KR20150028225A - 항원-특이적 조절 ｔ 세포의 유도 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 아폽토시스 세포 또는 아폽토시스체가 로딩된 미성숙 항원-제시 세포를 유도하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 시험관내 또는 생체내에서 항원-특이적 조절 T 세포를 수득하는 방법에 관한 것이다. 아폽토시스체/세포가 로딩된 세포 및 조절 T 세포는 세포용해 CD4+ T 세포에 의한 항원-제시 세포의 아폽토시스를 유도함으로써 수득될 수 있다. 세포는 질환, 예컨대 자가면역 질환, 이식편 거부 및 알레르기성 질환을 억제 또는 예방하는 데, 및 그와 관련된 의약을 위해 사용된다. 질환, 예컨대 자가면역 질환, 이식편 거부 및 알레르기성 질환을 억제 또는 예방하기 위한, 및 그와 관련된 의약을 위한 항원-특이적 조절 T 세포의 용도를 추가로 개시한다. 상기 방법에 의해 수득된 항원-특이적 조절 T 세포 집단을 추가로 개시한다.
Description
본 발명은 항원-특이적 조절 T 세포를 수득하는 방법, 및 자가면역 질환, 알레르기성 질환 또는 이식편 거부와 같은 병태를 치료하기 위한 의약으로서의 항원-특이적 조절 T 세포의 용도에 관한 것이다.
조절 T 세포 (Treg), 특히 전사 억제인자 Foxp3 (포크헤드 박스 P3)을 발현하는 Treg는 정상적인 면역 항상성을 유지하는 데 필수적이다. 상기 세포가 부재할 경우, 자가면역은 임상 소견, 예컨대 당뇨병 및 다른 자가면역 질환과 함께 빠르게 발생하다 (문헌 [Sakaguchi et al., (2012) Nature Med . 18, 54-58]에서 검토됨). Foxp3+ Treg는 흉선에서 능동적으로 선별되고, 말초 혈액 중에서 발견되는 세포 집단을 구성하는데, 이는 Foxp3을 안정적으로 발현한다. 흉선 상피 세포에 의해 제시되는 자가 펩티드의 동족 인식시에 세포가 흉선에서 선별되는 역치는, 이펙터 T 세포와 달리, 유의적인 친화성을 가진 Foxp3+ 세포가 말초 혈액 중에서 발견되는 것이다. 현재, 말초 내성은 그 중에서도 특히, 약한 친화성을 가진 자가항원-특이적 이펙터 세포와 보다 높은 친화성을 가진 Foxp3+ 세포 사이의 균형에 의해 유지되며, 이로써 내성은 평형을 이루게 된다는 견해가 있다. 이러한 Treg 중심적 선별 이외에도, 세포는 주변부에서 전사 인자 Foxp3을 발현하도록 전환될 수 있다. 그러나, 발현은 흉선에서 선별된 집단에서보다 낮고, 후천적 표현형은 일부 가역성을 띠는 것으로 관찰되었다.
흉선에서 선별되며 고도하고 안정적인 Foxp3 발현을 특징으로 하는 천연 Treg 특성에 기인하여, 천연 Treg는 자가면역 반응을 특징으로 하는 병리상태를 제어하기 위한 수단 뿐만 아니라, 단지 몇몇 예를 들자면, 이식편 또는 알레르겐에 대한 원치않는 반응을 억제시키기 위한 치료 도구로서 매우 큰 관심의 대상이 된다. 그러나, 주변부에 존재하는 항원-특이적 천연 Treg의 개수는 매우 낮으며, 이를 생체내에서 또는 심지어는 시험관내에서 증대시키는 방법에 대해서는 잘 정의되어 있지도 않고, 믿을만하지도 못하다. Treg 집단을 선택적으로 증대시킬 수 있는 방법은 유익한 반응을 증가시킬 수 있는 유기체의 전반적인 능력에는 영향을 미치지 않으면서, 질환 과정을 예방하거나, 억제시킬 수 있는 잠재능을 보유할 것이다.
아폽토시스, 또는 프로그램화된 세포 사멸은 조직 항상성을 유지시키는 데 도움을 주는 생리학적 메카니즘이다 (문헌 [Fuchs and Steller (2011) Cell 147, 742-758]에서 검토됨). 인체에서는 매 1분당 최대 106개까지의 세포가 아폽토시스에 의해 파괴되는 것으로 계산되었다. 세포 사멸에 의해 유리된 방대한 양의 항원은 자가 단백질에 대한 면역 반응이 유도되지 못하도록 하기 위해서는 제어되어야 한다. 실제로, 아폽토시스 세포는 스캐빈저 세포, 주로 미성숙 수지상 세포에 의해 흡수된 후, 내성을 유도하는 방식으로 프로세싱된다. 아폽토시스 세포로부터 유래된 항원의 교차 제시는 클래스 II 주요 조직적합성 복합체 (MHC)에서 제시되며, 이는 Foxp3+ Treg 증대를 유도하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 염증성 환경의 부재하에서 발생하는 세포의 아폽토시스는 조절 T 세포를 증대시키는 생리학적 방식을 나타낸다.
그러므로, 자가항원, 또는 그에 대한 면역 반응이 바람직하지 못한 것인 항원 (예컨대, 알레르기성 질환 또는 이식편 거부에서)을 제시하는 세포의 아폽토시스를 유도한 후, 이어서 아폽토시스체를 생성할 수 있고, 이로써 항원-특이적 Treg를 증대시킬 수 있도록 하는 방법을 디자인하는 것이 바람직할 수 있다. 당업계에 공지되어 있는 비-특이 면역억제 요법은 일반적으로 중증의 감염 및 다른 심각한 결과에 대한 감수성을 유도하여 삶의 질에 부정적인 영향을 미친다. 따라서, 종래 요법의 바람직하지 못한 효과는 포함하지 않으면서, 항원-특이적 Treg를 이용하여 면역 질환을 치료할 수 있는 방법을 개발하는 것이 이로울 것이다.
항원-특이적 세포용해 CD4+ T 세포를 유도할 수 있는 일반 방법은 WO2008/017517에 기재되어 있다. 상기 세포는 펩티드-MHC 클래스 II 복합체의 동족 인식 후, 항원-제시 세포의 아폽토시스를 유도한다. 본 발명은 선행 기술과는 달리 유리하게는, 이식편에 의해 유리된 동종항원으로부터, 자가항원 또는 알레르겐으로부터 유래된 클래스 II 제한 에피토프를 보유하는 항원-제시 세포의 아폽토시스를 유도함으로써 항원-특이적 Foxp3 Treg을 증대시키는 것을 제공한다.
본 발명은 항원-특이적 Foxp3+ 조절 T 세포를 유도하는 방법을 기재한다.
상기 방법은
(a) 항원-특이적 세포용해 CD4+ T 세포를 수득하는 단계;
(b) 항원-제시 세포를 세포용해 CD4+ T 세포에 노출시킴으로써 항원-제시 세포의 아폽토시스를 유도하는 단계;
(c) 항원-제시 세포의 아폽토시스로부터 아폽토시스 세포 및 아폽토시스체를 수득하는 단계; 및
(d) 아폽토시스 세포 또는 아폽토시스체를, 아폽토시스 세포 또는 아폽토시스체로부터 항원을 제시할 수 있는 세포와 함께 인큐베이션시키는 단계
를 포함한다.
cCD4+ T (세포용해 CD4+ 세포) 세포는 동물의 능동 면역화에 의해 수득될 수 있고, 표면-특이적 항체로 코팅된 자기 비드를 사용하는 친화도 정제에 의해 제조될 수 있다. 전형적으로, CD8+, CD19+, CD127+ 세포는 고갈된다.
별법으로, 본원에 기재된 바와 같이, 또는 WO2008/017517에 기재된 바와 같이, 나이브 CD4+ T 세포를 동물로부터 단리시키고, 배양물 중에서 측면 잔기 내에 티오리덕타제 모티프를 함유하는 클래스 II 제한 에피토프에 노출시키는 것을 포함하는 방법에 의해 cCD4+ T 세포를 시험관내에서 수득한다. 별법으로, 본원에 기재된 바와 같이, 또는 WO2008/017517에 기재된 바와 같이, 분극화된 CD4+ T 세포를 동물로부터 단리시키고, 배양물 중에서 측면 잔기 내에 티오리덕타제 모티프를 함유하는 클래스 II 제한 에피토프에 노출시키는 것을 포함하는 방법에 의해 cCD4+ T 세포를 시험관내에서 수득할 수 있다.
면역 반응을 능동적으로 일으키는 동물에서 cCD4+ T 세포를, cCD4+ T 세포에 의해 인식되는 항원 쪽으로 이동시키는 것을 포함하는 방법에 의해 cCD4+ T 세포는 항원-제시 세포의 아폽토시스를 유도하는 데 생체내에서 사용될 수 있다.
본 발명의 방법의 실시양태에서, cCD4+ T 세포는 시험관내에서 cCD4+ T 세포에 의해 인식되는 에피토프를 제시하는 항원-제시 세포를 포함하는 배양물 중에서 아폽토시스체를 생성하거나 수득하는 데 사용된다.
본 발명의 방법의 다른 실시양태에서, 시험관내에서 배양물로부터 수득된 아폽토시스체는 미성숙 항원-제시 세포에 로딩하는 데 사용되고, 미성숙 항원-제시 세포는 나이브 동물로부터 수득된 CD4+ T 세포 집단을 사용하는 자극 주기에 의해 항원-특이적 Treg를 생성하거나 수득하는 데 사용된다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 시험관내 배양으로부터 수득된 아폽토시스체가 로딩된 미성숙 항원-제시 세포는 치료를 필요로 하는 동물에게로 수동 전달하는 데 사용된다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 아폽토시스체가 로딩된 미성숙 항원-제시 세포는 치료를 필요로 하는 동물에게로 수동 전달하기 위하여 시험관내에서 Treg를 생성하거나 수득하는 데 사용된다.
