MXPA05008936A - Adyuvante para vacunas con linfocitos humanos. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se relaciona con un adyuvante derivado de linfocitos humanos. El adyuvante se puede utilizar en combinacion con vacunas tradicionales o inmunoterapia del cancer, para intensificar la respuesta del sistema inmunologico del paciente a la vacuna u otro agente inmunoterapeutico. El adyuvante se deriva del sobrenadante recolectado a partir de linfocitos activados cultivados.

Description

ADYUVANTE PARA VACUNAS CON LINFOCITOS HUMANOS CAMPO DE IA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con un adyuvante derivado de linfocitos humanos. El adyuvante se puede utilizar en combinación con vacunas tradicionales de inmunoterapia del cáncer, para intensificar la respuesta del sistema inmunológico del paciente a la vacuna u otro agente inmunoterapéutico .

ANTECEDENTES DE IA INVENCIÓN Los adyuvantes inmunológicos se utilizan en combinación con vacunas para aumentar la respuesta inmunológica al antigeno. Una forma en la cual los adyuvantes inmunológicos funcionan es al atraer macrófagos hacia el antigeno, de tal forma que los macrófagos puedan presentar el antigeno a los nodos linfáticos regionales e iniciar una respuesta antigénica eficaz. Los adyuvantes también pueden actuar como portadores en si mismos para el antigeno, o pueden influir en la respuesta inmunológica mediante otros mecanismos tales como por ejemplo, efecto de depósito, inducción de citosinas, activación complementaria, reclutamiento de diferentes poblaciones celulares del sistema inmunológico, suministro de antigenos a diferentes células presentadoras de antigenos, regulación de la expresión de moléculas clase I o clase II de HLA y la estimulación para producir diferentes subtipos de anticuerpos. Muchas de las vacunas más recientes únicamente son débilmente inmunogénicas y de esta forma requieren la presencia de adyuvantes. Son bien conocidos los materiales que tienen actividad adyuvante. El hidróxido de aluminio (Al (OH) 3) , y los geles de aluminio similares son adyuvantes autorizados para uso en humanos . La actividad adyuvante del hidróxido de aluminio se descubrió primero en 1926 por Glenny (Chemestry and Industry, 15 de junio, 1926; J. Path. Bacteriol, 34,267). El hidróxido de aluminio y el fosfato de aluminio (comúnmente denominados de forma colectiva como trihidrato de alúmina) se utilizan rutinariamente como adyuvantes en seres humanos y vacunas veterinarias. La eficacia del trihidrato de alúmina en las respuestas de los anticuerpos cada vez mayores a difteria y toxoides del tétanos está bien establecida, y, más recientemente, una vacuna HBsAg se ha ayudado con el trihidrato de alúmina. Se sabe que otros materiales tienen actividad adyuvante, y éstos incluyen: adyuvante completo de Freund, una emulsión de agua-en-mineral-aceite que contienen micobacterias deshidratadas, exterminadas en la fase oleosa; adyuvante incompleto de Freund, una formulación más débil sin las micobacterias; saponina, un glucósido activo membranoso extraído del árbol Quillia; surfactantes de copolimeros en bloque no iónicos, moléculas sintéticas sin metabolizar que tienden a unir proteínas con superficies celulares; ISCOMS, micelas lípidicas que incorporan Quil A (saponina) que imitan, en términos físicos, las partículas infecciosas; y dipéptido muramílico, una molécula estimuladora de leucocitos que es uno de los componentes activos de las micobacterias exterminadas. Un adyuvante conocido en la terapia del cáncer es bacillus calmette guerin (BCG, por sus siglas en inglés) que se utiliza en combinación con diversas estrategias de vacuna anti-cáncer. También se ha encontrado que GM-CSF es un adyuvante eficaz cuando se utiliza en combinación con células tumorales autólogas . Con la totalidad de estos agentes, la toxicidad, reacciones crónicas inaceptables y/o baja potencia (en el caso de BCG) son características que actualmente limitan su utilización como adyuvantes potenciales. De esta forma, existe una necesidad continua y actual por adyuvantes novedosos para reforzar la respuesta inmunológica para las vacunas, tanto en la terapia del cáncer como en otros tratamientos de enfermedades. Una línea de investigación en el desarrollo de adyuvantes se ha dirigido al estudio de células dendríticas. Las células de dendríticas (DC, por sus siglas en inglés) son células que presentan antigenos profesionales (APC, por sus siglas en inglés) que tienen la única capacidad de iniciar las respuestas inmunológicas primarias in vivo e in vitro (1-3) . Las mismas se derivan de precursores mieloideos (DCÍ, por sus siglas en inglés) o linfoides (DC2, por sus siglas en inglés) y se distribuyen en su forma inmadura en todo el cuerpo en los tejidos que comúnmente encuentran patógenos ambientales (piel, membranas mucosas, epitelios intestinales, etc.) (1, 2, 4-7) . Mientras que DCI y DC2 comprenden un pequeño porcentaje del número total de células mononucleares en la circulación periféricas, los precursores de DCI en la forma de monocitos CD14+/CDllc+/HLA-DR+ son relativamente abundantes, constituyendo aproximadamente del 10% hasta el 15% de células sanguíneas mononucleares (11-15) . Las DC inmaduras expresan un hospedero de estructuras superficiales que están implicadas en la adquisición de antígenos, la activación/maduración de las DC, y la presentación de antígenos (1, 2, 8) . Una vez que las DC encuentran un antigeno, las mismas experimentan un proceso de maduración caracterizado por la sobre-regulación de moléculas clase I y II de HLA así como también, moléculas co-estimuladoras e interactúan con receptores cognados en linfocitos T y B, dando por resultado en la generación respuestas celulares e inmunológicas humorales antigeno-especificas (1, 2, 9, 10) . Se considera que las DC son las APC primarias en el sistema inmunológico . La capacidad de aislar estas células y/o sus precursores y estudiarlas in vitro ha agregado una considerable dimensión al conocimiento de su función en la inmunidad innata y adquirida (1, 2) . Los medios clásicos para generar la DC humanas in vitro es aislar y enriquecer los monocitos CD14+ de la sangre periférica y cultivarlos durante diversos periodos de tiempo en GM-CSF y IL-4 seguido por la maduración final con varias citosinas, entre las que se incluyen, IL-2, IL-6, IL-7, IL-13, IL-15, TNFa, IL-ß, (16, 36) o con otros diversos agentes entre los que se incluyen lipopolisacáridos, PGE2, interferones tipo 1, o ARN de doble cadena (20-24) . Muchas investigaciones han mostrado que estas DC derivadas de monocitos generados in vitro son potentes células presentadoras de antigenos (APC) capaces de iniciar y anular las respuestas de las células CD8+ y CD4+ T antigeno-especificas primarias (27-30) . Recientes estudios in vitro han generado un cúmulo de información más bien exhaustivo con respecto a la biología en las DC1 e iluminan los procesos mediante los cuales se generan in . vivo (1-2) las respuestas inmunológicas antígeno-específicas . En los tejidos periféricos, las DC inmaduras adquieren materiales antigénicos en el contexto de señales peligrosas que inician un medio de citosina/quimiosina complejo que se genera por las DC y otros tipos de células en la vecindad (31) . Los mediadores solubles producidos por las DC pueden actuar en una forma autocrina o paracrina. Los linfocitos T producen citosinas y quimiosinas adicionales después de la interacción con las DC armadas con antigenos, de tal forma que producen otras células inmunológicas que se activan por las citosinas liberadas (32-35) . Esta red compleja de interacciones a su vez puede crear un ambiente que estimule la generación de la DC a partir de sus precursores monociticos. Diversos investigadores han descrito el uso de diversos sobrenadantes en cultivos libres de células, también denominados como "medios condicionados", como agentes para maduración de DC. Estos medios contienen mezclas de citosinas (12, 25, 26) más o menos bien definidas. Los medios condicionados de monocitos (MC , por sus siglas en inglés) , que contienen IFNoc, IL-?ß, IL-6, y TNF , han mostrado que inducen la expresión de CD83 y p55, moléculas superficiales que son características de la DC maduras (26) . Sin embargo, cuando se agregan combinaciones de estas citosinas a las DC inmaduras a concentraciones comparables con aquellas encontradas en los medios condicionados, las mismas fueron menos eficaces en las DC maduras en comparación con los MCM. Estos resultados sugieren que se requirieron componentes adicionales para afectar la maduración total de las DC inmaduras. En un estudio, ato et al. prepararon medios acondicionados (designados TCCM) al calcular linfocitos T aislados con anticuerpos monoclonales anti-CD3 que se habían adherido a superficies plásticas (25) . Estos medios fueron capaces de madurar las DC inmaduras que se habían generado a partir de monocitos cultivados en GM-CSF e IL-4. De manera interesante, diferentes clones de anti-CD3 indujeron diferentes cantidades del ligando CD40 soluble e IFNy y estas diferencias se reflejaron en la capacidad de los medios para madurar las DC. Mientras que MCM y TCCM son mediadores muy eficaces de la maduración final de las DC, su capacidad para diferenciar .monocitos en las DC inmaduras no se reportó. Los inventores están conscientes de un reporte en donde se observó esta actividad con medios provenientes de PBMC estimulado con oligonucleótidos CpG-A (33) . Está bien establecido que CpG-A induce la producción de interferones (IFNa/IFN ) tipo I mediante las DC de plasmacitoides , un componente celular menor en PBMC (6, 37-39) . En el estudio citado, los anticuerpos para IFNoc disminuyeron aunque no anularon la actividad de este medio de cultivo lo que sugiere que citosinas adicionales podrían estar participando en la inducción de la diferenciación de monocitos . Por supuesto, esto es posible debido a que se sabe que IFNa induce la producción de citosinas en otros tipos celulares (incluyendo linfocitos T) que puede afectar la diferenciación de monocitos (6, 38, 39). Se piensa que los compuestos o composiciones que estimulan esta maduración de células dendriticas, cuando se administran en combinación con un antigeno de vacuna, dará por resultado en células que presenten más antigenos que presentan el antigeno de vacuna para linfocitos T y células B, reforzando asi la respuesta inmunologica al antigeno de la vacuna.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención resuelve la necesidad anterior al proporcionar adyuvantes novedosos, con base en productos de linfocitos humanos que proporcionan potenciación inmunologica y aumenta la cantidad y calidad de la respuesta inmunologica a los antigenos de vacuna. En un aspecto de la invención, el adyuvante se deriva de material sobrenadante recolectado de células mononucleares sanguíneas periféricas humanas cultivadas y estimuladas in vitro. Los linfocitos T que no han requerido tratamiento previo se activan durante el proceso de cultivo. El adyuvante funciona para intensificar la capacidad de una vacuna para iniciar, crear, reforzar y/o mantener una respuesta inmunológica a un agente en seres humanos, y otro animales o especies vegetales. La presente invención proporciona un adyuvante con base en una mezcla de citosinas y quimiosinas obtenidas de células mononucleares sanguíneas periféricas estimuladas con perlas recubiertas con anti~CD3/CD28. En el sentido en el que se presenta en la presente, el término "medio acondicionado con linfocitos (LCM, por sus siglas en inglés)", se utilizará para hacer referencia a este adyuvante. Se ha encontrado que LCM es un medio acondicionado altamente eficaz con la capacidad de madurar las DC derivadas de monocitos y hacer que los monocitos sean potentes APC. El adyuvante puede proporcionar un método rápido, de costo redituable, y probablemente más "fisiológico" para derivar grandes cantidades de DCl a partir de células precursoras in vitro, y el LCM por lo tanto puede funcionar como un adyuvante de vacuna eficaz. Se piensa que los productos derivados de PBMC pueden proporcionar el medio de citosinas requerido para generar rápidamente DCl a partir de sus precursores después de la iniciación de una respuesta inmunológica in vivo. Las citosinas y quimiosinas identificadas en la preparación de LCM se sabe que participan en la generación de respuestas inmunológicas por su efecto autocrino o paracrino sobre las APC y que responden a linfocitos T y B. Las concentraciones de citosinas encontradas en el LCM son considerablemente menores que las concentraciones de citosinas que se utilizan comúnmente para diferenciar monocitos en las DC inmaduras o para madurar las DC in vitro (16, 22) . El LCM contiene las citosinas (??G??, IL-12) y el ligando CD40 soluble que se sabe polarizan los linfocitos T hacia una respuesta TH1 asi como también las citosinas (IL-4 e IL-10) que polarizan los linfocitos T hacia las respuestas TH2 (5, 40, 41) . Estas últimas citosinas también pueden inducir alergia de linfocitos T cuando están presentes en cultivos de las DC inmaduras que presentan antigenos y linfocitos T. Sin embargo, la presencia de IL-10 y las pequeñas cantidades de IL-4 en el LCM no abrogan una respuesta de anulación de linfocitos T para TT; en su lugar, se aumentan las respuestas de los linfocitos T, lo que demuestra claramente que domina el efecto de las citosinas TH1. Además de las citosinas pro-inflamatorias, en el LCM se detectaron altas concentraciones de quimiosinas.

Estas quimiosinas se producen por células linfoides asi como también por células no linfoides en el contexto de un proceso inflamatorio (35, 42) . Como un ejemplo, RANTES se produce por linfocitos T con CD8+, y a su vez induce la generación de otras citosinas y quimiosinas (????ß, IL-2, IL-6, y los interferones tipo 1) que activan los linfocitos T asi como también los monocitos (43) . La inducción de estas citosinas y quimiosinas podría ser representativa de lo que ocurre cuando los linfocitos T se activan por las APC ín vivo en el contexto de la presentación de antígenos. Después de la activación de los linfocitos T a través del receptor de linfocitos T y la ligación CD28, los linfocitos T liberan citosinas y quimiosinas que se sabe influyen en la diferenciación de monocitos en las DC inmaduras así como también su migración hacia órganos linfoides regionales. Estos factores solubles también pueden atraer precursores de las DC y otras APC hacia el entorno del encuentro inicial de antígenos (señal de peligro) . Juntas las citosinas y quimiosinas producidas por los linfocitos T activados y, en dirección 3' , mediante las células presentes se podría esperar que refuercen la cascada de respuestas inmunológicas, lo cual es una propiedad conveniente de un adyuvante. Existe una conciencia cada vez mayor de la capacidad de diversas citosinas que actúan como adyuvantes para vacunas, en particular GM-CSF e IL-2. La generación de un medio acondicionado derivado de PBMC tiene la capacidad de generar grandes cantidades de las DC inmaduras a partir de sus precursores y madurar las DC derivadas de monocitos. Este método rápido y de costos redituable puede desempeñar una función importante en el desarrollo de futuras vacunas, y para utilizarse como un adyuvante. Además, la amplia gama de citosinas y quimiosinas contenidas en el LCM sugiere un estimulo más fisiológico, que proporciona un medio de citosinas similar al que se podría encontrar in vivo una vez que los linfocitos T encuentran el antígeno. La presente invención proporciona un método para utilizar el adyuvante, tanto el sobrenadante como el basado en células, en combinación con un antígeno de vacuna, para proporcionar una respuesta inmunológica intensificada a la vacuna . Por lo tanto, un objetivo de la presente invención es proporcionar un adyuvante de vacuna que sea capaz de intensificar la respuesta inmunogénica a la vacuna. Un objetivo adicional de la presente invención es proporcionar un adyuvante de vacuna derivado de linfocitos humanos . Otro objetivo de la invención es proporcionar un adyuvante de vacuna derivado del sobrenadante recolectado a partir de linfocitos humanos cultivados, estimulados. Un objetivo adicional de la invención es proporcionar un método para utilizar el adyuvante de vacuna, al administrar el adyuvante a un animal hospedero en combinación con una vacuna.

Estos y otros objetivos de la invención se harán más fácilmente evidentes a partir de la siguiente descripción, dibujos, y reivindicaciones anexas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las Figuras 1A-1E: el LCM induce un fenotipo similar a las DC en monocitos cultivados con el LCM únicamente. La expresión de CD14 (Figura 1A) , HLA-DR (Figura IB), CD40 (Figura 1C) , CD80 (Figura ID) y CD86 (Figura 1E) se analizó a diferentes puntos de tiempo. Los datos representan las medias ± SEM de 9 experimentos. * indica p < 0.05, y ** indica p < 0.005. Las Figuras 2A-2X: el efecto del LCM sobre la maduración de las DC inmaduras derivadas de monocitos . Los monocitos decantados se cultivaron con GM-CSF/I-4 durante 3-4 días después de la adición del medio solo (Figuras 2G-2L) , el LCM (Figuras 2M-2R) , o el cóctel de maduración (Figuras 2S-2X) durante 48 horas. