JP2004535819A - 新規の単離された樹状細胞、それらを調製する方法、及び医薬組成物におけるそれらの使用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、CD14陽性であり、免疫蛍光染色及びフローサイトメトリー分析により決定されるように、約1500未満のメディアン蛍光強度のMHCクラスI、及び約500未満のメディアン蛍光強度のCD86を発現する、不可逆的に成熟化へと誘発された樹状細胞に関するものである。
Description
【技術分野】
【0001】
本発明は、新規の単離された樹状細胞、それらを調製する方法、及び医薬組成物におけるそれらの使用に関するものである。
【0002】
樹状細胞とは、特異的な外因性抗原に対する一次免疫応答及び二次免疫応答の両方を刺激することができる最も強力な抗原提示細胞と定義される(Hart "Dendritic cells:unique leucocyte populations which control the primary immune response" Blood, 1997, vol.90, p3245)。in vivoでは、末梢で抗原を捕捉した未熟樹状細胞は、リンパ管を通ってリンパ系器官のT細胞領域へと遊走し、そこで、MHC分子との関係においてこれらの抗原に由来するエピトープを提示し、抗原特異的ナイーブT細胞の活性化及び増殖を可能にする。
【0003】
樹状細胞は、異なる組織源、又は血中もしくは骨髄に存在する前駆細胞より得ることができる。未熟樹状細胞は、定義された培養条件を使用して単球を分化させることにより血球より得ることができる。一例として、単球に由来する樹状細胞は、特許出願WO94/26875、WO96/22781又はWO97/44441に従い調製され得る。未熟樹状細胞は、Boyerら(Exp. Hematol. 1999, vol. 27, pp751-761)又はBanchereauら(Annu. Rev.Immunol., 2000, 18:767-911)によっても調製され得る。
【0004】
例えばIL−13の存在下で、血中単球から分化した後、樹状細胞は未熟表現型を示し、特に、IL−10及びIL−12を分泌しない(又は極微量にしか分泌しない)。
【0005】
未熟樹状細胞はin vitroで自然には成熟しない。成熟剤が存在しない場合、それらは、死滅するか又はマクロファージ型細胞へと復帰する。
【0006】
in vivoでは、樹状細胞は、遊走の間に、形態学及び表現型の変化をもたらす成熟化過程を経る。成熟化は、樹状細胞の抗原捕捉能の低下及び抗原提示能の上昇を誘導する。サイトカインの産生は、樹状細胞成熟の際に獲得される特性である。成熟した樹状細胞は、生物活性型のIL−12(IL−12p70)及びIL−10のような免疫刺激性サイトカインを分泌することができる。IL−12は、Tヘルパー1(Th1)細胞傷害性応答へと免疫系を偏向させことができ、IL−10は、Tヘルパー2(Th2)応答を誘導する。
【0007】
Th1型応答は、抗原特異的Tリンパ球CD8+の刺激を含む免疫応答と考えられており、Th2型免疫応答は、むしろ、抗体応答の刺激を含み、おそらくは抗原に対する細胞傷害性リンパ球の非応答性を含む。
【0008】
Tヘルパー1 CD4 T細胞は細胞傷害性CD8 T細胞応答を支援し、Tヘルパー2は抗体産生のためのB細胞を支援するであろう。二つの応答型の間には、包括的な平衡が存在する。IL−4、IL−5又はIL−10のようなTh2サイトカインは、Th1応答を妨害し、アナジー及びその他の様々な免疫抑制効果を引き起こし得る。一般に、癌又は感染性疾患において、最も有効な応答は、液性応答(抗体)ではなく、細胞傷害性応答(腫瘍細胞又は感染細胞を死滅させるCD8 T細胞)であると信じられている。
【0009】
癌及び感染性疾患の処置のための自己抗原負荷樹状細胞の使用は、安全で、忍容性が良好で、潜在的に有効な細胞療法であると考えられるため、現在、関心が高まりつつある。樹状細胞は、成熟の段階及び分泌されるサイトカインのパターンに依っては、T細胞応答の強力なモジュレーターであることが認識されている。
【0010】
最近、ex vivoで大量の樹状細胞を調製する可能性が開発されて以来、免疫療法における、そして細胞ワクチンとしてのこれらの細胞の使用には、ますます関心が集まってきている。
【0011】
本発明の目的の一つは、Th1免疫応答にとって好都合な新規の樹状細胞を作製することである。
【0012】
本発明のもう一つの目的は、容易に、かつ迅速に得ることができる新規の単離された樹状細胞を得ることである。
【0013】
本発明のもう一つの目的は、最適な活性を保持しつつ、使用まで保存し、適切なタイミングで患者へ注射することができる新規の樹状細胞を提供することである。
【0014】
本発明は、以下の特徴を示す、不可逆的に成熟化へと誘発された樹状細胞に関する。
− CD14陽性である。
− 免疫蛍光染色及びフローサイトメトリー分析により決定されるように、約1500未満のメディアン蛍光強度(median fluorescence intensity)のMHCクラスI、及び約500未満のメディアン蛍光強度のCD86を発現する。
【0015】
「成熟化」という用語は、細胞の表現型及び機能の修飾をもたらす、未熟な高度に貪食性の樹状細胞の活性化と定義される。特に、細胞は、高レベルのサイトカインを産生するという特性を獲得し、貪食能を喪失する。
【0016】
「不可逆的に成熟化へと誘発された樹状細胞」という用語は、低いサイトカインの分泌及びCD14の発現のような未熟の特徴を有するが、任意の細胞培養培地中で成熟するであろう細胞と定義される。
【0017】
「メディアン蛍光強度」という用語は、細胞試料中の各蛍光色素についての相対蛍光強度と定義される。検出のため使用されるモノクローナル抗体が、蛍光色素と直接カップリングされる(Boyerら、Exp. Hematol., 27, 751-761,1999)。
【0018】
フローサイトメーターは、これらのパラメーターの相対差を検出するためのものであり、単位測定に関する絶対的なデータは提供しない。Becton Dickinson Immunocytometry Systems, Computer Based Training、Volume I "Flow Cytometry and Immunology Basics"からのFACS(商標)Academyによると:「フローサイトメーターは、粒子に関連したサイズ、相対粒度及び蛍光の差が存在すれば、それらを検出する。[...]レーザー光のビームが、セルを横切って投射される。同時に、レーザー光が粒子に当たり、粒子中又は粒子上に存在するあらゆる蛍光が蛍光を発するであろう。一度励起されると、放射される蛍光シグナルの強度は、粒子中の蛍光化合物の量に比例するはずである。」
【0019】
本発明の誘発された樹状細胞は、CD14陽性であり、約1500未満のメディアン蛍光強度のMHCクラスI、及び約500未満のメディアン蛍光強度のCD86を発現する(これらの特性は、全て、未熟の特徴に相当する)。
【0020】
本発明の樹状細胞は、未熟樹状細胞のように、低レベルのIL−12p70及びIL−10を分泌する。本発明の特定の態様によると、不可逆的に成熟化へと誘発された樹状細胞は、106細胞/mlについてElisaアッセイにより決定されるように、約3000pg/ml未満のIL−12p70及び500pg/ml未満のIL−10を分泌する。
【0021】
本発明のより具体的な態様によると、不可逆的に成熟化へと誘発された樹状細胞は、以下の特徴を示す。
− CD14陽性である。
− (免疫蛍光染色及びフローサイトメトリー分析により決定されるように)約700未満のメディアン蛍光強度のMHCクラスI、及び約300未満のメディアン蛍光強度のCD86を発現する。
− (106細胞/mlについてElisaアッセイにより決定されるように)約80pg/ml未満のIL−12p70及び約300pg/ml未満のIL−10を分泌する。
【0022】
具体的な態様によると、本発明の不可逆的に成熟化へと誘発された樹状細胞は、CD83陰性である。この発現の欠如は、未熟表現型の特徴である。
【0023】
もう一つの態様によると、本発明の樹状細胞は、以下の特徴を示す。
免疫蛍光染色及びフローサイトメトリー分析により決定されるような、
− 約3〜20のメディアン蛍光強度のCD83発現
− 約20〜100のメディアン蛍光強度のCD14発現
− 約400〜700のメディアン蛍光強度のMHCクラスI発現
− 約100〜300のメディアン蛍光強度のCD86発現:及び
計106細胞/mlについてELISAアッセイにより決定されるような、
− 1〜約80pg/mlのIL−12p70分泌
− 約15〜300pg/mlのIL−10分泌。
【0024】
不可逆的に成熟化へと誘発された樹状細胞は、成熟表現型及び未熟表現型の両方の特徴を示す。
【0025】
CD83の発現範囲、CD14の欠如、及びIL−12の高度の分泌は、成熟表現型の特徴である。
【0026】
CD14の発現範囲及びCD83の欠如は、未熟表現型の特徴である(概説については、Banchereauら、2000, Ann. Rev. Immunol.を参照のこと)。
【0027】
本発明の樹状細胞は、1〜16時間、好ましくは6時間培養された血中単球由来の未熟樹状細胞より生ずる。
【0028】
もう一つの態様によると、本発明の樹状細胞は、成熟過程を阻止することができ、この阻止の後、適切な条件下で生育させられた場合に成熟を再開させることができるという特性を有する。
【0029】
例えば癌の処置のため、該樹状細胞を患者へ注射することができるため、この特性は極めて興味深い。特に、患者から採取された自己細胞を成熟因子により処理して本発明の樹状細胞を得て、それらを注射まで保存することが可能である。それらは、患者の組織において完全に成熟する。
【0030】
本発明のもう一つの態様によると、該樹状細胞は、十分な培養時間で、成熟因子及びサイトカインを含有しない培養培地中でin vitroで成熟化するという特性を有する。
【0031】
「成熟因子及びサイトカインを含有しない」という表現は、培養培地が、IFNγ、ポリI:C、CD40リガンド又はCD40抗体、多糖、TNFα、FLAT3リガンド等のような、一般に使用されている成熟因子及びサイトカインを欠いていてもよいことを意味する。
【0032】
「十分な培養時間」という表現は、該細胞が成熟樹状細胞の特徴を獲得するのに十分な時間、実際には16〜40時間を意味する。一般的に述べると、それは、これらの細胞が、低下した抗原捕捉能及び増加した抗原提示能を示すことを意味する。特に、成熟した細胞は、約1000pg/ml超のIL−12p70を分泌し、Th1免疫応答を誘導する能力を獲得している。
【0033】
本発明のもう一つの態様によると、該樹状細胞は、患者への注射の後、in vivoで成熟化するという特性を有する。
【0034】
患者へin vivo注射された場合、該樹状細胞は、成熟を完了し、有効な特異的T細胞の刺激に必要なサイトカインを産生するであろう。患者の血清は、該細胞の成熟に適切な培地である。注射後、樹状細胞は、活性化の進行をたどりながら、T細胞エリアへ遊走する。本発明の目的は、実務者が、細胞傷害性T細胞免疫応答の誘導のために最適に有効な樹状細胞を注射することを可能にする。
【0035】
本発明は、薬物、核酸又は目的の抗原、例えば腫瘍抗原が負荷された樹状細胞にも関する。本発明の樹状細胞は、腫瘍細胞、特に黒色腫腫瘍細胞系の溶解物を負荷させることができる(実施例9参照)。
【0036】
細胞は、当業者に既知の方法に従い、貧食作用、飲作用、親和性結合、融合、核酸(DNA、RNA)による導入又は受容体媒介取り込みにより、抗原を負荷させてもよい。
【0037】
もう一つの態様によると、本発明の樹状細胞は、TヘルパーCD4+T細胞の発生を促進し、ある抗原と貪食樹状細胞との事前の接触の後、該抗原に特異的な細胞傷害性CD8+Tリンパ球を活性化する。
【0038】
細胞傷害性CD8+Tリンパ球の活性化は、これらの細胞によるIFNγの分泌を誘導する。従って、Th1応答の誘導は、IFNγ放出に関するElispotアッセイにより追跡することができる。
【0039】
機能的には、これらの樹状細胞は、未熟樹状細胞がCD8 T細胞応答を生成させ持続させることができない条件である、CD4の支援の非存在下、そして付加的な外因性サイトカインが存在しない場合ですら、抗原特異的CD8 T細胞をin vitroで生成させる力が極めて強い(実施例5及び6参照)。
【0040】
本発明は、適切な凍結保存培地中の凍結形態の、不可逆的に成熟化へと誘発された樹状細胞の組成物にも関する。
【0041】
適切な培地は、例えば10%自己血清+10%ジメチルスルホキシドを含むリン酸緩衝食塩水から構成される(実施例9参照)。
【0042】
本発明の細胞は、使用まで−80℃未満の温度で凍結状態で維持することができ、このことは、産業上の有利な効果である。
【0043】
本発明は、血中単球由来の未熟樹状細胞を、2個の因子:
a − サイトカイン又はサイトカインのアゴニスト又はサイトカイン誘導因子、並びに
b − 細菌の膜画分及び/もしくはリボソーム画分の混合物、又はサイトカインとは異なるリガンドもしくはアゴニスト、
の組み合わせと接触させ、1〜16時間、好ましくは6時間、それらをインキュベートするステップを含む、CD14陽性であり、(免疫蛍光染色及びフローサイトメトリー分析により決定されるように)約1500を下回るメディアン蛍光強度のMHCクラスI、及び約500を下回るメディアン蛍光強度のCD86を発現するという特徴を示す、不可逆的に成熟化へと誘発された樹状細胞を得るための方法にも関する。
【0044】
本発明の具体的な態様において、記載されたような方法によって、CD14陽性であり、(免疫蛍光染色及びフローサイトメトリー分析により決定されるように)約700を下回るメディアン蛍光強度のMHCクラスI、及び約300を下回るメディアン蛍光強度のCD86を発現し、(106細胞/mlについてElisaアッセイにより決定されるように)約80pg/ml未満のIL−12p70及び約300pg/ml未満のIL−10を分泌するという特徴を示す、不可逆的に成熟化へと誘発された樹状細胞が得られる。
【0045】
2個の因子の組み合わせは、好ましくは、IFNγのようなサイトカイン及び細菌膜画分より構成される。
【0046】
カイネティクス研究によって、本発明者らは、未熟樹状細胞の成熟剤との短期in vitro接触が、成熟過程を誘発するのに十分であり、次いで、成熟剤の除去後、成熟化過程が自然に進行し、完全に成熟化を完了することを証明した。実施例6に示されるように、6時間のインキュベーションが、所定の抗原に特異的なCD8細胞を生成させ得る樹状細胞を産生するための最適な時間である。実施例4及び8に示されるように、成熟剤との短時間インキュベーションは、高レベルのIL−10分泌を誘導するのに十分ではない。
