JP2015518376A - 抗原特異的な調節性ｔ細胞を誘導するための方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、アポトーシス細胞またはアポトーシス小体を積載した未成熟な抗原提示細胞を誘発する方法に関する。また、本発明は、抗原特異的な調節性Ｔ細胞を生体外または生体内で取得する方法に関する。アポトーシス小体／細胞を積載した細胞および調節性Ｔ細胞は、細胞溶解性ＣＤ４＋Ｔ細胞によって抗原提示細胞のアポトーシスを誘発することによって取得可能である。細胞は、自己免疫疾患、移植片拒絶、およびアレルギー性疾患などの疾患を抑制または予防するために使用されるとともに、これに関連する薬物に使用される。自己免疫疾患、移植片拒絶、およびアレルギー性疾患などの疾患を抑制および予防するための抗原特異的な調節性Ｔ細胞の使用、およびこれに関連する薬物がさらに開示される。上記の方法によって取得された抗原特異的な調節性Ｔ細胞の個体群がさらに開示される。

Description

発明の分野
本発明は、抗原特異的な調節性Ｔ細胞を取得する方法、および自己免疫疾患、アレルギー性疾患、または移植片拒絶などの症状を治療するためのこれらの薬物としての使用に関する。

発明の背景
調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、特に転写抑制因子Ｆоｘｐ３（フォークヘッドボックスＰ３）を発現するＴｒｅｇは、正常な免疫恒常性を維持するのに必要不可欠である。このような細胞が無い場合、糖尿病および他の自己免疫疾患などの臨床症状とともに自己免疫が急速に進行する（Sakaguchiら（２０１２年）によるNature Med. 18, 54-58においてレビューされている）。Ｆоｘｐ３＋Ｔｒｅｇは、胸腺において積極的に選択され、安定的にＦоｘｐ３を発現する末梢血に見られる細胞の個体群を構成する。胸腺上皮細胞によって提示される自己ペプチドの同族認識に際して胸腺において細胞が選択される発端は、エフェクターＴ細胞とは対照的に、抹消血において著しい親和性を有するＦｏｘｐ３＋細胞が見られることである。現時点での見解は、とりわけ低い親和性を有する自己抗原特異的エフェクター細胞と高い親和性を有するＦоｘｐ３＋細胞との間のバランスによって末梢性免疫寛容が維持され、免疫寛容に均衡がもたらされるというものである。この中央的なＴｒｅｇの選択に加え、細胞は末梢において変換され、転写因子Ｆｏｘｐ３を発現することができる。しかしながら、発現は胸腺で選択された個体群よりも低く、獲得された表現型に可逆性が観察された。

胸腺において選択され、高く安定したＦｏｘｐ３の発現によって特徴付けられた天然Ｔｒｅｇの特性は、自己免疫応答によって特徴づけられた病状を制御する手段、および移植片またはアレルゲンへの不要な応答を制御する数少ない治療手法として、非常に魅力的なものとなっている。しかしながら、末梢における抗原特異的な天然Ｔｒｅｇの数は非常に少なく、これらを生体内または生体外で拡大する方法は十分に定義されておらず、信頼性も低い。Ｔｒｅｇの個体群を選択的に拡大することができる方法は、良好な応答を得るための生物の全体的な能力に影響を与えることなく疾患経過を防止または抑制する潜在能力を有する。

アポトーシスまたはプログラム細胞死は、組織の恒常性を維持するのに役立つ生理的な機構である（FuchsおよびSteller（２０１１年）によるCell 147, 742-758において検討されている）。毎分１０^６個に上る数の細胞が人体においてアポトーシスによって破壊されていることが算出されている。細胞死によって放たれた莫大な数の抗原は、自己蛋白質に対する免疫反応の誘発を回避するように制御し続けなければならない。実際には、アポトーシス細胞は、主に未熟な樹状細胞などのスカベンジャー細胞によって取り出され、寛容を誘発するように処理される。アポトーシス細胞由来の抗原の交差提示は、Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇの拡大を誘発することで知られるクラスＩＩ組織適合性主複合体（ＭＨＣ）において提示される。したがって、炎症状態が無い場合に起こる細胞のアポトーシスは、調節性Ｔ細胞が拡大する生理的な方法を示している。

このため、免疫反応が望まれない自己抗原または抗原（たとえば、アレルギー性疾患または移植片拒絶において）を示す細胞のアポトーシスを引き起こすことが可能であり、アポトーシス小体を生成し、抗原特異的なＴｒｅｇが拡大される方法を設計することが望ましい。当該技術分野において知られる非特異性の免疫抑制療法では、通常、生活の質に有害な影響を与える重度の感染症および他の深刻な結果に至りやすくなる。このようなことから、抗原特異的なＴｒｅｇを使用して従来の療法による望ましくない結果を得ることなく免疫疾患を治療する方法を開発することが有利である。

抗原特異的な細胞溶解性ＣＤ４＋Ｔ細胞（ｃＣＤ４+Ｔ細胞）を誘発することができる一般的な方法が、国際特許出願公開第２００８／０１７５１７号に記載されている。このような細胞は、ペプチドＭＨＣクラスＩＩ複合体の同族認識後に抗原提示細胞のアポトーシスを引き起こす。先行技術よりも有利であって異なる点として、本発明は、移植片によって放出された同種抗原に由来する、または自己抗原もしくはアレルゲンに由来するクラスＩＩ制限エピトープを担持する抗原提示細胞のアポトーシスを誘発することによって抗原特異的なＦｏｘｐ３Ｔｒｅｇの拡大を図る。

発明の概要
本発明は、抗原特異的なＦоｘｐ３＋調節性Ｔ細胞を誘発する方法を開示する。

これらの方法は、
（ａ）抗原特異的な細胞溶解性ＣＤ４＋Ｔ細胞を取得するステップと、
（ｂ）抗原提示細胞を細胞溶解性ＣＤ４＋Ｔ細胞に対して露出することによって抗原提示細胞のアポトーシスを誘発するステップと、
（ｃ）抗原提示細胞のアポトーシスからアポトーシス細胞およびアポトーシス小体を取得するステップと、
（ｄ）アポトーシス細胞またはアポトーシス小体とアポトーシス細胞またはアポトーシス小体からの抗原を提示することが可能な細胞を培養するステップと含む、一般的なステップを備える。

ｃＣＤ４＋Ｔ（細胞溶解性ＣＤ４+細胞）細胞は、動物の能動免疫によって取得することができ、表面特異的な抗体でコーティングされる磁性ビードを用いた親和性精製によって準備することができる。典型的には、ＣＤ８＋、ＣＤ１９＋、ＣＤ１２７＋細胞が除去される。

代替的に、ｃＣＤ４＋Ｔ細胞が生体外で取得され、その方法は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を動物から分離するステップと、本明細書または国際特許出願公開第２００８／１０７５１７号に記載されるように、培養において隣接残基内のチオレダクターゼモチーフを含むクラスＩＩ制限エピトープに対して露出するステップとを備える。代替的に、ｃＣＤ４＋Ｔ細胞は生体外で取得することができ、その方法は、分極ＣＤ４＋Ｔ細胞を動物から分離するステップと、本明細書または国際特許出願公開第２００８／１０７５１７号に記載されるように、培養において隣接残基内のチオレダクターゼモチーフを含むクラスＩＩ制限エピトープに対して露出するステップとを備える。

ｃＣＤ４＋Ｔ細胞は、抗原提示細胞のアポトーシスを誘発するために生体内で使用することができ、その方法は、免疫反応を能動的に生じさせる動物におけるｃＣＤ４＋細胞をｃＣＤ４＋Ｔ細胞によって認識される抗原へ転移させるステップを備える。

本発明の方法の実施形態において、ｃＣＤ４＋Ｔ細胞は、ｃＣＤ４＋Ｔ細胞によって認識されたエピトープを提示する抗原提示細胞とともに培養において生体外で使用され、アポトーシス小体が生成または取得される。

本発明の他の実施形態において、生体外での培養において取得されたアポトーシス小体は、未成熟な抗原提示細胞を積載するために使用され、未成熟な抗原提示細胞は、ナイーブ動物から取得されたＣＤ４＋Ｔ細胞の個体群を使用した刺激のサイクルによって抗原特異的なＴｒｅｇを生成または取得するために使用される。

本発明の他の局面において、生体外での培養において取得されたアポトーシス小体が積載された未成熟な抗原提示細胞は、治療を必要とする動物への受動伝達に使用される。

本発明の他の局面において、アポトーシス小体が積載された未成熟な抗原提示細胞は、治療を必要とする動物への受動伝達のためにＴｒｅｇを生成または取得するために生体外で使用される。

本発明の特定の局面において、本明細書に記載の方法によって取得（および／または分離）されたＴｒｅｇは、予防または治療を必要とする対象の疾患の予防または治療のために使用される。疾患は、自己免疫疾患、アレルギー疾患、または移植片拒絶であり得る。

