de 30.000 estaría en un estadio avanzado de la enfermedad (ver ejemplos 7 y 8, figuras 5 y 6 respectivamente).
La presente invención se refiere también a un método para analizar la eficacia del tratamiento recibido por un sujeto con una enfermedad oncológica, neurodegenerativa y/o vascular. Así, un cuarto aspecto de la presente invención se refiere a un método para analizar la eficacia de un tratamiento de una enfermedad vascular caracterizado por que comprende las siguientes etapas:
A) aislar cuerpos apoptóticos de dos muestras de fluido corporal tomadas de un paciente con una enfermedad vascular siguiendo el método de la invención según el primer aspecto de la invención, donde una primera muestra es tomada antes del tratamiento y una segunda muestra es tomada después del tratamiento, o donde las dos muestras son tomadas durante el tratamiento, una primera muestra una vez comenzado el tratamiento y una segunda muestra al menos 48 horas después de la primera,
B) cuantificar los cuerpos apoptóticos aislados en la etapa A), y
C) comparar el número de cuerpos apoptóticos en las dos muestras, donde un menor número de cuerpos apoptóticos en la segunda muestra que en la primera indica que el tratamiento es eficaz.
En una realización más particular de este método, las muestras de la etapa A) se toman con al menos 72 h de diferencia, y de manera más particular, con al menos 92 h de diferencia y de manera preferente con 92 h de diferencia.
Un quinto aspecto de la presente invención se refiere a un método para analizar la eficacia de un tratamiento de una enfermedad oncológica y/o neurodegenerativa caracterizado por que comprende las siguientes etapas: A) aislar cuerpos apoptóticos de dos muestras de fluido corporal tomadas de un paciente con una enfermedad oncológica y/o neurodegenerativa siguiendo el método de la invención según el primer aspecto de la invención, donde una primera muestra es tomada antes del tratamiento y una segunda muestra es tomada después del tratamiento, o donde las dos muestras son tomadas durante el tratamiento, una primera muestra una vez comenzado el tratamiento y una segunda muestra al menos dos semanas después de la primera,
B) cuantificar los cuerpos apoptóticos aislados en la etapa A), y
C) comparar el número de cuerpos apoptóticos en las dos muestras, donde en la enfermedad oncológica un mayor número de cuerpos apoptóticos en la segunda muestra que en la primera indica que el tratamiento es eficaz y en la enfermedad neurodegenerativa un menor número de cuerpos apoptóticos en la segunda muestra que en la primera indica que el tratamiento es eficaz. En el caso de las enfermedades oncológicas, los tratamientos antitumorales: quimioterapia, radioterapia y terapias biológicas, están dirigidos a matar las células tumorales induciendo apoptosis y por lo consiguiente su desintegración. Si el paciente responde al tratamiento, es decir, la terapia funciona, es eficaz, se produce la muerte del tumor, y por lo tanto se detectan niveles más altos de cuerpos apoptóticos en la segunda muestra de fluido corporal que en la primera (ver ejemplo
9, figura 7).
En el caso de una enfermedad neurodegenerativa y/o vascular si el paciente responde al tratamiento (la terapia es eficaz), se detectan niveles más bajos de cuerpos apoptóticos en la segunda muestra de fluido corporal que en la primera
(ver el ejemplo 6, figura 4, para una enfermedad neurodegenerativa).
En el contexto de la presente invención, las enfermedades oncológicas se refieren a un grupo de enfermedades cuya causa es la aparición de un tumor. El tumor suele invadir el tejido circundante y puede provocar metástasis en puntos distantes del organismo En una realización particular, la enfermedad oncológica se selecciona del grupo que consiste en cáncer colorectal, de páncreas, de estómago, de esófago, de hígado, de pulmón, de mama, de ovario, de útero, de próstata, de testículo, de tiroides, de cabeza y cuello, tumores cerebrales (gliomas y neuroblastomas) y melanomas. En una realización más particular, la enfermedad oncológica se selecciona del grupo que consiste en cáncer colorectal y cáncer de hígado.
La integridad de los cuerpos apoptóticos aislados por el método según el primer aspecto de la presente invención permite, además de su cuantificación, identificar el tipo celular del que provienen, es decir, permite identificar qué tipo de célula ha muerto por apoptosis. Esta información es muy importante a nivel clínico en enfermedades vasculares, neurodegenerativas y oncológicas y, en especial, en el campo de las enfermedades neurodegenerativas y cerebrovasculares. Dependiendo del tipo de célula del sistema nervioso que haya muerto así será la severidad de la patología e influirá en su evolución o pronóstico. Por ejemplo, dos pacientes con un infarto isquémico en los que se detecta un incremento de los cuerpos apoptóticos en la segunda muestra de fluido corporal (al menos 48 h después de la toma de la primera muestra) tienen un mal pronóstico. Además, la enfermedad puede agravarse, o en otras palabras, el pronóstico puede empeorar si el número de cuerpos apoptóticos procedentes de neuronas es muy alto, ya que éstas tienen escasa capacidad de regeneración en comparación con el resto de células del sistema nervioso, como por ejemplo, los astrocitos. Otro ejemplo, dos pacientes con esclerosis múltiple, con el mismo número de cuerpos apoptóticos en la muestra de fluido corporal, el sujeto cuyo número de cuerpos apoptóticos procedentes de oligodendrocitos sea mayor tendrá un pronóstico más desfavorable. Los oligodendrocitos son los componentes celulares encargados de la mielinización de los axones neuronales, un mayor proceso de desmielinización va acompañado de un empeoramiento de la enfermedad. Asimismo, la identificación del tipo celular que ha muerto por apoptosis es clínicamente muy relevante en las enfermedades oncológicas, en especial, en la evaluación de la eficacia del tratamiento antitumoral. Por ejemplo, dos pacientes diagnosticados de cáncer de colon que han recibido tratamiento quimioterapéutico en los que se detectan niveles plasmáticos altos de cuerpos apoptóticos tras la terapia es indicativo de eficacia del dicho tratamiento.
En este contexto, un número de cuerpos apoptóticos (CA por mi de muestra) procedente de células tumorales más elevada indicará una mayor eficacia de dicho tratamiento. Así, un sexto aspecto de la presente invención se refiere a un método para identificar el tipo celular de una célula que ha muerto por apoptosis caracterizado por que comprende las siguientes etapas:
1) aislar cuerpos apoptóticos de una muestra de fluido corporal siguiendo el método de la invención,
2) detectar en la parte externa de la membrana plasmática del cuerpo apoptótico un marcador de tipo celular.
En el contexto de la presente invención se entiende por "marcador de tipo celular", a una proteína que es específica o se encuentra únicamente en un tipo de célula. En concreto, en la presente invención dicha proteína se debe encontrar en la parte externa de la membrana plasmática de la célula o debe ser una proteína transmembrana. En este método se pueden detectar uno o varios marcadores de tipo celular.
En una realización particular del método para identificar el tipo celular de una célula que ha muerto por apoptosis, el marcador de tipo celular es un marcador neuronal, y de manera más particular dicho marcador neuronal se selecciona del grupo constituido por CD90 (Molécula de adhesión neuronal L1), NGFR (Receptor del factor de crecimiento nervioso) p75, PSA-NCAM, Efrina-A2, Efrina-A4, Efrina-A5, Efrina-B1 , Efrina-B2, GAP-43, Laminina-1 , NAP-22, Netrina-1 , Neurofilina, Plexina- A1 , Semaforina 3A, Semaforina 3F, Semaforina 4D, Trk A, Encefalina, GAD65 (glutamato descarboxilasa), GAP-43 (proteína asociada al crecimiento 43), LINGO- 1 , subunidad de la Na+/K+ ATPasa, transportador de Colina, transportador de
Dopamina (DAT), transportador de Norepinefrina (NET), transportador de Serotonina (SERT), Transportador 1 , 2 y 3 de GABA, Transportador neuronal de glutamato,, Proteína de unión a AMPA (ABP), Complexina 1 (CPLX1), Contactina- 1 , VAMP-2, transportador vesicular de acetilcolina (VAChT), transportador vesicular de GABA (VGAT; VIAAT), transportador vesicular de glutamato 1 , 2, 3 (VGLUT), transportador vesicular de monoamina 1 , 2 (VMAT) y N-cadherina, E-cadherina.
En una realización particular del método para identificar el tipo celular de una célula que ha muerto por apoptosis, el marcador de tipo celular es un marcador glial, y de manera más particular dicho marcador glial se selecciona del grupo constituido por
GLAST, CD1 1 b, CD100, CD104 y NG2 proteoglicano sulfato de condroitina. En una realización más particular del método para identificar el tipo celular de una célula que ha muerto por apoptosis, el marcador de tipo celular se selecciona del grupo constituido por CD90, GLAST, CD11 b y CD100. Así se identifican neuronas, astrocitos, la microglía y oligodendrocitos, respectivamente (ver ejemplos 3 y 6, figuras 1 y 4 respectivamente).
En cuanto a las enfermedades oncológicas, sirve como marcador de tipo celular cualquier antígeno tumoral descrito en el estado de la técnica. En una realización particular del método para identificar el tipo celular de una célula que ha muerto por apoptosis, el marcador de tipo celular es antígeno tumoral seleccionado del grupo constituido por antígeno carcinoembrionario (CEA), antígeno de membrana específico de próstata (PSMA), mucinas, integrinas y receptores tirosina quinasa. Las mucinas incluyen CA-125, CA-19-9 y CA-15-3, las integrinas incluyen EpCAM
(molécula de adhesión epitelial), CD24, CD44, CD49, CD100 y CD104 y los receptores tirosina quinasa incluyen EGFR (receptor del factor de crecimiento epidérmico), FGFR (receptor del factor de crecimiento de fibroblastos), VEGFR (receptor del factor de crecimiento endotelial vascular) PDGF (receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas) y el receptor de insulina
Así, en otra realización particular del método para identificar el tipo celular de una célula que ha muerto por apoptosis, el marcador de tipo celular se selecciona del grupo constituido por CD90, GLAST, CD11 b, CD100 y antígenos tumorales.