본 발명의 특정 측면에서, 본원에 기재된 방법에 의해 수득된 (및/또는 단리된) Treg는 질환의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환의 예방 또는 치료를 위해 사용된다. 질환은 자가면역 질환, 알레르기성 장애 또는 이식편 거부일 수 있다.
본 발명의 한 측면은 아폽토시스 세포 또는 아폽토시스체가 로딩된 세포를 수득하는 시험관내 방법에 관한 것이다. 상기 방법은
a) 항원에 대한 항원-특이적 세포용해 CD4+ T 세포를 제공하는 단계;
b) 항원을 제시하는 항원-제시 세포를 제공하는 단계;
c) 항원-제시 세포를 세포용해 CD4+ T 세포에 노출시켜 항원-제시 세포의 아폽토시스를 유도하는 단계;
d) 단계 c)에서 아폽토시스된 항원-제시 세포로부터 아폽토시스 세포 또는 아폽토시스체를 단리하는 단계; 및
e) 아폽토시스 세포 또는 아폽토시스체를, 아폽토시스 세포로부터 또는 아폽토시스체로부터 항원을 제시할 수 있는 세포와 함께 인큐베이션시켜 아폽토시스 세포 또는 아폽토시스체가 로딩된 세포를 수득하는 단계
를 포함한다.
또한, 상기 방법은 단계 e)의 로딩된 세포를 CD4+ 세포의 추가의 공급원과 접촉시켜 항원-특이적 조절 T 세포 집단을 수득함으로써 항원-특이적 조절 T 세포를 수득하는 단계 f)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 세포는 항원-특이적 세포용해 CD4+ 세포를 생성하는 데 사용된 항원에 대하여 특이적인 것이다.
상기 항원-특이적 조절 T 세포는 전형적으로 Foxp3 고도 CD4+ T 세포이다.
특정 실시양태에 따라, CD4+ 세포의 공급원은 나이브 CD4+ 세포, 분극화된 CD4+ T 세포 및 천연 Treg로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에 따라, 아폽토시스 세포로부터 또는 아폽토시스체로부터 항원을 제시할 수 있는 세포는 수지상 세포, 대식세포, B 림프구, 및 MHC 클래스 II 결정기를 발현할 수 있는 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
단계 d)에서 단리되는 아폽토시스 세포 또는 아폽토시스체는 친화도 정제, 원심분리, 겔 여과, 자기 비드 분류 또는 형광-활성화 분류에 의해 단리될 수 있다.
아폽토시스 세포 또는 아폽토시스체로부터 항원을 제시할 수 있는 세포는 말초 혈액 단핵구 또는 골수 유래 전구체의 형질전환에 의해 수득되는 미성숙 항원-제시 세포일 수 있다.
기재된 방법의 실시양태에서 사용되는 항원은 자가면역 항원, 알레르겐 또는 이식편 거부에 관여하는 항원일 수 있다.
본 발명의 방법의 실시양태에서, 항원-특이적 세포용해 CD4+ T 세포는 항원의 MHC 클래스 II 제한 에피토프 및 모티프 [CST]-X(2)-C 또는 C-X(2)-[CST]를 가진 서열을 포함하는 펩티드와 말초 혈액 세포를 접촉시킴으로써 수득된다.
본 발명의 방법의 실시양태에서, 항원-특이적 세포용해 CD4+ T 세포는 나이브 CD4+ T 세포, 분극화된 CD4+ T 세포로부터, 또는 천연 Treg로부터 수득된다.
본 방법의 추가의 실시양태에서, 단계 e)에서 수득된 아폽토시스 세포 또는 아폽토시스체가 로딩된 세포를 단리시키는 추가의 단계를 수행한다.
본 발명의 방법의 다른 실시양태는 기재된 방법에 의해 수득된 항원-특이적 조절 T 세포를 단리하는 단계를 포함한다.
구체적인 실시양태에서, 항원-특이적 조절 T 세포는 표면 마커 CD25 및/또는 CTLA-4의 발현 (이 둘 모두는 전형적으로 고도로 발현됨), 또는 시토카인 TGF-베타 및/또는 IL-10의 생산, 또는 Foxp3의 발현에 기초하여 상이한 하위세트로 분리된다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 언급된 방법에 의해 수득된 항원-특이적 Treg 집단에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 의약으로서 사용하기 위한, 상기 방법에 의해 수득된 아폽토시스 세포 또는 아폽토시스체가 로딩된 세포 집단에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 의약으로서 사용하기 위한, 상기 방법에 의해 수득된 항원-특이적 조절 T 세포 집단에 관한 것이다.
또 다른 측면은 상기 방법에 의해 수득된 아폽토시스 세포 또는 아폽토시스체가 로딩된 세포 집단 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
또 다른 측면은 상기 방법에 의해 수득된 항원-특이적 조절 T 세포 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 포유동물 대상체에게 제14항에 따른 항원-특이적 조절 T 세포 집단을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 포유동물 대상체에서 자가면역 질환, 알레르기성 질환, 이식편 거부, 만성 염증성 질환의 군으로부터 선택되는 장애를 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다. 전형적으로, 포유동물 대상체는 인간이다.
본 발명의 또 다른 측면은 포유동물 대상체에게 아폽토시스 세포 또는 아폽토시스체가 로딩된 세포 집단을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 포유동물 대상체에서 자가면역 질환, 알레르기성 질환, 이식편 거부, 만성 염증성 질환의 군으로부터 선택되는 장애를 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다. 전형적으로, 포유동물 대상체는 인간이다.
상기 언급된 세포로 치료될 수 있는 질환으로는 자가면역 질환, 알레르기성 질환, 이식편 거부, 만성 염증성 질환을 포함한다.
자가면역 질환은 전신 또는 기관-특이적 자가면역 질환일 수 있다.
자가면역 질환은 항원, 예컨대 티로글로불린, 갑상선 퍼옥시다제, TSH 수용체, 인슐린 (프로인슐린), 글루탐산 데카르복실라제 (GAD), 티로신 포스파타제 IA-2, 미엘린 핍지교세포 단백질 및 열-충격 단백질 HSP65에 대한 것일 수 있다.
알레르겐에 대한 알레르기성 질환은 공기전달 알레르겐, 식품 알레르겐, 접촉 알레르겐 또는 전신 알레르겐에 대한 알레르기일 수 있다.
이식편 거부는 세포 기관 또는 조직 기관의 이식편 거부일 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 항원-특이적 조절 T 세포의 작용 메카니즘을 평가하기 위한, 상기 방법에 의해 수득된 항원-특이적 조절 T 세포의 용도에 관한 것이다.
도 1은 암컷 수용자에서 수행된, 수컷 피부 이식편 중 Foxp3+ 조절 T 세포의 축적을 보여주는 것이다. 이식편에서, 정상 피부에서는 1%인 것과 비교하여, CD3+ 림프구 집단 중 약 12.5%가 Foxp3+ 세포에 의해 나타난다 (n = 군당 마우스 3마리).
정의
본원에서 사용된 "펩티드"라는 용어는, 펩티드 결합에 의해 연결된 2 내지 200개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 분자를 의미하지만, 이는 (예를 들어, 연결 유기 화합물과 같이) 비-아미노산 구조도 포함할 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용되는 펩티드는 통상의 20종의 아미노산 또는 그의 변형된 버전 중 임의의 것을 포함할 수 있거나, 화학적 펩티드 합성에 의해 또는 화학적 또는 효소적 변형에 의해 도입된 비-자연적으로 발생된 아미노산을 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 "항원"이라는 용어는, 거대분자, 전형적으로 (폴리사카라이드를 포함하거나 포함하지 않는) 단백질로 이루어지거나, 또는 하나 이상의 합텐(들)을 포함하고 T 세포 에피토프를 포함하는 단백질 조성물로 제조된 구조체를 의미한다.
본원에서 사용된 "항원성 단백질"이라는 용어는 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하는 단백질을 의미한다. 본원에서 사용된 자가항원 또는 자가항원성 단백질이란 동일 인간 또는 동물 체내에서 면역 반응을 유도하는, 체내 존재하는 인간 또는 동물 단백질을 의미한다.
"식품 또는 제약 항원성 단백질"이라는 용어는 식품 또는 제약 제품, 예컨대 백신에 천연적으로 존재하는 항원성 단백질을 의미한다.
"에피토프"라는 용어는, 항체 또는 그의 일부 (Fab', Fab2' 등), 또는 B 또는 T 세포 림프구의 세포 표면에 존재하는 수용체에 의해 특이적으로 인식되고, 결합되고, 상기 결합에 의해 면역 반응을 유도할 수 있는, 항원성 단백질의 한 부분 또는 (입체형태적 에피토프를 정의할 수 있는) 여러 부분을 의미한다.
본 발명과 관련하여 "T 세포 에피토프"라는 용어는 우세, 준우세(sub-dominant) 또는 열세(minor) T 세포 에피토프, 즉, T 림프구의 세포 표면에 존재하는 수용체에 의해 특이적으로 인식되고, 결합되는 항원성 단백질의 일부를 의미한다. 에피토프가 우세 에피토프인지, 준우세 에피토프인지, 또는 열세 에피토프인지 여부는 에피토프에 대해 유도되는 면역 반응에 의존한다. 우세 정도는 상기 에피토프가 단백질의 모든 가능한 T 세포 에티토프들 중에서 T 세포에 의해 인식되고, 그를 활성화시킬 수 있는 빈도에 의존한다. 특정 실시양태에서, T 세포 에피토프는 MHC II 분자의 그루브에 맞는(fit), (클래스 II 일배체형에 따라) 8 또는 9개의 아미노산으로 이루어진 서열로 구성된, MHC 클래스 II 분자에 의해 인식된 에피토프이다. T 세포 에피토프를 나타내는 펩티드 서열 내에서 에피토프 중의 아미노산은 P1 내지 P9로 넘버링되는데, 에피토프의 아미노산 N-말단은 P-1, P-2 등으로 넘버링되고, 에피토프의 아미노산 C-말단은 P+1, P+2 등으로 넘버링된다.