本発明の局面は、アポトーシス細胞またはアポトーシス小体が積載された細胞を生体外で取得する方法に関する。これらの方法は、
ａ）抗原特異的な細胞溶解性ＣＤ４＋Ｔ細胞を抗原に付与するステップと、
ｂ）抗原を提示する抗原提示細胞を付与するステップと、
ｃ）細胞溶解性ＣＤ４＋Ｔ細胞に対して抗原提示細胞を露出させ、抗原提示細胞のアポトーシスを誘発するステップと、
ｄ）ステップｃ）においてアポトーシスを経た抗原提示細胞からアポトーシス細胞またはアポトーシス小体を分離するステップと、
ｅ）アポトーシス細胞またはアポトーシス小体とアポトーシス細胞またはアポトーシス小体からの抗原を提示することが可能な細胞を培養し、アポトーシス細胞またはアポトーシス小体が積載された細胞を取得するステップとを備える。

加えて、これらの方法は、ｆ）ステップｅ）の積載細胞をＣＤ４＋細胞のさらなる供給源と接触させることによって抗原特異的な調節性Ｔ細胞を取得し、抗原特異的な調節性Ｔ細胞の個体群を取得するステップをさらに備え得る。これらの細胞は、抗原特異的な細胞溶解性ＣＤ４＋細胞を生成するために使用された抗原に対して特異的である。

このような抗原特異的な調節性Ｔ細胞は、典型的にはＦоｘｐ３の高いＣＤ４＋Ｔ細胞である。

特定の実施形態によれば、ＣＤ４＋細胞の供給源は、ナイーブＣＤ４＋細胞、分極ＣＤ４＋Ｔ細胞、および天然Ｔｒｅｇから構成されるグループから選択される。

特定の実施形態によれば、アポトーシス細胞またはアポトーシス小体からの抗原を提示することが可能な細胞は、樹状細胞、マクロファージ、Ｂリンパ球、およびＭＨＣクラスＩＩ決定因子を発現させることが可能な細胞から構成されるグループから選択される。

ステップｄ）において分離されたアポトーシス細胞またはアポトーシス小体は、親和性精製、遠心分離、ゲルろ過、磁性ビード選別、または蛍光活性化選別によって分離され得る。

アポトーシス細胞またはアポトーシス小体からの抗原を提示することが可能な細胞は、末梢血液単球または骨髄由来の前駆体の変態によって取得される未成熟な抗原提示細胞であり得る。

記載される方法の実施形態において使用される抗原は、自己免疫抗原、アレルゲン、または移植片拒絶に関わる抗原であり得る。

本発明の方法の実施形態において、抗原特異的な細胞溶解性ＣＤ４＋Ｔ細胞は、末梢血液細胞を、抗原のＭＨＣクラスＩＩ制限エピトープと［ＣＳＴ］−Ｘ（２）−ＣまたはＣ−Ｘ（２）−［ＣＳＴ］モチーフを有する配列とを含むペプチドと接触させることによって取得される
本発明の方法の実施形態において、抗原特異的な細胞溶解性ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、分極ＣＤ４＋Ｔ細胞、または天然Ｔｒｅｇから取得される。

これらの方法のさらなる実施形態において、ステップｅ）において取得されたアポトーシス細胞またはアポトーシス小体が積載された細胞を分離するさらなるステップが行われる。

本発明の方法の他の実施形態は、記載された方法によって取得された抗原特異的な調節性Ｔ細胞を分離するステップを備える。

定の実施形態において、抗原特異的な調節性Ｔ細胞は、典型的に高度に発現される表面マーカーＣＤ２５および／もしくはＣＴＬＡ−４の発現、サイトカインＴＧＦベータおよび／もしくはＩＬ−１０の産出、またはＦｏｘｐ３の発現に基づき、異なるサブセットに分離される。

発明の他の局面は、上記の方法によって取得された抗原特異的なＴｒｅｇの個体群に関する。

発明の他の局面は、薬物として使用される、上記の方法によって取得されたアポトーシス細胞またはアポトーシス小体が積載される細胞の個体群に関する。

発明の他の局面は、薬物として使用される、上記の方法によって取得された抗原特異的な調節性Ｔ細胞の個体群に関する。

他の局面は、上記の方法によって取得されたアポトーシス細胞またはアポトーシス小体が積載される細胞の個体群と医薬的に許容されるキャリアとを備える医薬品組成物に関する。

他の局面は、上記の方法によって取得された抗原特異的な調節性Ｔ細胞と医薬的に許容されるキャリアとを備える医薬品組成物に関する。

本発明の他の局面は、哺乳類対象において、自己免疫疾患、アレルギー性疾患、移植片拒絶、および慣性炎症性疾患から構成されるグループから選択される疾患を治療または防止する方法に関し、哺乳類対象に対し、請求項１４に係る抗原特異的な調節性Ｔ細胞の個体群を投与するステップを備える。典型的に、哺乳類対象は人間である。

本発明の他の局面は、哺乳類対象において、自己免疫疾患、アレルギー性疾患、移植片拒絶、および慢性炎症性疾患から構成されるグループから選択される疾患を治療または防止する方法に関し、哺乳類対象に対し、アポトーシス細胞またはアポトーシス小体が積載された細胞の個体群を投与するステップを備える。典型的に、哺乳類対象は人間である。

上記の細胞を用いて治療され得る疾患は、自己免疫疾患、アレルギー性疾患、移植片拒絶、および慢性炎症性疾患を含む。

自己免疫疾患は、全身性または臓器特異的な自己免疫疾患であり得る。
自己免疫疾患は、チログロブリン、サイロイドペルオキシダーゼ、ＴＳＨ受容体、インシュリン（プロインシュリン）、グルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）、チロシンホスファターゼＩＡ−２、ミエリンオリゴデンドロサイト蛋白質、および熱ショック蛋白質ＨＳＰ６５などの抗原に対して向けられ得る。

アレルゲンに対するアレルギー性疾患は、空中アレルゲン、食物アレルゲン、接触アレルゲン、または全身性アレルゲンに対するアレルギーであり得る。

移植片拒絶は、細胞起源または組織起源の移植片拒絶であり得る。
本発明の他の局面は、抗原特異的な調節性Ｔ細胞の作用機序を評価するための、上記の方法によって取得された抗原特異的な調節性Ｔ細胞の使用に関する。

雌の受容者に対する雄の皮膚移植片のＦоｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の蓄積を示す図である。移植片において、ＣＤ３＋リンパ球個体群の約１２．５％はＦоｘｐ３＋細胞によって示され、これに比して正常な皮膚（ｎ＝グループごとに３匹のマウス）では１％である。

定義
本明細書で使用される「ペプチド」の用語は、ペプチド結合によって結合された２個から２００個のアミノ酸のアミノ酸配列を含む分子を言うが、非アミノ酸構造（たとえば、結合有機化合物）も含み得る。本発明の方法において使用されるペプチドは、従来の２０個のアミノ酸またはその改質形態のいずれかを含み得る、または化学的なペプチド合成または化学変異もしくは酵素変異によって組み込まれる非天然アミノ酸を含み得る。

本明細書で使用される「抗原」の用語は、典型的には蛋白質（多糖類の有無に関わらない）である、または１つ以上のハプテンとＴ細胞エピトープとを含む蛋白質組成物からなる、巨大分子の構造を言う。

本明細書で使用される「抗原性蛋白質」の用語は、１つ以上のＴ細胞エピトープを含む蛋白質を言う。本明細書で使用される自己抗原または自己抗原性蛋白質は、身体に存在する人間または動物の蛋白質であって、人間または動物の身体内において免疫反応を誘発するものを言う。

「食物または医薬の抗原性蛋白質」の用語は、ワクチンなど、食物または医薬の生産物に自然に存在する抗原性蛋白質を言う。

「エピトープ」の用語は、抗体もしくはその一部（Ｆａｂ′、Ｆａｂ２′など）またはＢもしくはＴ細胞リンパ球の細胞表面にある受容体によって特異的に認識および結合され、この結合によって免疫反応を引き起こすことができる、抗原性蛋白質の１つまたは複数の部分（構造エピトープを規定し得る）を言う。

本発明に関連する「Ｔ細胞エピトープ」の用語は、優性、準優性、または少数のＴ細胞エピトープ、すなわち、Ｔリンパ球の細胞表面において特異的に認識されるとともに受容体によって結合される抗原性蛋白質の一部を言う。エピトープが優性、準優性、または少数であるかどうかは、エピトープに対して誘発される免疫反応に応じたものとなる。優性は、蛋白質のすべてのＴ細胞エピトープのうち、このようなエピトープがＴ細胞によって認識されて活性化することができる頻度に応じたものとなる。特定の実施形態において、Ｔ細胞エピトープは、ＭＨＣＩＩ分子の溝に嵌まる８個または９個のアミノ酸の配列（クラスＩＩハプロタイプに応じる）からなるＭＨＣクラスＩＩ分子によって認識されるエピトープである。Ｔ細胞エピトープを示すペプチド配列内において、エピトープ中のアミノ酸は、Ｐ１からＰ９の番号が付けられ、エピトープのアミノ酸Ｎ末端にはＰ−１、Ｐ−２という番号が付けられ、エピトープのアミノ酸Ｃ末端にはＰ＋１、Ｐ＋２という番号が付けられる。