La cuantificación de los CA llevada a cabo en cualquiera de los métodos descritos en los aspectos segundo, tercero, cuarto, quinto y sexto de la presente invención, se puede llevar a cabo mediante técnicas convencionales, ampliamente conocidos por el experto en la materia. En una realización particular, la cuantificación de CA se lleva a cabo por un método seleccionado del grupo constituido por citometría de flujo, tecnología de nanosight ® NTA "nanoparticle tracking analysis" y tecnología de impedancia. En una realización preferente la cuantificación de CA se lleva a cabo por citometría de flujo o tecnología de nanosight ® NTA. Un séptimo aspecto de la presente invención se refiere al uso del método de la invención según el aspecto primero de la invención para pronóstico. Una realización particular de este aspecto se refiere al uso del método de la invención para pronóstico de enfermedades vasculares y/o neurodegenerativas. Un octavo aspecto de la presente invención se refiere al uso del método de la invención para evaluar la eficacia del tratamiento de una enfermedad oncológica, neurodegenerativa y/o vascular.
Un noveno aspecto de la presente invención se refiere al uso del método de la invención para identificar el tipo celular de una célula que ha muerto por apoptosis. Los marcadores del tipo celular son aquellos descritos anteriormente en el sexto aspecto de la presente invención. Por último, la presente invención se refiere también a los cuerpos apoptóticos aislables por el método de la invención según el primer aspecto de la invención. Una realización particular, se refiere a un cuerpo apoptótico aislable por el método de la invención, que comprende en la membrana externa CD90, GLAST, CD1 1 b, CD100 o un antígeno tumoral. Una realización más particular, se refiere a un cuerpo apoptótico aislable por el método de la invención, que comprende en la membrana externa CD90, GLAST, CD11 b o CD100.
Todas estas ventajas hacen del método de aislamiento de cuerpos apoptóticos de la presente invención una herramienta de extremado valor en la práctica clínica diaria como método no invasivo para determinar el grado de muerte celular que ha tenido lugar en los pacientes, lo que permitiría un pronóstico precoz y más exacto, una monitorización más efectiva de la evolución del paciente, y la selección de los tratamientos más adecuados en diversas patologías, incluyendo enfermedades neurodegenerativas, vasculares y oncológicas. Se proporciona así una terapia más personalizada que puede alertar de un pronóstico desfavorable a pesar de que otros parámetros clínicos puedan ser favorables. Asimismo, como ya se ha mencionado anteriormente, es un método que puede llevarse a cabo a partir de distintos fluidos corporales lo que le convierte en un método de rápida y fácil aplicación, siendo además un método de interpretación sencilla, fácilmente reproducible y de bajo coste económico.
Ejemplos
A continuación se detallan unos ejemplos concretos de realización de la invención que sirven para ilustrar la invención sin limitar el alcance de la misma.
EJEMPLO 1 : Aislamiento de cuerpos apoptóticos. Pureza.
El estudio clínico incluye 6 pacientes, dos diagnosticados de ictus isquémico (paciente 1 : mujer de 85 años, Paciente 2: hombre de 59 años), dos de esclerosis múltiple (paciente 3: Mujer de 51 años, Paciente 4: Hombre de 32 años) y dos de enfermedad de Parkinson (Paciente 5: Hombre de 61 años, Paciente 6: Mujer de 68 años).
Se recogió sangre (20 mi) de cada paciente en el servicio de neurología y se depositó en tubos con citrato sódico. Transcurridos menos de 2 horas desde la extracción se procedió al aislamiento de cuerpos apoptóticos mediante centrifugaciones seriadas según el método del primer aspecto de la invención, tal y como se indica a continuación:
Las muestras sanguíneas fueron sometidas a centrifugación: 250 g durante 10 min a 18°C. La fase de plasma de la muestra procedente del paciente 1 fue diluida en tampón TBS 1X en una relación 1 :3 (etapa a1) y centrifugado a 850 g durante 20 min a 18°C (etapa b). El sobrenadante de la centrifugación anterior fue traspasado a un tubo limpio de policarbonato y centrifugado a 12.000 g durante 20 min a 9°C (etapa c). El sobrenadante de la última centrifugación fue eliminado y el sedimento que contiene los cuerpos apoptóticos, fue resuspendido mediante pipeteo en tampón TBS 1X.