"동종항원"이라는 용어는 같은 종의 두 개체 사이에서 단백질 다형성에 의해 생성되는 항원을 의미한다.
"동종반응성"이라는 용어는 이식편 수용자와 공여자의 대립유전자 차이에 대한 면역 반응을 의미한다. 동종반응성은 항체 및 T 세포에 적용된다. 본 발명과 관련하여, 상기 용어는 펩티드-MHC 복합체로서 MHC 결정기와 관련하여 존재하는 동종항원의 T 세포 인식에 기초하는, T 세포 동종반응성에 관한 것이다.
"주요 조직적합성 항원"이라는 용어는 2가지 일반 부류로 분류되는, 인간에서는 HLA 시스템 (마우스에서는 H2)에 속하는 분자를 의미한다. MHC 클래스 I 분자는, 세포 표면에서 베타 2 마이크로글로불린과 회합하는, 3개의 도메인 (알파 1, 2 및 3)을 함유하는 단일 다형성 쇄로 구성된다. 클래스 I 분자는 인간에서 A, B 및 C로 명명되는 3개의 유전자좌에 의해 코딩된다. 상기 분자는 펩티드를 CD8+ 하위세트의 T 림프구에 제시한다. 클래스 II 분자는 각각 2개의 쇄 (알파 1 및 2, 및 베타 1 및 2)를 함유하는 2개의 다형성 쇄로 구성된다. 이들 클래스 II 분자는 인간에서 3개의 유전자좌인 DP, DQ 및 DR에 의해 코딩된다.
"부 조직적합성 항원"이라는 용어는 정상적인 세포 단백질로부터 유래되고, 클래스 I 및/또는 클래스 II 복합체에 속하는 MHC에 의해 제시되는 펩티드를 의미한다. 세포 표면에서 상기 펩티드의 디스플레이에 정질적으로 또는 정량적으로 영향을 주는 임의의 유전적 다형성이 부 조직적합성 항원을 생기게 할 수 있다.
에피토프와 관련하여 본원에서 사용된 "상동체"라는 용어는 자연적으로 발생된 에피토프와 50% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 98% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지며, 이로써 B 및/또는 T 세포의 세포 표면 수용체 또는 항체에 결합할 수 있는 에피토프의 능력을 유지시하는 분자를 의미한다. 에피토프의 특정 상동체는 최대 3개, 더욱 특히, 최대 2개, 가장 특히, 1개의 아미노산에서 변형된 천연 에피토프에 상응한다.
펩티드와 관련하여 본원에서 사용된 "유도체"라는 용어는 적어도 펩티드 활성부 (즉, 세포용해 CD4+ T 세포 활성을 유도할 수 있는 부분)를 함유하고, 그 이외에도, 다른 목적을 가질 수 있는, 예컨대 펩티드를 안정화시키거나 또는 펩티드의 약동학적 또는 약력학적 특성을 변경시키고자 하는 목적을 가진 상보적인 부분을 포함하는 분자를 의미한다.
본 발명과 관련하여 "환원 활성을 가지는 유기 화합물"이라는 용어는 단백질 상의 이황화 결합에 대해 환원 활성을 가지는 화합물, 더욱 특히, 아미노산 서열을 의미한다.
"면역 장애" 또는 "면역 질환"이라는 용어는 면역계의 반응이 유기체에서 기능장애 또는 비생리학적인 상황의 원인이 되거나, 또는 그를 지속시키는 질환을 의미한다. 그 중에서도 특히, 알레르기성 장애 및 자가면역 질환이 면역 질환에 포함된다.
본원에서 사용된 "알레르기성 질환" 또는 "알레르기성 장애"라는 용어는 알레르겐 (예컨대, 꽃가루, 쏘임, 약물, 또는 식품)이라 불리는 특이 물질에 대한 면여계의 과민성 반응을 특징으로 하는 질환을 의미한다. 알레르기는 개별 아토피 환자를 감작화시켰던 알레르겐을 상기 환자가 접하게 될 때에는 언제든지 관찰되는 징후 및 증상의 집합체(ensemble)로서, 이를 통해 각종 질환, 특히 호흡기 질환 및 증상, 예컨대 기관지 천식이 발병될 수 있는 것이다. 다양한 유형의 분류가 존재하며, 대개 알레르기성 장애는 그가 발생된 포유동물 모체의 위치에 따라 다른 명칭을 가진다. "과민성"은 개체가 감작화되었었던 항원에 노출되었을 때 개체에서 발생되는 바람직하지 못한 (손상성인, 불쾌감을 초래하는, 및 때?로 치명적인) 반응이다; "즉시형 과민증"은 IgE 항체 생산에 의존하고, 따라서, 알레르기와 등가이다.
"자가면역 질환" 또는 "자가면역 장애"라는 용어는 유기체가 (분자 수준 이하에 이르기까지의) 그 자신의 구성 성분을 "자가"인 것으로 인식하지 못함에 따라 발생되는 그 자신의 세포 및 조직에 대한 비정상적인 면역 반응으로부터 유발되는 질환을 의미한다. 상기 질환 군은 2개의 카테고리, 기관-특이적 질환 (예컨대, 애디슨병, 용혈성 빈혈 또는 악성 빈혈, 굿패스쳐 증후군, 그레이브스병, 특발성 혈소판감소성 자반증, 인슐린-의존성 당뇨병, 소아 당뇨병, 포도막염, 크론병, 궤양성 결장염, 천포창, 아토피성 피부염, 자가면역 간염, 원발성 담즙성 간경변증, 자가면역 폐장염, 자가면역 심장염, 중증 근무력증, 사구체신염 및 자발적 불임) 및 전신 질환 (예컨대 홍반성 루푸스, 건선, 혈관염, 다발근염, 경피증, 다발성 경화증, 강직성 척추염, 류마티스 관절염 및 쇼그렌 증후군)으로 분류될 수 있다. 따라서, 자가면역 장애는 자신의 세포 또는 조직에 대한 것이고, 특정 포유동물 유기체의 자신의 구성 성분인 항원 (예컨대, 단백질인 것)을 의미하는 "자가항원"에 대한 반응을 포함한다. 이러한 메카니즘에서, 자가항원은 B-및/또는 T 세포에 의해 인식되고, 이를 통해서는 상기 자가항원에 대한 면역 반응이 설비될 것이다.
따라서, "자가면역 질환" 또는 "자가면역 장애"라는 용어에 포함되는 질환에 관한 비제한적인 목록으로는 급성 파종성 뇌척수염 (ADEM), 애디슨병, 원형 탈모증, 항인지질 항체 증후군 (APS), 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 수포성 유천포창, 베체트병, 복강 질환, 염증성 장 질환 (IBD) (예컨대, 크론병 및 궤양성 결장염), 피부근염, 1형 당뇨병, 굿패스쳐 증후군, 그레이브스병, 길랑-바레 증후군 (GBS), 하시모토병, 특발성 혈소판감소성 자반증, 홍반성 루푸스, 혼합형 결합 조직 질환, 다발성 경화증 (MS), 중증 근무력증, 기면증, 심상성 천포창, 악성 빈혈, 건선, 건선성 관절염, 다발근염, 원발성 담즙성 간경변증, 류마티스 관절염 (RA), 쇼그렌 증후군, 측두 동맥염, 혈관염, 베게너 육아종증 및 아토피성 피부염을 포함한다.
"알레르겐"은 소인을 가진, 특히 유전적으로 소인을 가진 개별 (아토피) 환자에서 IgE 항체의 생산을 유도하는 물질, 일반적으로 거대분자 또는 단백질성 조성물로 정의된다. 유사한 정의는 문헌 [Liebers et al., (1996) Clin . Exp . Allergy 26, 494-516]에 제시되어 있다.
"염증성 질환" 또는 "염증성 장애"라는 용어는 염증의 전형적인 특징들이 관찰되는 질환을 의미한다. 따라서, 상기 용어는 염증 측면 또한 존재하는 다른 질환과 중복될 수 있다. "급성 염증"과 "만성 염증성 질환"이 구별될 수 있다는 것이 당업계에 공지되어 있다. "염증성 질환" 또는 "염증성 장애"라는 용어는 류마티스 관절염, 결막염, 류마티스 척추염, 골관절염, 통풍성 관절염, 기관지염, 결핵, 만성 담낭염, 염증성 장 질환, 급성 췌장염, 패혈증, 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환, 피부 염증성 장애, 예컨대 건선 및 아토피성 피부염, 전신 염증 반응 증후군 (SIRS), 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS), 암-연관 염증, 종양-연관 혈관신생 감소, 당뇨병, 이식편 대 숙주 질환 치료 및 연관된 조직 거부 염증 반응, 크론병, 지연형 과민증, CNS 질환의 면역-매개 및 염증성 요소; 예컨대 알츠하이머병, 파킨슨병, 다발성 경화증 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
"치료 유효량"이라는 용어는 환자에서 원하는 치료학적 또는 예방학적 효과를 일으키는 세포의 개수를 의미한다. 예를 들어, 질환 또는 장애와 관련하여, 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상을 어느 정도 감소시키는, 및 더욱 특히, 질환 또는 장애와 관련되거나, 또는 그의 원인이 되는 생리학적 또는 생화학적 파라미터를 부분적으로 또는 완전하게 정상 수준으로 회복시키는 세포의 개수이다. 본 발명의 한 특정 실시양태에 따라, 치료학상 유효 개수는 정상적인 생리학적 상황으로 개선될 수 있도록 또는 회복될 수 있도록 하는 세포의 개수이다. 예를 들어, 면역 장애를 앓는 포유동물을 치료학적으로 치료하는 데 사용될 때, 상기 개수는 포유동물 체중 1 kg당 1일 세포 개수이다.