「同種抗原」の用語は、同じ種の２つの個体間において蛋白質多型によって生成された抗原を言う。

「同種異系反応性」の用語は、移植片の受容者とドナーとの間の対立形質の差に向けられる免疫反応を言う。同種異系反応性は、抗体およびＴ細胞に適用される。本発明に関連し、これは、ペプチドＭＨＣ複合体としてのＭＨＣ決定因子との関係において提示される同種抗原のＴ細胞認識に基づく、Ｔ細胞同種異系反応性に関連する。

「主要組織適合抗原」は、２つの概略的なクラスに分けられる、人間のＨＬＡ系（マウスにおけるＨ２）に属する分子を言う。ＭＨＣクラスＩ分子は、細胞表面のベータ２ミクログロブリンと関連付けられる、３つの領域（アルファ１、２、および３）を含む単一の多型性の鎖からなる。クラスＩ分子は、人間においてＡ、Ｂ、およびＣと呼ばれる３つの座にコードされる。このような分子は、ペプチドをＣＤ８＋サブセットのＴリンパ球に提示する。クラスＩＩ分子は、各々が２つの鎖を含む２つの多型性の鎖（アルファ１および２、ならびにベータ１および２）からなる。これらのクラスＩＩ分子は、人間においてＤＰ、ＤＱ、およびＤＲの３つの座によってコードされる。

「非主要組織適合抗原」の用語は、正常な細胞蛋白質に由来し、クラスＩおよび／またはクラスＩＩの複合体に属するＭＨＣによって提示されるペプチドを言う。細胞表面におけるこのようなペプチドの表示に定性的または定量的に影響を与える遺伝的多型は、非主要組織適合抗原のもととなり得る。

本明細書においてエピトープを参照して使用される「同族体」の用語は、自然発生のエピトープに対して少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％のアミノ酸配列の同一性を有し、エピトープをＢおよび／もしくはＴ細胞の抗体もしくは細胞表面の受容体に結合する能力を維持する分子を言う。エピトープの特定の同族体は、最大で３つのアミノ酸、より特定的には最大で２つのアミノ酸、最も特定的には１つのアミノ酸において改質された天然エピトープに対応する。

本明細書においてペプチドを参照して使用される「誘導体」は、少なくともペプチド活性部分（すなわち、細胞溶解性ＣＤ４＋Ｔ細胞の活動を誘発することができる）を含み、これに加え、ペプチドを安定させる、またはペプチドの薬物動態学的または薬力学的な特性を変化させるなどの異なる目的を有し得る補完部分を含む分子を言う。

「低減作用を有する有機化合物」の用語は、本発明に関連し、蛋白質のジスルフィド結合に対する低減作用を有する化合物、より特定的にはアミノ酸配列を言う。

「免疫異常」または「免疫疾患」の用語は、免疫系の反応が生物における機能不全または非生理的な状況の原因となる、またはこれを維持する疾患を言う。免疫異常には、とりわけ、アレルギー疾患および自己免疫疾患が含まれる。

本明細書において使用される「アレルギー性疾患」または「アレルギー異常」は、アレルゲンと呼ばれる特定の物質（花粉、刺傷、薬物、または食物）に対する免疫系の過敏反応によって特徴付けられる疾患を言う。アレルギーは、アトピー性の個々の患者が敏感なアレルゲンに遭遇した場合に観察される兆候および症状の全体を言い、これが気管支喘息などの呼吸器系の疾患および症状など、各種疾患に発展し得る。様々なタイプの分類が存在し、主にアレルギー疾患は、哺乳類の身体のどこで発生するかに応じて異なる名前を持つ。「過敏症」は、固体が敏感となっている抗原に対して露出した場合にもたらされる望ましくない（損傷を受ける、不快感を伴う、および場合によっては致命的である）反応である。「即時過敏症」は、ＩｇＥ抗体の産出に応じたものであり、アレルギーに等しい。

「自己免疫疾患」または「自己免疫異常」は、生物が自身の構成部分を（サブ分子レベルで）「自己」として認識できないことにより、自身の細胞および組織に対して生物が異常な免疫反応を起こすことによって引き起こされる疾患を言う。疾患のグループは２つのカテゴリに分けることができ、臓器特異的な疾患（アジソン病、溶血性もしくは悪性の貧血、グッドパスチャー症候群、グレーヴス病、特発性血小板減少性紫斑病、インスリン依存性糖尿病、若年型糖尿病、ブドウ膜炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、天疱瘡、アトピー性皮膚炎、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫性肺炎、自己免疫性心臓炎、重症筋無力症、糸球体腎炎、および自発性不妊症など）と、全身性疾患（紅斑性狼瘡、乾癬、脈管炎、多発性筋炎、強皮症、多発性硬化症、強直性脊椎炎、慢性関節リウマチ、およびシェーグレン症候群など）とがある。したがって、自己免疫疾患は、自己の細胞または組織に対して向けられたものであり、特定の哺乳類の生物の自己の構成部分である抗原（たとえば、蛋白質）を意味する「自己抗原」に対する反応を含む。この構造において、自己抗原は、この抗原に対して免疫反応を備えさせるＢおよび／もしくはＴ細胞によって認識される。

このため、「自己免疫疾患」または「自己免疫異常」の用語に含まれる非限定的な疾患の一覧には、急性散在性脳脊髄膜炎（ＡＤＥＭ）、アディソン病、円形脱毛症、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）、自己免疫溶血性貧血、自己免疫性肝炎、水疱性類天疱瘡、ベーチェット病、小児脂肪便症、炎症性腸感染（ＩＢＤ）（クローン病および潰瘍性大腸炎など）、皮膚筋炎、１型糖尿病、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギランバレー症候群（ＧＢＳ）、橋本病、特発性血小板減少性紫斑病、紅斑性狼瘡、混合結合組織病、多発性硬化症（ＭＳ）、重症筋無力症、ナルコレプシー、尋常性天疱瘡、悪性貧血、乾癬、乾癬性関節炎、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、シェーグレン症候群、側頭動脈炎、脈管炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、およびアトピー性皮膚炎が含まれる。

「アレルゲン」は、罹患しやすい、特に遺伝子的に罹患しやすい個々の（アトピー性）患者においてＩｇＥの産出を誘発する、通常は巨大分子または蛋白質組成物である物質として定義される。同様の定義が、Liebersら（１９９６）によるClin.Exp. Allergy 26, 494-516において示されている。

「炎症性疾患」または「炎症性異常」は、典型的な炎症の特徴が観察される疾患を言う。このため、この用語は炎症の外観がある他の疾患と重複し得る。当該技術分野においては、「急性炎症」および「慢性炎症疾患」の間で区別がされ得る。「炎症性疾患」または「炎症性異常」の用語は、慢性関節リウマチ、結膜炎、リウマチ性脊椎炎、変形性関節症、痛風性関節炎、気管支炎、結核、慢性胆嚢炎、炎症性腸感染、急性膵炎、敗血症、喘息、慢性閉塞性肺疾患、乾癬やアトピー性皮膚炎などの皮膚炎症性疾患、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、急性呼吸不全症候群（ＡＲＤＳ）、癌関連炎症、腫瘍関連血管新生の減少、糖尿病、移植片対宿主病および関連する組織の拒絶炎症反応の処置、クローン病、遅延型過敏症、ならびにアルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症などの中枢神経系疾患の免疫介在性および炎症性要素のグループから選択される疾患を含むが、これらに限定されない。

「治療上有効量」の用語は、患者に対する望ましい治療効果または予防効果をもたらす細胞の数を言う。たとえば、疾患または異常を参照すると、疾患または異常の１つ以上の症状にある程度減少される細胞の数であり、より特定的には、部分的または完全に正常に戻る、疾患または異常に関連する、またはその原因となる生理的または生化学的なパラメーターである。本発明の１つの特定の実施形態によれば、治療上有効数は、正常な生理的状態の向上または回復につながる細胞の数である。たとえば、免疫不全に冒された哺乳類を治療するために使用される場合、哺乳類の体重のｋｇあたりの細胞の日毎の数である。

