CN104411818A

CN104411818A - 诱导抗原特异性调节性t细胞的方法

Info

Publication number: CN104411818A
Application number: CN201380022688.7A
Authority: CN
Inventors: J-M·圣莱美
Original assignee: Katholieke Universiteit Leuven; Imcyse SA
Current assignee: Katholieke Universiteit Leuven; Imcyse SA
Priority date: 2012-04-30
Filing date: 2013-04-29
Publication date: 2015-03-11
Also published as: WO2013164289A1; KR20150028225A; AU2013255888A1; CA2871541A1; HK1206786A1; JP2015518376A; ZA201407298B; BR112014026606A2; RU2014148172A; IN2014DN08964A; EP2844741A1; US20150125880A1

Abstract

本发明涉及引发载有凋亡细胞或凋亡体的未成熟抗原呈递细胞的方法。本发明还涉及体外或体内获得抗原特异性调节性T细胞的方法。载有凋亡体/凋亡细胞的细胞和调节性T细胞可通过用溶细胞性CD4+T细胞诱导抗原呈递细胞凋亡来获得。所述细胞用于抑制或预防疾病，例如自体免疫疾病、移植物排斥和过敏性疾病，以及与其相关的药物。还公开了用于抑制或预防疾病，例如自体免疫疾病、移植物排斥和过敏性疾病的抗原特异性调节心T细胞以及其相关药物的应用。还公开了通过所述方法获得的抗原特异性调节性T细胞的群。

Description

诱导抗原特异性调节性T细胞的方法

发明领域

本发明涉及获得抗原特异性调节性T细胞的方法及其作为药物治疗病症(如自体免疫疾病、过敏性疾病或移植排斥)的应用。

发明背景

调节性T细胞(Treg)，尤其是表达转录受体Foxp3(叉头框P3)的Treg，是维持正常免疫稳定状态所必需的。在此类细胞不存在时，自体免疫迅速发展，并伴随临床表现例如糖尿病和其它自体免疫疾病(参见Sakaguchi等.(2012)NatureMed.18,54-58)。Foxp3+Treg在胸腺中被主动选择，并且组成周围血液中发现的细胞群，其稳定表达Foxp3。在同种识别由胸腺上皮细胞呈递的自身肽后的胸腺中选择细胞的阈值使得在外周血中发现具有显著亲和性的Foxp3+细胞，这与效应T细胞不同。目前的观点是，外周耐受尤其通过弱亲和性的自身抗原特异性效应细胞与Foxp3+细胞之间的平衡由此提供平衡至耐受来得以维持。除了对Treg的所述中心选择以外，细胞可在外周被转化以表达转录因子Foxp3。然而，表达低于胸腺选择的群，并且观察到获取的表型具有一些可逆性。

天然Treg的性质，如选择自胸腺中并且以高度且稳定地表达Foxp3为特点，使其就作为控制以自体免疫应答为特点的疾病的手段以及保持对移植物或受控过敏原的不需要应答的治疗工具等而言具有吸引力。然而，外周中的抗原特异性天然Treg非常低，并且使其体内甚至体外扩增的方法既不确定又不可靠。一种能够选择性扩增Treg群的方法将有可能防止或抑制疾病进程但不影响器官产生有益应答的整体能力。

凋亡，或程序性细胞死亡，是帮助维持组织稳定状态的生理学机制(参见Fuchs和Steller(2011)Cell 147,742-758)。已经计算在人体中，每分钟有多至10⁶个细胞通过凋亡被损毁。须控制通过细胞死亡而释放的大量抗原，从而避免引发针对自身蛋白质的免疫应答。实际上，凋亡的细胞被清除细胞(主要是未成熟树突细胞)摄取，然后以某种方式被处理以诱导耐受。源自凋亡细胞的抗原的交叉呈递出现在II类主要组织相容性复合体(MHC)中，已知其引发Foxp3+Treg的表达。因此，在炎性状态不存在时发生的细胞凋亡，显示了使调节性T细胞扩增的一种生理学途径。

因此，需要设计一种能够诱导呈递自体抗原或引起不希望的免疫应答(例如，过敏性疾病或移植物排斥)的抗原的细胞凋亡的方法，这之后将产生凋亡体，导致抗原特异性Treg的表达。本领域已知的非特异性免疫抑制治疗法通常易于发生严重感染和其它严重后果，其严重影响生活质量。因此，开发采用抗原特异性Treg来治疗免疫疾病但不产生传统疗法的不利后果的方法是有利的。

WO2008/017517中已经描述了能够引发抗原特异性溶细胞性CD4+T细胞(cCD4+T细胞)的一般方法。此类细胞在同类识别肽-MHC II类复合体之后诱导抗原呈递细胞的凋亡。不同于且优于现有技术，本发明提供通过诱导抗原呈递细胞凋亡来扩增抗原特异性Foxp3 Treg，所述抗原呈递细胞携带源自移植物释放的同种抗原、自体抗原或免疫原的II类限制性表位。

发明概述

本发明描述引发抗原特异性Foxp3+调节性T细胞的方法。

这些方法包括如下一般步骤：

(a)获得抗原特异性溶细胞性CD4+T细胞；

(b)通过使抗原呈递细胞接触所述溶细胞性CD4+T细胞来诱导所述抗原呈递细胞的凋亡；

(c)由所述抗原呈递细胞的凋亡获得凋亡细胞和凋亡体；和

(d)使所述凋亡细胞或凋亡体与能够呈递来自所述凋亡细胞或凋亡体的抗原的细胞孵育。

cCD4+T(溶细胞性CD4+细胞)细胞可通过主动免疫动物然后采用被覆有表面特异性抗体的磁珠进行亲和纯化来制备获得。通常使CD8+、CD19+、CD127+细胞减少。

或者，体外获得cCD4+T细胞，该方法包括从动物分离原初CD4+T细胞，并在培养中接触包含本文中或WO2008/017517中所述的侧接残基内含硫还原酶(thioreductase)基序的II类限制性表位。或者，可体外获得cCD4+T细胞，该方法包括从动物分离极化的CD4+T细胞，并在培养中接触包含本文中或WO2008/017517中所述的侧接残基内含硫还原酶基序的II类限制性表位。

所述cCD4+T细胞可用于体内诱导抗原呈递细胞的凋亡，该方法包括传递动物中的cCD4+T细胞，该动物主动产生针对由cCD4+T细胞识别的抗原的免疫应答。

在本发明方法的实施方式中，所述cCD4+T细胞在体外用于与抗原呈递细胞培养，所述抗原呈递细胞呈递由cCD4+T细胞识别的表位，以产生或获得凋亡体。

在本发明方法的其它实施方式中，使未成熟抗原呈递细胞载上体外培养所得的凋亡体，并且所述未成熟抗原呈递细胞用于采用获自未处理动物的CD4+T细胞群通过循环刺激来产生或获得抗原特异性Treg。