본원에서 펩티드 또는 서열을 언급할 때, "천연"이라는 용어는 서열이 자연적으로 발생된 서열과 동일하다는 사실에 관한 것이다. 상기 용어는 집단의 대다수에서 접하게 되는 야생형 서열 뿐만 아니라, 집단 중 덜 빈번하게 존재하는 다형성 및 돌연변이도 포함하였다. 상기와 달리, "인공"이라는 용어는 이에 따라 자연상에는 존재하지 않는 서열 또는 펩티드를 의미한다. 임의로, 인공 서열은 제한된 변형, 예컨대 자연적으로 발생된 서열 내의 하나 이상의 아미노산을 변이시킴으로써, 또는 자연적으로 발생된 서열의 아미노산 N- 또는 C-말단에 아미노산을 부가함으로써 천연 서열로부터 수득된다. 본원에서 아미노산은 그의 전체 명칭, 그의 3문자 약어 또는 그의 1문자 약어로 지칭된다.
"Foxp3" (포크헤드 박스 P3)은 전사 인자 중 포크-윙드(fork-winged) 나선 패밀리의 구성원이고, 자연적으로 발생된 CD4-양성/CD25-양성 T 조절 세포 (Treg)의 발생 및 기능에서 중요한 역할을 한다.
"Treg" (조절 T 세포)는 부적절한 면역 반응에 대한 능동적인 억제에 관여한다. 이러한 세포로는 CD4+, CD25+, FoxP3+ 세포가 있다.
"나이브 cd4+ T 세포"는 CD62L을 발현하고, CD44를 낮은 또는 중간 정도로 발현하며, 바람직한 경로 없이 낮은 정도로 시토카인을 생산한다.
"분극화된 CD4+ 세포"는 CD44를 높은 정도로 발현하고, 시토카인을 제한된 세트로 생산한다.
"cCD4+ T 세포" 세포용해 CD4+ T 세포는 WO 2009/101207에 특징이 규명되어 있고, 하기 특성들 중 하나 이상을 특징으로 한다:
- 전사 억제인자 Foxp3의 발현 검출불가능,
- 천연 CD4+ 조절 T 세포와 비교하였을 때, 세린-트레오닌 키나제 AKT의 활성 증가,
- 천연 CD4+ 조절 T 세포와 비교하였을 때, TGF-베타 생산은 검출불가능하고, IL-10의 생산은 검출불가능하거나, 매우 낮음,
- 천연 CD4+ 조절 T 세포와 비교하였을 때, 고농도의 IFN-감마,
- 항원성 자극 후, 전사 활성인자 T bet 및 GATA3의 공발현,
- NKG2D 발현,
- 고농도의 가용성 Fas 리간드 (Fasl) 생산.
본 발명의 설명
본 발명의 일반 원리는 항원-특이적 Foxp3+ Treg 생산을 유도하기 위한, 특이 항원이 로딩된 항원-제시 세포로부터 수득되는 아폽토시스체의 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 목적은 MHC 클래스 II 결정기와 관련하여 자가항원, 또는 그에 대한 면역 반응이 바람직하지 못한 것인 항원 (예컨대, 알레르겐, 이식편으로부터의 동종항원, 또는 치료학적 목적으로 사용되는 동종인자)을 제시하는 항원-제시 세포로부터 선택적으로 아폽토시스시키는 방법을 제공하는 것이다. 그러므로, 하기에 더욱 상세하게 기재되는 바와 같이, 본 발명은 항원-특이적 Treg를 생성하거나, 수득하거나 또는 단리시켜, 주어진 항원에 대해 특이적인 면역 반응의 작동 전원을 끌 수 있는(switching off) 가능성을 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
아폽토시스에서 유도된 세포는 포스파티딜세린, 폴리사카라이드 및 당지질의 산화를 비롯한 다수의 표면 변경을 거쳐 진행하게 되며, 그러한 변경을 통해 상기 세포는 포식세포에 의해 인식될 수 있게 된다. 추가로, 아폽토시스 세포는 새로운 단백질, 예컨대 트롬보스폰딘-1을 발현하고/거나, 그의 표면에 세포내 성분, 예컨대 포스파티딜세린, DNA 및 뉴클레오솜을 배치한다. 전체적으로 보아, 이러한 표면 변경을 통해서는 선천 수용체, 예컨대 톨-유사 수용체, NOD 또는 RIG에 의한 라이게이션의 부재하에서도, 선천 면역 반응을 일으키지 않으면서 아폽토시스 세포를 포식할 수 있는 가능성을 제공한다.
아폽토시스 세포를 제거하는 식세포성 세포에는 인식 수용체, 예컨대 CD14, 스캐빈저 수용체 및 C형 렉틴 수용체가 장착되어 있다 (문헌 [Ravichandran & Lorenz (2007) Nature Rev . Immunol . 7, 964-974]). 스캐빈저 수용체는 산화된 또는 아세틸화된 저밀도 지단백질 (LDL) 뿐만 아니라, 다가음이온성 리간드 및 아폽토시스 세포에 결합할 수 있는 표면 당단백질이다. 스캐빈저 수용체의 예로는 CD36, LOX-1 및 CLA-1을 포함한다. 인식에 이어서, 내재화가 진행되고, 아폽토시스 세포의 경우에는, 파괴 및 엔도솜 및 리소솜과의 융합이 이루어진다. 특히, 아폽토시스 세포에 의해 트롬보스폰딘-1이 생산되는 것이 관심의 대상이 되는데, 이는 포식세포 상에서 발현되는 CD36과의 가용성 브릿지로서의 역할을 한다. 트롬보스폰딘-1의 발현은 카스파제-의존성이다.
가용성 인자는 또한 아폽토시스 세포의 제거에서도 중요한 역할을 한다. 그 예로는 콜렉틴 및 콜렉틴-유사 분자, 예컨대 만노스 결합 렉틴 및 C1q를 포함한다. 이 둘 모두 포식세포의 표면에서 발현된 칼레티쿨린과 상호작용한다. 혈청 아밀로이드 P (SAP) 및 C-반응성 단백질 (CRP) 및 원형 펜트락신 (PTX)을 포함하는, 펜트락신 패밀리 또한 아폽토시스 세포에 결합한다.
전체적으로 보아, 생리학적 조건하에서 천연 프로그램화된 세포 사멸, 또는 아폽토시스된 세포를 처리하는 데 사용되는 인자가 다수 존재한다 (문헌 [Jeannin et al., (2008) Curr . Opinion in Immunol. 20, 530-537]). 포유동물에서는 정상적인 세포 개수 및 활성을 유지시키기 위해 세포가 계속해서 재생된다 (문헌 [Steinman et al., (2000) J. Exp . Med. 191, 411-416]). 염증성 병태가 없는 경우, 아폽토시스체는 항원-제시 세포에 의해 기관에 흡수되고, 이를 통해 부위 림프절 쪽으로 이주하게 되고, 여기서 직접적으로 또는 이주 항원-제시 세포의 신속한 용해의 결과로서 아폽토시스체와 림프절 수지상 세포와의 교환이 이루어진다. 부위 림프절로 이주하는 수지상 세포 중 적어도 일부는 미성숙한 것으로 나타났는데, 이는 포식세포가 아폽토시스 세포를 식균할 수 있는 높은 능력을 보인다. 림프절에서, 수지상 세포는 주로 미성숙 상태이지만, 외관상으로는 클래스 I 및 클래스 II 결정기 둘 모두에서 항원을 제시할 수 있는 능력을 보이는 하위세트에 속한다. 비-염증성 병태와 관련된 공동 자극성 신호의 부재하에서, MHC 클래스 II 제시를 통해 Treg에 필요한 신호가 동원되고 활성화된다. 상기 Treg는 (자가항원에 대하여) 항원-특이적이고, 상기 자가항원에 대한 반응의 활성화를 억제시킨다. 따라서, 비-염증성 환경에서 발생된 아폽토시스는 항원-특이적 Treg를 유도하고, 이로써 자가항원에 대한 내성은 유지된다.
반대로, 염증성 병태하에서는 자가면역 질환 또는 동종항원 또는 알레르겐에 대한 반응에서, 또는 감염원에 대해 구형된 면역 반응 동안 발생하는 것과 같이, 아폽토시스체의 생산은 증가하고, 이는 부위 림프절로 운반된다. 아폽토시스체가 로딩된 세포의 이러한 대량 유입은 Treg를 동원하고 활성화시키기 위해 상기 소체를 포획하여 제시할 수 있는 림프절 수지상 세포의 능력을 초과한다. 추가로, 염증유발성 시토카인이 존재하면, 림프절 수지상 세포의 표현형은 변경되어 성숙화되는 쪽으로 유도되고, 그 결과 Treg의 손상에 대한 이펙터 T 세포의 활성화가 증가하게 된다. 비록 이러한 것이 자가면역 질환, 알레르기성 반응 및 이식편 거부과 관련해서는 감염원에 대한 반응 동안 바람직한 효과일 수 있지만, 불행하게도 이는 추가로 조직 파괴 및 염증을 일으킨다. 따라서, 비-염증성 환경에서 아폽토시스체를 생성하거나 또는 수득하여 항원-특이적 Treg를 생성하거나, 수득하거나 또는 단리시킬 수 있는 능력을 증가시키는 새로운 방법을 고안하는 것이 이로울 것이다.
측면 잔기 내에 티오리덕타제 모티프를 보유하는 MHC 클래스 II 제한 에피토프를 사용하는 cCD4+ T 세포 유도에 관한 (아직 공개되지 않은) 연구를 수행하는 동안, 예상 밖으로 cCD4+ 유도의 결과로서 표적 기관 내에 Foxp3+ Treg가 축적된다는 것을 발견하게 되었다. 따라서, 피부 이식편 거부의 모델에서는 동종이계 이식편이 장기간 지속된 경우, 이식편 그 자체에 Foxp3+ Treg 존재를 동반하였다. 다발성 경화증에 대한 실험 모델에서도 같은 관찰 결과를 얻었는데, 질환 예방 또는 억제는 중추 신경계 (CNS) 백질에서 Foxp3+ Treg 축적을 동반하였다.