「天然」の用語は、本明細書でペプチドまたは配列を参照する場合、自然発生する配列と同じ配列であるという事実に関する。これは、個体群の大多数に見られる個体群において多型性および突然変異が起こりにくい野生型配列を含む。これとは対照的に、「人工」の用語は、自然発生しない配列またはペプチドを言う。自然発生した配列内の１つ以上のアミノ酸を変更するなどの限定的な変異、または自然発生した配列にアミノ酸のＮ末端またはＣ末端を加えることにより、人工配列は自然配列から任意で取得される。アミノ酸は、本明細書では、フルネーム、３文字の省略形、または１文字の省略形を用いて記載される。

「Ｆоｘｐ３」（フォークヘッドボックスＰ３）は、転写因子のフォークウィングドへリックスファミリーの１つであり、自然発生したＣＤ４陽性／ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の成長および機能において重要な役割を果たす。

「Ｔｒｅｇ」（調節性Ｔ細胞）Ｔｒｅｇは、不適切な免疫反応に対する能動的な抑制に関与する。これらの細胞は、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、Ｆоｘｐ３＋細胞である。

「ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞」はＣＤ６２Ｌを発現し、ＣＤ４４の低い発現もしくは中間的な発現、および好ましい経路のない低いサイトカイン産出を有する。

「分極ＣＤ４＋細胞」は、高いＣＤ４４の発現およびサイトカインの限られたセットの産出を有する。

「ｃＣＤ４＋Ｔ細胞」細胞溶解性ＣＤ４＋Ｔ細胞は、国際特許出願公開第２００９／１０１２０７において詳細に特徴づけられ、以下の１つ以上の特性によって特徴づけられる。

−転写抑制因子Ｆоｘｐ３を検知不能に発現する。
−天然ＣＤ４＋調節性Ｔ細胞と比して、セリン・トレオニンキナーゼＡＫＴの活動を増加させる。

−天然ＣＤ４＋調節性Ｔ細胞と比して、ＴＧＦ−ベータを検知不能に産出し、ＩＬ−１０を検知不能または非常に低い度合いで産出する。

−天然ＣＤ４＋調節性Ｔ細胞と比して、高い濃度のＩＦＮ−ガンマを有する。
−抗原性刺激の後、転写活性化剤Ｔ−ｂｅｔおよびＧＡＴＡ３を同時発現する。

−ＮＫＧ２Ｄを発現する。
−高濃度の可溶性Ｆａｓリガンド（Ｆａｓｌ）を産出する。

発明の記載
本発明の全般的な原理は、特異的な抗原を積載した抗原提示細胞から取得したアポトーシス小体を使用し、抗原特異的なＦоｘｐ３+Ｔｒｅｇの産出を誘発することに関する。具体的には、本発明の目的は、ＭＨＣクラスＩＩ決定因子に関連し、免疫反応が望まれない自己抗原または抗原（たとえば、アレルゲン、治療目的で使用される移植片からの同種抗原または同種因子（allofactor））を提示する抗原提示細胞から取得された選択的アポトーシスによる方法を提供することにある。このため、以下でより詳細に説明するように、本発明は、抗原特異的なＴｒｅｇを生成、取得、または分離し、所与の抗原に特異的な免疫反応を切ることができる方法を提供する。

アポトーシスが誘導された細胞は、ホスファチジルセリン、多糖類、および糖脂質の酸化を含む複数の表面改質を経て、食細胞により認識可能となる。加えて、アポトーシス細胞は、トロンボスポンジン−１などの新たな蛋白質を発現する、および／またはホスファチジルセリン、ＤＮＡ、およびヌクレオソームなどの細胞間構成要素をそれらの表面に配置する。これらの表面変質は合わせて、トール様受容体、ＮＯＤ、またはＲＩＧなどの生来の受容体による連結のない状態で、生来の免疫反応を引き起こすことなくアポトーシス細胞を食細胞が食い込むことを可能とする。

アポトーシス細胞を取り除く食細胞は、ＣＤ１４、スカベンジャー受容体、およびＣ型レクチン受容体などの認識受容体を備えている（RavichandranおよびLorenzら（２００７）によるNature Rev. Immunol. 7, 964-974)。スカベンジャー受容体は、酸化またはアセチル化した低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）およびポリアニオン性リガンドとアポトーシス細胞とを結合することができる表面糖蛋白質である。スカベンジャー受容体の例としては、ＣＤ３６、ＬＯＸ−１、およびＣＬＡ−１が含まれる。認識の後には急速なインターナリゼーションが行われ、アポトーシス細胞の場合、破壊ならびにエンドソームおよびリソソームとの融合が行われる。特に興味深いのは、食細胞上に発現するＣＤ３６との可溶性の間橋として作用する、アポトーシス細胞によるトロンボスポンジン−１の産出である。トロンボスポンジン−１の発現はカスパーゼに依存する。

可溶性の因子は、アポトーシス細胞を除去する役割も果たす。例としては、コレクチンならびにマンノース結合レクチンおよびＣ１ｑなどのコレクチン状分子が含まれる。両方とも、食細胞の表面に発現するカルレティキュリンと相互作用する。血清アミロイドＰ（ＳＡＰ）、Ｃ反応性蛋白質（ＣＲＰ）、および原型ペントラキシン（ＰＴＸ）を含むペントラキシンのファミリーもアポトーシス細胞に結合する。

合わせて、自然なプログラム細胞死またはアポトーシスを起こしている細胞を処置するために生理的条件下で使用される多数の因子が存在する（Jeanninら（２００８）によるCurr. Opinion in Immunol. 20, 530-537）。哺乳類においては、正常な細胞数および活動を維持するために持続的な細胞の更新が行われる（Steinmanら（２０００）によるJ. Exp. Med. 191, 411-416）。炎症性の症状のない状態において、アポトーシス小体は、器官内において抗原提示細胞によって取り上げられる。抗原提示細胞は、局所リンパ節に向けて移動し、局所リンパ節では、直接的または移動する抗原提示細胞の早期溶菌の結果として起こるリンパ節樹状細胞とのアポトーシス小体の交換が行われる。局所リンパ節に移動する樹状細胞の少なくとも一部は未成熟であり食細胞アポトーシス細胞に対する高い許容量を示す。リンパ節において、樹状細胞はまず未成熟な状態であるが、クラスＩおよびクラスＩＩの決定因子の両方に抗原を提示する能力を示すサブセットに属すると考えられる。非炎症性の症状に関連する共刺激シグナルのない状態においては、ＭＨＣクラスＩＩの提示により、Ｔｒｅｇに必要な漸増シグナルおよび活性化シグナルが提供される。このようなＴｒｅｇは抗原特異的（自己抗原に向けられる）であり、このような自己抗原に対する応答の活性化を抑制する。したがって、非炎症性の状態において起こるアポトーシスは、自己抗原に対する耐性を維持する抗原特異的なＴｒｅｇを誘発する。

逆に、自己免疫疾患または同種抗原もしくはアレルゲンに対する反応、または伝染因子に対して生じる免疫反応時において起こる炎症性の症状においては、アポトーシス小体の産出が増大し、アポトーシス小体が局所リンパ節に運ばれる。アポトーシス小体を積載した細胞のこのような膨大な流入は、Ｔｒｅｇを漸増および活性化させるために提示するこのようなアポトーシス小体を捕捉するリンパ節樹状細胞の許容量を超える。加えて、炎症誘発性のサイトカインが存在することにより、成熟するように誘導されるリンパ節樹状細胞の表現型が変化し、結果として、エフェクターＴ細胞の活性化が増大し、Ｔｒｅｇが損失する。自己免疫疾患、アレルギー反応、および移植片拒絶に関連する伝染因子への反応時においては望ましい効果であるが、残念ながらさらなる組織の破壊および炎症につながることとなる。このため、非炎症性の状態においてアポトーシス小体を生成または取得して抗原特異的なＴｒｅｇを生成、取得、または分離する能力を高める新たな方法を考案すると有利である。

隣接残基内にチオレダクターゼモチーフを担持するＭＨＣクラスＩＩ制限エピトープを用いたｃＣＤ４＋Ｔ細胞の誘発についての研究（未公開）の際に、ｃＣＤ４＋を誘導すると標的期間においてＦоｘｐ３＋Ｔｒｅｇが蓄積することが偶然に発見された。したがって、皮膚移植片拒絶のモデルにおいて、長期にわたる同種異系の移植片の残存に移植片自体におけるＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇの存在が伴った。多発性硬化症の実験モデルにおいても同じ観察がなされ、疾患の予防または抑制には中枢神経系（ＣＮＳ）白質中にＦоｘｐ３＋Ｔｒｅｇの蓄積が伴った。

このため、本発明の方法も、特定の実施形態において、国際特許出願公開第２００８／０１７５１７号（引用によりここに援用される）に記載されるように隣接残基内にチオレダクターゼモチーフを担持するＭＨＣクラスＩＩ制限エピトープの使用を含む。