Posteriormente, las preparaciones de CA fueron analizadas mediante citometría de flujo para determinar el número total de microvesículas (MV)(vesículas positivas para Anexina V), incluyendo cuerpos apoptóticos (CA), mi ero partículas (MP) y exosomas (EXO), por mililitro de plasma. Para ello, las muestras fueron incubadas con Anexina-V e loduro de propidio (IP).
Los resultados de este análisis se muestran en la tabla 1. Sorprendentemente, el número total de CA (positivos para Anexina V e loduro de propidio en análisis por citometría de flujo) aislados por mililitro de plasma, representaba más del 80% del total de microvesículas obtenidas por el procedimiento objeto de la invención, mientras que el número de micropartículas y exosomas (positivos para Anexina V y negativos para loduro de propidio en análisis por citometría de flujo) fue inferior al 20% del total de microvesículas. Estos hallazgos demuestran que el sedimento y las preparaciones de CA obtenidas por el procedimiento objeto de la presente invención tienen un alto grado de pureza, es decir, están mínimamente contaminados con otras microvesículas. Tabla 1.- Pureza del sedimento que comprende los CA.
Figure imgf000023_0001
EJEMPLO 2: Aislamiento de cuerpos apoptóticos. Rendimiento.
El estudio clínico incluye 2 pacientes, dos diagnosticados de ictus isquémico (paciente 1 : Hombre de 76 años, Paciente 2: hombre de 58 años).
Se recogió sangre (20 mi) de cada paciente en el servicio de neurología y se depositó en tubos con citrato sódico. Transcurridos menos de 2 horas desde la extracción se procedió al aislamiento de cuerpos apoptóticos según se indica a continuación:
Las muestras sanguíneas fueron sometidas a centrifugación: 160 g durante 20 min a 18°C. La fase de plasma (que contiene los cuerpos apoptóticos) de la muestra procedente del paciente 2 fue traspasada a un tubo estéril de polipropileno (etapa a) y centrifugado a 700 g durante 30 min a 18°C (etapa b). La fase de plasma de la muestra procedente del paciente 1 fue diluida en tampón TBS 1X en una relación 1 :3 (etapa a1) y centrifugado a 700 g durante 30 min a 18°C (etapa b). El sobrenadante de la centrifugación anterior fue traspasado a un tubo limpio de policarbonato y centrifugado a 14.000 g durante 30 min a 9°C (etapa c). El sobrenadante de la última centrifugación fue eliminado y el sedimento que contiene los cuerpos apoptóticos, fue resuspendido mediante pipeteo en tampón TBS 1X.
En ambos casos, antes de proceder al aislamiento de cuerpos apoptóticos, se retiró una parte (1 mi) de la fase de plasma para determinar el número de cuerpos apoptóticos por mililitro mediante citometría de flujo (incubación con Anexina-V e loduro de propidio).
Asimismo, las preparaciones de cuerpos apoptóticos íntegros y con un alto grado de pureza (mínimamente contaminados con otras microvesículas) obtenidas mediante el protocolo anterior fueron analizadas mediante citometría de flujo para determinar el número total de cuerpos apoptóticos por mililitro de plasma. Para ello, los cuerpos apoptóticos fueron incubados con Anexina-V e loduro de propidio.
Los resultados de este análisis se muestran en la tabla 2. El número total de cuerpos apoptóticos aislados por mililitro de plasma, representaba el 90% del total de cuerpos apoptóticos presentes en el plasma si se obtenían mediante el procedimiento objeto de la invención incluyendo la etapa a1 (dilución), mientras que si dicha etapa no era realizada el número total de cuerpos apoptóticos aislados suponía el 78% del total presente en el plasma.
Tabla 2.- Rendimiento del aislamiento
Figure imgf000024_0001
EJEMPLO 3: Ictus isquémico
El estudio clínico incluye dos pacientes, mujer de 78 años y mujer de 70 años, que fueron atendidas por el servicio de Neurología por sospecha de Ictus isquémico. Se les realizó un TC-simple con protocolo de perfusión que mostró una lesión isquémica en el territorio de la arteria cerebral media derecha en la paciente 1 y en el área de la arteria cerebral media izquierda en la paciente 2. A continuación, se muestran los datos clínicos registrados de cada paciente;
- etiología según clasificación TOAST:
Paciente 1 : Infarto cerebral de origen indeterminado.
Paciente 2: Infarto cerebral de origen cardioembólico.
- valoración radiológica: (i) inicial (determinación del volumen de infarto inicial, obtenido de la prueba de TC- perfusión) y (ii) final, a las 96 h desde el inicio de los síntomas (se realizó un TC-simple para determinar el volumen de infarto final).
Paciente 1 : volumen de infarto inicial: 22.310 mm3, volumen de infarto a las 96 h: 57.127 mm3. La lesión isquémica aumentó 2,5 veces durante las primeras 96 h.
Paciente 2: volumen de infarto inicial: 5.080 mm3, volumen de infarto a las
96h: 5.500 mm3. No se registró un aumento de la región infartada durante las primeras 96 h.