따라서, 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법은 또한 WO2008/017517 (본원에 참조로 포함)에 기재된 바와 같은, 측면 잔기 내에 티오리덕타제 모티프를 보유하는 MHC 클래스 II 제한 에피토프의 용도를 포함한다.
일반적으로, 본 발명의 실시양태에서 사용되는 펩티드는, 환원 활성을 가지는 유기 화합물에 커플링된, 면역 반응을 유발할 수 있는 잠재성을 가진, 항원 (자가항원 또는 비-자가항원)의 적어도 하나의 T 세포 에피토프, 예컨대 티오리덕타제 서열 모티프 [CST]-X(2)-[CST] (여기서, [CST] 중 적어도 하나는 Cys이고; 따라서, 모티프는 [C]-X(2)-[CST] 또는 [CST]-X(2)-[C]이다)를 포함하는 펩티드이다. 특정 실시양태에서, 펩티드는 서열 모티프 [C]-X(2)-[CS] 또는 [CS]-X(2)-[C]를 포함한다. 더욱 특정 실시양태에서, 펩티드는 서열 모티프 C-X(2)-S, S-X(2)-C 또는 C-X(2)-C를 포함한다. T 세포 에피토프 및 유기 화합물은 임의로 링커 서열에 의해 이격되어 있다.
상기 펩티드는 화학적 합성법에 의해 제조될 수 있으며, 이로써 비-천연 아미노산이 도입될 수 있다. 따라서, 환원성 화합물의 모티프에서 C는 시스테인 또는 티올기를 가지는 다른 아미노산, 예컨대 메르캅토발린, 호모시스테인, 또는 티올 작용기를 가지는 다른 천연 또는 비-천연 아미노산을 나타낸다. 환원 활성을 가지기 위해서는 모티프에 존재하는 시스테인은 시스틴 이황화 브릿지의 일부로서, 또는 산화된 시스테인으로서 존재하지 않아야 한다. 그럼에도 불구하고, 모티프는 생체내에서 유리 티올기를 가진 시스테인으로 전환되는, 예컨대 메틸화된 시스테인과 같은 변형된 시스테인을 포함할 수 있다.
환원성 화합물의 [CST]-X(2)-[CST] 모티프에서 아미노산 X는 S, C, 또는 T 를 비롯한, 임의의 천연 아미노산일 수 있거나, 또는 비-천연 아미노산일 수 있다. 특히, X는 소형 측쇄를 가진 아미노산, 예컨대 Gly, Ala, Ser 또는 Thr이다. 별법으로, 벌키한 측쇄를 가진 아미노산, 예컨대 Tyr은 아니다. 더욱 특히, [CST]-X(2)-[CST] 모티프에서 적어도 하나의 X는 His 또는 Pro이다.
환원성 화합물로서 상기 기재된 모티프를 포함하는 펩티드에서, 모티프는, 에피토프가 MHC 그루브에 맞을 때에는 모티프가 MHC 결합 그루브의 바깥쪽에 그대로 남아 있도록 배치된다. 모티프는 펩티드 내의 에피토프 서열 바로 옆에 인접하게 배치되어 있거나, 또는 링커에 의해 T 세포 에피토프로부터 이격되어 있다. 더욱 특히, 링커는 7개 이하의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 포함한다. 가장 특히, 링커는 1, 2, 3, 또는 4개의 아미노산을 포함한다. 별법으로, 링커는 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산을 포함한다. 모티프 서열이 에피토프 서열에 인접해 있는 상기 펩티드에서, 모티프 서열은 에피토프 서열과의 비교로 위치 P-4 내지 P-1 또는 P+1 내지 P+4로 표시된다.
환원성 모티프 이외에도, 상기 펩티드는 (선행 기술에서 설명되어 있는 바와 같이) 적용에 따라, 항원, 전형적으로 알레르겐 또는 자가항원으로부터 유래된 T 세포 에피토프를 포함한다. 단백질 서열 중 상기 T 세포 에피토프는 기능성 검정 및/또는 하나 이상의 인실리코 예측 검정에 의해 확인될 수 있다.
적합한 알고리즘은 예를 들어, 문헌 [Zhang et al., (2005) Nucleic Acids Res 33, W180-W183] (PREDBALB); [Salomon & Flower (2006) BMC Bioinformatics 7, 501] (MHCBN); [Schuler et al., (2007) Methods Mol . Biol . 409, 75-93] (SYFPEITHI); [Donnes & Kohlbacher (2006) Nucleic Acids Res . 34, W194-W197] (SVMHC); [Kolaskar & Tongaonkar (1990) FEBS Lett . 276, 172-174] 및 [Guan et al., (2003) Appl Bioinformatics 2, 63-66] (MHCPred)에 기재되어 있다.
T 세포 에피토프 서열에서 아미노산은 MHC 단백질의 결합 그루브 중 그의 위치에 따라 넘버링된다. 전형적으로, 펩티드 내에 존재하는 T 세포 에피토프는 8 내지 25개의 아미노산, 추가로, 더욱 특히, 8 내지 16개의 아미노산, 추가로, 가장 특히, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개의 아미노산으로 구성된다.
더욱 특히, T 세포 에피토프는 9 또는 8개의 아미노산으로 이루어진 서열로 구성된다.
더욱 특히, T 세포 에피토프는 MHC 클래스 II 분자에 의해 T 세포에 제시되는 에피토프이다. 특히, T 세포 에피토프 서열은 MHC II 단백질의 틈(cleft)에 맞는 에피토프 서열, 더욱 특히, MHC II 틈에 맞는 비펩티드이다.
펩티드의 T 세포 에피토프는 서열의 천연 에피토프 서열과 일치할 수 있거나, 또는 그의 변형된 버전일 수 있는데, 단, 변형된 T 세포 에피토프는 천연 T 세포 에피토프 서열과 유사한, MHC 틈 내에 결합할 수 있는 그의 능력을 유지하여야 한다. 변형된 T 세포 에피토프는 천연 에피토프와 동일한, MHC 단백질에 대한 결합 친화도를 가지지만, 이는 또한 더 낮은 친화도도 가질 수 있다. 이러한 경우, 변형된 펩티드의 결합 친화도는 원래의 펩티드보다 10배 이상 더 낮고, 더욱 특히, 5배 이상 더 낮다.
본 발명의 방법의 실시양태에서 사용하기 위한 것으로서, T 세포 에피토프의 유래 기점이 될 수 있는 (자가)항원의 예로는 티로글로불린, 갑상선 퍼옥시다제, TSH 수용체, 인슐린 (프로인슐린), 글루탐산 데카르복실라제 (GAD), 티로신 포스파타제 IA-2, 미엘린 핍지교세포 단백질 및 열-충격 단백질 HSP65가 있다.
이론으로 한정하고 제한하고자 하지 않으면서, 일반 작용 메카니즘은 하기 단계를 포함한다:
(a) 아폽토시스체가 로딩된 미성숙 수지상 세포가 MHC 클래스 II 결정기에 존재하는 결정기에 대해 특이적인 Treg를 유도하는 단계,
(b) 상기 Treg가 원치않는 면역 반응이 일어나는 위치로 이주하는 단계,
(c) 표적 위치에의 상기 Treg의 축적으로 인해 Treg의 다수의 항염증 특성의 결과로서 염증이 제어되는 단계,
(d) 조직 파괴 및 아폽토시스 세포 생산이 억제되고, 표적 위치에서의 정상 세포 교체가 재확립되며, 이로써 정상적인 조직 기능이 회복되는 단계.
본 발명은 항원-특이적 Treg를 수득할 수 있는 방법의 다양한 실시양태를 제공한다. 본 발명의 방법의 한 실시양태에서, 항원-제시 세포의 아폽토시스는 시험관내에서 cCD4+ T 세포에 노출시킴으로써 수득할 수 있다. 아폽토시스체는 미성숙 수지상 세포에 로딩하는 데 사용된다. 아폽토시스체가 로딩된 미성숙 수지상 세포는 세포 요법에 사용되거나, 또는 세포 요법에 사용하기 위한 항원-특이적 Treg를 시험관내에서 생성하거나, 단리시키거나 또는 수득하는 데 사용된다. 본 발명과 관련하여 세포 요법은 포유동물에게 투여하기 위한 세포를 제조하는 단계를 포함한다.
시험관내에서 세포의 아폽토시스를 유도하는 일반 방법은 당업계에 기재되어 있고, 공지되어 있다. 예를 들어, CD4+ T 세포 림프구의 아폽토시스는 그를 CD3 및 CD28에 대한 불용화된 항체의 존재에서 배양함으로써 수득할 수 있다. 세포가 실제로 아폽토시스성인지 여부를 측정하는 데 사용되는 방법은 당업계에 잘 기재되어 있다. 상기 방법은 아폽토시스 세포의 표면에서 발현되는 인지질 상에 아넥신 V를 결합시키는 단계, 카스파제를 활성화시키는 단계, 및 핵산을 분해시키는 단계를 포함한다. 상기 방법에 관한 검토는 공개 문헌, 예컨대 문헌 [Fuchs and Steller (2011), Cell 147, 742-758]에서 살펴볼 수 있다.
선행 기술과 달리, 본 발명에서, 항원-제시 세포에서 유도된 아폽토시스는 항원-제시 세포 (APC)와 아폽토시스를 유도하는 세포, 즉, cCD4+ T 세포 사이에 시냅스 형성을 필요로 한다. 시냅스 형성은 cCD4+ T 세포의 세포용해 특성을 활성화시켜 상응하는 항원 유래 클래스 II 제한 에피토프를 제시하는 세포의 아폽토시스만을 유도한다. 이롭게는, 이는 엄격한 항원-특이적성을 제공한다. 검정 시스템에 대한 임의의 추가의 시약, 예컨대 항-CD3 항체의 부재하에서, 본 발명의 방법에서 기재된 시험관내 아폽토시스 유도는 생체내에서 발생하는 것과 유사한 조건을 재현한다.