概して、本発明の実施形態において使用されるペプチドは、免疫反応を引き起こす可能性を有する抗原（自己または非自己）の少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含むペプチドであって、少なくとも一方の［ＣＳＴ］がシステインであるチオレダクターゼ配列モチーフ［ＣＳＴ］−Ｘ（２）−［ＣＳＴ］などの低減作用を有する有機化合物に結合される。したがって、モチーフは［Ｃ］−Ｘ（２）−［ＣＳＴ］または［ＣＳＴ］−Ｘ（２）−［Ｃ］である。特定の実施形態において、ペプチドは配列モチーフ［Ｃ］−Ｘ（２）−［ＣＳ］または［ＣＳ］−Ｘ（２）−［Ｃ］を含む。さらに特定の実施形態において、ペプチドは、配列モチーフＣ−Ｘ（２）−Ｓ、Ｓ−Ｘ（２）−Ｃ、またはＣ−Ｘ（２）−Ｃを含む。Ｔ細胞エピトープおよび有機化合物は、任意でリンカー配列によって分離される。

これらのペプチドは、非天然アミノ酸の組み込みを可能とする化学合成によって作ることができる。このため、化合物を低減するモチーフにおいて、Ｃは、システイン、またはメルカプトバリン、ホモシステイン、もしくはチオール機能を有する他の天然もしくは非天然アミノ酸など、チオール基を有する他のアミノ酸を示す。低減作用を得るために、モチーフに存在するシステインは、シスチンジスルフィド架橋の一部または酸化システインとして発生すべきではない。それにもかかわらず、モチーフは、生体内において自由チオール基を伴うシステイン変換されるメチル化システインなどの改質システインを含み得る。

低減化合物の［ＣＳＴ］−Ｘ（２）−［ＣＳＴ］モチーフにおけるアミノ酸Ｘは、Ｓ、Ｃ、もしくはＴを含む任意の天然アミノ酸であり得る、または非天然アミノ酸であり得る。特に、ＸはＧｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒなどの小さな側鎖を有するアミノ酸である。Ｔｙｒなどの大きな側鎖を有するアミノ酸は代替とはならない。より特定的には、［ＣＳＴ］−Ｘ（２）−［ＣＳＴ］モチーフにおける少なくとも１つのＸはＨｉｓまたはＰｒｏである。

低減化合物としての上記のモチーフを含むペプチドにおいて、モチーフは、エピトープがＭＨＣ溝に嵌まった時にモチーフがＭＨＣ結合溝の外に残るように置かれる。モチーフは、ペプチド内のエピトープ配列の真隣に置かれる、またはリンカーによってＴ細胞エピトープから分離される。より特定的には、リンカーは、７つ以下のアミノ酸のアミノ酸配列を含む。最も特定的には、リンカーは、１個、２個、３個、または４個のアミノ酸を含む。代替的に、リンカーは、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個のアミノ酸を含む。モチーフ配列がエピトープ配列に隣接するこれらのペプチドにおいて、これは、エピトープ配列と比して位置Ｐ−４からＰ−１、またはＰ＋１からＰ＋４として示される。低減モチーフに加え、このようなペプチドは、（先行技術に記載のように）用途に応じ、典型的にはアレルゲンまたは自己抗原である抗原由来のＴ細胞エピトープを含む。蛋白質配列におけるこのようなＴ細胞エピトープは、機能分析および／または１つ以上のインシリコ予測分析によって識別され得る。

適したアルゴリズムは、たとえば、Zhangら（２００５）によるNucleic Acids Res 33, W180-W183 （PREDBALB）、SalomonおよびFlower（２００６）によるBMC Bioinformatics 7、501 （MHCBN）、Schulerら（２００７）によるMethods Mol. Biol. 409, 75-93 （SYFPEITHI）、DonnesおよびKohlbacher（２００６）によるNucleic Acids Res. 34, W194-W197（SVMHC）、KolaskarおよびTongaonkar（１９９０）によるFEBS Lett. 276, 172-174、およびGuanら（２００３）によるAppl Bioinformatics 2, 63-66 （MHCPred）に記載されている。

Ｔ細胞エピトープ配列におけるアミノ酸は、ＭＨＣ蛋白質の結合溝における位置に応じて番号が付けられている。典型的には、ペプチド内に存在するＴ細胞エピトープは、８個から２５個のアミノ酸からなり、より特定的には８個から１６個のアミノ酸からなり、最も特定的には８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、または１６個のアミノ酸から構成される。

より特定的には、Ｔ細胞エピトープは、９個または８個のアミノ酸の配列から構成される。

より特定的には、Ｔ細胞エピトープは、ＭＨＣクラスＩＩ分子によってＴ細胞に提示されるエピトープである。特にＴ細胞エピトープ配列は、ＭＨＣＩＩ蛋白質の裂溝に嵌まるエピトープ配列であり、より特定的にはＭＨＣＩＩ裂溝に嵌まるノナペプチドである。

ペプチドのＴ細胞エピトープは、蛋白質の天然エピトープ配列に対応し得る、またはその変質版に対応し得て、変質Ｔ細胞エピトープは、天然Ｔ細胞エピトープ配列と同様に、ＭＨＣ裂溝内で結合する能力を保持する。変質Ｔ細胞エピトープは、天然エピトープと同じＭＨＣ蛋白質への結合親和性を有し得るが、低い親和性も有し得る。変質ペプチドの結合親和性は、このような場合に元のペプチドの１０分の１以上であり、より特定的には５分の１以上である。

本発明の方法の実施形態において使用するためにＴ細胞エピトープが導出され得る（自己）抗原の例としては、チログロブリン、サイロイドペルオキシダーゼ、ＴＳＨ受容体、インシュリン（プロインシュリン）、グルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）、チロシンホスファターゼＩＡ−２、ミエリン乏突起膠細胞蛋白質、および熱ショック蛋白質ＨＳＰ６５がある。限定することおよび理論に縛られることを意図せず、概略的な作用機序は、以下のステップを含む。

（ａ）アポトーシス小体が積載された未成熟な樹状細胞が、ＭＨＣクラスＩＩ決定因子において提示される決定因子に特異的なＴｒｅｇを誘発する。

（ｂ）これらのＴｒｅｇは、不必要な拒絶反応がある位置へ移動する。
（ｃ）目標位置にこれらのＴｒｅｇが蓄積することにより、Ｔｒｅｇの大きな抗炎症特性の結果として炎症が制御される。

（ｄ）組織の破壊およびアポトーシス細胞の産出が抑制され、目標位置における正常な細胞の代謝回転が再構築され、正常な組織機能が回復する。

本発明は、抗原特異的なＴｒｅｇを取得できる方法の様々な実施形態を提供する。本発明の方法の実施形態において、抗原提示細胞のアポトーシスは、ｃＣＤ４＋Ｔ細胞への露出により生体外で取得され得る。アポトーシス小体は、未成熟な樹状細胞を積載するために使用される。アポトーシス小体が積載された未成熟な樹状細胞は、細胞治療に使用される、または細胞治療に使用する抗原特異的なＴｒｅｇを生成、分離、もしくは取得するために生体外において使用される。本発明に関連する細胞治療は、哺乳類に投与する細胞を準備するステップを含む。

生体外で細胞のアポトーシスを引き起こすための一般的な方法は、当該技術分野において開示されており、既知である。たとえば、ＣＤ４＋Ｔ細胞リンパ球のアポトーシスは、ＣＤ３およびＣＤ２８に対する不溶化抗体が有る状態でこれらを培養することによって得られる。細胞がアポトーシスを起こしているかを判定するために使用される方法は、当該技術分野において十分に開示されている。これらの方法は、アポトーシス細胞の表面に発現したリン脂質に対してアネキシンＶの結合すること、カスパーゼの活性化、および核酸の分解を含む。これらの方法についての検討は、FuchsおよびSteller（２０１１）によるCell 147, 742-758などの刊行物に見ることができる。

本発明においては、先行技術とは異なり、抗原提示細胞において引き起こされるアポトーシスは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）とアポトーシスを引き起こす細胞、すなわちｃＣＤ４＋Ｔ細胞との間のシナプスの形成を必要とする。シナプスの形成により、ｃＣＤ４＋Ｔ細胞の細胞溶解特性が活性化され、対応する抗原由来のクラスＩＩ制限エピトープを提示する細胞のみからなるアポトーシスが誘発される。利点として、これによって厳格な抗原特異性がもたらされる。抗ＣＤ３抗体など、アッセイ系のための追加の試薬がない場合において、本発明の方法に記載された生体外でのアポトーシスの誘発により、生体内で起こる状況に近い状況が再現される。