- situación funcional según la escala NIHSS: (i) inicial y (ii) final, a las 96 h post- ictus, lo que permite determinar la evolución del infarto cerebral:
Paciente 1 : Infarto progresivo (aumento de más de 4 puntos en la escala)
Paciente 2: Infarto regresivo (descenso de más de 4 puntos en la escala).
Se recogió sangre (20 mi) de cada paciente y se depositó en tubos con citrato sódico durante la evolución inicial y posteriormente a las 96 h desde el inicio de los síntomas del ictus. Transcurridos menos de 2 h desde la extracción, se procedió al aislamiento de cuerpos apoptóticos como se indica a continuación:
Las muestras sanguíneas fueron sometidas a centrifugación: 250 g durante 10 min a 18°C. La fase de plasma fue traspasada a un tubo estéril de polipropileno y fue diluida en tampón TBS 1X en una relación 1 :3 y centrifugado a 850 g durante 20 min a 18°C. El sobrenadante de la centrifugación anterior fue traspasado a un tubo limpio de policarbonato y centrifugado a 12.000 g durante 20 min a 9°C. El sobrenadante de la última centrifugación fue eliminado y el sedimento que contiene los cuerpos apoptóticos, fue resuspendido mediante pipeteo en tampón TBS 1X. Posteriormente, las preparaciones de CA íntegros y con un alto grado de pureza fueron analizadas mediante citometría de flujo para determinar el número total de CA por mililitro de plasma que procede de la muerte de células del sistema nervioso (microglía, oligodendrocitos, neuronas y astrocitos) de cada paciente. Para ello, los cuerpos apoptóticos fueron incubados con Anexina-V, loduro de propidio, y anticuerpos, anti-CD1 1 b, anti-CD100, anti-CD90 y anti-GLAST
Los resultados de este análisis se exponen en la figura 1. En la paciente 1 , con un infarto progresivo y que experimentó un aumento de la lesión isquémica durante las primeras 96 horas desde el inicio de los síntomas del ictus, se detectó un incremento significativo de los niveles de CA procedentes de la muerte de tejido nervioso, mientras que en la paciente 2, con un infarto regresivo y sin aumento de la región isquémica, la concentración de CA disminuyó considerablemente transcurridas 96 horas post-infarto.
Por lo tanto, estos resultados indican que la cuantificación de los cuerpos apoptóticos de origen neuronal y glial aislados mediante el procedimiento objeto de la presente invención es un marcador de muerte cerebral que permite la monitorización efectiva de la isquemia cerebral, así como, la determinación precisa del pronóstico o evolución del paciente infartado. Esta información ayudaría enormemente al desarrollo y selección de tratamientos adecuados para cada paciente (terapia personalizada).
EJEMPLO 4: Ictus isquémico
El estudio clínico incluye dos pacientes, Hombre de 76 años y Hombre de 85 años, que fueron atendidos por el servicio de Neurología por sospecha de Ictus isquémico. La evaluación radiológica inicial mostró que el paciente 1 no presentaba lesiones isquémicas cerebrales, y el paciente 2 tenía un volumen de infarto cerebral de 17.455 mm3. La exploración neurológica completa determinó que el paciente 1 sufrió un AIT con recuperación funcional completa, mientras que el paciente 2 tuvo un ictus isquémico de origen aterotrombótico.
Se recogió sangre (20 mi) de cada paciente y se depositó en tubos con citrato sódico durante la evolución inicial. Transcurridos menos de 2 horas desde la extracción, se procedió al aislamiento de cuerpos apoptóticos como se indica a continuación:
Las muestras sanguíneas fueron sometidas a centrifugación: 160 g durante 20 min a 18°C. La fase de plasma fue traspasada a un tubo estéril de polipropileno y centrifugado a 700 g durante 30 min a 18°C. El sobrenadante de la centrifugación anterior fue traspasado a un tubo limpio de policarbonato y centrifugado a 14.000 g durante 30 min a 9°C. El sobrenadante de la última centrifugación fue eliminado y el sedimento que contiene los cuerpos apoptóticos, fue resuspendido mediante pipeteo en tampón PBS 1X.
Posteriormente, las preparaciones de cuerpos apoptóticos íntegros y con un alto grado de pureza fueron analizadas mediante citometría de flujo para determinar el número total de CA por mililitro de plasma. Para ello, los cuerpos apoptóticos fueron incubados con Anexina-V e loduro de propidio.
Los resultados de este análisis se exponen en la figura 2. La cuantificación de CA reveló que el paciente 1 , que no sufrió un ictus isquémico sino un AIT, tenía inicialmente unos niveles plasmáticos once veces inferiores a los detectados en el paciente 2, con un ictus isquémico establecido. Estos hallazgos demuestran que la cuantificación de CA aislados mediante el procedimiento objeto de la presente invención tiene utilidad clínica en el establecimiento de un diagnóstico precoz y exacto de la enfermedad cerebrovascular.