CD4+ T 세포에 의한 항원-제시 세포의 아폽토시스는 문헌 [Janssens et al., (2008) J. Immunol . 171, 4604-4612]에 보고된 바 있다. 일부 환경하에서 Treg는 표적 세포 아폽토시스를 유도할 수 있고, 퍼포린의 존재하에 또는 부재하에서 그랜자임 B의 IDO 방출 활성화를 비롯한, 다수의 유도 메카니즘이 기재되어 있다. 이러한 메카니즘에 관한 검토는 문헌 [Shevach (2011) Adv . Immunol. 112, 137-176]에서 살펴볼 수 있다. 본 발명의 방법에서 cCD4+ T 세포는 표현형 및 기능적 특성 둘 모두에 있어서 Treg와는 상이한, 독특한 세포 하위세트를 나타낸다. 상기 cCD4+ T 세포를 유도할 수 있는 방법은 WO2008/017517에서 살펴볼 수 있다.
아폽토시스체를 확인하고, 단리시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 아폽토시스 세포 또는 아폽토시스체는 그의 표면에 신규한 성분들을 다수 발현하고, 상기 기재된 바와 같이, 추가로, 가용성 인자에 의해 옵소닌화될 수 있다. 상기 2가지 유형의 변경은 아폽토시스 세포 또는 아폽토시스체를 단리시키는 방법을 제공한다. 상기 예는 당업계에서 살펴볼 수 있다 (문헌 [Schiller et al., (2008) Cell Death Diff . 15, 183-191]). 일례는 아폽토시스성 주기를 시작할 수 있기 때문에 트롬보스폰딘을 발현하는 세포 또는 세포 파편을 단리시키기 위하여 트롬보스폰딘에 대한 항체를 사용하는 것이다.
본 발명의 한 실시양태에서, 단리된 아폽토시스체 또는 아폽토시스 세포를 수지상 세포와 인큐베이션시켜 MHC 클래스 II 결정기와 관련하여 포식시키고, 프로세싱하고, 제시한다. 기능, 표면 표현형 및 성숙도를 달리하는, 수지상 세포의 상이한 하위세트가 기재되어 있다. 일반적으로, 미성숙 수지상 세포는 아폽토시스 세포 및 아폽토시스체를 흡수할 수 있는 고도한 능력을 가지지만, MHC 클래스 II 결정기 내의 에피토프 발현에 있어서는 효율적이지 못할 수도 있다. 그러나, 수지상 세포 중 일부 하위세트, 특히, 림프절 내에 내장되어 있는 것은 아폽토시스 세포 또는 아폽토시스체의 흡수 및 그의 표면에 에피토프 제시라는 2가지 특성을 조합하고 있다.
그러나, 본 발명과 관련하여, 수시장 세포는 시험관내에서 유도되고, 당업계에 잘 기재되어 있는 방법에 의해 미성숙한 상태 그대로 유지된다. 인터페론-감마 (IFN-감마)의 존재하에서 수지상 세포를 유도체화하면 고도로 성숙한 상태가 유도되는 반면, IL-4는 수지상 세포를 미성숙한 상태 그대로 유지시킬 것이라는 것이 선행 기술에 의해 교시되었다. 수지상 세포는 말초 혈액 단핵구로부터 또는 골수 전구체로부터 유도될 수 있다. 상기 기재된 바와 같이 수득된 아폽토시스 세포 및 아폽토시스체를 미성숙 수지상 세포와 함께 인큐베이션시켜 MHC 클래스 II 결정기에 의해 제시될 수 있도록 할 수 있다.
아폽토시스 세포 또는 아폽토시스체로부터 프로세싱된 항원을 제시할 수 있는 제시 세포를 수득하는 데 있어서 수지상 세포가 바람직하기는 하지만, 배타적 수단은 아니라는 것을 당업자는 명백히 이해하여야 한다. 대안으로는, MHC 클래스 II 발현에서 유도될 수 있는, 대식세포, 내피 세포 또는 상피 세포를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 측면은 세포 요법에서 아폽토시스 세포 또는 아폽토시스체로부터 유래된 항원이 로딩된 수지상 세포의 용도에 관한 것이다. 일례로, 자가항원을 제시하는 항원-제시 세포 상의 cCD4+ T 세포의 세포용해 작용에 의해 수득되는 아폽토시스체로부터 유래된 클래스 II 제한 에피토프를 제시하는 수지상 세포를, 자가항원에 대한 면역 반응이 연루되어 있는 질환 과정이 발생한 동물에게 정맥내로 투여한다. 상기 세포 요법의 결과는 면역 반응의 특이적인 억제 및 상기 질환의 치유이다. 추가의 예는 하기에 제공하지만, 본 발명의 범주는 그러한 예로 제한되지 않는다.
본 발명의 방법의 구체적인 실시양태에서, 아폽토시스 세포 또는 아폽토시스체가 로딩된 미성숙 수지상 세포를 인큐베이션시키는 동안 CD4+ T 세포 집단 첨가되어 있는 배양물 중에서 유지시켜 Treg를 생성하거나, 단리시키거나, 수득한다. 나이브 동물로부터 수득되고, 예를 들어 특이 항체로 코팅된 자기 비드를 사용하여 친화도에 의해 제조된 세포; Treg 유도가 바람직할 수 있는 (자가)항원에 대한 면역 반응과 관련하여 질환 과정이 진행 중에 있는 동물의 비장, 림프절, 조직, 또는 말초 혈액로부터 수득된 분극화된 CD4+ T 세포; 또는 Foxp3 전사 억제인자의 고도하고 안정한 발현을 보이는 것으로 정의된, 천연 Treg를 포함하나, 이에 한정되지 않는 수개의 가능한 CD4+ T 세포 공급원이 사용될 수 있다.
관련된 환경을 고려해 볼 때, CD4+ T 세포의 이들 3가지 공급원들은 각각 다른 것들보다 더 적절할 수 있다는 것을 당업자는 명백히 이해하여야 한다. 일례로, 나이브 CD4+ T 세포는 심지어 말초 혈액로부터도 쉽게 접근이 가능하며, 임의 항원을 인식하는 데 충분할 정도로 큰 레퍼토리를 제공한다. 질환 과정을 예방하는 것이 바람직하고, 이로써 항원을 그 중에서도 주어진 동물의 MHC 클래스 II 일배체형에 따라 선택할 수 있는 상황하에서, 나이브 CD4+ T 세포는 최선의 선택을 나타낼 것이다. 한편, 분극화된 CD4+ T 세포는 펩티드-MHC 복합체에 대해 친화성이 증가된 세포를 사용하는 것이 바람직한 상황하에서 본 발명의 방법을 실시하기 위한 세포 공급원을 나타낸다. 일례는 1형 당뇨병에서 발견되는 자가반응성 CD4+ T 세포에 의해 제공되는데, 여기서 인슐린으로부터 유도된 펩티드의 CD4+ T 세포에 의한 인식은 주로 펩티드-MHC 복합체에의 불완전 결합을 통해 이루어지고, 이를 통해 상대적으로 낮은 T 세포 수용체 친화성을 얻게 된다.
본 발명에서, 한 실시양태는 공급원으로서의 천연 Treg의 용도이다. Treg의 레퍼토리는 자가항원을 인식하는 방향으로 형상화되어 있고, 상기 기재된 바와 같이, 상기 세포는 항원-제시 세포와 함께 기능적으로 시냅스를 형성할 수 있는 충분한 친화성을 가지고 있다. 주어진 항원에 대한 항원-특이적 천연 Treg는 총 CD4+ T 세포수의 단지 5 내지 10%만을 나타내는 바, 상기 Treg 개수는 극히 낮다. 본 발명은 상기와 같이 낮은 개수를 시험관내에서 증가시킬 수 있는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법에서, 흉선에서 선별된 천연 Treg를 사용하는 것의 추가의 장점은 보고된 바와 같은 그의 표현형상의 안정성이다. 따라서, 천연 Treg에서, Foxp3의 발현은 고도하고, 시간이 경과함에 따라 및 다양한 활성화 조건하에서 안정한 상태 그대로 유지된다. 그에 반해, 주변부에서 유도되고, Foxp3 발현을 획득한 Treg는 Treg 계통에 관여하는 후생유전자 시그너쳐가 존재하지 않고, 예를 들어 염증성 병태하에서와 같이, 환경 변화시 활성을 띠는 그의 조절 특성이 느슨해지기 때문에 불안정할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 아폽토시스 세포 또는 아폽토시스체로부터 유래된 항원을 제시하는 아폽토시스 세포 또는 아폽토시스체와 함께 시험관내 배양에 의해 증대되거나 (천연 Treg), 유도된 (나이브 또는 분극화된) Treg는 세포 요법에 사용된다. 상기 요법은 예방 요법으로서, 예를 들어 이식편 거부를 예방하는 데, 또는 억제 요법으로서, 예를 들어 1형 당뇨병에서 수행될 수 있다.
임의로, 본 발명에 기재된 방법에 의해 수득된 Treg는 상기 Treg의 개수를 추가로 증가시키는 것이 바람직할 때에는 비-특이 수단을 사용하여 추가로 증대될 수 있다. 그러한 비-특이 방법의 예는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 불용화된 항-CD3 및 항-CD28 항체 및 IL-2의 존재하에서 인큐베이션된 세포는 여러 자리수만큼(several orders of magnitude) 증대될 수 있다.