【0047】
16時間のインキュベーションの後、得られる細胞は、成熟の特徴を示し、従って不可逆的に成熟化へと誘発された樹状細胞の定義を満たさない。
【0048】
「細菌膜」という用語は、内側の細胞質膜と定義され、それには膜間空間が含まれ、外側の膜は除外される。膜の概略図は、"Drugs, 1997, Adis international limited"の34頁の図2に示されている。
【0049】
「膜抽出物」という用語は、同一膜画分に富んだ細菌抽出物と定義される。膜抽出物又は膜画分とは、細菌培養物から精製又は部分精製された、これらの膜を含有するあらゆる抽出物又は画分に相当する。そのような抽出物の調製の方法は、培養後に得られた細菌の溶解のステップ、及び具体的には遠心分離又はろ過による、細菌膜含有画分の分離のステップを少なくとも含む。
【0050】
「リボソーム抽出物」という用語は、リボソーム画分、具体的には一本鎖及び/又は二本鎖のリボ核酸を含有する細菌抽出物と定義される。リボソーム抽出物又はリボソーム画分とは、細菌培養物から精製又は部分精製された、リボソームを含有するあらゆる抽出物に相当する。そのような抽出物の調製の方法は、培養後に得られた細菌の溶解のステップ、及び具体的には遠心分離又はろ過による、全溶解物からの細菌リボソーム含有画分の分離のステップを少なくとも含む。
【0051】
ポリIC、CD40のリガンド、抗CD40抗体、内毒素、生細菌、リポ多糖、培養上清、TNFαを含むアゴニスト性サイトカインのカクテルのような、樹状細胞の成熟化のため使用されるいくつかの既知の作用物質が存在する。インターフェロン−γは、樹状細胞の成熟特徴及び刺激性表現型を増大させるよう、成熟剤と相乗的に作用する。
【0052】
リボムニル(Ribomunyl)(登録商標)(国際的な非登録名又は一般名称:細菌のリボソーム画分及び膜画分、膜プロテオグリカン)は、非特異的な天然の免疫刺激効果があることで知られている。それは、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)に由来するプロテオグリカン(凍結乾燥物の用量中0.015mg)、及び4つの異なる細菌株、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)(35部)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)(30部)、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)A群(30部)及びヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)(5部)に由来する70%RNAを含有するリボソーム画分(凍結乾燥物の用量中0.01mgのリボソーム抽出物)の両方を含有している。リボムニルは、多形核細胞(PMN)及びマクロファージに作用することにより一般的な自然免疫応答を刺激すること、いくつかのサイトカイン(IL−1、IL−6、IL−8、TNFα、CSF)の産生を増加させること、そしてナチュラルキラー細胞を活性化し得ることが示されている。
【0053】
熱ショックタンパク質70は、いくつかの単球のための潜在的な成熟因子として同定されている(Kuppnerら、2001);それは、未熟樹状細胞を成熟化へと誘発するため、ポリI:C又はサイトカインと有効に組み合わせることができる。
【0054】
本発明は、CD83陰性である、不可逆的に成熟化へと誘発された樹状細胞の調製のための方法にも関する。
【0055】
本発明の具体的な態様において、本法において使用されるサイトカインはIFNγであってよく、使用されるサイトカイン誘導因子はポリI:Cであってもよい。
【0056】
ポリI:CはIFNγの分泌を誘導する。
【0057】
本発明の具体的な態様において、使用される細菌の膜画分及び/又はリボソーム画分の混合物は、一つの細菌株の膜亜画分である。もう一つの態様において、膜亜画分は、該膜亜画分から得られた精製されたタンパク質であり得る。
【0058】
本発明の具体的な態様において、使用される細菌の膜画分及び/もしくはリボソーム画分の混合物は、リボムニル(登録商標)(Inava Laboratory, Pierre Fabre)である。
【0059】
リボムニルとIFNγとの組み合わせは、リボムニル単独の使用より樹状細胞によるIL−12分泌を誘導する効果がより高い(実施例3参照)。
【0060】
本発明の具体的な態様において、使用される膜亜画分は、FMKp(クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)膜画分)である。本発明の方法におけるリボムニルまでのFMKpの使用は、得られる樹状細胞によるサイトカインのより顕著な分泌をもたらす(実施例1C、3A及び3Bの結果を、実施例7Cと比較すること)。
【0061】
特に、方法において使用されるサイトカインはIFNγであり、膜亜画分はFMKpである。好ましくは、IFNγの濃度は約500U/mlであり、FMKpの使用濃度は約1μg/mlである。
【0062】
本発明の特定の態様において、使用されるリガンドは、抗CD40抗体又はCD40リガンドである。
【0063】
本発明の具体的な態様において、使用されるリガンドは、誘導性熱ショックタンパク質70又はそれに由来する単離されたポリペプチド配列である。
【0064】
本発明は、本願に記載された方法に従って得られる、不可逆的に誘発された樹状細胞にも関する。本発明は、IL−10の分泌より高度のIL−12p70の分泌を有する、即ち、IL−12p70/IL−10分泌比が1を上回っている成熟樹状細胞にも関する。特に、本発明は、少なくとも24時間に(106細胞/mlについてElisaアッセイにより決定されるように)約1000pg/ml超のIL−12p70、及び約100pg/ml未満のIL−10を分泌し、かつTh1免疫応答及び細胞傷害性免疫応答を刺激する成熟樹状細胞に関する。
【0065】
関連した表現型の修飾は、CD80、CD86、CD83、MHCクラスI及びII分子の細胞表面発現の増加、並びにCD14の表面発現の減少である。機能的な変化は、貪食特性の喪失、遊走能の獲得、並びにサイトカイン及びケモカインの発現プロファイルの変化、特に増加したIL−12分泌である。
【0066】
本発明は、in vitro又はin vivoで、外因性の成熟因子又はサイトカインを添加せずに、該不可逆的に誘発された樹状細胞を培養するステップを含む、不可逆的に成熟化へと誘発された樹状細胞から成熟樹状細胞を調製するための方法にも関する。
【0067】
本発明は、本法により得られるような、前記定義の成熟樹状細胞にも関する。
【0068】
本発明は、薬学的に許容される媒体と共に、内在化された抗原、好ましくはワクチン抗原を有する不可逆的に成熟化へと誘発された樹状細胞を活性物質として含有している医薬組成物にも関する。
【0069】
「ワクチン抗原」という用語は、免疫応答を誘導する抗原と定義される。
【0070】
本発明に係る樹状細胞は、正確なT細胞亜集団に対して作用することができる。これは、本発明に係る樹状細胞が、Th2/Th1免疫応答を刺激又は調節し得ることを意味する。従来技術において記載された樹状細胞は、in vivoで抗原特異的なT細胞の増殖を誘導し、従って抗原特異的な細胞傷害性の増加及び免疫刺激をもたらすのみならず、in vivoで調節T細胞を誘導し、従って抗原特異的な細胞傷害性T細胞の阻害を誘導し、特異的抗原に対する非応答性をもたらすこともできる。
【0071】
本発明の樹状細胞は、主としてTh1免疫応答を介した強い免疫刺激特性のみを保有しており、臨床的なワクチン使用に適している。
【0072】
誘導される免疫応答は、所定の病原体又は腫瘍の減少又は排除をもたらす、それらに対するin vivoの臨床的な免疫応答を特徴とし得る。in vitroでは、これは、樹状細胞の場合、抗原特異的なCD8細胞傷害性Tリンパ球の免疫刺激アッセイにおいて測定され得る。
【0073】
本発明は、1ワクチン用量当たり約104〜109、好ましくは約105〜107の量で、不可逆的に成熟化へと誘発された樹状細胞を活性物質として含有している細胞ワクチン組成物にも関する。
【0074】
「細胞ワクチン組成物」という用語は、ワクチン抗原のプロセシングを行い、それらを提示している樹状細胞と定義される。
【0075】
使用された略語:
抗CD40mAb=CD40に対するモノクローナル抗体
DC=樹状細胞
FMKp=クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)膜画分
HLA−ABC=組織適合性クラスI分子
iDC=未熟樹状細胞
IFNγ=インターフェロンガンマ
Isot Ctr=アイソタイプコントロール
IVS=in vitro刺激
MFI=メディアン蛍光強度
ポリI:C=ポリリボイノシン酸ポリリボシチジル酸
RBL=リボムニル(登録商標)
【0076】
図1A、1B、1C:
リボムニル(登録商標)及びIFNγにより誘発された樹状細胞は、完全に成熟化するよう方向付けられている。
【0077】
未熟樹状細胞を、リボムニル(RBL)+IFNγと共に6時間インキュベートし、洗浄し、さらに34時間培養した。
【0078】
白抜き棒グラフは、6時間目の時点での測定を表し(RBL+IFNγによる6時間の誘発の後)、黒棒グラフは、40時間目の時点での測定を表す(RBL+IFNγによる6時間の誘発、及び成熟因子なしの34時間の培養の後)。
【0079】
成熟化を追跡するため、樹状細胞を、抗CD14抗体、抗CD83抗体、抗HLA−ABC抗体及び抗CD86抗体で染色し、フローサイトメーターで蛍光を分析した。6時間目及び24時間目の時点でのマーカーCD14、CD83(1A)、HLA−ABC及びCD86(1B)の発現が、メディアン蛍光強度任意の単位として表されている(Y軸)。
【0080】
培養上清中のIL−10及びIL−12p70の濃度を、ELISAにより、6時間目及び40時間目の時点で測定し(1C)、pg/ml/106細胞の単位で表した(Y軸)。
【0081】
図2A、2B、2C:
ポリI:C及び抗CD40抗体により誘発された樹状細胞は、完全に成熟化するよう方向付けられている。
【0082】
未熟樹状細胞を、抗CD40mAb+ポリI:Cと共に6時間インキュベートし、洗浄し、さらに34時間培養した。
【0083】
白抜き棒グラフは、6時間目の時点での測定を表し(ポリI:C+抗CD40mAbによる6時間の誘発の後)、黒棒グラフは、40時間目の時点での測定を表す(ポリI:C+抗CD40mAbによる6時間の誘発、及び成熟因子なしの34時間の培養の後)。
【0084】
成熟化を追跡するため、樹状細胞を、抗CD14抗体、抗CD83抗体、抗HLA−ABC抗体及び抗CD86抗体で染色し、フローサイトメーターで蛍光を分析した。
【0085】
マーカーCD14、CD83(2A)、HLA−ABC及びCD86(2B)の発現が、メディアン蛍光強度任意の単位として表されている(Y軸)。
【0086】
培養上清中のIL−10及びIL−12p70の濃度を、ELISAにより、6時間目及び40時間目の時点で測定し(2C)、pg/ml/106細胞の単位で表した(Y軸)。
【0087】
図3A、3B:
リボムニル単独と、IFNγと併用されたリボムニルの樹状細胞によるサイトカイン分泌に対する成熟化効果の比較。
【0088】
未熟樹状細胞を、RBL単独又はRBL+IFNγと共に6時間インキュベートし、洗浄し、さらに34時間培養した。
【0089】
白抜き棒グラフは、6時間目の時点での測定を表し(RBL+IFNγ又はRBLによる6時間の誘発の後)、黒棒グラフは、40時間目の時点での測定を表す(RBL+IFNγ又はRBLによる6時間の誘発、及び成熟因子なしの34時間の培養の後)。
【0090】
培養上清中のIL−12p70(3A)及びIL−10(3B)の量を、ELISAにより、6時間目及び40時間目の時点で測定した。サイトカインの濃度は、pg/ml/106細胞の単位で表されている(Y軸)。
【0091】
図4:
IL−10の分泌は、RBL+IFNγの存在下での比較的長い樹状細胞のインキュベーション時間を必要とする。
【0092】
未熟樹状細胞を、
− RBL+IFNγと共に6時間インキュベートし、洗浄し、さらに34時間培養するか、又は
− RBL+IFNγと共に40時間インキュベートした。
− RBL+IFNγによる6時間の刺激の後(黒棒グラフ/白点)、
− RBL+IFNγによる6時間の刺激を含む、40時間の培養の後(白抜き棒グラフ/黒点)、
− RBL+IFNγによる40時間の刺激の後(白抜き棒グラフ/黒斜線)、
培養上清中の分泌されたIL−10の量を、ELISAにより測定した。IL−10の濃度は、pg/ml/106細胞の単位で表されている(Y軸)。
【0093】
図5:
ペプチド抗原でパルス処理された誘発された樹状細胞は、外因性サイトカインの非存在下ですら、抗原特異的CD8 T細胞を生成させ得る。
【0094】
未熟樹状細胞を、抗CD40mAb+ポリI:C又はRBL+IFNγの存在下で6時間インキュベートした。成熟時間の終了直前に細胞をペプチドでパルス処理し、次いで採集し、洗浄し、CD8 T細胞を刺激するために使用した。パルス処理樹状細胞によるin vitro刺激の後、CD8 T細胞によるIFNγ放出を、Melan−Aペプチドでパルス処理されたT2細胞を刺激剤として使用したELISPOTアッセイによりアッセイした。
【0095】
異なる記号は、各ドナーを表す。棒グラフは、各条件についての平均値を示す。Y軸は、特異的スポット形成細胞の数を示す。
【0096】
図6:
RBL+IFNγとの6時間のインキュベーションにより誘発された樹状細胞は、抗原特異的エフェクターCD8 T細胞の生成にとって最適である。
【0097】
未熟樹状細胞を、成熟化刺激の非存在下(iDC)、又はRBL+IFNγの存在下で、3時間、6時間又は16時間インキュベートした。細胞を成熟化時間の終了直前にペプチドでパルス処理し、次いで採集し、洗浄し、CD8 T細胞を刺激するために使用した。ペプチドパルス処理樹状細胞による2回の刺激の後、CD8 T細胞によるINFγ放出を、Melan−Aペプチドでパルス処理されたT2細胞を刺激剤として使用したELISPOTアッセイによりアッセイした。
【0098】
異なる記号は、各ドナーを表す。棒グラフは、各条件についての平均値を示す。Y軸は、特異的スポット形成細胞の数を示す。
【0099】
図7A、7B、7C:
FMKp及びINFγにより誘発された樹状細胞は、完全に成熟化するよう方向付けられている。
【0100】