在本发明的另一个方面中，载有体外培养所得的凋亡体的所述未成熟抗原呈递细胞用于被动传送进入需要治疗的动物。

在本发明的另一个方面中，载有凋亡体的所述未成熟抗原呈递细胞用于体外产生或获得Treg，以供被动传送至需要治疗的动物。

在本发明的特定方面中，通过本文所述的方法获得(和/或分离)的Treg用于预防或治疗对所述预防或治疗有需要的患者的疾病。所述疾病可以是自体免疫疾病、过敏性疾病或移植物排斥。

本发明的方面设计获得载有凋亡细胞或凋亡体的细胞的方法。这些方法包括如下步骤：

a)提供针对某一抗原的抗原特异性溶细胞性CD4+T细胞，

b)提供抗原呈递细胞，呈递所述抗原，

c)使所述抗原呈递细胞接触所述溶细胞性CD4+T细胞，由此诱导所述抗原呈递细胞凋亡；

d)从经历步骤c)中的凋亡的抗原呈递细胞分离凋亡细胞或凋亡体；和

e)使所述凋亡细胞或凋亡体与能够呈递来自所述凋亡细胞或来自所述凋亡体的抗原的细胞孵育，由此获得载有所述凋亡细胞或凋亡体的细胞。

除此以外，这些方法还可包括步骤f)用于通过使步骤e)的负载细胞接触其它CD4+T细胞源来获得抗原特异性调节性T细胞，由此获得抗原特异性调节性T细胞群。这些细胞对已用于产生所述抗原特异性溶细胞性CD4+T细胞的抗原具有特异性。

此类抗原特异性调节性T细胞通常是Foxp3高CD4+T细胞。

根据某些实施方式，CD4+T细胞的源选自下组：原初CD4+T细胞、极化的CD4+T细胞，和天然Treg。

根据某些实施方式，能够呈递来自所述凋亡细胞或来自所述凋亡体的抗原的细胞选自下组：树突细胞、巨噬细胞、B淋巴细胞和能够表达MHC II类决定簇的细胞。步骤d)中分离的凋亡细胞或凋亡体可通过亲和纯化、离心、凝胶过滤、磁珠分选或荧光激活的分选来分离。

能够呈递来自凋亡细胞或凋亡体的抗原的细胞可以是通过外周血单核细胞或骨髓源性前体转化的未成熟的抗原呈递细胞。

用于所述方法的实施方式的抗原可以是自体免疫抗原、免疫原或移植排斥中涉及的抗原。

本发明方法的实施方式中，抗原特异性溶细胞性CD4+T细胞通过如下方式获得：使外周血细胞与肽接触，所述肽包含所述抗原的MHC II类限制性表位和具有基序[CST]-X(2)-C或C-X(2)-[CST]的序列。

在本发明方法的实施方式中，抗原特异性溶细胞性CD4+T细胞获自原初CD4+T细胞、极化的CD4+T细胞或来自天然Treg。在这些方法的其它实施方式中，进行将步骤e)中获得的载有所述凋亡细胞或凋亡体的细胞分离的额外步骤。

本发明方法的其它实施方式包括将通过所述方法获得的抗原特异性调节性T细胞分离的步骤。

在特定实施方式中，基于表面标志物CD25和/或CTLA-4(通常均高度表达)的表达或基于细胞因子TGF-β和/或IL-10或基于Foxp3的表达来将抗原特异性调节性T细胞分成不同亚组。

本发明的另一方面涉及通过上述方法获得的抗原特异性Treg的群。

本发明的另一方面涉及作为药物应用的通过上述方法获得的载有凋亡细胞或凋亡体的细胞的群。

本发明的另一方面涉及作为药物应用的通过上述方法获得的抗原特异性调节性T细胞的群。

另一个方面涉及包含通过上述方法获得的载有凋亡细胞或凋亡体的细胞的群和药学上可接受的运载体的药物组合物。

另一方面涉及包含通过上述方法获得的抗原特异性调节性T细胞和药学上可接受的运载体的药物组合物。

本发明的另一方面涉及治疗或预防哺乳动物疾病的方法，所述疾病选自自体免疫疾病、过敏性疾病、移植排斥、慢性炎性疾病，所述方法包括如下步骤：给予所述哺乳动物对象如权利要求14所述的抗原特异性调节性T细胞的群。哺乳动物通常是人。

本发明的另一方面涉及治疗或预防哺乳动物疾病的方法，所述疾病选自自体免疫疾病、过敏性疾病、移植排斥、慢性炎性疾病，所述方法包括如下步骤：给予所述哺乳动物对象载有凋亡细胞或凋亡体的细胞的群。哺乳动物通常是人。

可用上述细胞治疗的疾病包括自体免疫疾病、过敏性疾病、移植物排斥、慢性炎性疾病。

所述自体免疫疾病可以是全身性或器官特异性的自体免疫疾病。

所述自体免疫疾病可针对抗原例如甲状腺球蛋白、甲状腺过氧化物酶、TSH受体、胰岛素(胰岛素原)、谷氨酸脱羧酶(GAD)、酪氨酸磷酸酶IA-2、髓磷脂少突胶质细胞蛋白和热激蛋白HSP65。

针对过敏原的过敏性疾病可以是针对空气传播过敏原、食物过敏原、接触过敏原或全身性过敏原的过敏反应。

移植物排斥可以是细胞来源或组织来源的移植物排斥。

本发明的另一个方面涉及通过上述方法获得的抗原特异性调节性T细胞用于评价抗原特异性调节性T细胞的作用机制的应用。

附图简要说明

图1显示在女性受者上移植的男性皮肤移植物中的Foxp3+调节性T细胞的累积。在该移植物中，有12.5％的CD3+淋巴细胞群显示为Foxp3+细胞，对比正常皮肤中的1％(n＝3只小鼠/组)。

发明详述

定义

本文所用的术语“肽”指包含由肽键连接的2～200个氨基酸的氨基酸序列的分子，但其可包含非氨基酸结构(例如，连接有机化合物)。本发明方法中所用的肽可包含任何20个常规氨基酸或其修饰形式，或可包含通过化学肽合成或通过化学或酶修饰引入的非天然发生的氨基酸。本文所用的术语“抗原”指某种大分子结构，通常是蛋白质(含或不含多糖)或由包含一个或多个半抗原且包含T细胞表位的蛋白质组合组成。

本文所用术语“抗原性蛋白质”指包含一个或多个T细胞表位的蛋白质。本文所用的自体抗原或自体抗原性蛋白质指体内存在的人或动物蛋白质，其引发相同人或动物体内的免疫应答。

术语“食物或药物抗原性蛋白质”指天然存在于食物或药物产品(例如疫苗)中的抗原性蛋白质。

本文所用的术语“表位”指抗原性蛋白质的一个或数个部分(其可定义一个构象表位)，所述部分被抗体或其部分(Fab'、Fab2'等)或存在于B或T细胞淋巴细胞的细胞表面的受体特异性识别并结合，并能够通过所述结合来诱导免疫应答。