세포 투여에 앞서, 추가 단계가 부가될 수 있다는 것을 당업자는 명백히 이해하여야 한다. 한가지 가능성은 Treg를 그에 대해 맞추는 것이 바람직할 수 있는 합성 펩티드 중 하나 이상이 로딩된 MHC 클래스 II 결정기 사량체와 함께 세포를 인큐베이션시킴으로써 Treg의 특이성을 추가로 제한하는 것이다. 또 다른 가능성은 표면 마커, 또는 다양한 Foxp3 발현 정도에 의해 세포를 분류하는 것이다. 특히 Foxp3을 고도로 발현하는 세포 집단은 전체 천연 Treg 집단의 일부이며, 본 발명과 관련하여 특히 적합한 것으로 만드는 특징을 제시하는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명의 방법에 의해 수득된 Treg는 질환 프로세서의 발생에 있어 주어진 항원 또는 에피토프의 관련성을 확립하는 데 사용될 수 있다. 많은 질환에서, 상기 과정에 관여하는 항원은 1개 초과로 존재하지만, 가장 중요한 것을 확인하는 것은 여전히 어려운 상태이다. 본 발명의 방법을 실시함으로써 항원-특이적 Treg를 제조하는 것은 질환 발병에서 특이 항원을 단리시키고, 그의 역할을 확인할 수 있는 수단으로서 특이 항원의 전원을 끄는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 의해 수득되는 항원-특이적 Treg는 그의 기능에 있어 Treg 표현형의 중요성을 측정하는 방법을 제공한다. 일례로, 항원-특이적 Treg를 그랜자임의 발현에 따라 분류하고, 그랜자임+ 및 그랜자임(-) 집단을 시험관내 또는 생체내에서 반응을 억제시킬 수 있는 능력에 대해 비교한다.
본 발명의 다양한 측면 및 실시양태는 하기 실시예에서 예시된다. 그러나, 본 발명의 범주를 하기의 실시예로 제한하고자 하는 의도는 없다.
실시예
실시예
1.
시험관내에서의
아폽토시스 유도
C57BL/6 마우스로부터 항원-제시 세포 (APC)를 제조하고, 다발성 경화증의 모델로서 사용된, 실험상의 자가면역 뇌척수염 (EAE)과 관련된 자가항원의 클래스 II 제한 T 세포 에피토프를 포함하는 펩티드를 상기 세포에 로딩하였다.
따라서, 미엘린 핍지교세포 당단백질 (MOG)의 아미노산 잔기 37-52에 상응하는, 서열 VGWYRSPFSRVVHLYR [서열 1]로 이루어진 MOG 펩티드를 사용하여 세포에 로딩하였다.
상기 펩티드는 우세 T 세포 에피토프를 함유하였다. P1 위치, 즉, MHC 클래스 II 그루브에 고정된 첫번째 아미노산은 Y40이었다 (P1-P9 서열은 밑줄로 표시).
펩티드의 아미노 말단 단부의 3개의 아미노산이 서열 CGPC로 치환됨에 따라 서열 CGPCYRSPFSRVVHLYR [서열 2]의 펩티드로 생성되는 서열 1의 펩티드 50 ㎍과 와 함께, 수산화알루미늄을 사용하여 4회에 걸쳐 면역화된 동물의 비장으로부터 세포용해 CD4+ T 세포 (cCD4+ T 세포)를 수득하였다.
cCD4+ T 세포를 로딩된 APC의 존재하에 37℃에서 밤새도록 배양하였다. 세포를 세척하고, 활성화된 카스파제 3에 대한 항체를 사용하여 APC 아폽토시스 정도를 측정하였다.
실시예
2. 아폽토시스체의 단리
실시예 1에서 수득된 아폽토시스 세포 상청액을 수집하고, 2 단계 원심분리를 거쳐 (500xg, 5min) 세포를 제거하였다. 이어서, 상청액을 1.2 μM 친유성 시린지 필터를 통해 여과시켰다. 30분 동안 100,000xg에서 원심분리한 후, 펠릿 중에 함유되어 있는 아폽토시스체를 수거하고, 세포 실험에 사용하였다.
별법으로, 아폽토시스의 결과로서 발현된 세포 표면 성분에 대한 항체를 사용함으로써 친화도에 의해 아폽토시스 세포 및 아폽토시스체를 단리시킬 수 있다. 상기 예로는 항-트롬보스폰딘 항체가 있다. 바람직한 제조 단계에서, 항-트롬보스폰딘 항체를 자기 비드에 공유적으로 커플링시켰다. 20℃에서 1 h 동안 완만하게 진탕시키면서, 인큐베이션시킨 후, 자기 비드는 자석 상에 유지되었다. 이어서, 약간 산성을 띠는 완충제를 이용하여 용리시킴으로써 아폽토시스체를 회수하였다.
본 방법은 선행 기술에 설명되어 있다 (문헌 [Schiller et al., (2008) Cell Death Diff . 15, 183-191]; [Gautier et al., (1999) J. Immunol . Methods 228, 49-58]).
실시예
3. 미성숙 수지상 세포 (
iDC
)의 생성 또는 수득
무릎 상부 및 하부 뼈로부터 골수 전구 세포를 수득하였다. 각각 CD19 및 CD90 마이크로비드를 이용하는 자기 고갈에 의해 B 및 T 림프구를 제거하였다. CD19- CD90- iDC 전구체를 함유하는 음성 분획을 500 U/ml 재조합 GM-CSF를 함유하는 무혈청 배지 중에 재현탁시키고, 조직 배양 플레이트 상에 시딩하고 (3x106개의 세포/ml), 37℃에서 유지시켰다. 응집체 파괴를 막기 위해 세포를 6일 동안 격일로 세척하였다. 6일째, iDC 응집체를 제거하고, 세척하고, 새 플레이트에 첨가하였다. 7일째, 세포를 수거하고, 검정에 사용하였다.
상기 방법은 선행 기술에 기재되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Inaba et al., (2009) Curr . Prot . immunol . 1(86), unit 3.7. p 10-12]을 참조할 수 있다.
실시예
4. 항원이 로딩된 미성숙 수지상 세포의 생성 또는 수득
iDC는 아폽토시스체를 포식할 수 있는 고도한 능력을 보인다. 따라서, 실시예 3에서 수득된 iDC를 실시예 2에서 수득된 아폽토시스체와 함께 인큐베이션시켰다. 이를 위해, 2x105개의 iDC를 37℃에서 30 min 동안 인큐베이션시킴으로써 미량배양 웰에 플레이팅하였다. 이어서, 37℃에서 16 h 동안 추가로 인큐베이션시키기 위해 아폽토시스체 현탁액을 배양물에 첨가하였다. 이어서, 세포를 세척하고, 배지 중에 재현탁시켰다.
실시예
5. 항원이
로딩된
수지상 세포의 세포 요법을 위한 용도
질환 유도 이전 또는 그 이후에 아폽토시스체가 로딩된 iDC (2x105 개)를 동물 내로 정맥내 경로에 의해 주사하였다.
따라서, C57BL/6 마우스는 프로토콜에 따라 미코박테리움 추출물과 함께 완전 프로인트 아주반트 중 MOG 펩티드 (서열 1의 펩티드에 대해 실시예 1 참조)를 투여받고, 백일해 독소를 2회 주사맞았다. 상기 프로토콜을 통해 MOG 펩티드 투여 후 2주 이내에 인간 다발성 경화증과 유사한 징후 발생이 유도되었다.
상기 모델에서, 실시예 4에서 수득된 바와 같은, 아폽토시스체가 로딩된 iDC를 질환 유도 하루 전, 또는 질환의 첫번째 징후가 관찰된 후, 즉, 유도 후 2주 경과하였을 때 마우스에 주사하였다.
iDC를 주사맞지 않은 동물, 또는 로딩되지 않은 iDC를 주사맞은 동물을 대조군으로서 사용하였다. 실험군 및 2개의 대조군에서 질환 징후 예방 또는 억제에 대해 평가하였다.
실시예
6. 항원-특이적
Treg
를 유도하는, 항원이 로딩된 수지상 세포의 용도
아폽토시스체가 로딩된 iDC를 통해 시험관내에서 Treg를 생성할 수 있었다.
따라서, 실시예 4에 기재된 바와 같은 iDC를 배양물 중에 유지시켰다.
항체를 사용하여 자기 마이크로비드 분류를 수행하여 CD8+, CD19+, CD127+ 세포를 고갈시킨 후, CD25+ 세포의 양성 선별을 수행하여 나이브 마우스의 비장으로부터 T 세포를 단리시켰다. 세포 투과 후 Foxp3 특이 항체를 사용하여 형광-활성화 세포 분류 (facs)에 의해서 CD4+Foxp3고도 세포의 비율(%)을 체크하였다. 상기 세포를 수득하는 방법이 선행 기술에 개시되어 있다 (문헌 [Peters et al., (2003) Plos one 3, 574-584]). 85% 초과의 세포 순도를 수득하였다.
이어서, CD4+Foxp3고도 세포를 실시예 4에 기재된 바와 같은 iDC 배양물에 첨가하였다 (1x106개의 세포/웰). IL-2 (20 IU/ml)의 존재하에 37℃에서 7일 동안 자극 주기를 거친 후, 세포를 세척하고, 아폽토시스체가 로딩된 iDC의 새 배치를 사용하여 같은 프로토콜에 따라 다시 인큐베이션시켰다. 상기 2회차 자극 주기를 거친 후, IL-2의 존재하에서 항-CD3 및 항-CD28 항체로 코팅된 자기 비드와의 인큐베이션에 의해 세포를 임의로 추가로 증대시킬 수 있었다. 세포를 세척하고, Foxp3 발현에 대하여 facs에 의해 평가하였다.
실시예
7. 세포 요법을 위한 항원-특이적
Treg
의 용도
실시예 6에서 제조된 바와 같은 세포를 자가면역 질환 환경에서 수동적으로 투여하는 데 사용할 수 있었다.
따라서, 실시예 5에 기재된 것과 유사한 프로토콜을 따라 진행하되, 단, iDC 대신 2x105개의 CD4+Foxp3고도 세포를 IV 투여하는 것을 포함하였다.