ＣＤ４＋Ｔ細胞による抗原提示細胞のアポトーシスは、Janssensら（２００８）によるJ. Immunol.171, 4604-4612で報告されている。Ｔｒｅｇは、一部の状況下において、標的細胞アポトーシスを引き起こし得て、パーフォリンの有無に関わらないグランザイムＢのＩＤＯ放出の活性化を含め、複数の誘発の機構が記載されている。これらの機構についての検討は、（Shevach（２０１１）によるAdv. Immunol. 112, 137-176）に見ることができる。本発明の方法において、ｃＣＤ４＋Ｔ細胞は、特有の細胞サブセットを示し、表現型特性および機能特性の両方についてＴｒｅｇとは異なる。このようなｃＣＤ４＋Ｔ細胞を誘発することができる方法は、国際特許出願公開第２００８／０１７５１７号に見ることができる。

アポトーシス小体を認識および分離する方法は、当該技術において既知である。上述のように、アポトーシス細胞またはアポトーシス小体は、それらの表面に新たな複数の構成要素を発現し、加えて、可溶因子によってオプソニン化することができる。これら２つのタイプの変質により、アポトーシス細胞またはアポトーシス小体を分離する方法が提供される。この例は、当該技術分野において見ることができる（Schillerら（２００８）によるCell Death Diff. 15, 183-191）。一例として、アポトーシスのサイクルに入ることによってトロンボスポンジンを発現する細胞または細胞残屑を分離するために抗体がトロンボスポンジンに対して使用される。

本発明の実施形態において、分離されたアポトーシス小体またはアポトーシス細胞は、樹状細胞とともに培養され、ＭＨＣクラスＩＩ決定因子に関連する包み込み、処理、および提示が可能となる。機能、表面表現型、および成熟度の異なる樹状細胞の異なるサブセットが開示された。概して、未成熟な樹状細胞は、アポトーシス細胞およびアポトーシス小体を取り上げるための高い許容量を有するが、ＭＨＣクラスＩＩ決定因子内におけるエピトープの発現の面からは効率的でない。しかしながら、樹状細胞の一部のサブセット、特にリンパ節内に収容されたものは、アポトーシス細胞もしくはアポトーシス小体の摂取および表面でのエピトープの提示の２つの特性を組み合わせる。

しかしながら、本発明に関連し、樹状細胞は、当該技術分野においてよく開示されている方法によって生体外で導出され、未成熟な状態が維持される。先行技術は、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−ガンマ）が有る場合における樹状細胞の誘導体化が高度に成熟した状態を引き起こし、ＩＬ−４が樹状細胞を未成熟な状態に維持することを教示している。樹状細胞は、末梢血液単球または骨髄前駆体のいずれかに由来し得る。上記のように取得されたアポトーシス細胞およびアポトーシス小体は、未成熟な樹状細胞とともに培養され、ＭＨＣクラスＩＩ決定因子による提示が可能となる。

アポトーシス細胞またはアポトーシス小体から処理される抗原を提示することが可能な提示細胞を取得するための手段は樹状細胞が好ましいがこれに限定されないことは、当業者にとって明確である。代替としては、ＭＨＣクラスＩＩ発現において誘発され得るマクロファージ、内皮細胞、または上皮細胞が含まれるが、これらに限定されない。

本発明の他の局面は、アポトーシス細胞またはアポトーシス小体に由来する抗原を積載した樹状細胞の細胞治療における使用に関する。例として、自己抗原を提示する抗原提示細胞上のｃＣＤ４＋Ｔ細胞の細胞溶解作用によって取得されるアポトーシス小体に由来するクラスＩＩ制限エピトープを提示する樹状細胞は、自己抗原への免疫反応が関係する病気に冒された動物に静脈経由で投与される。このような細胞治療は、免疫反応を特異的に制御し、病気を治療する。追加の例は以下に記載するが、本発明の範囲はこのような例に限定されない。

本発明の方法の具体的な実施形態において、アポトーシス細胞またはアポトーシス小体を積載した未成熟な樹状細胞は、Ｔｒｅｇを生成、分離、または取得する培養のためにＣＤ４＋Ｔ細胞の個体群が加えられる培養に維持される。いくつかの可能なＣＤ４＋Ｔ細胞の供給源を使用することができ、この供給源としては、ナイーブ動物から取得され、たとえば特異的な抗体によってコーティングされた磁性ビードを用いた親和性により準備される細胞、Ｔｒｅｇを誘発することが望ましい（自己）抗原に対する免疫反応に関連する病気が進行中の動物の脾臓、リンパ節、組織、もしくは末梢血から取得した分極ＣＤ４＋Ｔ細胞、またはＦоｘｐ３転写抑制因子の高度で安定した発現が示されると定義づけられる天然Ｔｒｅｇが含まれるが、これらに限定されない。

ＣＤ４＋Ｔ細胞のこれら３つの供給源の各々は所与の妥当な状況においては他のものよりも適切であり得ることは当業者にとって明らかである。例として、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞は、末梢血からであっても容易にアクセスすることができ、いずれの抗原をも認識するのに十分な大きさのレパートリーを提供する。病気を防止することが好ましく、とりわけ所与の動物のＭＨＣクラスＩＩハロタイプに従って抗原を選択することができる状況においては、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞は最良の選択肢である。他方、分極ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ペプチドＭＨＣ複合体との親和性の高い細胞を使用することが好ましい状況における本発明の方法の実施のための細胞の供給源を示す。一例としては、１型糖尿病にみられる自己反応性ＣＤ４＋Ｔ細胞が挙げられ、ＣＤ４＋Ｔ細胞によるインシュリン由来のペプチドの認識がペプチドＭＨＣ複合体への不完全な結合によって起こり、Ｔ細胞受容体との親和性が比較的低くなる。

本発明において、一実施形態では、供給源として天然Ｔｒｅｇが使用される。Ｔｒｅｇのレパートリーは、自己抗原の認識に向けて具現化され、上述のように、このような細胞は、抗原提示細胞とのシナプスを機能的に形成する十分な親和性を有する。所与の抗原に向けられた抗原特異的な天然Ｔｒｅｇの数は過度に小さく、ＴｒｅｇはＣＤ４＋Ｔ細胞の総数に対して５％から１０％のみである。本発明は、このような少ない数を体外で増大させる方法を提供する。本発明の方法において胸腺で選択される天然Ｔｒｅｇを使用することのさらなる利点は、報告された表現型の安定性にある。したがって、天然Ｔｒｅｇにおいて、Ｆｏｘｐ３の発現は高度であり、時間が経過しても、様々な活性化条件下においても安定的に維持される。対照的に、末梢内に誘発されてＦｏｘｐ３を発現するＴｒｅｇは不安定となり得て、Ｔｒｅｇ系統への拘束に関するエピゲノム識別特性がないことにより不安定となり得て、たとえば炎症性の条件下など活性化される状況が変化した場合に調節特性を失い得る。

発明の他の局面において、アポトーシス細胞またはアポトーシス小体由来の抗原を提示する未成熟な樹状細胞とともに体外で培養されることにより拡張（天然Ｔｒｅｇ）または減少（ナイーブまたは分極化）したＴｒｅｇが細胞治療に使用される。このような療法は、たとえば移植片拒絶の予防などにおける予防療法、またはたとえば１型糖尿病における抑制療法として実施され得る。

任意で、本発明において記載された方法により取得されるＴｒｅｇは、このようなＴｒｅｇの数をさらに増加させることが望ましい場合には、非特定的な手段を用いてさらに拡大することができる。このような非特定的な方法の例は、当該技術分野において既知である。たとえば、不溶化抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体ならびにＩＬ−２の有る状態で培養された細胞は、桁違いに拡大することができる。

細胞を投与する前にさらなるステップを加えることができる点は、当業者にとって明らかである。１つの可能性としては、Ｔｒｅｇを適応させることが望ましい１つ以上の合成ペプチドを積載したＭＨＣクラスＩＩ決定因子の四量体とともに細胞を培養することによってＴｒｅｇの特異性をさらに制限することが挙げられる。他の可能性としては、表面マーカーまたはＦｏｘｐ３の発現の様々な程度によって細胞を選別することが挙げられる。Ｆｏｘ３の発現が特に高度である細胞の個体群は、天然個体群の全体の一部であり、本発明に関連して特に適切な特徴を提示することが知られている。

発明の他の局面において、本発明の方法によって取得されたＴｒｅｇは、疾患経過に対して所与の抗原もしくはエピトープを関連付けるために使用することができる。多くの疾患においては、疾患に関わる抗原は２つ以上あり、最も重要なものを識別することは依然として難しい。本発明の方法を実施して抗原特異的なＴｒｅｇを産出することにより、疾患経過における特異的な抗原の役割を分離および識別する手段として特異的な抗原を切る方法が提供される。

本発明の方法によって取得された抗原特異的なＴｒｅｇは、Ｔｒｅｇ表現型の機能の重要性を判定する方法を提供する。たとえば、抗原特異的なＴｒｅｇは、グランザイムの発現に応じて選別され、グランザイム＋およびグランザイム（−）の個体群が、体外または体内のいずれかにおいて反応を抑制する能力の面において比較される。