本发明内容中的术语“T细胞表位”指显性、亚显性或隐性T细胞表位，即，被T淋巴细胞的细胞表面受体特异性识别并结合的抗原性蛋白质的部分。表位是显性、亚显性或是隐性取决于针对所述表位引起的免疫反应。显性取决于所述表位在蛋白质的所有可能T细胞表位中被T细胞识别以及能够激活T细胞的频率。在具体实施方式中，T细胞表位是由MHC II类分子识别的表位，其由与所述MHC II分子的槽契合的8或9个氨基酸的序列(视该II类单体型而定)组成。在代表T细胞表位的肽序列中，将该表位中的氨基酸编号为P1-P9，该表位N末端的氨基酸编号为P-1、P-2等，该表位C末端的氨基酸编号为P+1、P+2等。

术语“自体抗原”指由相同物种的两个个体之间的蛋白质多态性产生的抗原。

术语“自体反应性”指针对移植物受体和供体之间的等位差异而产生的免疫应答。自体反应性应用于抗体和T细胞。在本发明内容中，其涉及T细胞自体反应性，这基于T细胞对由肽-MHC复合体的MHC决定簇内容中呈递的自体抗原的识别。

术语“主要组织相容性抗原”指属于人HLA系统(小鼠的H2)的分子，其被分为两个一般类别。MHC I型分子由含有3个结构域的单一多态性链组成(α1、2和3)，其与细胞表面上的β2微球蛋白相关。I类分子由在人类中称为A、B和C的3个基因座编码。此类分子向CD8+亚组的T淋巴细胞呈递肽。II型分子由2条多态性链组成，其各自含有2条链(α1和2，以及β1和2)。这些II类分子由在人类中称为DP、DQ和DR的3个基因座编码。

术语“次要组织相容性抗原”指源自正常细胞蛋白质并且被属于I类和/或II类复合体的MHC呈递的肽。在质上或量上影响此类肽在细胞表面上呈现的任何遗传多态性可产生次要组织相容性抗原。

述及表位时，本文所用的术语“同源物”指这样的分子：所述分子与天然发生的表位具有至少50％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％氨基酸序列相同性，由此保持该表位与抗体或B细胞和/或T细胞的细胞表面受体结合的能力。某一表位的具体同源物对应于天然表位而言在至多三个，更具体地至多两个，更具体地至多一个氨基酸上有修饰。

述及肽，本文所用的术语“衍生物”是指至少含有肽活性部分(例如，能够引发细胞溶解性CD4+T细胞活性)的分子，并且所述分子还包含可以具有不同目的(诸如使所述肽稳定或改变所述肽的药代动力学或药效性质)的互补部分。

本发明内容中，术语“具有还原活性的有机化合物”指对蛋白质的二硫键具有还原活性的化合物，更具体地，氨基酸序列。

所述术语“免疫紊乱”或“免疫疾病”指生物体内免疫系统的反应引起或维持失常或非生理状况的疾病。免疫疾病包括过敏性疾病和自体免疫疾病。

本文所用术语“过敏性疾病”或“过敏性紊乱”指以免疫系统对于称作免疫原的特定物质(例如花粉、刺毛、药物或食物)的超敏反应为特征的疾病。过敏，是遗传性过敏症个体患者接触使其敏感化的过敏原时所显示的迹象和症状的统称，其可导致发展出各种疾病，尤其是呼吸道疾病和症状，例如支气管哮喘。存在不同类型的分类方法，并且大多数过敏性疾病根据其在哺乳动物体内发生的位置而具有不同的名称。“超敏反应”是不希望的(破坏性、造成不舒适而有时致命)的反应，其在个体接触使其敏感化的抗原之后于该个体中产生；“速发型过敏反应”视IgE抗体的产量而定并因而等同于过敏症。

术语“自体免疫疾病”或“自体免疫紊乱”指生物体针对其自身细胞或组织的异常免疫应答导致的疾病，这归因于该生物体无法识别其自身组成部分(低至亚分子水平)为“自身”。该组疾病可被分为两类：器官特异性(例如爱迪生病、溶血性贫血或恶性贫血、古德帕斯丘综合征、格氏病、特发性血小板减少性紫癜、胰岛素依赖型糖尿病、青少年糖尿病、葡萄膜炎、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、天疱疮、过敏性皮肤炎、自体免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、自体免疫性肺炎、自体免疫性心肌炎、重症肌无力、血管球性肾炎和自发性不育症，以及全身性疾病，例如红斑狼疮、银屑病、血管炎、多肌炎、硬皮病、多发性硬化、强直性脊柱炎、类风湿性关节炎和干燥综合征。因此，自身免疫病症针对自身细胞或组织，并且包含针对“自体抗原”的反应，自体抗原表示的抗原(例如，蛋白质)是特定哺乳动物生物体自己的组成部分。在这种机制中，由B-细胞和/或T-细胞识别自体抗原，其会引起针对所述自体抗原的免疫反应。

术语“自体免疫疾病”或“自体免疫紊乱”所包括的疾病的非限制性列表包含：急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、阿狄森氏病、斑秃、抗磷脂抗体综合征(APS)、自身免疫性溶血、自体免疫性肝炎、大疱性类天疱疮、白塞氏病、腹部疾病、炎性肠病(IBD)(诸如克罗恩病和溃疡性结肠炎)、皮肌炎、1型糖尿病、古德帕斯彻氏综合征、格雷夫斯氏病、格-巴二氏综合征(Guillain-Barrésyndrome)(GBS)、桥本病、特发性血小板减少性紫癜、红斑狼疮、混合型结缔组织病、多发性硬化(MS)、重症肌无力、嗜睡症、慢性天疱疮、恶性贫血、银屑病、银屑病性关节炎、多肌炎、原发性胆汁性肝硬化、类风湿性关节炎(RA)、舍格伦综合征、颞动脉炎、脉管炎、韦格纳肉芽肿病和特应性皮炎。

“过敏原”定义为一种物质，通常是大分子或蛋白质成分，其在有倾向的、尤其是遗传倾向的个体(特应性)患者中引发IgE抗体产生。相似定义见于Liebers等.(1996)Clin.Exp.Allergy 26,494-516。