어떤 CD4+Foxp3고도 세포도 주사맞지 않은 대조군 동물과 비교하였을 때, 질환 징후는 유의적으로 예방 및/또는 억제된 것으로 나타났다.
실시예
8. 분석 목적을 위한 항원-특이적
Treg의
분류
CD4+Foxp3고도 세포 집단을 추가로 분석하여 그의 작용 메카니즘을 위한 단일 성분 또는 성분들의 조합의 중요성을 측정할 수 있었다.
따라서, FasL에 대한 항체로 코팅된 자기 마이크로비드를 사용하여 CD4+Foxp3고도 세포를 분리하였다. 이어서, 두 세포 집단, FasL+ 및 FasL(-)을 기능에 대해 시험하고, 내성을 유도할 수 있는 그의 능력에 대해 비교하였다. CD4+CD25(-) 표현형을 특징으로 하는 폴리클로날 이펙터 CD4+ 림프구를 나이브 동물의 비장으로부터 단리시키는 검정 시스템을 사용하여 수행하였다.
천연 Treg는 보통 이펙터 세포에 대하여 방관 억제를 발휘할 수 있는 그의 능력에 의해 정의된다. 본원에서 검정 시스템은 비-특이 자극에 의해, 즉, 항-CD3 및 항-CD28 항체의 조합에 의해 CD4+CD25+ T 세포 집단을 활성화시키는 것을 포함한다.
CD4+CD25(-) T 세포의 증식을 억제시킬 수 있는 FasL+ CD4+Foxp3고도 세포의 능력을 FasL(-)CD4+Foxp3고도 세포의 것과 비교하였다.
FasL을 발현하는 세포가 이펙터 세포 증식을 억제시키는 데 있어 더 높은 능력을 보이는 것으로 밝혀졌다.
실시예
9. 피부
이식편에의
Foxp3
Treg
축적
WO 2009/100505에 기재되어 있는 바와 같이, 피부 이식 이전에 측면 잔기 내에 티오레독스 모티프를 함유하는 Dby의 클래스 II 제한 에피토프 (ccDby)를 포함하는 50 ㎍의 펩티드를 주사함으로써 8 내지 10주령된 C57BL/6 암컷 마우스를 면역화시켰다.
동계 수컷 공여자의 전체 두께의 피부를 수용자의 등쪽에 이식시킨 후, 거부 징후에 대해 추적 조사하였다. 모든 마우스는 이식편에 대하여 내성을 보였다. 조직학적 분석을 위해 이식 후 6주째에 이식편의 생검을 채취하였다. Foxp3+ 세포가 이식편에 축적되어 있는 것이 관찰되었다.
비교로서, 정상 피부 중의 Foxp3+ T 세포의 함량은 도 1에 제시되어 있다.
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> modified sequence of MOG epitope
<400> 2
Cys Gly Pro Cys Tyr Arg Ser Pro Phe Ser Arg Val Val His Leu Tyr
1 5 10 15
Arg
Claims (29)
- a) 항원에 대한 항원-특이적 세포용해 CD4+ T 세포를 제공하는 단계;
b) 상기 항원을 제시하는 항원-제시 세포를 제공하는 단계;
c) 상기 항원-제시 세포를 상기 세포용해 CD4+ T 세포에 노출시켜 상기 항원-제시 세포의 아폽토시스를 유도하는 단계;
d) 단계 c)에서 아폽토시스된 항원-제시 세포로부터 아폽토시스 세포 또는 아폽토시스체를 단리하는 단계; 및
e) 상기 아폽토시스 세포 또는 상기 아폽토시스체를, 상기 아폽토시스 세포로부터 또는 상기 아폽토시스체로부터 항원을 제시할 수 있는 세포와 함께 인큐베이션시켜 아폽토시스 세포 또는 아폽토시스체가 로딩된 세포를 수득하는 단계
를 포함하는, 아폽토시스 세포 또는 아폽토시스체가 로딩된 세포를 수득하는 시험관내 방법. - 제1항에 있어서,
f) 제1항의 단계 e)의 상기 로딩된 세포를 CD4+ 세포의 추가의 공급원과 접촉시켜 항원-특이적 조절 T 세포 집단을 수득하는 단계
를 추가로 포함하는, 항원-특이적 조절 T 세포를 수득하기 위한 방법. - 제2항에 있어서, 상기 항원-특이적 조절 T 세포가 Foxp3 고도 CD4+ T 세포인 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 CD4+ 세포의 공급원이 나이브 CD4+ 세포, 분극화된 CD4+ T 세포 및 천연 Treg로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아폽토시스 세포로부터 또는 상기 아폽토시스체로부터 항원을 제시할 수 있는 상기 세포가 수지상 세포, 대식세포, B 림프구, 및 MHC 클래스 II 결정기를 발현할 수 있는 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 아폽토시스 세포 또는 아폽토시스체가 단계 d)에서 친화도 정제, 원심분리, 겔 여과, 자기 비드 분류 또는 형광-활성화 분류에 의해 단리되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아폽토시스 세포 또는 상기 아폽토시스체로부터 항원을 제시할 수 있는 상기 세포가 말초 혈액 단핵구 또는 골수 유래 전구체의 형질전환에 의해 수득되는 미성숙 항원-제시 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원이 항원이 자가면역 항원, 알레르겐 또는 이식편 거부에 관여하는 항원인 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원-특이적 세포용해 CD4+ T 세포가 상기 항원의 MHC 클래스 II 제한 에피토프 및 모티프 [CST]-X(2)-C 또는 C-X(2)-[CST]를 가진 서열을 포함하는 펩티드와 말초 혈액 세포를 접촉시킴으로써 수득되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원-특이적 세포용해 CD4+ T 세포가 나이브 CD4+ T 세포, 분극화된 CD4+ T 세포로부터, 또는 천연 Treg로부터 수득되는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 단계 e)에서 수득된 아폽토시스 세포 또는 아폽토시스체가 로딩된 상기 세포를 단리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 항원-특이적 조절 T 세포를 단리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 항원-특이적 조절 T 세포를 표면 마커 CD25 및/또는 CTLA-4의 발현, 또는 시토카인 TGF-베타 및/또는 IL-10의 생산, 또는 Foxp3의 발현에 기초하여 상이한 하위세트로 분리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제2항 내지 제10항 중 어느 한 항에 의해 수득된 항원-특이적 Treg 집단.
- 제1항 및 제5항 내지 제11항 중 어느 한 항에 의해 수득된 아폽토시스 세포 또는 아폽토시스체가 로딩된 세포 집단.
- 제14항에 있어서, 의약으로서 사용하기 위한 항원-특이적 조절 T 세포 집단.
- 제14항에 있어서, 자가면역 질환, 알레르기성 질환, 이식편 거부 또는 만성 염증성 질환의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 항원-특이적 조절 T 세포 집단.
- 제14항에 있어서, 전신 또는 기관-특이적 자가면역 질환의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 항원-특이적 조절 T 세포 집단.
- 제14항에 있어서, 티로글로불린, 갑상선 퍼옥시다제, TSH 수용체, 인슐린 (프로인슐린), 글루탐산 데카르복실라제 (GAD), 티로신 포스파타제 IA-2, 미엘린 핍지교세포 단백질 및 열-충격 단백질 HSP65로 이루어진 항원 군으로부터 선택되는 항원에 대한 자가면역 질환의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 항원-특이적 조절 T 세포 집단.
- 제14항에 있어서, 공기전달 알레르겐, 식품 알레르겐, 접촉 알레르겐 및 전신 알레르겐으로 이루어진 항원 군으로부터 선택되는 알레르겐에 대한 알레르기성 질환의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 항원-특이적 조절 T 세포 집단.
- 제14항에 있어서, 세포 기원 또는 조직 기원의 이식편 거부의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 항원-특이적 조절 T 세포 집단.
- 제14항의 항원-특이적 조절 T 세포의 작용 메카니즘을 평가하기 위한, 상기 항원-특이적 조절 T 세포의 용도.
- 제15항에 있어서, 자가면역 질환, 알레르기성 질환, 이식편 거부 또는 만성 염증성 질환의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한, 아폽토시스 세포 또는 아폽토시스체가 로딩된 세포 집단.
- 제15항에 있어서, 전신 또는 기관-특이적 자가면역 질환의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한, 아폽토시스 세포 또는 아폽토시스체가 로딩된 세포 집단.
- 제15항에 있어서, 티로글로불린, 갑상선 퍼옥시다제, TSH 수용체, 인슐린 (프로인슐린), 글루탐산 데카르복실라제 (GAD), 티로신 포스파타제 IA-2, 미엘린 핍지교세포 단백질 및 열-충격 단백질 HSP65로 이루어진 항원 군으로부터 선택되는 항원에 대한 자가면역 질환의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한, 아폽토시스 세포 또는 아폽토시스체가 로딩된 세포 집단.
- 제15항에 있어서, 공기전달 알레르겐, 식품 알레르겐, 접촉 알레르겐 및 전신 알레르겐으로 이루어진 항원 군으로부터 선택되는 알레르겐에 대한 알레르기성 질환의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한, 아폽토시스 세포 또는 아폽토시스체가 로딩된 세포 집단.
- 제15항에 있어서, 세포 기원 또는 조직 기원의 이식편 거부의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한, 아폽토시스 세포 또는 아폽토시스체가 로딩된 세포 집단.
- 포유동물 대상체에게 제14항에 따른 항원-특이적 조절 T 세포 집단을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 포유동물 대상체에서 자가면역 질환, 알레르기성 질환, 이식편 거부, 만성 염증성 질환의 군으로부터 선택되는 장애를 치료 또는 예방하는 방법.
- 포유동물 대상체에게 제15항에 따른 아폽토시스 세포 또는 아폽토시스체가 로딩된 세포 집단을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 포유동물 대상체에서 자가면역 질환, 알레르기성 질환, 이식편 거부, 만성 염증성 질환의 군으로부터 선택되는 장애를 치료 또는 예방하는 방법.
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