EJEMPLO 5: Ictus isquémico
El estudio clínico incluye dos pacientes, Hombre de 45 años y Hombre de 58 años, que fueron atendidos por el servicio de Neurología por sospecha de Ictus isquémico. La evaluación radiológica inicial mostró que en el paciente 1 no presentaba lesiones isquémicas cerebrales, y el paciente 2 tenía un volumen de infarto cerebral de 12.300 mm3. La exploración neurológica completa determinó que el paciente 1 sufrió un AIT con recuperación funcional completa, mientras que el paciente 2 tuvo un ictus isquémico de origen aterotrombótico.
Se recogió sangre (20 mi) de cada paciente y se depositó en tubos con citrato sódico durante la evolución inicial. Transcurridos menos de 2 horas desde la extracción, se procedió al aislamiento de cuerpos apoptóticos mediante centrifugaciones seriadas. A continuación se detalla el protocolo de extracción de cuerpos apoptóticos, objeto de la presente invención:
Las muestras sanguíneas fueron sometidas a centrifugación: 160 g durante 20 min a 18°C. La fase de plasma fue traspasada a un tubo estéril de polipropileno y fue diluida en tampón PBS 1X en una relación 1 :3 y centrifugado a 700 g durante 30 min a 18°C. El sobrenadante de la centrifugación anterior fue traspasado a un tubo limpio de policarbonato y centrifugado a 14.000 g durante 30 min a 9°C. El sobrenadante de la última centrifugación fue eliminado y el sedimento que contiene los cuerpos apoptóticos, fue resuspendido mediante pipeteo en tampón PBS 1X.
Posteriormente, las preparaciones de cuerpos apoptóticos íntegros y con un alto grado de pureza fueron analizadas mediante citometría de flujo para determinar el número total de cuerpos apoptóticos por mililitro de plasma. Para ello, los cuerpos apoptóticos fueron incubados con Anexina-V e loduro de propidio.
Los resultados de este análisis se exponen en la figura 3. La cuantificación de cuerpos apoptóticos reveló que el paciente 1 , que no sufrió un ictus isquémico sino un AIT, tenía inicialmente unos niveles plasmáticos quince veces inferiores a los detectados en el paciente 2, con un ictus isquémico establecido. Estos hallazgos demuestran que la cuantificación de cuerpos apoptóticos aislados mediante el procedimiento objeto de la presente invención tiene utilidad clínica en el establecimiento de un diagnóstico precoz y exacto de la enfermedad cerebrovascular.
EJEMPLO 6: Esclerosis Múltiple
El estudio clínico incluye dos pacientes, Hombre de 38 años y Mujer de 44 años diagnosticados de Esclerosis Múltiple Remitente Recurrente (EMRR) con 2 y 3 años de evolución y una puntuación en la escala EDSS (escala de medición de discapacidad) de 1 y 0 respectivamente. El paciente 1 estaba en tratamiento con
Interferón Beta y el paciente 2 con Natalizumab.
Se recogió sangre (20 mi) de cada paciente (en situación de ausencia de brote, clínicamente estables) y se depositó en tubos con citrato sódico. Transcurridos menos de 2 horas desde la extracción, se procedió al aislamiento de CA como se indica a continuación:
Las muestras sanguíneas fueron sometidas a centrifugación: 200 g durante 15 min a 18°C. La fase de plasma fue traspasada a un tubo estéril de polipropileno y fue diluida en tampón Hepes 10 mM en una relación 1 :3 y centrifugado a 600 g durante 40 min a 18°C. El sobrenadante de la centrifugación anterior fue traspasado a un tubo limpio de policarbonato y centrifugado a 13.000 g durante 30 min a 9°C. El sobrenadante de la última centrifugación fue eliminado y el sedimento que contiene los cuerpos apoptóticos, fue resuspendido mediante pipeteo en tampón Hepes 10 mM.
Posteriormente, las preparaciones de CA íntegros y con un alto grado de pureza fueron analizadas mediante citometría de flujo tal y como se ha indicado en el ejemplo 3.
Los resultados de este análisis se exponen en la figura 4. En el paciente 1 , en terapia con Interferon Beta, el número de CA plasmáticos procedentes de la muerte de neuronas, astrocitos y oligodendrocitos fue aproximadamente dos veces superior al detectado en el paciente 2, que estaba en tratamiento con Natalizumab.
Por lo tanto, estos resultados indican que la cuantificación de los CA de origen neuronal y glial aislados mediante el procedimiento objeto de la presente invención permite evaluar la eficacia de fármacos en la enfermedad de esclerosis múltiple, lo que facilita la selección de los tratamientos más adecuados para cada paciente
(terapia personalizada).
EJEMPLO 7: Esclerosis Múltiple
El estudio clínico incluye 4 pacientes diagnosticados de esclerosis múltiple, 1 hombre y 3 mujeres, con una edad media de 30.5 años (rango 21-41). El paciente 1 y 2 se encontraban en la fase o estadio precoz, mientras que los pacientes 3 y 4 estaban en el estadio avanzado de la enfermedad.
Se recogió sangre (20 mi) de cada paciente en el servicio de neurología y se depositó en tubos con citrato sódico. Transcurridos menos de 2 horas desde la extracción se procedió al aislamiento de CA mediante centrifugaciones seriadas, tal y como se ha indicado en el ejemplo anterior. Posteriormente, las preparaciones de CA íntegros y con un alto grado de pureza fueron analizadas mediante citometría de flujo para determinar el número total de cuerpos apoptóticos por mililitro de plasma. Para ello, los cuerpos apoptóticos fueron incubados con Anexina-V e loduro de propidio. Los resultados de este análisis se exponen en la figura 5. Como muestra la figura 5, la concentración plasmática de cuerpos apoptóticos en pacientes en fase o estadio precoz (41.765±7.300 CA/ml plasma) es claramente superior a la detectada en pacientes en estadio más avanzados (8.585±726 CA/ml plasma). Estos resultados apoyan el valor clínico de la concentración plasmática de CA aislados mediante el procedimiento objeto de la presente invención (método no invasivo para el aislamiento de cuerpos apoptóticos íntegros y que están mínimamente contaminados con otras microvesículas) en la detección precoz y estadiaje de la Esclerosis Múltiple. EJEMPLO 8: Enfermedad de Parkinson
El estudio clínico incluye 6 pacientes diagnosticados de enfermedad de Parkinson, 4 hombres y 2 mujeres, con una edad media de 68 años (rango 49-81). La cohorte de sujetos del estudio se distribuyó homogéneamente en los tres primero estadios de la patología (I, n=2; II, n=2 y III, n=2).
Se recogió sangre (20 mi) de cada paciente en el servicio de neurología y se depositó en tubos con citrato sódico. Transcurridos menos de 2 horas desde la extracción se procedió al aislamiento de CA siguiendo el método descrito en el ejemplo 3.
Posteriormente, las preparaciones de CA íntegros y con un alto grado de pureza (mínimamente contaminados con otras microvesículas) fueron analizadas mediante citometría de flujo para determinar el número total de CA por mililitro de plasma. Para ello, los CA fueron incubados con Anexina-V e loduro de propidio. Los resultados de este análisis se exponen en la figura 6. Como se muestra en la figura, la concentración plasmática de CA en pacientes en estadio I (81.513±7.000 CA /mi plasma) es claramente superior a la detectada en pacientes en estadio II (35.277±2.255 CA /mi plasma) y en estadio III (7.565±3.000 CA /mi plasma). Estos resultados apoyan el valor clínico de la concentración plasmática de CA aislados mediante el procedimiento objeto de la presente invención en la detección precoz y estadiaje de la enfermedad de Parkinson.
EJEMPLO 9: Cáncer de colon metastático
El estudio clínico incluye 3 pacientes diagnosticados de cáncer de colon metastático
(metástasis localizadas en el hígado) y atendidos en el servicio de cirugía general. El paciente 1 , mujer de 70 años, y el paciente 2, Hombre de 72 años, habían recibido 6 ciclos de tratamiento quimioterapéutico con Folfiri (Irinotecan, 5- Fluoruracilo y ácido polínico), mientras que la paciente 3, mujer de 71 años, no fue sometida a quimioterapia.
Se recogió sangre (20 mi) de cada paciente una vez finalizado el tratamiento antitumoral y se depositó en tubos con citrato sódico. Transcurridos menos de 2 h desde la extracción, se procedió al aislamiento de CA mediante el método descrito en el ejemplo 5.
Posteriormente, las preparaciones de CA íntegros y con un alto grado de pureza fueron analizadas mediante citometría de flujo para determinar el número total de CA por mililitro de plasma. Para ello, los CA fueron incubados con Anexina-V e loduro de propidio.
Los resultados de este análisis se exponen en la figura 7. La cuantificación de CA reveló que el paciente 1 , una vez finalizada la terapia antineoplásica, tenía una concentración plasmática de CA 10 veces superior a la detectada en el paciente 2, después del tratamiento, y a la encontrada en el paciente 3, que no había recibido quimioterapia. De manera interesante, las exploraciones radiológicas de los pacientes mostraron que únicamente, el paciente 1 , experimentó una reducción del tamaño tumoral de las metástasis hepáticas, indicando una buena respuesta al tratamiento antitumoral. Estos datos demuestran que la determinación de los niveles plasmáticos de CA aislados mediante el procedimiento objeto de la presente invención permiten evaluar la respuesta a la quimioterapia de los pacientes con cáncer de colon metastático.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Método de aislamiento de cuerpos apoptóticos a partir de una muestra de fluido corporal caracterizado por que comprende las siguientes etapas:
a) centrifugar una muestra de fluido corporal tomada de un sujeto, a una velocidad menor o igual a 300 g, y recoger el sobrenadante,
b) centrifugar el sobrenadante obtenido en la etapa a) a una velocidad entre 400 g y 1.000 g y recoger el sobrenadante,
c) centrifugar el sobrenadante obtenido en la etapa b) a una velocidad entre 8.000 g y 40.000 g y eliminar el sobrenadante,
donde el sedimento obtenido en la etapa c) comprende los cuerpos apoptóticos aislados.
2. Método según la reivindicación 1 , donde el fluido corporal se selecciona del grupo constituido por sangre, plasma, orina, líquido cefalorraquídeo, líquido ascítico, líquido sinovial y líquido amniótico.
3. Método según la reivindicación 1 ó 2, donde el fluido corporal es sangre.
4. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la velocidad de la etapa b) es de entre 500 g y 800 g.
5. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la velocidad de la etapa c) es de entre 1 1.000 g y 30.000 g.
6. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde entre las etapas a) y b) se lleva a cabo una etapa a1) en la que el sobrenadante obtenido en la etapa a) se diluye en un tampón.
7. Método de pronóstico de una enfermedad vascular caracterizado por que comprende las siguientes etapas:
i) aislar cuerpos apoptóticos de una primera y una segunda muestra de fluido corporal tomadas de un paciente con una enfermedad vascular siguiendo el método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde la segunda muestra es tomada al menos 48 h después de la primera muestra,
ii) cuantificar los cuerpos apoptóticos aislados en la etapa i), y
iii) comparar el número de cuerpos apoptóticos aislados en las dos muestras, donde un mayor número de cuerpos apoptóticos en la segunda muestra que en la primera es indicativo de un mal pronóstico.
8. Método de determinación del estadio de una enfermedad neurodegenerativa caracterizado por que comprende las siguientes etapas:
I) aislar cuerpos apoptóticos de una muestra de fluido corporal tomada de un paciente con una enfermedad neurodegenerativa siguiendo el método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6,
II) cuantificar los cuerpos apoptóticos aislados en la etapa I), y
III) comparar el número de cuerpos apoptóticos aislados de la muestra con unos valores de referencia.
9. Método para analizar la eficacia de un tratamiento de una enfermedad vascular caracterizado por que comprende las siguientes etapas: A) aislar cuerpos apoptóticos de dos muestras de fluido corporal tomadas de un paciente con una enfermedad vascular siguiendo el método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde una primera muestra es tomada antes del tratamiento y una segunda muestra es tomada después del tratamiento, o donde las dos muestras son tomadas durante el tratamiento, una primera muestra una vez comenzado el tratamiento y una segunda muestra al menos 48 horas después de la primera,
B) cuantificar los cuerpos apoptóticos aislados en la etapa A), y
C) comparar el número de cuerpos apoptóticos en las dos muestras, donde un menor número de cuerpos apoptóticos en la segunda muestra que en la primera indica que el tratamiento es eficaz.
10. Método para analizar la eficacia de un tratamiento de una enfermedad oncológica y/o neurodegenerativa caracterizado por que comprende las siguientes etapas: A) aislar cuerpos apoptoticos de dos muestras de fluido corporal tomadas de un paciente con una enfermedad oncológica y/o neurodegenerativa siguiendo el método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde una primera muestra es tomada antes del tratamiento y una segunda muestra es tomada después del tratamiento, o donde las dos muestras son tomadas durante el tratamiento, una primera muestra una vez comenzado el tratamiento y una segunda muestra al menos dos semanas después de la primera,
B) cuantificar los cuerpos apoptoticos aislados en la etapa A), y
C) comparar el número de cuerpos apoptoticos en las dos muestras, donde en la enfermedad oncológica un mayor número de cuerpos apoptoticos en la segunda muestra que en la primera indica que el tratamiento es eficaz y en la enfermedad neurodegenerativa un menor número de cuerpos apoptoticos en la segunda muestra que en la primera indica que el tratamiento es eficaz.
1 1. Método para identificar el tipo de célula que ha muerto por apoptosis caracterizado por que comprende las siguientes etapas:
1) aislar cuerpos apoptoticos de una muestra de fluido corporal siguiendo el método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6,
2) detectar en la parte externa de la membrana plasmática del cuerpo apoptótico un marcador de tipo celular.
12. Método según la reivindicación anterior, donde el marcador de tipo celular se selecciona del grupo constituido por CD90, GLAST, CD1 1 b, CD100 y antígenos tumorales.
13. Uso del método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, para pronóstico de una enfermedad vascular y/o neurodegenerativa.
14. Uso del método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, para evaluar la eficacia del tratamiento de una enfermedad oncológica, neurodegenerativa y/o vascular.
15. Uso del método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -6, para identificar el tipo celular de una célula que ha muerto por apoptósis.
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