术语“炎性疾病”或“炎性紊乱”指其中显示炎症的典型特征的疾病。因此，该术语可能与其中也显示炎性方面的其它疾病重叠。本领域已知“急性炎症”和“慢性炎性疾病”之间存在差异。术语“炎性疾病”或“炎性紊乱”包括但不限于选自下组的疾病：类风湿性关节炎、结膜炎、类风湿性脊椎炎、骨关节炎、痛风性关节炎、支气管炎、结核、慢性胆囊炎、炎性肠病、急性胰炎、败血症、哮喘、慢性阻塞性肺病、皮肤炎性疾病例如银屑病和特应性皮炎、全身炎性反应综合征(SIRS)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、癌症相关炎症、肿瘤相关血管生成的减少、糖尿病、移植物v.宿主疾病与相关联的组织排斥炎性反应的治疗、克罗恩氏病、迟发型超敏反应、免疫介导的和炎性CNS疾病要素；例如，阿兹海默症、帕金森病、多发性硬化等。术语“治疗有效量”指在患者中产生所需治疗或预防效果的细胞数。例如，述及疾病或紊乱，其为一定程度上使所述疾病或紊乱的一种或多种症状减少，尤其是使与所述疾病或紊乱相关或引起所述疾病或紊乱的生理学参数或生化参数部分或完全回复至正常的细胞数。根据本发明的一个具体实施方式，所述治疗有效量是导致正常生理状况改善或恢复的细胞数。例如，当用于治疗性治疗受免疫疾病影响的哺乳动物时，其为每天的细胞数/kg该哺乳动物体重。

本文中述及肽或序列时，术语“天然的”指该序列与天然发生的序列相同。这包括群体中大多数所具有的野生型序列，但也包括群体中出现的不常见的多态性和突变。相反，术语“人工的/人造的”指自然中不存在的序列或肽。任选地，人工序列通过对天然序列进行有限修饰而获得，所述修饰例如更换天然发生序列中的一个或多个氨基酸，向天然发生序列的N末端或C末端添加氨基酸。本文中，氨基酸采用其全名、三字母缩写形式或单字母缩写形式表示。

"Foxp3"(叉头框P3)是叉-翼螺旋转录因子家族的成员，其在天然发生的CD4-阳性/CD25-阳性T调节细胞(Treg)的发育和功能中起重要作用。

"Treg"(调节性T细胞)Treg涉及对不适当免疫应答的主动抑制。这些细胞是CD4+、CD25+、FoxP3+细胞。

“原初cd4+T细胞"表达CD62L，低度或中度表达CD44，低产细胞因子，无优选通路。"极化的CD4+细胞"具有高CD44表达并生成有限的细胞因子组。

"cCD4+T细胞"溶细胞性CD4+T细胞已在WO 2009/101207中具体表征，并且以如下性质中的一种或多种为特点：-转录阻遏物Foxp3的表达不可检测，

-丝氨酸-苏氨酸激酶AKT相较于天然CD4+调节性T细胞而言活性增加，

-TGF-β的产量不可检测，并且IL-10的产量不可检测或与天然CD4+调节性T细胞相比产量极低，

-相较于天然CD4+调节性T细胞而言的高IFN-γ浓度，

-抗原性刺激后，转录活化剂T-bet和GATA3共表达，

-NKG2D表达，

-产生高浓度的可溶性Fas配体(Fasl)。

发明描述

本发明的一般原理涉及获自载有特异性抗原的抗原呈递细胞的凋亡体用于引发抗原特异性Foxp3+Treg生成的应用。具体而言，本发明的目的是：提供从以MHC II类决定簇呈递自体抗原或引发不希望的免疫应答的抗原(例如，过敏原、来自移植物的自体抗原或用于治疗目的的同种异体因子)的抗原呈递细胞获得选择性凋亡的方法。如下文更详细地描述，因此，本发明提供产生、获得或分离抗原特异性Treg的方法，由此提供使特定针对给定抗原的免疫应答停止的可能性。

被诱导凋亡的细胞经历许多表面变化，包括磷脂酰丝氨酸、多糖和糖脂的氧化，这使所述细胞可被吞噬细胞识别。此外，凋亡细胞表达新蛋白质，例如凝血栓蛋白-1和/或使胞内组分定位于其表面，所述胞内组分例如磷脂酰丝氨酸、DNA和核小体。这些表面变化共同为巨噬细胞吞噬凋亡细胞而不触发先天免疫反应提供可能(在先天受体例如Toll样受体、NOD或RIG不存在的情况下)。

移除凋亡细胞的吞噬细胞具有识别受体(例如CD14)、清除受体和C型凝集素受体(Ravichandran和Lorenz(2007)Nature Rev.Immunol.7,964-974)。清除受体是能够与氧化的或乙酰化的低密度脂蛋白(LDL)以及多阴离子配体和凋亡细胞结合的表面糖蛋白。清除受体的例子包括CD36、LOX-1和CLA-1。识别之后是快速内化，以及在凋亡细胞的情况中的破裂和与内体和溶酶体的融合。特别感兴趣的是凋亡细胞产生的凝血栓蛋白-1，其作为连接吞噬细胞上表达的CD36的可溶桥。凝血栓蛋白-1的表达是半胱天冬酶依赖性的。

可溶因子还在凋亡细胞的移除中起作用。示例包括胶原凝集素和胶原凝集素样分子，例如甘露糖结合凝集素和C1q。所述两者均与吞噬细胞表面表达的钙网蛋白相互作用。正五聚蛋白家族，其包括血清淀粉体P(SAP)和C-反应性蛋白(CRP)，而原型正五聚蛋白(PTX)也结合凋亡细胞。总之，有许多因子在生理学条件下用于处理经历自然程序性细胞死亡或凋亡的细胞(Jeannin等.(2008)Curr.Opinion in Immunol.20,530-537)。哺乳动物中，细胞持续更新以维持正常细胞数量和活性(Steinman等.(2000)J.Exp.Med.191,411-416)。在不存在炎性条件的情况下，凋亡体被器官由抗原呈递细胞摄取，所述细胞迁移至局部淋巴结，并在此处与淋巴结树突细胞进行凋亡体交换，该交换直接发生或因迁移抗原呈递细胞快速裂解而发生。发现迁移至局部淋巴结的树突细胞中的至少一些是未成熟的，其显示吞噬凋亡细胞的高能力。在淋巴结中，树突细胞开始处于未成熟状态，但似乎属于显示以I类和II类决定簇呈递抗原的能力的亚组。在与非炎性条件相关的共刺激信号不存在的情况下，MHC II类呈递提供对Treg所需信号的募集和活化。此类Treg是抗原特异性的(导向自体抗原)并且阻遏针对此类自体抗原的反应的活性。因此，在非炎性情况下发生的凋亡引发抗原特异性Treg，这维持对于自身抗原的耐受。

相反地，在炎性条件下，因为其自体免疫疾病中发生或响应同种抗原或过敏原或在准确针对感染剂的免疫应答过程中发生，所以凋亡体产量增加，其被带至局部淋巴结。所述载有凋亡体的细胞的大量流入超过了淋巴结树突细胞捕获并呈递所述凋亡体从而招募并激活Treg的能力。因此，促炎性细胞因子的存在改变了淋巴结树突细胞的表型，其被诱导成熟并且最终使效应T细胞活化增加至破坏Treg。尽管这是对感染剂的响应过程中希望的效果，但在自体免疫疾病、过敏性反应和移植物排斥中，这不幸地导致其它组织损伤和炎症。因此，设计一种使非炎性情况下生成或获得凋亡体的能力增加，以产生、获得或分离抗原特异性Treg的方法是有利的。

在对于采用侧接残基内携带硫还原酶基序的MHC II类限制性表位的cCD4+T细胞的引发的研究(尚未公开)过程中，出乎预料地发现CD4+诱导的结果是目标器官中Foxp3+Treg的累积。因此，在皮肤移植物排斥模型中，同种异源移植物的长期持续伴随该移植物本身中Foxp3+Treg的存在。在多种硬化症实验模型中进行了相同观察，其中疾病的预防和抑制伴随着中枢神经系统(CNS)白质中Foxp3+Treg的累积。

因此，在具体实施方式中，本发明方法包括携带WO2008/017517(其通过引用纳入本文)中所述侧接残基内含硫还原酶基序的MHC II类限制性表位的应用。

一般而言，用于本发明实施方式的肽是包含可能触发免疫反应的抗原(自身或非自身)的至少一种T细胞表位的肽，其偶联至具有还原活性的有机化合物，例如含硫还原酶序列基序[CST]-X(2)-[CST]，其中至少一个[CST]是Cys；因此所述基序是[C]-X(2)-[CST]或[CST]-X(2)-[C]。在具体实施方式中，肽包含序列基序[C]-X(2)-[CS]或[CS]-X(2)-[C]。在更具体的实施方式中，肽包含序列基序C-X(2)-S、S-X(2)-C或C-X(2)-C。所述T细胞表位和所述有机化合物任选地由接头序列分隔。

这些肽可以通过化学合成来制备，其允许引入非天然氨基酸。因此，在还原性化合物的基序中，C代表半胱氨酸或具有硫醇基团的其它氨基酸，例如巯基缬氨酸、同型半胱氨酸或具有硫醇功能的其它天然或非天然氨基酸。为了具有还原活性，所述基序中存在的半胱氨酸应不作为胱氨酸二硫桥的部分或作为氧化的半胱氨酸出现。不过，该基序可包含经修饰的半胱氨酸，例如甲基化的半胱氨酸，其在体内被转化成具有三个硫醇基团的半胱氨酸。

还原性化合物的[CST]-X(2)-[CST]基序中的氨基酸X可以是任何天然氨基酸，包括S、C或T或可以是非天然氨基酸。具体而言，X是具有小侧链例如Gly、Ala、Ser或Thr的氨基酸。或者，不是具有大侧链例如Tyr的氨基酸。更具体地，[CST]-X(2)-[CST]基序中的至少一个X是His或Pro。

在包含上述基序的作为还原性化合物的肽中，所述基序如此定位：当表位嵌合进入MHC槽时，该基序留在该MHC结合槽的外侧。所述基序的位置直接毗邻所述肽内的毗邻所述表位序列，或与所述T细胞表位由一个接头隔开。更具体地，所述接头包括7个或更少氨基酸的氨基酸序列。最具体地，所述接头包含1、2、3或4个氨基酸。或者，接头包含5、6、7、8、9或10个氨基酸。在基序序列与表位序列相邻的那些肽中，这指示为相较于表位序列的P-4位至P-1位或P+1位至P+4位。

除还原性基序以外，此类肽包含(如现有技术中所述)源自抗原的T细胞表位，所述抗原通常是过敏原或自体抗原，视应用而定。蛋白质序列中的此类T细胞表位可通过功能性实验和/或一种或多种计算机预测实验来鉴定。

合适算法见述于，例如Zhang等，(2005)Nucleic Acids Res 33,W180-W183(PREDBALB)；Salomon和Flower(2006)BMC Bioinformatics 7,501(MHCBN)；Schuler等，(2007)Methods Mo/Biol.409,75-93(SYFPEITHI)；Donnes和Kohlbacher(2006)Nucleic Acids Res.34,W194-W197(SVMHC)；Kolaskar和Tongaonkar(1990)FEBS Lett.276,172-174和Guan等，(2003)ApplBioinformatics 2,63-66(MHCPred)。

T细胞表位序列中的氨基酸根据其在MHC蛋白的结合槽中的位置来编号。通常，肽内存在的T细胞表位由8～25个氨基酸组成，然而更具体地，由8～16个氨基酸组成，然而最具体地，由7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个氨基酸组成。

更具体地，所述T细胞表位由9或8个氨基酸的序列组成。更具体地，所述T细胞表位是由MHC II类分子呈递至T细胞的表位。尤其所述T细胞表位序列是嵌合进入MHC II蛋白裂隙的表位序列，更具体而言是嵌合进入所述MHC II裂隙的九肽。

肽的T细胞表位可以对应蛋白质的天然表位序列，或者可以是其修饰形式，前提是修饰的T细胞表位与天然T细胞表位序列相似，保留其在MHC缝隙内结合的能力。修饰的T细胞表位就MHC蛋白而言可具有与天然表位相同的结合亲和性，但也可以具有较低亲和性。在此类情况中，经修饰肽的结合亲和性相较原始肽降低不小于10倍，更优选降低不小于5倍。

可衍生用于本发明方法的实施方式的T细胞表位的(自体)抗原的示例有甲状腺球蛋白、甲状腺过氧化物酶、TSH受体、胰岛素(胰岛素原)、谷氨酸脱羧酶(GAD)、酪氨酸磷酸酶IA-2、髓磷脂少突胶质细胞蛋白和热激蛋白HSP65。

并不意在限制并受理论限制，作用的一般机制包括如下步骤：

(a)载有凋亡体的未成熟树突细胞引发对以MHC II类决定簇中存在的决定簇具有特异性的Treg。

(b)这些Treg迁移至不希望的免疫应答发生的位置。

(c)这些Treg在所述目标位置处的累积导致因所述Treg的大量抗炎性性质所致的对于炎症的控制。

(d)抑制组织破坏和凋亡细胞产生，并重新建立该目标位置处正常细胞的周转，由此恢复正常组织功能。

本发明提供能够获得抗原特异性Treg的方法的多种实施方式。在本发明方法的一个实施方式中，抗原呈递细胞的凋亡可通过与cCD4+T细胞接触而在体外获得。使未成熟树突细胞载有凋亡体。载有凋亡体的未成熟树突细胞用于细胞治疗，或用于体外产生、分离或获得供于细胞治疗的抗原特异性Treg。本发明内容中的细胞治疗包括制备用于给予哺乳动物的细胞的步骤。

本领域中描述并已知用于诱导细胞体外凋亡的一般方法。例如，CD4+T细胞淋巴细胞的凋亡可通过在针对CD3和CD28的不溶性抗体存在下培养所述细胞来获得。用于测定细胞是否实际凋亡的方法是本领域中熟知的。这些方法包括使膜联蛋白V与凋亡细胞表面上表达的磷脂结合，胱冬酶的激活，以及核酸降解。关于这些方法的综述可见于出版物如Fuchs和Steller(2011),Cell 147,742-758。

与现有技术不同，本发明中，抗原呈递细胞中诱导的凋亡需要在所述抗原呈递细胞(APC)和所述诱导凋亡的细胞(即，cCD4+T细胞)之间形成突触。所述突触的形成激活cCD4+T细胞的溶细胞性质，导致仅诱导呈递对应抗原衍生的II类限制性表位的细胞的凋亡。有利的是，这提供严格的抗原特异性。在用于该试验系统的任何其它试剂(例如抗CD3抗体)不存在时，本发明方法中描述的凋亡的体外诱导再现与体内存在那些接近的条件。

通过CD4+T细胞的抗原呈递细胞的凋亡已被Janssens等人报道，Janssens等.(2008)J.Immunol.171,4604-4612)。在一些情况中，Treg可能诱导靶细胞凋亡，而凋亡的多种机制已经描述，包括在穿孔蛋白存在或不存在下激活粒酶B的IDO释放。关于这些机制的综述可见于(Shevach(2011)Adv.Immunol.112,137-176)。在本发明方法中，cCD4+T细胞代表独特的细胞亚组，与Treg在表型上和功能性质上均有差异。能够诱导此类cCD4+T细胞的方法可见于WO2008/017517。

用于鉴定和分离凋亡体的方法是本领域已知的。凋亡细胞或凋亡体在其表面上表达多种新组分，从而使所述凋亡细胞或凋亡体易受可溶性因子的调理，如上所述。这两种变化形式提供分离凋亡细胞或凋亡体的方式。关于此的示例可见于本领域(Schiller等.(2008)Cell Death Diff.15,183-191)。一个示例是采用针对凝血栓蛋白的抗体来分离细胞或细胞碎片，其因进入凋亡周期而表达凝血栓蛋白。

本发明的一个实施方式中，使分离的凋亡体或凋亡细胞与树突细胞孵育以允许吞噬、加工和在MHC II类决定簇中的呈递。已描述了树突细胞的不同亚组，其在功能上、表面表型和成熟度上均有差异。一般而言，未成熟的树突细胞具有摄取凋亡细胞和凋亡体的高能力，但可能就在MHC II类决定簇中表达表位而言并不有效。然而，树突细胞的一些亚基，尤其是封在淋巴结内的那些，结合这两种性质，在其表面表位呈递摄取凋亡细胞或凋亡体。

然而，在本发明内容中，树突细胞通过本领域熟知的方法衍生自体外并且保持在未成熟状态。本领域教导树突细胞在干扰素-γ(IFN-γ)存在下的衍生化诱导高度成熟状态，而IL-4将树突细胞保持在未成熟状态。树突细胞可源自外周血单核细胞或骨髓前体。如上所述获得的凋亡细胞和凋亡体与未成熟的树突细胞孵育，由此允许通过MHC II类决定簇呈递。

本领域技术人员应清楚，优选树突细胞，但并不排除获得能够呈递由凋亡细胞或凋亡体加工的抗原的呈递细胞的方法。代替方式包括但不限于巨噬细胞、内皮细胞或上皮细胞，其可以MHC II类表达诱导。

本发明的另一方面涉及载有源自凋亡细胞或凋亡体的抗原的树突细胞在细胞治疗中的应用。通过示例方式，将通过呈递自体抗原的抗原呈递细胞上的cCD4+T细胞的溶细胞作用所获得的树突细胞静脉内给予受疾病影响的动物，所述树突细胞呈递源自凋亡体的II类限制性表位，该疾病中涉及针对自体抗原的免疫应答。所述细胞治疗的结果是特异性抑制所述免疫应答并治愈所述疾病。其它示例如下所示，但本发明的范围不限于这些示例。在本发明方法的特定实施方式中，使载有凋亡细胞或凋亡体的未成熟树突细胞维持在培养中，并向其添加CD4+T细胞的群，孵育以产生、分离或获得Treg。可采用数种CD4+T细胞的可能来源，包括但不限于：从未处理动物获得并采用例如被覆有特异性抗体的磁珠通过亲和性来制备的细胞；获自动物脾、淋巴结、组织或外周血的极化的CD4+T细胞，其中所述动物具有涉及针对(自体)抗原的免疫应答的疾病病程，就该疾病而言需要引发Treg；或确定为显示高且稳定的转录Foxp3受体表达的天然Treg。

本领域技术人员应清楚，这三种CD4+T细胞来源在给定相关环境中可能各有优势。例如，原初CD4+T细胞甚至更易从外周血进入并提供足够大的库以识别任何抗原。在优选预防疾病进程的情况中，而其中可尤其根据给定动物的MHC II类单体型来选择抗原，原初CD4+T细胞将是最佳选择。另一方面，极化的CD4+T细胞是用于在优选采用对肽-MHC复合体具有较高亲和性的细胞的情况中实践本发明方法的细胞来源。一个例子是，在1型糖尿病中发现自体反应性CD4+T细胞，其中对CD4+T细胞对胰岛素原型肽的识别主要通过与肽-MHC复合体的不完全结合而发生，导致相对低的T细胞受体亲和性。

本发明中，一个实施方式是采用天然Treg作为来源。Treg的库针对对于自体抗原的识别而形成，并且如上所述，此类细胞具有足够的亲和性来与抗原呈递细胞功能上形成突触。针对给定抗原的抗原特异性天然Treg的数量过低，因为此类Treg仅为总CD4+T细胞数的5-10％。本发明提供能使所述低数量体外增加的方法。在本发明方法中，采用胸腺选择的天然Treg的另一个好处是，经报道它们表型稳定性。因此，在天然Treg中，Foxp3高表达且随时间在不同活化条件下维持稳定。相反，Treg诱导进入外周并且获取Foxp3表达可能不稳定，这是因为没有对于Treg系确定的表观特征，从而在其活化的环境变化时(例如在炎性条件下)其调节性质减弱。

在本发明的另一个方面中，采用通过与呈递来自凋亡细胞或凋亡体的抗原的未成熟的树突细胞体外培养扩增的Treg(天然Treg)或诱导的(原初或极化的)Treg进行基因治疗。所述治疗可作为预防性治疗给予，例如预防移植物排斥，或作为抑制治疗给予，例如在1型糖尿病中。

任选地，通过本发明所述的方法获得的Treg在需要更大数量的此类Treg时可另采用非特定方法扩增。此类非特定方法的示例是本领域中已知的。例如，在不溶性抗CD3和抗CD28抗体和IL-2存在下孵育的细胞可被扩增数个数量级。

本领域技术人员应清楚，在给予细胞之前，可添加其它步骤。一种可能是通过将细胞与载有一种或多种合成肽的MHC II类决定簇的四聚体孵育来进一步限制Treg的特异性，所述合成肽是希望用于定向Treg的肽。另一种可能是，通过表面标志物或不同Foxp3的表达程度来分选出细胞。已知Foxp3表达特别高的细胞群是整个天然Treg群的部分，并且显示使其适合于本发明内容的特点。

在本发明的另一个方面，通过本发明方法获得的Treg可用于建立关于疾病进程发展的给定抗原或表位的关联性。在许多疾病中，有多于一种抗原涉及病程，而仍旧难以鉴定最重要的一种。通过实施本发明方法来产生抗原特异性Treg提供关闭特异性抗原的方法，以作为分离和鉴定疾病发展中特异性抗原的作用的手段。