未熟樹状細胞を6時間FMKp及びIFNγで処理した。細胞を6時間目に洗浄し、直ちに分析するか、又は24時間目の時点まで成熟因子の非存在下でさらに培養した。
【0101】
白抜き棒グラフは、6時間の時点での測定を表し(FMKp+IFNγによる6時間の誘発の後)、黒棒グラフは、24時間の時点での測定を表す(FMKp+IFNγによる6時間の誘発、並びに成熟因子なしの18時間の培養の後)。
【0102】
成熟化を追跡するため、両方の時点で、樹状細胞をマーカーCD14及びCD83(7A)、並びにHLA−ABC及びCD86(7B)の発現に関して分析した。マーカーの発現が、メディアン蛍光強度任意の単位として表されている(Y軸)。
【0103】
両方の時点で、培養上清中のIL−10及びIL−12p70の濃度をELISAにより測定し(7C)、pg/ml/106細胞の単位で表した(Y軸)。
【0104】
図8:
樹状細胞によるIL−10分泌は、FMKp+IFNγの存在下での細胞の長時間インキュベーションを必要とする。
【0105】
未熟樹状細胞を、3時間、6時間又は40時間、FMKp及びIFNγにより処理した。3時間目又は6時間目に刺激された細胞を洗浄し、3時間目又は6時間目の時点で分析するか、又は成熟因子なしの培地中でさらに生育させ、次いで24時間目の時点でIL−10分泌を測定した。
【0106】
− FMKp+IFNγによる3時間の刺激の後(白抜き棒グラフ)、
− FMKp+IFNγによる6時間の刺激の後(白抜き棒グラフ/黒点)、
− FMKp+IFNγによる3時間の刺激を含む24時間の培養の後(黒棒グラフ)、
− FMKp+IFNγによる6時間の刺激を含む24時間の培養の後(黒棒グラフ/白点)、
− FMKp+IFNγによる24時間の刺激の後(白抜き棒グラフ/黒斜線)、
培養上清中の分泌されたIL−10をELISAにより測定した。
【0107】
IL−10の濃度が、pg/ml/106細胞の単位で表されている(Y軸)。
【0108】
図9:
樹状細胞への黒色腫細胞溶解物の負荷、及びその後の凍結/解凍ステップは、成熟過程を混乱させない。
【0109】
未熟樹状細胞に一夜インキュベーションによりColo829溶解物を負荷させ、次いでFMKp及びIFNγにより6時間処理した。洗浄後、細胞を4%アルブミン/DMSO中で凍結させ、次いで解凍させた。
【0110】
新鮮に解凍させた細胞を、アルブミン4%に再懸濁させ、1mlシリンジ内で4℃で2時間インキュベートし、シリンジの振とう後に細胞を25G針に通し、成熟刺激なしの完全AIMV培地中で18時間培養した。
【0111】
− Colo829溶解物の負荷、及びFMKp+IFNγとの6時間のインキュベーションの後(白抜き棒グラフ)、
− Colo829溶解物の負荷、FMKp+IFNγとの6時間のインキュベーション、凍結、解凍、及びAIMV培地中での18時間の培養の後(黒棒グラフ)、
IL−12p70及びIL−10の分泌をELISAによりアッセイした。
【0112】
培養上清中のIL−12p70及びIL−10の濃度が、pg/ml/106細胞の単位で表されている(Y軸)。
【0113】
実施例:
使用された略語:
抗CD40mAb=CD40に対するモノクローナル抗体
DC=樹状細胞
FMKp=クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)膜画分
HLA−ABC=組織適合性クラスI分子
IDC=未熟樹状細胞
IFNγ=インターフェロンガンマ
IVS=in vitro刺激
MFI=メディアン蛍光強度
PBS=リン酸緩衝生理食塩水
ポリI:C=ポリリボイノシン酸ポリリボシチジン酸
RBL=リボムニル(登録商標)
【0114】
実施例1:リボムニル(登録商標)及びIFNγにより誘発された樹状細胞は、ex vivo培養後に完全に成熟化するよう方向付けられている
樹状細胞:
未熟樹状細胞を、特許出願WO97/44441、及びBoyerら(Exp. Hematolo., 1999, 27, 751-761)に従って、末梢血単球の培養により調製し、水簸(elutriated)した。簡単に説明すると、500U/ml GM−CSF(Leucomax, Novartis Pharma)及び50ng/ml IL−13(Sanofi Synthelabo)が補足されたAIMV培地(=完全AIMV培地)中で樹状細胞を分化させ、7日間の培養後に水簸した。
【0115】
成熟化:
樹状細胞を、リボムニル(1ug/ml)及びIFNγ(500U/ml)の存在下で6時間、完全AIMV培地(Life Technologies, Paisley PA49RF, GB)中で培養した。凍結乾燥リボムニル(登録商標)(Inava Laboratory, Pierre Fabre, Paris, France)の各バイアルは、K.ニューモニエ(pneumoniae)、S.ニューモニエ(pneumoniae)、S.ピオゲネス(pyogenes)及びH.インフルエンザ(influenzae)に由来するリボソーム画分0.010mg及びK.ニューモニエ(pneumoniae)に由来する膜画分0.015mgを含有している。IFNγ(Imukin)は、ベーリンガーインゲルハイムフランス(Boehringer Ingelheim France)より入手した。6時間目に細胞を洗浄し、40時間目の時点まで(成熟因子の非存在下で)完全AIMV培地中でさらに培養した。
【0116】
表現型分析:
成熟化を追跡するため、樹状細胞を、6時間及び40時間の時点で、CD83、CD86、CD14及びHLA−ABCマーカーの発現に関して分析した。樹状細胞を、1%ウシ胎仔血清が補充されたリン酸緩衝食塩水(PBS)に懸濁させた。細胞を、以下のFITC又はPEとコンジュゲートした特異的モノクローナル抗体又はアイソタイプマッチコントロール:抗CD83、CD86、MHCクラスI、マウスIgG2b、マウスIgG2a(Immunotech, Marseille, France)、抗CD14(Becton Dickinson, St Jose, CA)と共に、氷上で30分間インキュベートした。次いで、細胞をPBSで洗浄し、3nMのTO−PRO3を含有するPBSに再懸濁させ、分析から死細胞を排除した。
【0117】
フローサイトメトリー分析は、CellQuestソフトウェアと共にBecton Dickinsonサイトメーターを用いて実施した。結果は、メディアン蛍光強度(MFI)値(任意の単位)として表される。
【0118】
サイトカイン検出:
6時間及び40時間の時点で、製造業者の指示に従いR&D Systems Europe(Abingdon, UK)の抗体対を使用して実施された市販のELISAにより、培養上清を、IL−12p70及びIL−10の分泌に関してELISAによりアッセイした。
【0119】
結果:
結果は、図1A(CD14及びCD83の発現);1B(HLA−ABC及びCD86の発現);1C(サイトカイン分泌)に示される。FACS分析に関するネガティブコントロール(アイソタイプコントロール)が示される。
【0120】
成熟因子との6時間のインキュベーションの後、樹状細胞は、未熟細胞の特徴を示す:細胞は、CD14を発現するが、CD83は極少量しか発現しない。HLA−ABC及びCD86は有意にアップレギュレートされない。IL−12p70及びIL−10の分泌は極めて低い。
【0121】
洗浄及び40時間目までのさらなる培養の後、細胞は成熟細胞の特徴を示す:それらは、CD14陰性であり、蛍光強度49のCD83(約95%陽性細胞)、蛍光強度3460のHLA−ABC、及び蛍光強度1640のCD86を発現する。IL−12p70分泌は劇的に増加するが、IL−10分泌は低いままである。
【0122】
結論として、樹状細胞は、RBL+IFNγとの6時間のインキュベーションの間に成熟化へと誘発された後、成熟因子の非存在下での培養中に成熟化する。
【0123】
実施例2:ポリI:C及び抗CD40抗体により誘発化された樹状細胞は、ex vivo培養後に完全に成熟化するよう方向付けられている
実施例1に記載されたようにして、未熟樹状細胞を調製した。
【0124】
樹状細胞を、抗CD40抗体(2μg/ml)及びポリI:C(100μg/ml)の存在下で完全AIMV培地中で6時間インキュベートし、次いで洗浄し、さらに34時間培養した。
【0125】
表現型及びサイトカイン分泌を、実施例1に記載されたようにして分析した。
【0126】
結果:
結果は、図2A(CD14及びCD83の発現);2B(HLA−ABC及びCD86の発現);2C(サイトカイン分泌)に示される。FACS分析に関するネガティブコントロール(アイソタイプコントロール)が示される。
【0127】
組み合わせRBL+IFNγについて示されたのと同様に、抗CD40mAb及びポリI:Cとの6時間のインキュベーションは、樹状細胞成熟化を誘発するのに十分であった。6時間目の時点で、細胞は未熟特徴を示すが、洗浄及び成熟因子なしでの34時間の培養の後、樹状細胞は、高レベルのHLA−ABCを発現し、IL−12p70(85pg/ml)を分泌するが、IL−10は少量(20pg/ml)しか分泌しない。
【0128】
実施例3:樹状細胞によるサイトカイン分泌に対するリボムニル単独と、IFNγと併用されたリボムニルの成熟化効果の比較
未熟樹状細胞を、(実施例1に記載されたような)RBL+IFNγ、又はRBL単独(1μg/ml)により6時間処理した。以前に記載されたようにして、6時間目及び40時間目の時点でサイトカイン分泌をアッセイした。
【0129】
結果:
結果は、図3A(IL−12p70分泌);3B(IL−10分泌)に示される。
【0130】
0〜6時間目(白抜き棒グラフ)には、顕著なIL−12分泌は誘導されなかった。IL−10分泌は、低いままである(未熟DCは、通常少量のIL−10を分泌する)。成熟因子及びサイトカインを含まないさらなる34時間の培養の間、RBL単独と共にインキュベートされた未熟樹状細胞は、IL−12p70(400pg/ml/106細胞)及びIL−10(140pg/ml)を分泌し、樹状細胞を成熟化へと誘発するために使用されたRBLとIFNγとの組み合わせは、より高いIL−12p70(1500pg/ml/106細胞)の分泌及び低下したIL−10分泌(31pg/ml)をもたらす。2個の因子の組み合わせは、IL−12p70分泌とIL−10分泌との間の高い比率を示す樹状細胞を得ることを可能にする。
【0131】
実施例4:IL−10の分泌は、RBL+IFNγの存在下でのより長い樹状細胞のインキュベーション時間を必要とする
未熟樹状細胞をRBL+IFNγにより6時間処理し、次いで洗浄し、成熟因子及びサイトカインなしで34時間さらに培養するか、又は同じ成熟因子により40時間処理した。サイトカイン分泌を、ELISAにより6時間目及び40時間目にアッセイした。
【0132】
結果:
結果は、図4に示される;6時間の処理の後には、わずか20pg/mlのIL−10が分泌され、洗浄後の34時間の間にわずか31pg/mlが分泌されたが、40時間の間中、成熟刺激の存在下で細胞をインキュベートした場合には、1150pg/mlが分泌され得た。従って、本発明者らは、成熟刺激の存在下での長いインキュベーション時間は、より高いIL−10分泌をもたらすであろうとの結論を得た。樹状細胞の短時間のインキュベーションは、成熟化現象中の限定されたIL−10分泌をもたらす。この成熟の方法は、主としてIL−12を分泌する成熟樹状細胞を入手することを可能にする。
【0133】
実施例5:ペプチド抗原でパルス処理された誘発された樹状細胞は、ELISPOTにより測定されるようにIFNγを放出するよう抗原特異的T細胞を刺激する
実施例1に記載されたようにして、未熟樹状細胞を調製した。
【0134】
樹状細胞を、RBL+IFNγ又は抗CD40mAb+ポリI:Cの存在下で完全AIMV培地中で6時間生育させるか、又はそうしなかった。成熟化時間の終了前に細胞をペプチドでパルス処理し、次いで採集し、洗浄し、CD8 T細胞を刺激するために使用した。
【0135】
Melan−A特異的CTLの生成
樹状細胞を、37℃で、Melan−Aペプチド(10μg/ml)及びβ2ミクログロブリン(5μg/ml)で2時間パルス処理し、パルス処理の最後の30分間にマイトマイシンC(25μg/ml)で処理し、3回洗浄した。精製された自己CD8 T細胞(1.5×105/ウェル)を、外因性サイトカインの非存在下で、完全培地(10%自己血清、アルギニン、アスパラギン及びグルタミンが補充されたイスコブ(Iscove's)培地)中でマイクロウェル内でペプチドパルス処理DC(3×104/ウェル)と混合した。全ての実験において、各樹状細胞条件について8個のCD8ミクロ培養物を刺激した。
【0136】
7日目、前日に解凍させ6時間成熟させた自己樹状細胞を、Melan−Aペプチドでパルス処理し、やはり外因性サイトカインの非存在下でCD8 T細胞を再刺激するために使用した。
【0137】
IFNγ放出に関するELISPOTアッセイ
DC−ペプチドによる2回のin vitro刺激(IVS)により生成したCD8 T細胞を、予め一次抗IFNγmAb(300 CD8/ウェル)でコーティングされたニトロセルロース96穴プレートに添加した。個々のミクロ培養物を、デュプリケートでテストした。Melan−Aペプチド(又はコントロールペプチドとしてのPSA1)でパルス処理されたHLA−A2 pos.刺激剤(T2又は自己EBV-B細胞)を5×104/ウェルで添加した。PHA−Lで刺激されたT細胞をポジティブコントロールとして使用した。37℃における20時間のインキュベーションの後、プレートを洗浄し、IFNγに対するビオチン化二次mAbと共にインキュベートし、Vectastain Eliteキットで染色した。スポット形成細胞をELISPOTリーダーで計数した。標的細胞+コントロールペプチドで刺激されたT細胞からのバックグラウンドは、分析のために差し引かれ、決して重要ではなかった。
【0138】
結果:
結果は図5に示され、CD8 T細胞300個に関する「特異的スポット形成細胞」により表される。外因性サイトカインの非存在下では、未熟樹状細胞は、抗原特異的エフェクターT細胞を生成させることができない。しかしながら、成熟化へと誘発された樹状細胞は、抗原特異的CD8 T細胞を感作することができる。RBL+IFNgで誘発された樹状細胞は極めて効率的であるが、ポリI:C+Ab抗CD40で誘発された樹状細胞は、適度の応答を誘導した。
【0139】
実施例6:RBL+IFNγとの6時間のインキュベーションにより誘発された樹状細胞は、IFNγ ELISPOTにより測定されるように、最適に抗原特異的T細胞を刺激する