本発明の様々な局面および実施形態は、以下の実施例に示される。しかしながら、このような例に本発明の範囲を限定する意図はない。

実施例
実施例１．生体外におけるアポトーシスの誘発
抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスから準備され、多発性硬化症のモデルとして使用される実験的な自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）に関係する自己抗原のクラスＩＩ制限Ｔ細胞エピトープを含むペプチドが積載される。

したがって、ＭＯＧ蛋白質のアミノ酸残基３７−５２に対応する配列ＶＧＷＹＲＳＰＦＳＲＶＶＨＬＹＲ［配列ＩＤ番号１］のミエリン乏突起膠細胞糖蛋白質（ＭＯＧ）ペプチドが細胞に積載するために使用される。

このペプチドは、優性のＴ細胞エピトープを含む。Ｐ１位置、すなわちＭＨＣクラスＩＩ溝に固定された第１のアミノ酸はＹ４０である（Ｐ１−Ｐ９配列に下線が引かれている）。

細胞溶解性ＣＤ４＋Ｔ細胞（ｃＣＤ４＋Ｔ細胞）は、ペプチドのアミノ末端の３つのアミノ酸が配列ＣＧＰＣに置き換えられて配列ＣＧＰＣＹＲＳＰＦＳＲＶＶＨＬＹＲ［配列ＩＤ番号２］のペプチドとなった５０μｇの配列ＩＤ番号１のペプチドとともに、水酸化アルミニウムを使用して４度にわたって免疫化された動物の脾臓から取得された。

ｃＣＤ４＋Ｔ細胞は、積載されたＡＰＣの有る状態で３７℃で夜通し培養され、細胞が洗浄され、活性化カスパーゼ３に対して抗体を使用してＡＰＣアポトーシスの程度が測定される。

実施例２．アポトーシス小体の分離
実施例１において取得されたアポトーシス細胞の上澄みが回収され、細胞を取り除くために２つの遠心分離ステップ（５００ｘｇ、５分間）にかけられる。そして、上澄みは１．２μＭの親水性注射器フィルタを通して濾過された。１００，０００ｘｇの遠心分離を３０分間行なった後、ペレットに収容されたアポトーシス小体が採取され、細胞実験に使用される。

代替的に、アポトーシス細胞およびアポトーシス小体は、アポトーシスの結果として発現した細胞表面の構成要素に対して抗体を使用することで分離することができる。これらの例としては、抗トロンボスポンジン抗体がある。好ましい準備ステップにおいて、抗トロンボスポンジン抗体が磁性マイクロビードに共有結合で結合される。１時間にわたって２０℃で軽く振って培養した後、磁性ビードが磁石に保持される。そして、アポトーシス小体は、弱酸性のバッファーを用いて溶離することによって戻される。

これらの方法は、先行技術に開示されている。（Schillerら（２００８）によるCell Death Diff. 15, 183-191、Gautierら（１９９９）によるJ. Immunol. Methods 228, 49-58）
実施例３．未成熟な樹状細胞（ｉＤＣ）の生成または取得
骨髄始原細胞は、膝骨の上方および下方から取得される。ＢおよびＴリンパ球は、ＣＤ１９およびＣＤ９０マイクロビードによる磁気消耗によりそれぞれ除去される。ＣＤ１９前駆体、ＣＤ９０前駆体、およびｉＤＣ前駆体を含む陰性画分は、５００Ｕ／ｍｌの組換体ＧＭ−ＣＳＦを含む無血清の媒体内に再懸濁され、組織培養プレート上に添加（３×１０^６個／ｍｌ）され、３７℃に維持される。細胞は、凝集体が壊れるのを避けながら１日おきに６日間にわたって洗浄される。６日目に、ｉＤＣ凝集体が除去され、洗浄され、新しいプレートに加えられる。７日目に、細胞が採取され、分析に使用される。

これらの方法は、先行技術に開示されている。たとえば、Inabaら（２００９）によるCurr.Prot. immunol.1(86), unit 3.7.p 10-12を参照されたい。

実施例４．抗原を積載した未成熟な樹状細胞の生成または取得
ｉＤＣは、アポトーシス小体を包み込む高い容量を示す。このため、実施例３で取得されたｉＤＣは、実施例２で取得されたアポトーシス小体とともに培養される。このために、２×１０^５個のｉＤＣが、３０分間にわたる３７℃の培養により、微笑培養井戸において平板培養される。アポトーシス小体の懸濁が培養に加えられ、１６時間にわたって３７℃でさらに培養される。そして、細胞は洗浄され、媒体内に再懸濁される。

実施例５．細胞治療のための抗原が積載された樹状細胞の使用
アポトーシス小体が積載されたｉＤＣは、病気が誘発される前または病気が誘発された後に動物に静脈経由で注射される（２×１０^５個）。

したがって、Ｃ５７ＢＬ／６のマウスがマイコバクテリウムの抽出を伴う完全フロインドアジュバントにおけるＭＯＧペプチド（配列ＩＤ番号１のペプチドについて実施例１を参照）の投与と２度の百日咳毒素の注射とを含むプロトコルに供される。このプロトコルは、ＭＯＧペプチドの投与後の２週間以内における人間の多発性硬化症と比した兆候の進展を誘発する。

このようなモデルにおいて、実施例４で取得したアポトーシス小体を積載したｉＤＣは、病気を誘発する１日前、または病気の第１の兆候が観測された後、すなわち誘発から２週間後にマウスに対して注射される。

ｉＤＣが注射されていない動物、または積載していないｉＤＣを注射した動物が対照用に使用された。病気の兆候の予防または抑制は、実験群および２つの対照群において評価される。

実施例６．抗原特異的なＴｒｅｇを誘発するための抗原を積載した樹状細胞の使用
アポトーシス小体を積載したｉＤＣにより、Ｔｒｅｇを生体外で生成することが可能となる。

したがって、実施例４に記載のｉＤＣは、培養に維持される。
Ｔ細胞は、抗体を使用した磁性マイクロビード選別によりＣＤ８＋、ＣＤ１９＋、ＣＤ１２７＋細胞を消耗させ、ＣＤ２５＋細胞を積極的に選択することによりナイーブマウスの脾臓から分離される。ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３^ｈｉｇｈ細胞の割合は、細胞を浸透させた後でＦｏｘｐ３特異抗体を使用した蛍光活性化細胞分類（ｆａｃｓ）によりチェックされる。先行技術には、このような細胞を取得する方法が開示されている（Petersら（２００３）によるPlos one 3, 574-584）。８５％より高い細胞純度が取得される。

ＣＤ４＋Ｆоｘｐ３^ｈｉｇｈ細胞が加えられ（井戸ごとに１×１０^６個）、実施例４に記載のｉＤＣが培養される。７日間にわたる３７℃での刺激サイクルの後、ＩＬ−２（２０ＩＵ／ｍｌ）が有る状態で、細胞が洗浄され、新たな一群のアポトーシス小体を積載したｉＤＣを用いて同じプロトコルに従って再び培養される。この第２の刺激サイクルの後、細胞は、ＩＬ−２のある状態で抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体でコーティングされた磁性ビードを用いて培養により任意でさらに拡大することができる。細胞は洗浄され、Ｆｏｘｐ３の発現についてｆａｃｓにより評価される。

実施例７．細胞治療のための抗原特異的なＴｒｅｇの使用
実施例６において準備された細胞は、自己免疫疾患に関連した受動的な投与に使用することができる。

したがって、実施例５に記載されたものと同様のプロトコルが続くが、ｉＤＣの代わりに２×１０^５個のＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３^ｈｉｇｈ細胞のＩＶ投与が含まれる。

ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３^ｈｉｇｈ細胞が注射されていない対照用動物と比較し、病気の兆候が著しく予防および／または抑制されていることが示される。

実施例８．分析を目的とした抗原特異的なＴｒｅｇの識別
ＣＤ４＋Ｆоｘｐ３^ｈｉｇｈ細胞の個体群は、単一の構成要素または構成要素の組み合わせの作用機序に対する重要性を判定するためにさらに分析され得る。

したがって、ＣＤ４＋Ｆоｘｐ３^ｈｉｇｈ細胞は、ＦａｓＬに対する抗体でコーティングされた磁性マイクロビードを使用して分離される。そして、２つの細胞の個体群であるＦａｓＬ＋およびＦａｓＬ（−）は、機能的に試験され、耐性を誘発する能力が比較される。これは、ＣＤ４＋ＣＤ２５（−）表現型によって特徴づけられる多クローン性エフェクターＣＤ４＋リンパ球がナイーブ動物の脾臓から分離されるアッセイ系を使用して行われる。

天然Ｔｒｅｇは、通常はエフェクター細胞に対してバイスタンダー効果を加える能力によって定義される。ここで使用されるアッセイ系は、非特異的な刺激によるＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の活性化、すなわち抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体の組み合わせを伴う。