通过本发明方法获得的抗原特异性Treg提供确定Treg表型在其功能中的重要性的方法。举例而言，比较根据粒酶的表达和粒酶+与粒酶(-)的群来分选的抗原特异性Treg的抑制体外或体内应答的能力。

本发明的多个方面和实施方式通过如下实施例进行说明。然而，这并不意在将本发明的范围限制到这些实施例。

实施例

实施例1.体外凋亡的诱导

抗原呈递细胞(APC)制备自C57BL/6小鼠并用涵盖实验性自体免疫脑脊髓炎(EAE)中涉及的自体抗原的II类限制性T细胞表位的肽加载，用于多发性硬化症模型。

因此，具有序列VGWYRSPFSRVVHLYR[SEQ ID.NO:1]的髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(MOG)肽，对应于MOG蛋白的氨基酸残基37-52，被用于加载细胞。

该肽包含优势T细胞表位。P1位，即锚定至MHC II类槽的第一个氨基酸是Y40(P1-P9序列加有下划线)。

溶细胞性CD4+T细胞(cCD4+T细胞)获自动物的脾，所述动物用氢氧化铝和50μg的SEQ ID.NO:1的肽免疫四次，其中所述肽的氨基末端的3个氨基酸被序列CGPC替代，生成序列CGPCYRSPFSRVVHLYR[SEQ ID.NO:2]的肽。

cCD4+T细胞细胞在加载的APC存在下于37℃下培养过夜并洗涤，而采用针对活化的半胱天冬酶3的抗体来检测APC的凋亡程度。

实施例2.凋亡体的分离

实施例1中获得的凋亡细胞的上清液经收集并进行两次离心步骤(500xg，5分钟)以移除细胞。然后，将该上清液过滤通过1.2μM亲水性注射器滤器。以100,000xg离心30分钟后，沉淀中所含的凋亡体经收获并用于细胞实验。

或者，凋亡细胞和凋亡体可采用针对因凋亡而表达的细胞表面组分的抗体来通过亲和性分离。这些的示例有抗凝血栓蛋白抗体。在优选的制备步骤中，抗凝血栓蛋白抗体共价偶联至磁性微珠。在20℃下柔和振荡孵育1小时后，磁珠保留在磁铁上。然后，通过用弱酸性缓冲液洗脱来回收凋亡体。

这些方法是本领域已知的。(Schiller等.(2008)Cell Death Diff.15,183-191；Gautier等.(1999)J.Immunol.Methods 228,49-58)

实施例3.产生或获得未成熟的树突细胞(iDC)

从上膝和下膝骨获得骨髓祖细胞。分别采用CD19和CD90微珠利用磁性减少来移出B和T淋巴细胞。包含CD19-CD90-iDC祖细胞的阴性分离部分重悬在含有500U/ml重组GM-CSF的无血清培养基中并接种(3x10⁶个细胞/ml)在组织培养板上并保持在37℃。细胞每隔一天清洗一次，持续6天，避免破坏聚集体。在第6天，移出iDC聚集体，清洗并加至新板。在第7天，收获细胞并用于分析。

这些方法是本领域已知的。参见例如，Inaba等.(2009)Curr.Prot.immunol.1(86),第3.7.单元第10-12页。

实施例4.产生或获得载有抗原的未成熟树突细胞

iDC显示吞噬凋亡体的高能力。因此，将实施例3中获得的iDC与实施例2中获得的凋亡体孵育。就此而言，通过在37℃孵育30分钟来将2x10⁵个iDC铺板于微型培养孔。然后将凋亡体的悬液添加至培养物并在37℃另孵育16小时。细胞然后经清洗并重悬于培养基中。

实施例5.载有抗原的树突细胞用于细胞治疗的应用

载有凋亡体的iDC通过静脉内途径注射(2x10⁵)进入疾病诱导之前或之后的动物。

因此，对C57BL/6小鼠进行如下方案，包括在完全弗氏佐剂中给予MOG肽(参见实施例1的SEQ ID:NO1的肽)和分枝杆菌提取物，并注射2次百日咳毒素。该方案在MOG肽给予后两周内引发与人多发性硬化症相当的病征的发展。

在该模型中，载有凋亡体的iDC(如实施例4中所得)在疾病诱导前一天或首次观察到疾病病征之后(即诱导后两周)注射至小鼠。

未经iDC注射的动物，或未载有iDC的动物经注射作为对照。在实验组和两组对照组中评价疾病病征的预防或抑制。

实施例6.载有抗原的树突细胞用于引发抗原特异性Treg的应用。

允许载有凋亡体的iDC体外产生Treg。

因此，使实施例4中所述的iDC保持在培养中。

采用抗体通过磁性微珠分选从未处理小鼠的脾分离T细胞，以排除CD8+、CD19+、CD127+细胞，然后进行CD25+细胞正选择。CD4+Foxp3^高细胞的百分比通过荧光活化的细胞分选(facs)采用Foxp3特异性抗体在细胞透过后检测。本领域公开了获得此类细胞的方法(Peters等.(2003)Plos one 3,574-584)。获得纯度高于85％的细胞。

然后将CD4+Foxp3^高细胞(1x10⁶个细胞/孔)添加至实施例4所述的iDC培养物。在37℃7天的刺激循环后，在IL-2(20IU/ml)存在下，细胞经洗涤并根据相同方案采用载有凋亡体的新一批iDC再孵育。在该第二次刺激循环之后，可任选地通过与被覆有抗CD3和抗CD28抗体的磁珠在IL-2的存在下孵育来进一步扩增细胞。细胞经洗涤并通过facs评价Foxp3表达。

实施例7.抗原特异性Treg用于细胞治疗的应用

实施例6中制备的细胞可用于在自体免疫疾病的情况下被动给予。

因此，按照与实施例5中所述相似的方案但包括IV注射2x10⁵个CD4+Foxp3^高细胞代替iDC。

显示相较于未注射CD4+Foxp3^高细胞的对照动物而言，有疾病病征的显著预防和/或抑制。

实施例8.分选出抗原特异性Treg供于分析目的

还可分析CD4+Foxp3^高细胞群来确定单一组分或合并组分重要性的作用机制。

因此，CD4+Foxp3^高细胞采用被覆有针对FasL的抗体的微珠分离。然后，功能性测试两群细胞FasL+和FasL(-)，并比较其引发耐受的能力。这采用分析系统进行，其中，多克隆效应CD4+淋巴细胞(以CD4+CD25(-)表型为特点)从未处理动物的脾分离。

天然Treg通常通过其显示对效应细胞的旁路抑制的能力来确定。本文所用的分析系统涉及CD4+CD25+T细胞群的活化，所述活化通过非特异性刺激，即联合抗-CD3和抗-CD28抗体进行。

将FasL+CD4+Foxp3^高细胞抑制CD4+CD25(-)T细胞增殖的能力与FasL(-)CD4+Foxp3^高细胞做比较。

显示表达FasL的细胞显示较高的抑制效应细胞增殖的能力。

实施例9.Foxp3Treg在皮肤移植物中的累积

8～10周龄的C57BL/6雌性小鼠注射50μg的肽来免疫，然后进行皮肤移植，所述肽涵盖侧接残基内含硫氧还基序的Dby(ccDby)的II类限制性表位，如WO2009/100505中所述。

将雄性同系供体的完整厚度的皮肤移植在受体的背部，并跟踪排斥迹象。所有小鼠耐受该移植物。在移植后6周取该移植物的活检，供于组织学分析。显示Foxp3+细胞在该移植物中累积。

作为比较，正常皮肤中Foxp3+T细胞的含量示于图1。

Claims

1.一种获得载有凋亡细胞或凋亡体的细胞的体外方法，所述方法包括如下步骤：

a)提供针对某一抗原的抗原特异性溶细胞性CD4+T细胞，

b)提供抗原呈递细胞，呈递所述抗原，

e)使所述凋亡细胞或所述凋亡体与能够呈递来自所述凋亡细胞或来自所述凋亡体的抗原的细胞孵育，由此获得载有所述凋亡细胞或凋亡体的细胞。

2.如权利要求1所述的方法，所述方法用于获得抗原特异性调节性T细胞，所述方法还包括如下步骤：

f)使权利要求1所述的步骤e)的加载细胞与另一个CD4+细胞来源接触，由此获得抗原特异性调节性T细胞的群。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述抗原特异性调节性T细胞是Foxp3高CD4+T细胞。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述CD4+T细胞的来源选自下组：原初CD4+T细胞、极化的CD4+T细胞，和天然Treg。

5.如权利要求1～4中任一项所述的方法，其特征在于，所述能够呈递来自所述凋亡细胞或来自所述凋亡体的抗原的细胞选自下组：树突细胞、巨噬细胞、B淋巴细胞和能够表达MHC II类决定簇的细胞。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述凋亡细胞或凋亡体在步骤d)中通过亲和纯化、离心、凝胶过滤、磁珠分选或荧光活化的分选来分离。

7.如权利要求1～6中任一项所述的方法，其特征在于，所述能够呈递来自所述凋亡细胞或所述凋亡体的抗原的细胞选自下组：通过转化外周血单核细胞或骨髓源性的祖细胞获得的未成熟抗原呈递细胞。

8.如权利要求1～7中任一项所述的方法，其特征在于，所述抗原是自体免疫抗原、过敏原或涉及移植物排斥的抗原。

9.如权利要求1～8中任一项所述的方法，其特征在于，所述抗原特异性溶细胞性CD4+T细胞通过如下方式获得：使外周血细胞与肽接触，所述肽包含所述抗原的MHC II类限制性表位和具有基序[CST]-X(2)-C或C-X(2)-[CST]的序列。

10.如权利要求1～9中任一项所述的方法，其特征在于，所述抗原特异性溶细胞性CD4+T细胞获自原初CD4+T细胞、极化的CD4+T细胞或源自天然Treg。

11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括如下步骤：分离步骤e)中获得的所述载有凋亡细胞或凋亡体的细胞。

12.如权利要求2或3中所述的方法，其特征在于，所述方法还包括如下步骤：分离所述抗原特异性调节性T细胞。

13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述方法还包括如下步骤：基于表面标志物CD25和/或CTLA-4的表达或基于细胞因子TGF-β和/或IL-10的产生或基于Foxp3的表达来将所述抗原特异性调节性T细胞分成不同的亚组。

14.如权利要求2～10中任一项所述获得的抗原特异性Treg的群。

15.如权利要求1或权利要求5～11中任一项所述获得的载有凋亡细胞或凋亡体的细胞的群。

16.作为药物应用的如权利要求14所述的抗原特异性调节性T细胞的群。

17.用于治疗或预防自体免疫疾病、过敏性疾病、移植物排斥或慢性炎性疾病的如权利要求14所述的抗原特异性调节性T细胞的群。

18.用于治疗或预防全身性或器官特异性自体免疫疾病的如权利要求14所述的抗原特异性调节性T细胞的群。

19.用于治疗或预防针对某抗原的自体免疫疾病的如权利要求14所述的抗原特异性调节性T细胞的群，所述抗原选自下组：甲状腺球蛋白、甲状腺过氧化物酶、TSH受体、胰岛素(胰岛素原)、谷氨酸脱羧酶(GAD)、酪氨酸磷酸酶IA-2、髓磷脂少突胶质细胞蛋白和热激蛋白HSP65。

20.用于治疗或预防针对某过敏原的过敏性疾病的如权利要求14所述的抗原特异性调节性T细胞的群，所述过敏原选自下组：空气传播过敏原、食物过敏原、接触过敏原和全身性过敏原。

21.用于治疗或预防细胞来源或组织来源的移植物排斥的如权利要求14所述的抗原特异性调节性T细胞的群。

22.如权利要求14所述的抗原特异性调节性T细胞在评价所述抗原特异性调节性T细胞作用机制中的应用。

23.用于治疗或预防自体免疫疾病、过敏性疾病、移植物排斥或慢性炎性疾病的如权利要求15所述的载有凋亡细胞或凋亡体的细胞的群。

24.用于治疗或预防全身性或器官特异性自体免疫疾病的如权利要求15所述的载有凋亡细胞或凋亡体的细胞的群。

25.用于治疗或预防针对某抗原的自体免疫疾病的如权利要求15所述的载有凋亡细胞或凋亡体的细胞的群，所述抗原选自下组：甲状腺球蛋白、甲状腺过氧化物酶、TSH受体、胰岛素(胰岛素原)、谷氨酸脱羧酶(GAD)、酪氨酸磷酸酶IA-2、髓磷脂少突胶质细胞蛋白和热激蛋白HSP65。

26.用于治疗或预防针对某过敏原的过敏性疾病的如权利要求15所述的载有凋亡细胞或凋亡体的细胞的群，所述过敏原选自下组：空气传播过敏原、食物过敏原、接触过敏原和全身性过敏原。

27.用于治疗或预防细胞来源或组织来源的移植物排斥的如权利要求15所述的载有凋亡细胞或凋亡体的细胞的群。

28.一种治疗或预防哺乳动物对象疾病的方法，所述疾病选自下组：自体免疫疾病、过敏性疾病、移植物排斥、慢性炎性疾病，所述方法包括如下步骤：给予所述哺乳动物对象如权利要求14所述的抗原特异性调节性T细胞的群。

29.一种治疗或预防哺乳动物对象疾病的方法，所述疾病选自下组：自体免疫疾病、过敏性疾病、移植物排斥、慢性炎性疾病，所述方法包括如下步骤：给予所述哺乳动物对象如权利要求15所述的载有凋亡细胞或凋亡体的细胞的群。