未熟樹状細胞を、RBL+IFNγで、異なる時間(0、3、6及び16時間)処理し、実施例5に記載されたようにしてMelan−Aペプチドでパルス処理した。簡単に説明すると、細胞を成熟化時間の終了前にペプチドでパルス処理し、次いで採集し、洗浄し、外因性サイトカインの非存在下でCD8 T細胞を刺激するために使用した。2回のIVSの後のCD8 T細胞によるINFγ放出を、実施例5に記載されたようにして、ELISPOTによりアッセイした。
【0140】
結果:
この実験においては、最適な誘発時間を決定する目的で、異なる成熟化刺激とのインキュベーション時間を比較した。結果は図6に示される。RBL+IFNγの存在下での6時間のインキュベーションにより誘発された樹状細胞は、抗原特異的CD8 T細胞を生成させる効果が最も高い。しかしながら、3時間又は16時間誘発されたDCも、CD8 T細胞応答を誘導することができる。
【0141】
実施例7:FMKp及びINFγにより誘発された樹状細胞は、ex vivo培養後に完全に成熟化するよう方向付けられている
実施例1に記載されたようにして、未熟樹状細胞を調製した。
【0142】
成熟:
未熟樹状細胞を、完全AIMV培地(即ち、GM−CSF及びIL−13が補充されたAIMV)中で2×106細胞/ml/ウェルでインキュベートした。それらを、6時間、FMKp(1μg/ml、Pierre Fabre Medicament, France)及び500U/mlのIFNγで処理した。細胞を6時間目に洗浄し、直ちに分析するか、又は24時間目の時点まで(成熟因子の非存在下で)完全AIMV培地中でさらに培養した。
【0143】
表現型分析:
成熟化を追跡するため、樹状細胞を、6時間目及び24時間目の時点で、CD83マーカー、CD86マーカー、CD14マーカー及びHLA−ABCマーカーの発現に関して分析した。細胞を、1%ウシ胎仔血清及び0.1%アジ化ナトリウムを含有するPBSに再懸濁させた。それらを、以下のモノクローナル抗体:HLA−ABC−FITC、CD86−PE、CD14−FITC及びCD83−FITC(Immunotech)で4℃で20分間染色した。PBSで洗浄した後、細胞を、3nM TO−PRO−3(Molecular Probes)を含有するPBSに再懸濁させ、死細胞を排除した。取得は、ファックスキャリバー(FACSCalibur)フローサイトメーター(Becton Dickinson)で行った。結果はメディアン蛍光強度(MFI)値(任意の単位)として表される。FACS分析に関するネガティブコントロール(コントロールアイソタイプPE及びFITC):Isot Ctr PE及びFITCが示される。
【0144】
サイトカイン検出:
6時間目及び24時間目の時点で、培養上清を収集し、−80℃で保管した。解凍させた後、それらを、製造業者の指示に従いR&D Systems Europe(Abingdon, UK)の抗体対を使用して実施された市販のELISAによりIL−12p70及びIL−10分泌に関してELISAによりアッセイした。検出下限は、IL−12p70に関しては16pg/ml、IL−10に関しては31pg/mlであった。
【0145】
結果:
結果は、図7A(CD14及びCD83の発現);7B(HLA−ABC及びCD86の発現);7C(サイトカイン分泌)に示される。FMKp及びIFNγとの6時間のインキュベーションの後(白抜き棒グラフ)、樹状細胞は、以下のような未熟細胞特徴を示す。
− 細胞はCD14陽性であり、この実施例においてはCD83陽性である(CD83陰性である場合も存在する)。
− HLA−ABCの発現は1500未満であり、CD86の発現は500未満である(任意の値)。
− IL−12p70の分泌は低く、635pg/ml/106細胞である。この時点で、IL−10は検出されない。
【0146】
洗浄及び24時間目までのさらなる培養の後(黒棒グラフ)、細胞は以下のような成熟特徴を示す。
− CD14発現はほぼ抑制され、CD83発現はわずかにアップレギュレートされた。
− 18時間の培養後、HLA−ABCの発現は約3倍増大し(培養前の673から培養後の1928へ)、CD86の発現は4倍超高くなった(培養前の267から培養後の1165へ)。
− IL−12p70分泌は培養前よりも劇的に約20倍増加したが(6時間目の時点での635から24時間目の時点での13953pg/ml/106細胞)、IL−10分泌は3000pg/ml未満のままである。
【0147】
結論として、不可逆的に成熟化へと誘発された樹状細胞は、FMKp+IFNγと共に6時間インキュベートされ洗浄された後、成熟因子の非存在下ですら、21時間の培養期間中に成熟特徴を獲得する。
【0148】
実施例8:樹状細胞によるIL−10分泌は、FMKp+IFNγの存在下での細胞の長時間インキュベーションを必要とする
未熟樹状細胞を、3時間、6時間又は40時間、FMKp(1μg/ml)及びIFNγ(500U/ml)により処理した。3時間目又は6時間目に刺激された細胞を洗浄し、3時間目又は6時間目の時点で分析するか、又は成熟因子なしの培地中でさらに生育させ、次いで24時間目の時点でIL−10分泌を測定した。IL−10分泌は、以前に記載されたようにして、ELISAによりアッセイした。
【0149】
結果は図8に示される。
3時間の処理の後、IL−10は検出されなかった。6時間後、271pg/ml/106細胞のIL−10が上清中に検出された。成熟因子又はサイトカインなしの培地中での24時間目の時点までのさらなる培養の後、IL−10分泌は低いままであり、いずれの例においても4000pg/ml未満のままである。
反対に、FMKp及びINFγとの40時間のインキュベーションは、IL−10分泌の劇的な誘導をもたらす:40時間の刺激の後、約9000pg/mlが培養上清中に測定される。
【0150】
リボムニル(登録商標)+IFNγに関する実施例4において以前に示されたのと同様に、FMKp及びIFNγの存在下での短時間のインキュベーションは、成熟過程における限定されたIL−10分泌をもたらす。
【0151】
実施例9:樹状細胞への黒色腫細胞溶解物の負荷、及びその後の凍結/解凍ステップは、成熟過程を混乱させない:
黒色腫細胞溶解物の作製:
COLO829細胞系(ATCC番号CRL−1974)由来の黒色腫細胞を採集し、無菌PBSで2回洗浄し、5×107細胞/mlの濃度で無菌PBSに再懸濁させた。凍結及び解凍(F/T)のサイクル4回を適用し、溶解物をMisonix cup horn sonicator(登録商標)で超音波処理した(最大出力で2分間のパルス4回の後、5分間のサイクル1回)。次いで、溶解物をミクロチューブ内で5000rpmで5分間遠心分離し、上清を等分し、−80℃で保管した。
【0152】
細胞負荷:
未熟樹状細胞を、2×106細胞/mlの濃度で完全AIMV培地で希釈し、0.5腫瘍細胞相当量/DCの比率で腫瘍溶解物を添加した。次いで、細胞を、37℃でEVAバッグ(Stedim)内で一夜インキュベートした。
【0153】
成熟は、6時間、FMKp(1μg/ml)及びIFNγ(500U/ml)を用いて、実施例7に記載されたようにして実施した。
【0154】
凍結及び解凍:
不可逆的に成熟化へと誘発された負荷樹状細胞を、バッグ内で水簸溶液(PBS−グルコース、B.Braun Medical S.A.)で洗浄し(ブレーキなしの1600rpm、4℃、25分間の遠心分離)、ペレットをチューブ内で再懸濁させ、遠心分離した(1400rpm、4℃、10分間)。それらを、クリオバッグ(cryobags)内で5×106細胞/mlの濃度で4%アルブミン(90%)/DMSO(10%)中で凍結させた。
次いで、細胞凝集物を回避するため、細胞を0.93%アルブミン及び3.5%ACD−A(B. Braun Medical S.A.)が補充された水簸溶液中で解凍させ、ブレーキなしで1600rpm、4℃で25分間遠心分離した。
【0155】
シリンジ内でのインキュベーション及び最終培養:
新鮮に解凍させた細胞を、チューブ内で遠心分離し、20×106細胞/mlの濃度でアルブミン4%に再懸濁させ、及び1mlシリンジ内で4℃で2時間インキュベートした。
次いで、(細胞が沈殿物を形成したため)シリンジの振とう後に細胞を25G針に通し、24穴プレート内で2×106細胞/mlの濃度で完全AIMV培地中で一夜培養した。
【0156】
FMKp及びIFNγとの6時間のインキュベーションの直後、及びAIMV培地中での最終一夜培養の直後に、以前に記載されたようにして、ELISAによりサイトカイン分泌をアッセイした。
【0157】
結果:
結果は図9に示される。成熟刺激との6時間のインキュベーションの後(白抜き棒グラフ)、負荷樹状細胞は、2222pg/ml/106細胞のIL−12p70及び59pg/ml/106細胞のIL−10を分泌する。IL−10分泌は未だ誘導されていないが、IL−12分泌は既に開始している。
【0158】
凍結/解凍ステップの後、細胞を成熟刺激なしで一夜培養することにより、不可逆的に成熟へと誘発された樹状細胞は成熟過程を完了する(黒棒グラフ)。予想通り、IL−10分泌は低く、実際1200pg/ml未満のままであるが、IL−12p70の分泌は、18時間の培養の前に測定されたIL−12p70分泌より4倍顕著になっている(最終培養後は約10000pg/ml/106細胞)。
【0159】
本発明者らは、事前に細胞へ抗原を負荷させた場合ですら、そしてその細胞を成熟刺激との6時間のインキュベーションの後に凍結させた場合ですら、細胞とFMKp及びIFNγとの6時間のインキュベーションによるIL−12p70の高分泌の誘導は有効である、と結論する。
不可逆的に成熟化へと誘発された樹状細胞は、成熟過程の阻止の後、適切な条件で生育させられた場合、成熟を再開するという特性を有している。
【0160】
【表1】
【図面の簡単な説明】
【0161】
【図1A】リボムニル(登録商標)及びIFNγにより誘発された樹状細胞は、完全に成熟化するよう方向付けられている。
【図1B】リボムニル(登録商標)及びIFNγにより誘発された樹状細胞は、完全に成熟化するよう方向付けられている。
【図1C】リボムニル(登録商標)及びIFNγにより誘発された樹状細胞は、完全に成熟化するよう方向付けられている。
【図2A】ポリI:C及び抗CD40抗体により誘発された樹状細胞は、完全に成熟化するよう方向付けられている。
【図2B】ポリI:C及び抗CD40抗体により誘発された樹状細胞は、完全に成熟化するよう方向付けられている。
【図2C】ポリI:C及び抗CD40抗体により誘発された樹状細胞は、完全に成熟化するよう方向付けられている。
【図3A】リボムニル単独と、IFNγと併用されたリボムニルの樹状細胞によるサイトカイン分泌に対する成熟効果の比較。
【図3B】リボムニル単独と、IFNγと併用されたリボムニルの樹状細胞によるサイトカイン分泌に対する成熟効果の比較。
【図4】IL−10の分泌は、RBL+IFNγの存在下での比較的長い樹状細胞のインキュベーション時間を必要とする。
【図5】ペプチド抗原でパルス処理された誘発された樹状細胞は、外因性サイトカインの非存在下ですら、抗原特異的CD8 T細胞を生成させ得る。
【図6】RBL+IFNγとの6時間のインキュベーションにより誘発された樹状細胞は、抗原特異的エフェクターCD8 T細胞の生成にとって最適である。
【図7A】FMKp及びINFγにより誘発された樹状細胞は、完全に成熟化するよう方向付けられている。
【図7B】FMKp及びINFγにより誘発された樹状細胞は、完全に成熟化するよう方向付けられている。
【図7C】FMKp及びINFγにより誘発された樹状細胞は、完全に成熟化するよう方向付けられている。
【図8】樹状細胞によるIL−10分泌は、FMKp+IFNγの存在下での細胞の長時間インキュベーションを必要とする。
【図9】樹状細胞への黒色腫細胞溶解物の負荷、及びその後の凍結/解凍ステップは、成熟過程を混乱させない。
【0001】
本発明は、新規の単離された樹状細胞、それらを調製する方法、及び医薬組成物におけるそれらの使用に関するものである。
【0002】
樹状細胞とは、特異的な外因性抗原に対する一次免疫応答及び二次免疫応答の両方を刺激することができる最も強力な抗原提示細胞と定義される(Hart "Dendritic cells:unique leucocyte populations which control the primary immune response" Blood, 1997, vol.90, p3245)。in vivoでは、末梢で抗原を捕捉した未熟樹状細胞は、リンパ管を通ってリンパ系器官のT細胞領域へと遊走し、そこで、MHC分子との関係においてこれらの抗原に由来するエピトープを提示し、抗原特異的ナイーブT細胞の活性化及び増殖を可能にする。
【0003】
樹状細胞は、異なる組織源、又は血中もしくは骨髄に存在する前駆細胞より得ることができる。未熟樹状細胞は、定義された培養条件を使用して単球を分化させることにより血球より得ることができる。一例として、単球に由来する樹状細胞は、特許出願WO94/26875、WO96/22781又はWO97/44441に従い調製され得る。未熟樹状細胞は、Boyerら(Exp. Hematol. 1999, vol. 27, pp751-761)又はBanchereauら(Annu. Rev.Immunol., 2000, 18:767-911)によっても調製され得る。
【0004】
例えばIL−13の存在下で、血中単球から分化した後、樹状細胞は未熟表現型を示し、特に、IL−10及びIL−12を分泌しない(又は極微量にしか分泌しない)。
【0005】
未熟樹状細胞はin vitroで自然には成熟しない。成熟剤が存在しない場合、それらは、死滅するか又はマクロファージ型細胞へと復帰する。
【0006】
in vivoでは、樹状細胞は、遊走の間に、形態学及び表現型の変化をもたらす成熟化過程を経る。成熟化は、樹状細胞の抗原捕捉能の低下及び抗原提示能の上昇を誘導する。サイトカインの産生は、樹状細胞成熟の際に獲得される特性である。成熟した樹状細胞は、生物活性型のIL−12(IL−12p70)及びIL−10のような免疫刺激性サイトカインを分泌することができる。IL−12は、Tヘルパー1(Th1)細胞傷害性応答へと免疫系を偏向させことができ、IL−10は、Tヘルパー2(Th2)応答を誘導する。
【0007】
Th1型応答は、抗原特異的Tリンパ球CD8+の刺激を含む免疫応答と考えられており、Th2型免疫応答は、むしろ、抗体応答の刺激を含み、おそらくは抗原に対する細胞傷害性リンパ球の非応答性を含む。
【0008】
Tヘルパー1 CD4 T細胞は細胞傷害性CD8 T細胞応答を支援し、Tヘルパー2は抗体産生のためのB細胞を支援するであろう。二つの応答型の間には、包括的な平衡が存在する。IL−4、IL−5又はIL−10のようなTh2サイトカインは、Th1応答を妨害し、アナジー及びその他の様々な免疫抑制効果を引き起こし得る。一般に、癌又は感染性疾患において、最も有効な応答は、液性応答(抗体)ではなく、細胞傷害性応答(腫瘍細胞又は感染細胞を死滅させるCD8 T細胞)であると信じられている。
【0009】
癌及び感染性疾患の処置のための自己抗原負荷樹状細胞の使用は、安全で、忍容性が良好で、潜在的に有効な細胞療法であると考えられるため、現在、関心が高まりつつある。樹状細胞は、成熟の段階及び分泌されるサイトカインのパターンに依っては、T細胞応答の強力なモジュレーターであることが認識されている。
【0010】
最近、ex vivoで大量の樹状細胞を調製する可能性が開発されて以来、免疫療法における、そして細胞ワクチンとしてのこれらの細胞の使用には、ますます関心が集まってきている。
【0011】
本発明の目的の一つは、Th1免疫応答にとって好都合な新規の樹状細胞を作製することである。
【0012】
本発明のもう一つの目的は、容易に、かつ迅速に得ることができる新規の単離された樹状細胞を得ることである。
【0013】
本発明のもう一つの目的は、最適な活性を保持しつつ、使用まで保存し、適切なタイミングで患者へ注射することができる新規の樹状細胞を提供することである。
【0014】
本発明は、以下の特徴を示す、不可逆的に成熟化へと誘発された樹状細胞に関する。
− CD14陽性である。
− 免疫蛍光染色及びフローサイトメトリー分析により決定されるように、約1500未満のメディアン蛍光強度(median fluorescence intensity)のMHCクラスI、及び約500未満のメディアン蛍光強度のCD86を発現する。
【0015】
「成熟化」という用語は、細胞の表現型及び機能の修飾をもたらす、未熟な高度に貪食性の樹状細胞の活性化と定義される。特に、細胞は、高レベルのサイトカインを産生するという特性を獲得し、貪食能を喪失する。
【0016】
「不可逆的に成熟化へと誘発された樹状細胞」という用語は、低いサイトカインの分泌及びCD14の発現のような未熟の特徴を有するが、任意の細胞培養培地中で成熟するであろう細胞と定義される。
【0017】
「メディアン蛍光強度」という用語は、細胞試料中の各蛍光色素についての相対蛍光強度と定義される。検出のため使用されるモノクローナル抗体が、蛍光色素と直接カップリングされる(Boyerら、Exp. Hematol., 27, 751-761,1999)。
【0018】
フローサイトメーターは、これらのパラメーターの相対差を検出するためのものであり、単位測定に関する絶対的なデータは提供しない。Becton Dickinson Immunocytometry Systems, Computer Based Training、Volume I "Flow Cytometry and Immunology Basics"からのFACS(商標)Academyによると:「フローサイトメーターは、粒子に関連したサイズ、相対粒度及び蛍光の差が存在すれば、それらを検出する。[...]レーザー光のビームが、セルを横切って投射される。同時に、レーザー光が粒子に当たり、粒子中又は粒子上に存在するあらゆる蛍光が蛍光を発するであろう。一度励起されると、放射される蛍光シグナルの強度は、粒子中の蛍光化合物の量に比例するはずである。」
【0019】
本発明の誘発された樹状細胞は、CD14陽性であり、約1500未満のメディアン蛍光強度のMHCクラスI、及び約500未満のメディアン蛍光強度のCD86を発現する(これらの特性は、全て、未熟の特徴に相当する)。
【0020】
本発明の樹状細胞は、未熟樹状細胞のように、低レベルのIL−12p70及びIL−10を分泌する。本発明の特定の態様によると、不可逆的に成熟化へと誘発された樹状細胞は、106細胞/mlについてElisaアッセイにより決定されるように、約3000pg/ml未満のIL−12p70及び500pg/ml未満のIL−10を分泌する。
【0021】
本発明のより具体的な態様によると、不可逆的に成熟化へと誘発された樹状細胞は、以下の特徴を示す。
− CD14陽性である。
− (免疫蛍光染色及びフローサイトメトリー分析により決定されるように)約700未満のメディアン蛍光強度のMHCクラスI、及び約300未満のメディアン蛍光強度のCD86を発現する。
− (106細胞/mlについてElisaアッセイにより決定されるように)約80pg/ml未満のIL−12p70及び約300pg/ml未満のIL−10を分泌する。
【0022】
具体的な態様によると、本発明の不可逆的に成熟化へと誘発された樹状細胞は、CD83陰性である。この発現の欠如は、未熟表現型の特徴である。
【0023】
もう一つの態様によると、本発明の樹状細胞は、以下の特徴を示す。
免疫蛍光染色及びフローサイトメトリー分析により決定されるような、
− 約3〜20のメディアン蛍光強度のCD83発現
− 約20〜100のメディアン蛍光強度のCD14発現
− 約400〜700のメディアン蛍光強度のMHCクラスI発現
− 約100〜300のメディアン蛍光強度のCD86発現:及び
計106細胞/mlについてELISAアッセイにより決定されるような、
− 1〜約80pg/mlのIL−12p70分泌
− 約15〜300pg/mlのIL−10分泌。
【0024】
不可逆的に成熟化へと誘発された樹状細胞は、成熟表現型及び未熟表現型の両方の特徴を示す。
【0025】
CD83の発現範囲、CD14の欠如、及びIL−12の高度の分泌は、成熟表現型の特徴である。
【0026】
CD14の発現範囲及びCD83の欠如は、未熟表現型の特徴である(概説については、Banchereauら、2000, Ann. Rev. Immunol.を参照のこと)。
【0027】
本発明の樹状細胞は、1〜16時間、好ましくは6時間培養された血中単球由来の未熟樹状細胞より生ずる。
【0028】
もう一つの態様によると、本発明の樹状細胞は、成熟過程を阻止することができ、この阻止の後、適切な条件下で生育させられた場合に成熟を再開させることができるという特性を有する。
【0029】
例えば癌の処置のため、該樹状細胞を患者へ注射することができるため、この特性は極めて興味深い。特に、患者から採取された自己細胞を成熟因子により処理して本発明の樹状細胞を得て、それらを注射まで保存することが可能である。それらは、患者の組織において完全に成熟する。
【0030】
本発明のもう一つの態様によると、該樹状細胞は、十分な培養時間で、成熟因子及びサイトカインを含有しない培養培地中でin vitroで成熟化するという特性を有する。
【0031】
「成熟因子及びサイトカインを含有しない」という表現は、培養培地が、IFNγ、ポリI:C、CD40リガンド又はCD40抗体、多糖、TNFα、FLAT3リガンド等のような、一般に使用されている成熟因子及びサイトカインを欠いていてもよいことを意味する。
【0032】
「十分な培養時間」という表現は、該細胞が成熟樹状細胞の特徴を獲得するのに十分な時間、実際には16〜40時間を意味する。一般的に述べると、それは、これらの細胞が、低下した抗原捕捉能及び増加した抗原提示能を示すことを意味する。特に、成熟した細胞は、約1000pg/ml超のIL−12p70を分泌し、Th1免疫応答を誘導する能力を獲得している。
【0033】
本発明のもう一つの態様によると、該樹状細胞は、患者への注射の後、in vivoで成熟化するという特性を有する。
【0034】
患者へin vivo注射された場合、該樹状細胞は、成熟を完了し、有効な特異的T細胞の刺激に必要なサイトカインを産生するであろう。患者の血清は、該細胞の成熟に適切な培地である。注射後、樹状細胞は、活性化の進行をたどりながら、T細胞エリアへ遊走する。本発明の目的は、実務者が、細胞傷害性T細胞免疫応答の誘導のために最適に有効な樹状細胞を注射することを可能にする。
【0035】
本発明は、薬物、核酸又は目的の抗原、例えば腫瘍抗原が負荷された樹状細胞にも関する。本発明の樹状細胞は、腫瘍細胞、特に黒色腫腫瘍細胞系の溶解物を負荷させることができる(実施例9参照)。
【0036】
細胞は、当業者に既知の方法に従い、貧食作用、飲作用、親和性結合、融合、核酸(DNA、RNA)による導入又は受容体媒介取り込みにより、抗原を負荷させてもよい。
【0037】
もう一つの態様によると、本発明の樹状細胞は、TヘルパーCD4+T細胞の発生を促進し、ある抗原と貪食樹状細胞との事前の接触の後、該抗原に特異的な細胞傷害性CD8+Tリンパ球を活性化する。
【0038】
細胞傷害性CD8+Tリンパ球の活性化は、これらの細胞によるIFNγの分泌を誘導する。従って、Th1応答の誘導は、IFNγ放出に関するElispotアッセイにより追跡することができる。
【0039】
機能的には、これらの樹状細胞は、未熟樹状細胞がCD8 T細胞応答を生成させ持続させることができない条件である、CD4の支援の非存在下、そして付加的な外因性サイトカインが存在しない場合ですら、抗原特異的CD8 T細胞をin vitroで生成させる力が極めて強い(実施例5及び6参照)。
【0040】
本発明は、適切な凍結保存培地中の凍結形態の、不可逆的に成熟化へと誘発された樹状細胞の組成物にも関する。
【0041】
適切な培地は、例えば10%自己血清+10%ジメチルスルホキシドを含むリン酸緩衝食塩水から構成される(実施例9参照)。
【0042】
本発明の細胞は、使用まで−80℃未満の温度で凍結状態で維持することができ、このことは、産業上の有利な効果である。
【0043】
本発明は、血中単球由来の未熟樹状細胞を、2個の因子:
a − サイトカイン又はサイトカインのアゴニスト又はサイトカイン誘導因子、並びに
b − 細菌の膜画分及び/もしくはリボソーム画分の混合物、又はサイトカインとは異なるリガンドもしくはアゴニスト、
の組み合わせと接触させ、1〜16時間、好ましくは6時間、それらをインキュベートするステップを含む、CD14陽性であり、(免疫蛍光染色及びフローサイトメトリー分析により決定されるように)約1500を下回るメディアン蛍光強度のMHCクラスI、及び約500を下回るメディアン蛍光強度のCD86を発現するという特徴を示す、不可逆的に成熟化へと誘発された樹状細胞を得るための方法にも関する。
【0044】
本発明の具体的な態様において、記載されたような方法によって、CD14陽性であり、(免疫蛍光染色及びフローサイトメトリー分析により決定されるように)約700を下回るメディアン蛍光強度のMHCクラスI、及び約300を下回るメディアン蛍光強度のCD86を発現し、(106細胞/mlについてElisaアッセイにより決定されるように)約80pg/ml未満のIL−12p70及び約300pg/ml未満のIL−10を分泌するという特徴を示す、不可逆的に成熟化へと誘発された樹状細胞が得られる。
【0045】
2個の因子の組み合わせは、好ましくは、IFNγのようなサイトカイン及び細菌膜画分より構成される。
【0046】
カイネティクス研究によって、本発明者らは、未熟樹状細胞の成熟剤との短期in vitro接触が、成熟過程を誘発するのに十分であり、次いで、成熟剤の除去後、成熟化過程が自然に進行し、完全に成熟化を完了することを証明した。実施例6に示されるように、6時間のインキュベーションが、所定の抗原に特異的なCD8細胞を生成させ得る樹状細胞を産生するための最適な時間である。実施例4及び8に示されるように、成熟剤との短時間インキュベーションは、高レベルのIL−10分泌を誘導するのに十分ではない。
【0047】
16時間のインキュベーションの後、得られる細胞は、成熟の特徴を示し、従って不可逆的に成熟化へと誘発された樹状細胞の定義を満たさない。
【0048】
「細菌膜」という用語は、内側の細胞質膜と定義され、それには膜間空間が含まれ、外側の膜は除外される。膜の概略図は、"Drugs, 1997, Adis international limited"の34頁の図2に示されている。
【0049】
「膜抽出物」という用語は、同一膜画分に富んだ細菌抽出物と定義される。膜抽出物又は膜画分とは、細菌培養物から精製又は部分精製された、これらの膜を含有するあらゆる抽出物又は画分に相当する。そのような抽出物の調製の方法は、培養後に得られた細菌の溶解のステップ、及び具体的には遠心分離又はろ過による、細菌膜含有画分の分離のステップを少なくとも含む。
【0050】
「リボソーム抽出物」という用語は、リボソーム画分、具体的には一本鎖及び/又は二本鎖のリボ核酸を含有する細菌抽出物と定義される。リボソーム抽出物又はリボソーム画分とは、細菌培養物から精製又は部分精製された、リボソームを含有するあらゆる抽出物に相当する。そのような抽出物の調製の方法は、培養後に得られた細菌の溶解のステップ、及び具体的には遠心分離又はろ過による、全溶解物からの細菌リボソーム含有画分の分離のステップを少なくとも含む。
【0051】
ポリIC、CD40のリガンド、抗CD40抗体、内毒素、生細菌、リポ多糖、培養上清、TNFαを含むアゴニスト性サイトカインのカクテルのような、樹状細胞の成熟化のため使用されるいくつかの既知の作用物質が存在する。インターフェロン−γは、樹状細胞の成熟特徴及び刺激性表現型を増大させるよう、成熟剤と相乗的に作用する。
【0052】
リボムニル(Ribomunyl)(登録商標)(国際的な非登録名又は一般名称:細菌のリボソーム画分及び膜画分、膜プロテオグリカン)は、非特異的な天然の免疫刺激効果があることで知られている。それは、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)に由来するプロテオグリカン(凍結乾燥物の用量中0.015mg)、及び4つの異なる細菌株、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)(35部)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)(30部)、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)A群(30部)及びヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)(5部)に由来する70%RNAを含有するリボソーム画分(凍結乾燥物の用量中0.01mgのリボソーム抽出物)の両方を含有している。リボムニルは、多形核細胞(PMN)及びマクロファージに作用することにより一般的な自然免疫応答を刺激すること、いくつかのサイトカイン(IL−1、IL−6、IL−8、TNFα、CSF)の産生を増加させること、そしてナチュラルキラー細胞を活性化し得ることが示されている。
【0053】
熱ショックタンパク質70は、いくつかの単球のための潜在的な成熟因子として同定されている(Kuppnerら、2001);それは、未熟樹状細胞を成熟化へと誘発するため、ポリI:C又はサイトカインと有効に組み合わせることができる。
【0054】
本発明は、CD83陰性である、不可逆的に成熟化へと誘発された樹状細胞の調製のための方法にも関する。
【0055】
本発明の具体的な態様において、本法において使用されるサイトカインはIFNγであってよく、使用されるサイトカイン誘導因子はポリI:Cであってもよい。
【0056】
ポリI:CはIFNγの分泌を誘導する。
【0057】
本発明の具体的な態様において、使用される細菌の膜画分及び/又はリボソーム画分の混合物は、一つの細菌株の膜亜画分である。もう一つの態様において、膜亜画分は、該膜亜画分から得られた精製されたタンパク質であり得る。
【0058】
本発明の具体的な態様において、使用される細菌の膜画分及び/もしくはリボソーム画分の混合物は、リボムニル(登録商標)(Inava Laboratory, Pierre Fabre)である。
【0059】
リボムニルとIFNγとの組み合わせは、リボムニル単独の使用より樹状細胞によるIL−12分泌を誘導する効果がより高い(実施例3参照)。
【0060】
本発明の具体的な態様において、使用される膜亜画分は、FMKp(クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)膜画分)である。本発明の方法におけるリボムニルまでのFMKpの使用は、得られる樹状細胞によるサイトカインのより顕著な分泌をもたらす(実施例1C、3A及び3Bの結果を、実施例7Cと比較すること)。
【0061】
特に、方法において使用されるサイトカインはIFNγであり、膜亜画分はFMKpである。好ましくは、IFNγの濃度は約500U/mlであり、FMKpの使用濃度は約1μg/mlである。
【0062】
本発明の特定の態様において、使用されるリガンドは、抗CD40抗体又はCD40リガンドである。
【0063】
本発明の具体的な態様において、使用されるリガンドは、誘導性熱ショックタンパク質70又はそれに由来する単離されたポリペプチド配列である。
【0064】
本発明は、本願に記載された方法に従って得られる、不可逆的に誘発された樹状細胞にも関する。本発明は、IL−10の分泌より高度のIL−12p70の分泌を有する、即ち、IL−12p70/IL−10分泌比が1を上回っている成熟樹状細胞にも関する。特に、本発明は、少なくとも24時間に(106細胞/mlについてElisaアッセイにより決定されるように)約1000pg/ml超のIL−12p70、及び約100pg/ml未満のIL−10を分泌し、かつTh1免疫応答及び細胞傷害性免疫応答を刺激する成熟樹状細胞に関する。
【0065】
関連した表現型の修飾は、CD80、CD86、CD83、MHCクラスI及びII分子の細胞表面発現の増加、並びにCD14の表面発現の減少である。機能的な変化は、貪食特性の喪失、遊走能の獲得、並びにサイトカイン及びケモカインの発現プロファイルの変化、特に増加したIL−12分泌である。
【0066】
本発明は、in vitro又はin vivoで、外因性の成熟因子又はサイトカインを添加せずに、該不可逆的に誘発された樹状細胞を培養するステップを含む、不可逆的に成熟化へと誘発された樹状細胞から成熟樹状細胞を調製するための方法にも関する。
【0067】
本発明は、本法により得られるような、前記定義の成熟樹状細胞にも関する。
【0068】
本発明は、薬学的に許容される媒体と共に、内在化された抗原、好ましくはワクチン抗原を有する不可逆的に成熟化へと誘発された樹状細胞を活性物質として含有している医薬組成物にも関する。
【0069】
「ワクチン抗原」という用語は、免疫応答を誘導する抗原と定義される。
【0070】
本発明に係る樹状細胞は、正確なT細胞亜集団に対して作用することができる。これは、本発明に係る樹状細胞が、Th2/Th1免疫応答を刺激又は調節し得ることを意味する。従来技術において記載された樹状細胞は、in vivoで抗原特異的なT細胞の増殖を誘導し、従って抗原特異的な細胞傷害性の増加及び免疫刺激をもたらすのみならず、in vivoで調節T細胞を誘導し、従って抗原特異的な細胞傷害性T細胞の阻害を誘導し、特異的抗原に対する非応答性をもたらすこともできる。
【0071】
本発明の樹状細胞は、主としてTh1免疫応答を介した強い免疫刺激特性のみを保有しており、臨床的なワクチン使用に適している。
【0072】
誘導される免疫応答は、所定の病原体又は腫瘍の減少又は排除をもたらす、それらに対するin vivoの臨床的な免疫応答を特徴とし得る。in vitroでは、これは、樹状細胞の場合、抗原特異的なCD8細胞傷害性Tリンパ球の免疫刺激アッセイにおいて測定され得る。
【0073】
本発明は、1ワクチン用量当たり約104〜109、好ましくは約105〜107の量で、不可逆的に成熟化へと誘発された樹状細胞を活性物質として含有している細胞ワクチン組成物にも関する。
【0074】
「細胞ワクチン組成物」という用語は、ワクチン抗原のプロセシングを行い、それらを提示している樹状細胞と定義される。
【0075】
使用された略語:
抗CD40mAb=CD40に対するモノクローナル抗体
DC=樹状細胞
FMKp=クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)膜画分
HLA−ABC=組織適合性クラスI分子
iDC=未熟樹状細胞
IFNγ=インターフェロンガンマ
Isot Ctr=アイソタイプコントロール
IVS=in vitro刺激
MFI=メディアン蛍光強度
ポリI:C=ポリリボイノシン酸ポリリボシチジル酸
RBL=リボムニル(登録商標)
【0076】
図1A、1B、1C:
リボムニル(登録商標)及びIFNγにより誘発された樹状細胞は、完全に成熟化するよう方向付けられている。
【0077】
未熟樹状細胞を、リボムニル(RBL)+IFNγと共に6時間インキュベートし、洗浄し、さらに34時間培養した。
【0078】
白抜き棒グラフは、6時間目の時点での測定を表し(RBL+IFNγによる6時間の誘発の後)、黒棒グラフは、40時間目の時点での測定を表す(RBL+IFNγによる6時間の誘発、及び成熟因子なしの34時間の培養の後)。
【0079】
成熟化を追跡するため、樹状細胞を、抗CD14抗体、抗CD83抗体、抗HLA−ABC抗体及び抗CD86抗体で染色し、フローサイトメーターで蛍光を分析した。6時間目及び24時間目の時点でのマーカーCD14、CD83(1A)、HLA−ABC及びCD86(1B)の発現が、メディアン蛍光強度任意の単位として表されている(Y軸)。
【0080】
培養上清中のIL−10及びIL−12p70の濃度を、ELISAにより、6時間目及び40時間目の時点で測定し(1C)、pg/ml/106細胞の単位で表した(Y軸)。
【0081】
図2A、2B、2C:
ポリI:C及び抗CD40抗体により誘発された樹状細胞は、完全に成熟化するよう方向付けられている。
【0082】
未熟樹状細胞を、抗CD40mAb+ポリI:Cと共に6時間インキュベートし、洗浄し、さらに34時間培養した。
【0083】
白抜き棒グラフは、6時間目の時点での測定を表し(ポリI:C+抗CD40mAbによる6時間の誘発の後)、黒棒グラフは、40時間目の時点での測定を表す(ポリI:C+抗CD40mAbによる6時間の誘発、及び成熟因子なしの34時間の培養の後)。
【0084】
成熟化を追跡するため、樹状細胞を、抗CD14抗体、抗CD83抗体、抗HLA−ABC抗体及び抗CD86抗体で染色し、フローサイトメーターで蛍光を分析した。
【0085】
マーカーCD14、CD83(2A)、HLA−ABC及びCD86(2B)の発現が、メディアン蛍光強度任意の単位として表されている(Y軸)。
【0086】
培養上清中のIL−10及びIL−12p70の濃度を、ELISAにより、6時間目及び40時間目の時点で測定し(2C)、pg/ml/106細胞の単位で表した(Y軸)。
【0087】
図3A、3B:
リボムニル単独と、IFNγと併用されたリボムニルの樹状細胞によるサイトカイン分泌に対する成熟化効果の比較。
【0088】
未熟樹状細胞を、RBL単独又はRBL+IFNγと共に6時間インキュベートし、洗浄し、さらに34時間培養した。
【0089】
白抜き棒グラフは、6時間目の時点での測定を表し(RBL+IFNγ又はRBLによる6時間の誘発の後)、黒棒グラフは、40時間目の時点での測定を表す(RBL+IFNγ又はRBLによる6時間の誘発、及び成熟因子なしの34時間の培養の後)。
【0090】
培養上清中のIL−12p70(3A)及びIL−10(3B)の量を、ELISAにより、6時間目及び40時間目の時点で測定した。サイトカインの濃度は、pg/ml/106細胞の単位で表されている(Y軸)。
【0091】
図4:
IL−10の分泌は、RBL+IFNγの存在下での比較的長い樹状細胞のインキュベーション時間を必要とする。
【0092】
未熟樹状細胞を、
− RBL+IFNγと共に6時間インキュベートし、洗浄し、さらに34時間培養するか、又は
− RBL+IFNγと共に40時間インキュベートした。
− RBL+IFNγによる6時間の刺激の後(黒棒グラフ/白点)、
− RBL+IFNγによる6時間の刺激を含む、40時間の培養の後(白抜き棒グラフ/黒点)、
− RBL+IFNγによる40時間の刺激の後(白抜き棒グラフ/黒斜線)、
培養上清中の分泌されたIL−10の量を、ELISAにより測定した。IL−10の濃度は、pg/ml/106細胞の単位で表されている(Y軸)。
【0093】
図5:
ペプチド抗原でパルス処理された誘発された樹状細胞は、外因性サイトカインの非存在下ですら、抗原特異的CD8 T細胞を生成させ得る。
【0094】
未熟樹状細胞を、抗CD40mAb+ポリI:C又はRBL+IFNγの存在下で6時間インキュベートした。成熟時間の終了直前に細胞をペプチドでパルス処理し、次いで採集し、洗浄し、CD8 T細胞を刺激するために使用した。パルス処理樹状細胞によるin vitro刺激の後、CD8 T細胞によるIFNγ放出を、Melan−Aペプチドでパルス処理されたT2細胞を刺激剤として使用したELISPOTアッセイによりアッセイした。
【0095】
異なる記号は、各ドナーを表す。棒グラフは、各条件についての平均値を示す。Y軸は、特異的スポット形成細胞の数を示す。
【0096】
図6:
RBL+IFNγとの6時間のインキュベーションにより誘発された樹状細胞は、抗原特異的エフェクターCD8 T細胞の生成にとって最適である。
【0097】
未熟樹状細胞を、成熟化刺激の非存在下(iDC)、又はRBL+IFNγの存在下で、3時間、6時間又は16時間インキュベートした。細胞を成熟化時間の終了直前にペプチドでパルス処理し、次いで採集し、洗浄し、CD8 T細胞を刺激するために使用した。ペプチドパルス処理樹状細胞による2回の刺激の後、CD8 T細胞によるINFγ放出を、Melan−Aペプチドでパルス処理されたT2細胞を刺激剤として使用したELISPOTアッセイによりアッセイした。
【0098】
異なる記号は、各ドナーを表す。棒グラフは、各条件についての平均値を示す。Y軸は、特異的スポット形成細胞の数を示す。
【0099】
図7A、7B、7C:
FMKp及びINFγにより誘発された樹状細胞は、完全に成熟化するよう方向付けられている。
【0100】
未熟樹状細胞を6時間FMKp及びIFNγで処理した。細胞を6時間目に洗浄し、直ちに分析するか、又は24時間目の時点まで成熟因子の非存在下でさらに培養した。
【0101】
白抜き棒グラフは、6時間の時点での測定を表し(FMKp+IFNγによる6時間の誘発の後)、黒棒グラフは、24時間の時点での測定を表す(FMKp+IFNγによる6時間の誘発、並びに成熟因子なしの18時間の培養の後)。
【0102】
成熟化を追跡するため、両方の時点で、樹状細胞をマーカーCD14及びCD83(7A)、並びにHLA−ABC及びCD86(7B)の発現に関して分析した。マーカーの発現が、メディアン蛍光強度任意の単位として表されている(Y軸)。
【0103】
両方の時点で、培養上清中のIL−10及びIL−12p70の濃度をELISAにより測定し(7C)、pg/ml/106細胞の単位で表した(Y軸)。
【0104】
図8:
樹状細胞によるIL−10分泌は、FMKp+IFNγの存在下での細胞の長時間インキュベーションを必要とする。
【0105】
未熟樹状細胞を、3時間、6時間又は40時間、FMKp及びIFNγにより処理した。3時間目又は6時間目に刺激された細胞を洗浄し、3時間目又は6時間目の時点で分析するか、又は成熟因子なしの培地中でさらに生育させ、次いで24時間目の時点でIL−10分泌を測定した。
【0106】
− FMKp+IFNγによる3時間の刺激の後(白抜き棒グラフ)、
− FMKp+IFNγによる6時間の刺激の後(白抜き棒グラフ/黒点)、
− FMKp+IFNγによる3時間の刺激を含む24時間の培養の後(黒棒グラフ)、
− FMKp+IFNγによる6時間の刺激を含む24時間の培養の後(黒棒グラフ/白点)、
− FMKp+IFNγによる24時間の刺激の後(白抜き棒グラフ/黒斜線)、
培養上清中の分泌されたIL−10をELISAにより測定した。
【0107】
IL−10の濃度が、pg/ml/106細胞の単位で表されている(Y軸)。
【0108】
図9:
樹状細胞への黒色腫細胞溶解物の負荷、及びその後の凍結/解凍ステップは、成熟過程を混乱させない。
【0109】
未熟樹状細胞に一夜インキュベーションによりColo829溶解物を負荷させ、次いでFMKp及びIFNγにより6時間処理した。洗浄後、細胞を4%アルブミン/DMSO中で凍結させ、次いで解凍させた。
【0110】
新鮮に解凍させた細胞を、アルブミン4%に再懸濁させ、1mlシリンジ内で4℃で2時間インキュベートし、シリンジの振とう後に細胞を25G針に通し、成熟刺激なしの完全AIMV培地中で18時間培養した。
【0111】
− Colo829溶解物の負荷、及びFMKp+IFNγとの6時間のインキュベーションの後(白抜き棒グラフ)、
− Colo829溶解物の負荷、FMKp+IFNγとの6時間のインキュベーション、凍結、解凍、及びAIMV培地中での18時間の培養の後(黒棒グラフ)、
IL−12p70及びIL−10の分泌をELISAによりアッセイした。
【0112】
培養上清中のIL−12p70及びIL−10の濃度が、pg/ml/106細胞の単位で表されている(Y軸)。
【0113】
実施例:
使用された略語:
抗CD40mAb=CD40に対するモノクローナル抗体
DC=樹状細胞
FMKp=クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)膜画分
HLA−ABC=組織適合性クラスI分子
IDC=未熟樹状細胞
IFNγ=インターフェロンガンマ
IVS=in vitro刺激
MFI=メディアン蛍光強度
PBS=リン酸緩衝生理食塩水
ポリI:C=ポリリボイノシン酸ポリリボシチジン酸
RBL=リボムニル(登録商標)
【0114】
実施例1:リボムニル(登録商標)及びIFNγにより誘発された樹状細胞は、ex vivo培養後に完全に成熟化するよう方向付けられている
樹状細胞:
未熟樹状細胞を、特許出願WO97/44441、及びBoyerら(Exp. Hematolo., 1999, 27, 751-761)に従って、末梢血単球の培養により調製し、水簸(elutriated)した。簡単に説明すると、500U/ml GM−CSF(Leucomax, Novartis Pharma)及び50ng/ml IL−13(Sanofi Synthelabo)が補足されたAIMV培地(=完全AIMV培地)中で樹状細胞を分化させ、7日間の培養後に水簸した。
【0115】
成熟化:
樹状細胞を、リボムニル(1ug/ml)及びIFNγ(500U/ml)の存在下で6時間、完全AIMV培地(Life Technologies, Paisley PA49RF, GB)中で培養した。凍結乾燥リボムニル(登録商標)(Inava Laboratory, Pierre Fabre, Paris, France)の各バイアルは、K.ニューモニエ(pneumoniae)、S.ニューモニエ(pneumoniae)、S.ピオゲネス(pyogenes)及びH.インフルエンザ(influenzae)に由来するリボソーム画分0.010mg及びK.ニューモニエ(pneumoniae)に由来する膜画分0.015mgを含有している。IFNγ(Imukin)は、ベーリンガーインゲルハイムフランス(Boehringer Ingelheim France)より入手した。6時間目に細胞を洗浄し、40時間目の時点まで(成熟因子の非存在下で)完全AIMV培地中でさらに培養した。
【0116】
表現型分析:
成熟化を追跡するため、樹状細胞を、6時間及び40時間の時点で、CD83、CD86、CD14及びHLA−ABCマーカーの発現に関して分析した。樹状細胞を、1%ウシ胎仔血清が補充されたリン酸緩衝食塩水(PBS)に懸濁させた。細胞を、以下のFITC又はPEとコンジュゲートした特異的モノクローナル抗体又はアイソタイプマッチコントロール:抗CD83、CD86、MHCクラスI、マウスIgG2b、マウスIgG2a(Immunotech, Marseille, France)、抗CD14(Becton Dickinson, St Jose, CA)と共に、氷上で30分間インキュベートした。次いで、細胞をPBSで洗浄し、3nMのTO−PRO3を含有するPBSに再懸濁させ、分析から死細胞を排除した。
【0117】
フローサイトメトリー分析は、CellQuestソフトウェアと共にBecton Dickinsonサイトメーターを用いて実施した。結果は、メディアン蛍光強度(MFI)値(任意の単位)として表される。
【0118】
サイトカイン検出:
6時間及び40時間の時点で、製造業者の指示に従いR&D Systems Europe(Abingdon, UK)の抗体対を使用して実施された市販のELISAにより、培養上清を、IL−12p70及びIL−10の分泌に関してELISAによりアッセイした。
【0119】
結果:
結果は、図1A(CD14及びCD83の発現);1B(HLA−ABC及びCD86の発現);1C(サイトカイン分泌)に示される。FACS分析に関するネガティブコントロール(アイソタイプコントロール)が示される。
【0120】
成熟因子との6時間のインキュベーションの後、樹状細胞は、未熟細胞の特徴を示す:細胞は、CD14を発現するが、CD83は極少量しか発現しない。HLA−ABC及びCD86は有意にアップレギュレートされない。IL−12p70及びIL−10の分泌は極めて低い。
【0121】
洗浄及び40時間目までのさらなる培養の後、細胞は成熟細胞の特徴を示す:それらは、CD14陰性であり、蛍光強度49のCD83(約95%陽性細胞)、蛍光強度3460のHLA−ABC、及び蛍光強度1640のCD86を発現する。IL−12p70分泌は劇的に増加するが、IL−10分泌は低いままである。
【0122】
結論として、樹状細胞は、RBL+IFNγとの6時間のインキュベーションの間に成熟化へと誘発された後、成熟因子の非存在下での培養中に成熟化する。
【0123】
実施例2:ポリI:C及び抗CD40抗体により誘発化された樹状細胞は、ex vivo培養後に完全に成熟化するよう方向付けられている
実施例1に記載されたようにして、未熟樹状細胞を調製した。
【0124】
樹状細胞を、抗CD40抗体(2μg/ml)及びポリI:C(100μg/ml)の存在下で完全AIMV培地中で6時間インキュベートし、次いで洗浄し、さらに34時間培養した。
【0125】
表現型及びサイトカイン分泌を、実施例1に記載されたようにして分析した。
【0126】
結果:
結果は、図2A(CD14及びCD83の発現);2B(HLA−ABC及びCD86の発現);2C(サイトカイン分泌)に示される。FACS分析に関するネガティブコントロール(アイソタイプコントロール)が示される。
【0127】
組み合わせRBL+IFNγについて示されたのと同様に、抗CD40mAb及びポリI:Cとの6時間のインキュベーションは、樹状細胞成熟化を誘発するのに十分であった。6時間目の時点で、細胞は未熟特徴を示すが、洗浄及び成熟因子なしでの34時間の培養の後、樹状細胞は、高レベルのHLA−ABCを発現し、IL−12p70(85pg/ml)を分泌するが、IL−10は少量(20pg/ml)しか分泌しない。
【0128】
実施例3:樹状細胞によるサイトカイン分泌に対するリボムニル単独と、IFNγと併用されたリボムニルの成熟化効果の比較
未熟樹状細胞を、(実施例1に記載されたような)RBL+IFNγ、又はRBL単独(1μg/ml)により6時間処理した。以前に記載されたようにして、6時間目及び40時間目の時点でサイトカイン分泌をアッセイした。
【0129】
結果:
結果は、図3A(IL−12p70分泌);3B(IL−10分泌)に示される。
【0130】
0〜6時間目(白抜き棒グラフ)には、顕著なIL−12分泌は誘導されなかった。IL−10分泌は、低いままである(未熟DCは、通常少量のIL−10を分泌する)。成熟因子及びサイトカインを含まないさらなる34時間の培養の間、RBL単独と共にインキュベートされた未熟樹状細胞は、IL−12p70(400pg/ml/106細胞)及びIL−10(140pg/ml)を分泌し、樹状細胞を成熟化へと誘発するために使用されたRBLとIFNγとの組み合わせは、より高いIL−12p70(1500pg/ml/106細胞)の分泌及び低下したIL−10分泌(31pg/ml)をもたらす。2個の因子の組み合わせは、IL−12p70分泌とIL−10分泌との間の高い比率を示す樹状細胞を得ることを可能にする。
【0131】
実施例4:IL−10の分泌は、RBL+IFNγの存在下でのより長い樹状細胞のインキュベーション時間を必要とする
未熟樹状細胞をRBL+IFNγにより6時間処理し、次いで洗浄し、成熟因子及びサイトカインなしで34時間さらに培養するか、又は同じ成熟因子により40時間処理した。サイトカイン分泌を、ELISAにより6時間目及び40時間目にアッセイした。
【0132】
結果:
結果は、図4に示される;6時間の処理の後には、わずか20pg/mlのIL−10が分泌され、洗浄後の34時間の間にわずか31pg/mlが分泌されたが、40時間の間中、成熟刺激の存在下で細胞をインキュベートした場合には、1150pg/mlが分泌され得た。従って、本発明者らは、成熟刺激の存在下での長いインキュベーション時間は、より高いIL−10分泌をもたらすであろうとの結論を得た。樹状細胞の短時間のインキュベーションは、成熟化現象中の限定されたIL−10分泌をもたらす。この成熟の方法は、主としてIL−12を分泌する成熟樹状細胞を入手することを可能にする。
【0133】
実施例5:ペプチド抗原でパルス処理された誘発された樹状細胞は、ELISPOTにより測定されるようにIFNγを放出するよう抗原特異的T細胞を刺激する
実施例1に記載されたようにして、未熟樹状細胞を調製した。
【0134】
樹状細胞を、RBL+IFNγ又は抗CD40mAb+ポリI:Cの存在下で完全AIMV培地中で6時間生育させるか、又はそうしなかった。成熟化時間の終了前に細胞をペプチドでパルス処理し、次いで採集し、洗浄し、CD8 T細胞を刺激するために使用した。
【0135】
Melan−A特異的CTLの生成
樹状細胞を、37℃で、Melan−Aペプチド(10μg/ml)及びβ2ミクログロブリン(5μg/ml)で2時間パルス処理し、パルス処理の最後の30分間にマイトマイシンC(25μg/ml)で処理し、3回洗浄した。精製された自己CD8 T細胞(1.5×105/ウェル)を、外因性サイトカインの非存在下で、完全培地(10%自己血清、アルギニン、アスパラギン及びグルタミンが補充されたイスコブ(Iscove's)培地)中でマイクロウェル内でペプチドパルス処理DC(3×104/ウェル)と混合した。全ての実験において、各樹状細胞条件について8個のCD8ミクロ培養物を刺激した。
【0136】
7日目、前日に解凍させ6時間成熟させた自己樹状細胞を、Melan−Aペプチドでパルス処理し、やはり外因性サイトカインの非存在下でCD8 T細胞を再刺激するために使用した。
【0137】
IFNγ放出に関するELISPOTアッセイ
DC−ペプチドによる2回のin vitro刺激(IVS)により生成したCD8 T細胞を、予め一次抗IFNγmAb(300 CD8/ウェル)でコーティングされたニトロセルロース96穴プレートに添加した。個々のミクロ培養物を、デュプリケートでテストした。Melan−Aペプチド(又はコントロールペプチドとしてのPSA1)でパルス処理されたHLA−A2 pos.刺激剤(T2又は自己EBV-B細胞)を5×104/ウェルで添加した。PHA−Lで刺激されたT細胞をポジティブコントロールとして使用した。37℃における20時間のインキュベーションの後、プレートを洗浄し、IFNγに対するビオチン化二次mAbと共にインキュベートし、Vectastain Eliteキットで染色した。スポット形成細胞をELISPOTリーダーで計数した。標的細胞+コントロールペプチドで刺激されたT細胞からのバックグラウンドは、分析のために差し引かれ、決して重要ではなかった。
【0138】
結果:
結果は図5に示され、CD8 T細胞300個に関する「特異的スポット形成細胞」により表される。外因性サイトカインの非存在下では、未熟樹状細胞は、抗原特異的エフェクターT細胞を生成させることができない。しかしながら、成熟化へと誘発された樹状細胞は、抗原特異的CD8 T細胞を感作することができる。RBL+IFNgで誘発された樹状細胞は極めて効率的であるが、ポリI:C+Ab抗CD40で誘発された樹状細胞は、適度の応答を誘導した。
【0139】
実施例6:RBL+IFNγとの6時間のインキュベーションにより誘発された樹状細胞は、IFNγ ELISPOTにより測定されるように、最適に抗原特異的T細胞を刺激する
未熟樹状細胞を、RBL+IFNγで、異なる時間(0、3、6及び16時間)処理し、実施例5に記載されたようにしてMelan−Aペプチドでパルス処理した。簡単に説明すると、細胞を成熟化時間の終了前にペプチドでパルス処理し、次いで採集し、洗浄し、外因性サイトカインの非存在下でCD8 T細胞を刺激するために使用した。2回のIVSの後のCD8 T細胞によるINFγ放出を、実施例5に記載されたようにして、ELISPOTによりアッセイした。
【0140】
結果:
この実験においては、最適な誘発時間を決定する目的で、異なる成熟化刺激とのインキュベーション時間を比較した。結果は図6に示される。RBL+IFNγの存在下での6時間のインキュベーションにより誘発された樹状細胞は、抗原特異的CD8 T細胞を生成させる効果が最も高い。しかしながら、3時間又は16時間誘発されたDCも、CD8 T細胞応答を誘導することができる。
【0141】
実施例7:FMKp及びINFγにより誘発された樹状細胞は、ex vivo培養後に完全に成熟化するよう方向付けられている
実施例1に記載されたようにして、未熟樹状細胞を調製した。
【0142】
成熟:
未熟樹状細胞を、完全AIMV培地(即ち、GM−CSF及びIL−13が補充されたAIMV)中で2×106細胞/ml/ウェルでインキュベートした。それらを、6時間、FMKp(1μg/ml、Pierre Fabre Medicament, France)及び500U/mlのIFNγで処理した。細胞を6時間目に洗浄し、直ちに分析するか、又は24時間目の時点まで(成熟因子の非存在下で)完全AIMV培地中でさらに培養した。
【0143】
表現型分析:
成熟化を追跡するため、樹状細胞を、6時間目及び24時間目の時点で、CD83マーカー、CD86マーカー、CD14マーカー及びHLA−ABCマーカーの発現に関して分析した。細胞を、1%ウシ胎仔血清及び0.1%アジ化ナトリウムを含有するPBSに再懸濁させた。それらを、以下のモノクローナル抗体:HLA−ABC−FITC、CD86−PE、CD14−FITC及びCD83−FITC(Immunotech)で4℃で20分間染色した。PBSで洗浄した後、細胞を、3nM TO−PRO−3(Molecular Probes)を含有するPBSに再懸濁させ、死細胞を排除した。取得は、ファックスキャリバー(FACSCalibur)フローサイトメーター(Becton Dickinson)で行った。結果はメディアン蛍光強度(MFI)値(任意の単位)として表される。FACS分析に関するネガティブコントロール(コントロールアイソタイプPE及びFITC):Isot Ctr PE及びFITCが示される。
【0144】
サイトカイン検出:
6時間目及び24時間目の時点で、培養上清を収集し、−80℃で保管した。解凍させた後、それらを、製造業者の指示に従いR&D Systems Europe(Abingdon, UK)の抗体対を使用して実施された市販のELISAによりIL−12p70及びIL−10分泌に関してELISAによりアッセイした。検出下限は、IL−12p70に関しては16pg/ml、IL−10に関しては31pg/mlであった。
【0145】
結果:
結果は、図7A(CD14及びCD83の発現);7B(HLA−ABC及びCD86の発現);7C(サイトカイン分泌)に示される。FMKp及びIFNγとの6時間のインキュベーションの後(白抜き棒グラフ)、樹状細胞は、以下のような未熟細胞特徴を示す。
− 細胞はCD14陽性であり、この実施例においてはCD83陽性である(CD83陰性である場合も存在する)。
− HLA−ABCの発現は1500未満であり、CD86の発現は500未満である(任意の値)。
− IL−12p70の分泌は低く、635pg/ml/106細胞である。この時点で、IL−10は検出されない。