ＣＤ４＋ＣＤ２５（−）Ｔ細胞を抑制するＦａｓＬ＋ＣＤ４＋Ｆоｘｐ３^ｈｉｇｈ細胞の能力は、ＦａｓＬ（−）ＣＤ４＋Ｆоｘｐ３^ｈｉｇｈ細胞の能力と比較される。

ＦａｓＬを発現する細胞がエフェクター細胞の増殖を抑制する高い能力を示すことが示される。

実施例９．皮膚移植片におけるＦоｘｐ３Ｔｒｅｇの蓄積
国際特許出願公開第２００９／１００５０５号に開示されるように、生後８週間から１０週間のＣ５７ＢＬ／６の雌のマウスが、隣接残基（ｃｃＤｂｙ）内にチオレドキシンモチーフを含むＤｂｙクラスＩＩ制限エピトープを含むペプチド５０μｇを皮膚移植の前に注射することにより免疫化された。

共通遺伝子の雄ドナーの皮膚の全層がの受容側の背中に移植され、拒絶の兆候を経過観察した。すべてのマウスは、移植片に耐えた。組織分析のために移植片の生検が移植から６週間後に採取された。Ｆоｘｐ３+細胞が移植片に蓄積することが示された。

比較として、正常な皮膚におけるＦоｘｐ３＋Ｔ細胞の内容が図１に示される。

Claims (29)

1. アポトーシス細胞またはアポトーシス小体を積載した細胞を生体外で取得する方法であって、
   ａ）抗原特異的な細胞溶解性ＣＤ４＋Ｔ細胞を抗原に付与するステップと、
   ｂ）前記抗原を提示する抗原提示細胞を付与するステップと、
   ｃ）前記抗原提示細胞を前記細胞溶解性ＣＤ４＋Ｔ細胞に露出し、前記抗原提示細胞のアポトーシスを誘発するステップと、
   ｄ）ステップｃ）でアポトーシスを経た抗原提示細胞からアポトーシス細胞またはアポトーシス小体を分離するステップと、
   ｅ）前記アポトーシス細胞または前記アポトーシス小体と前記アポトーシス細胞または前記アポトーシス小体からの抗原を提示することが可能な細胞を培養し、アポトーシス細胞またはアポトーシス小体を積載した細胞を取得するステップとを備える、方法。
2. 抗原特異的な調節性Ｔ細胞を取得するための方法であって、
   ｆ）請求項１のステップｅ）の前記積載細胞をＣＤ４＋細胞のさらなる供給源に接触させ、抗原特異的な調節性Ｔ細胞の個体群を取得するステップをさらに備える、請求項１に記載の方法。
3. 前記抗原特異的な調節性Ｔ細胞は、Ｆоｘｐ３の高いＣＤ４＋Ｔ細胞である、請求項２に記載の方法。
4. ＣＤ４＋細胞の前記供給源は、ナイーブＣＤ４＋細胞、分極ＣＤ４＋Ｔ細胞、および天然Ｔｒｅｇから構成されるグループから選択される、請求項２に記載の方法。
5. 前記アポトーシス細胞または前記アポトーシス小体からの抗原を提示することが可能な前記細胞は、樹状細胞、マクロファージ、Ｂリンパ球、およびＭＨＣクラスＩＩ決定因子を発現することが可能な細胞から構成されるグループから選択される、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
6. アポトーシス細胞またはアポトーシス小体は、親和性精製、遠心分離、ゲルろ過、磁性ビード選別、または蛍光活性化選別によってステップｄ）において分離される、請求項１に記載の方法。
7. 前記アポトーシス細胞または前記アポトーシス小体からの抗原を提示することが可能な前記細胞は、末梢血液単球の変態または骨髄由来の前駆体の変態によって取得される未成熟な抗原提示細胞から構成されるグループから選択される、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記抗原は、自己免疫抗原、アレルゲン、または移植片拒絶に関わる抗原である、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記抗原特異的な細胞溶解性ＣＤ４＋Ｔ細胞は、末梢血液細胞を、前記抗原のＭＨＣクラスＩＩ制限エピトープとモチーフ［ＣＳＴ］−Ｘ（２）−ＣまたはＣ−Ｘ（２）−［ＣＳＴ］を有する配列とを含むペプチドと接触させることによって取得される、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記抗原特異的な細胞溶解性ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、分極ＣＤ４＋Ｔ細胞、または天然Ｔｒｅｇから取得される、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
11. ステップｅ）において取得されたアポトーシス細胞またはアポトーシス小体を積載した前記細胞を分離するステップをさらに備える、請求項１に記載の方法。
12. 前記抗原特異的な調節性Ｔ細胞を分離するステップをさらに備える、請求項２または３に記載の方法。
13. 表面マーカーＣＤ２５および／もしくはＣＴＬＡ−４の発現、サイトカインＴＧＦ−ベータおよび／もしくはＩＬ−１０の産出、またはＦｏｘｐ３の発現に基づき、前記抗原特異的な調節性Ｔ細胞を異なるサブセットに分離するステップをさらに備える、請求項１２に記載の方法。
14. 請求項２から１０のいずれか１項によって取得される抗原特異的なＴｒｅｇの個体群。
15. 請求項１または請求項５から１１のいずれか１項によって取得されるアポトーシス細胞またはアポトーシス小体を積載した細胞の個体群。
16. 薬物として使用される、請求項１４に係る抗原特異的な調節性Ｔ細胞の個体群。
17. 自己免疫疾患、アレルギー性疾患、移植片拒絶、または慢性炎症性疾患の治療または予防に使用される、請求項１４に記載の抗原特異的な調節性Ｔ細胞の個体群。
18. 全身性または臓器特異的な自己免疫疾患の治療または予防に使用される、請求項１４に記載の抗原特異的な調節性Ｔ細胞の個体群。
19. チログロブリン、サイロイドペルオキシダーゼ、ＴＳＨ受容体、インシュリン（プロインシュリン）、グルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）、チロシンホスファターゼＩＡ−２、ミエリン乏突起膠細胞蛋白質、および熱ショック蛋白質ＨＳＰ６５から構成される抗原のグループから選択される抗原に対する自己免疫疾患の治療または予防に使用される、請求項１４に記載の抗原特異的な調節性Ｔ細胞の個体群。
20. 空中アレルゲン、食物 アレルゲン、接触アレルゲン、および全身性アレルゲンから構成される抗原のグループから選択されるアレルゲンに対するアレルギー性疾患の治療および予防に使用される、請求項１４に記載の抗原特異的な調節性Ｔ細胞の個体群。
21. 細胞起源または組織起源の移植片拒絶の治療または予防に使用される、請求項１４に記載の抗原特異的な調節性Ｔ細胞の個体群。
22. 前記抗原特異的な調節性Ｔ細胞の作用機序を評価するための請求項１４の抗原特異的な調節性Ｔ細胞の使用。
23. 自己免疫疾患、アレルギー性疾患、移植片拒絶、または慢性炎症性疾患の治療または予防に使用される、請求項１５に記載のアポトーシス細胞またはアポトーシス小体を積載した細胞の個体群。
24. 全身性または臓器特異的な自己免疫疾患の治療または予防に使用される、請求項１５に記載のアポトーシス細胞またはアポトーシス小体を積載した細胞の個体群。
25. チログロブリン、サイロイドペルオキシダーゼ、ＴＳＨ受容体、インシュリン（プロインシュリン）、グルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）、チロシンホスファターゼＩＡ−２、ミエリン乏突起膠細胞蛋白質、および熱ショック蛋白質ＨＳＰ６５から構成される抗原のグループから選択される抗原に対する自己免疫疾患の治療または予防に使用される、請求項１５に記載のアポトーシス細胞またはアポトーシス小体を積載した細胞の個体群。
26. 空中アレルゲン、食物アレルゲン、接触アレルゲン、および全身性アレルゲンから構成される抗原のグループから選択されるアレルゲンに対するアレルギー性疾患の治療または予防に使用される、請求項１５に記載のアポトーシス細胞またはアポトーシス小体を積載した細胞の個体群。
27. 細胞起源または組織起源の移植片拒絶の治療または予防に使用される、請求項１５に記載のアポトーシス細胞またはアポトーシス小体を積載した細胞の個体群。
28. 哺乳類対象における自己免疫疾患、アレルギー性疾患、移植片拒絶、および慢性炎症性疾患のグループから選択される疾患を治療または防止する方法であって、前記哺乳類対象に対し、請求項１４に記載の抗原特異的な調節性Ｔ細胞の個体群を投与するステップを備える、方法。
29. 哺乳類対象における自己免疫疾患、アレルギー性疾患、移植片拒絶、および慢性炎症性疾患のグループから選択される疾患を治療または防止する方法であって、前記哺乳類対象に対し、請求項１５に記載のアポトーシス細胞またはアポトーシス小体を積載した細胞の個体群を投与するステップを備える、方法。
    

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