【0146】
洗浄及び24時間目までのさらなる培養の後(黒棒グラフ)、細胞は以下のような成熟特徴を示す。
− CD14発現はほぼ抑制され、CD83発現はわずかにアップレギュレートされた。
− 18時間の培養後、HLA−ABCの発現は約3倍増大し(培養前の673から培養後の1928へ)、CD86の発現は4倍超高くなった(培養前の267から培養後の1165へ)。
− IL−12p70分泌は培養前よりも劇的に約20倍増加したが(6時間目の時点での635から24時間目の時点での13953pg/ml/106細胞)、IL−10分泌は3000pg/ml未満のままである。
【0147】
結論として、不可逆的に成熟化へと誘発された樹状細胞は、FMKp+IFNγと共に6時間インキュベートされ洗浄された後、成熟因子の非存在下ですら、21時間の培養期間中に成熟特徴を獲得する。
【0148】
実施例8:樹状細胞によるIL−10分泌は、FMKp+IFNγの存在下での細胞の長時間インキュベーションを必要とする
未熟樹状細胞を、3時間、6時間又は40時間、FMKp(1μg/ml)及びIFNγ(500U/ml)により処理した。3時間目又は6時間目に刺激された細胞を洗浄し、3時間目又は6時間目の時点で分析するか、又は成熟因子なしの培地中でさらに生育させ、次いで24時間目の時点でIL−10分泌を測定した。IL−10分泌は、以前に記載されたようにして、ELISAによりアッセイした。
【0149】
結果は図8に示される。
3時間の処理の後、IL−10は検出されなかった。6時間後、271pg/ml/106細胞のIL−10が上清中に検出された。成熟因子又はサイトカインなしの培地中での24時間目の時点までのさらなる培養の後、IL−10分泌は低いままであり、いずれの例においても4000pg/ml未満のままである。
反対に、FMKp及びINFγとの40時間のインキュベーションは、IL−10分泌の劇的な誘導をもたらす:40時間の刺激の後、約9000pg/mlが培養上清中に測定される。
【0150】
リボムニル(登録商標)+IFNγに関する実施例4において以前に示されたのと同様に、FMKp及びIFNγの存在下での短時間のインキュベーションは、成熟過程における限定されたIL−10分泌をもたらす。
【0151】
実施例9:樹状細胞への黒色腫細胞溶解物の負荷、及びその後の凍結/解凍ステップは、成熟過程を混乱させない:
黒色腫細胞溶解物の作製:
COLO829細胞系(ATCC番号CRL−1974)由来の黒色腫細胞を採集し、無菌PBSで2回洗浄し、5×107細胞/mlの濃度で無菌PBSに再懸濁させた。凍結及び解凍(F/T)のサイクル4回を適用し、溶解物をMisonix cup horn sonicator(登録商標)で超音波処理した(最大出力で2分間のパルス4回の後、5分間のサイクル1回)。次いで、溶解物をミクロチューブ内で5000rpmで5分間遠心分離し、上清を等分し、−80℃で保管した。
【0152】
細胞負荷:
未熟樹状細胞を、2×106細胞/mlの濃度で完全AIMV培地で希釈し、0.5腫瘍細胞相当量/DCの比率で腫瘍溶解物を添加した。次いで、細胞を、37℃でEVAバッグ(Stedim)内で一夜インキュベートした。
【0153】
成熟は、6時間、FMKp(1μg/ml)及びIFNγ(500U/ml)を用いて、実施例7に記載されたようにして実施した。
【0154】
凍結及び解凍:
不可逆的に成熟化へと誘発された負荷樹状細胞を、バッグ内で水簸溶液(PBS−グルコース、B.Braun Medical S.A.)で洗浄し(ブレーキなしの1600rpm、4℃、25分間の遠心分離)、ペレットをチューブ内で再懸濁させ、遠心分離した(1400rpm、4℃、10分間)。それらを、クリオバッグ(cryobags)内で5×106細胞/mlの濃度で4%アルブミン(90%)/DMSO(10%)中で凍結させた。
次いで、細胞凝集物を回避するため、細胞を0.93%アルブミン及び3.5%ACD−A(B. Braun Medical S.A.)が補充された水簸溶液中で解凍させ、ブレーキなしで1600rpm、4℃で25分間遠心分離した。
【0155】
シリンジ内でのインキュベーション及び最終培養:
新鮮に解凍させた細胞を、チューブ内で遠心分離し、20×106細胞/mlの濃度でアルブミン4%に再懸濁させ、及び1mlシリンジ内で4℃で2時間インキュベートした。
次いで、(細胞が沈殿物を形成したため)シリンジの振とう後に細胞を25G針に通し、24穴プレート内で2×106細胞/mlの濃度で完全AIMV培地中で一夜培養した。
【0156】
FMKp及びIFNγとの6時間のインキュベーションの直後、及びAIMV培地中での最終一夜培養の直後に、以前に記載されたようにして、ELISAによりサイトカイン分泌をアッセイした。
【0157】
結果:
結果は図9に示される。成熟刺激との6時間のインキュベーションの後(白抜き棒グラフ)、負荷樹状細胞は、2222pg/ml/106細胞のIL−12p70及び59pg/ml/106細胞のIL−10を分泌する。IL−10分泌は未だ誘導されていないが、IL−12分泌は既に開始している。
【0158】
凍結/解凍ステップの後、細胞を成熟刺激なしで一夜培養することにより、不可逆的に成熟へと誘発された樹状細胞は成熟過程を完了する(黒棒グラフ)。予想通り、IL−10分泌は低く、実際1200pg/ml未満のままであるが、IL−12p70の分泌は、18時間の培養の前に測定されたIL−12p70分泌より4倍顕著になっている(最終培養後は約10000pg/ml/106細胞)。
【0159】
本発明者らは、事前に細胞へ抗原を負荷させた場合ですら、そしてその細胞を成熟刺激との6時間のインキュベーションの後に凍結させた場合ですら、細胞とFMKp及びIFNγとの6時間のインキュベーションによるIL−12p70の高分泌の誘導は有効である、と結論する。
不可逆的に成熟化へと誘発された樹状細胞は、成熟過程の阻止の後、適切な条件で生育させられた場合、成熟を再開するという特性を有している。
【0160】
【表1】
【図面の簡単な説明】
【0161】
【図1A】リボムニル(登録商標)及びIFNγにより誘発された樹状細胞は、完全に成熟化するよう方向付けられている。
【図1B】リボムニル(登録商標)及びIFNγにより誘発された樹状細胞は、完全に成熟化するよう方向付けられている。
【図1C】リボムニル(登録商標)及びIFNγにより誘発された樹状細胞は、完全に成熟化するよう方向付けられている。
【図2A】ポリI:C及び抗CD40抗体により誘発された樹状細胞は、完全に成熟化するよう方向付けられている。
【図2B】ポリI:C及び抗CD40抗体により誘発された樹状細胞は、完全に成熟化するよう方向付けられている。
【図2C】ポリI:C及び抗CD40抗体により誘発された樹状細胞は、完全に成熟化するよう方向付けられている。
【図3A】リボムニル単独と、IFNγと併用されたリボムニルの樹状細胞によるサイトカイン分泌に対する成熟効果の比較。
【図3B】リボムニル単独と、IFNγと併用されたリボムニルの樹状細胞によるサイトカイン分泌に対する成熟効果の比較。
【図4】IL−10の分泌は、RBL+IFNγの存在下での比較的長い樹状細胞のインキュベーション時間を必要とする。
【図5】ペプチド抗原でパルス処理された誘発された樹状細胞は、外因性サイトカインの非存在下ですら、抗原特異的CD8 T細胞を生成させ得る。
【図6】RBL+IFNγとの6時間のインキュベーションにより誘発された樹状細胞は、抗原特異的エフェクターCD8 T細胞の生成にとって最適である。
【図7A】FMKp及びINFγにより誘発された樹状細胞は、完全に成熟化するよう方向付けられている。
【図7B】FMKp及びINFγにより誘発された樹状細胞は、完全に成熟化するよう方向付けられている。
【図7C】FMKp及びINFγにより誘発された樹状細胞は、完全に成熟化するよう方向付けられている。
【図8】樹状細胞によるIL−10分泌は、FMKp+IFNγの存在下での細胞の長時間インキュベーションを必要とする。
【図9】樹状細胞への黒色腫細胞溶解物の負荷、及びその後の凍結/解凍ステップは、成熟過程を混乱させない。
Claims (31)
- CD14陽性であり、
免疫蛍光染色及びフローサイトメトリー分析により決定されるように、約1500未満のメディアン蛍光強度のMHCクラスI、及び約500未満のメディアン蛍光強度のCD86を発現する、
不可逆的に成熟化へと誘発された樹状細胞。 - 106細胞/mlについてElisaアッセイにより決定されるように、約3000pg/ml未満のIL−12p70及び約500pg/ml未満のIL−10を分泌する、請求項1に記載の樹状細胞。
- 免疫蛍光染色及びフローサイトメトリー分析により決定されるように、約700未満のメディアン蛍光強度のMHCクラスI、及び約300未満のメディアン蛍光強度のCD86を発現し、
106細胞/mlについてElisaアッセイにより決定されるように、約80pg/ml未満のIL−12p70及び約300pg/ml未満のIL−10を分泌する、請求項1又は2に記載の樹状細胞。 - CD83陰性である、請求項1〜3のいずれか一項記載の樹状細胞。
- 以下の特徴:
免疫蛍光染色及びフローサイトメトリー分析により決定されるような、
約3〜約20のメディアン蛍光強度のCD83発現、
約20〜約100のメディアン蛍光強度のCD14発現、
約400〜約700のメディアン蛍光強度のMHCクラスI発現、
約100〜約300のメディアン蛍光強度のCD86発現:及び
計106細胞/mlについてELISAアッセイにより決定されるような、
1〜約80pg/mlのIL−12p70分泌、
約15〜約300pg/mlのIL−10分泌、
を示す、請求項3又は4に記載の樹状細胞。 - 1〜16時間、好ましくは6時間培養された血中単球由来の未熟樹状細胞より生ずる、請求項1〜5のいずれか一項記載の樹状細胞。
- 成熟過程を阻止され、この阻止の後、適切な条件下で生育させられた場合に成熟を再開することができるという特性を有する、請求項1〜6のいずれか一項記載の樹状細胞。
- 十分な培養時間で、成熟因子及びサイトカインを含有しない培養培地中でin vitroで成熟化するという特性を有する、請求項1〜7のいずれか一項記載の樹状細胞。
- 患者への注射の後、in vivoで成熟化するという特性を有する、請求項1〜7のいずれか一項記載の樹状細胞。
- 薬物、核酸又は目的の抗原、例えば腫瘍抗原が負荷された、請求項1〜9のいずれか一項記載の樹状細胞。
- 腫瘍細胞、特に黒色腫腫瘍細胞系の溶解物が負荷された、請求項10に記載の樹状細胞。
- TヘルパーCD4+T細胞の発生を促進し、ある抗原と貪食樹状細胞との事前の接触の後、該抗原に特異的な細胞傷害性CD8+Tリンパ球を活性化する、請求項1〜11のいずれか一項記載の樹状細胞。
- 適切な凍結保存培地中で凍結形態にある、請求項1〜12のいずれか一項記載の樹状細胞の組成物。
- CD14陽性であり、
免疫蛍光染色及びフローサイトメトリー分析により決定されるように、約1500を下回るメディアン蛍光強度のMHCクラスI、及び約500を下回るメディアン蛍光強度のCD86を発現する、不可逆的に成熟化へと誘発された樹状細胞を得るための方法であって、
血中単球由来の未熟樹状細胞を、2つの因子:
a − サイトカイン又はサイトカインのアゴニスト又はサイトカイン誘導因子、並びに
b − 細菌の膜画分及び/もしくはリボソーム画分の混合物、又はサイトカインとは異なるリガンドもしくはアゴニスト、
の組み合わせと接触させ、1〜16時間、好ましくは6時間、それらをインキュベートするステップを含む方法。 - 免疫蛍光染色及びフローサイトメトリー分析により決定されるように、約700を下回るメディアン蛍光強度のMHCクラスI、及び約300を下回るメディアン蛍光強度のCD86を発現し、
106細胞/mlについてElisaアッセイにより決定されるように、約80pg/ml未満のIL−12p70及び約300pg/ml未満のIL−10を分泌する、不可逆的に成熟化へと誘発された樹状細胞を得るための、請求項14に記載の方法。 - 得られる樹状細胞がCD83陰性である、請求項14又は15に記載の方法。
- サイトカインがIFNγであるか、又はサイトカイン誘導因子がポリI:Cである、請求項14〜16のいずれか一項記載の方法。
- 細菌の膜画分及び/又はリボソーム画分の混合物が、一つの株の細菌の膜亜画分である、請求項14〜16のいずれか一項記載の方法。
- 膜亜画分が、該膜亜画分から得られた精製されたタンパク質である、請求項18に記載の方法。
- 細菌の膜画分及び/又はリボソーム画分の混合物がリボムニル(登録商標)であり、膜亜画分がFMKp(クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)膜画分)である、請求項18に記載の方法。
- サイトカインがIFNγであり、かつ膜亜画分がFMKpである、請求項14〜20のいずれか一項記載の方法。
- IFNγの使用濃度が約500U/mlであり、かつFMKpの使用濃度が約1μg/mlである、請求項21に記載の方法。
- リガンドが抗CD40抗体又はCD40リガンドである、請求項14〜16のいずれか一項記載の方法。
- リガンドが誘導性熱ショックタンパク質70又はそれに由来する単離されたポリペプチド配列である、請求項14〜16のいずれか一項記載の方法。
- 請求項14〜24のいずれか一項記載の方法により得られるような、不可逆的に成熟化へと誘発された樹状細胞。
- IL−10の分泌より高度のIL−12p70の分泌を有する、成熟樹状細胞。
- 少なくとも24時間に(106細胞/mlについてElisaアッセイにより決定されるように)約1000pg/ml超のIL−12p70、及び約100pg/ml未満のIL−10を分泌し、かつTh1免疫応答及び細胞傷害性免疫応答を刺激する、成熟樹状細胞。
- 請求項1〜12又は請求項25のいずれか一項記載の不可逆的に成熟化へと誘発された樹状細胞から成熟樹状細胞を調製する方法であって、
in vitro又はin vivoで、外因性の成熟因子及びサイトカインを添加せずに、該不可逆的に誘発された樹状細胞を培養するステップを含む方法。 - 請求項27に記載の方法により得られるような、成熟樹状細胞。
- 薬学的に許容されうる媒体と共に、内在化抗原、好ましくはワクチン抗原を有する、請求項1〜12又は請求項25のいずれか一項記載の不可逆的に成熟化へと誘発された樹状細胞を活性物質として含有する医薬組成物。
- 1ワクチン用量当たり約104〜約109、好ましくは約105〜約107の量で、請求項1〜12又は請求項25のいずれか一項記載の不可逆的に成熟化へと誘発された樹状細胞を活性物質として含有する細胞ワクチン組成物。
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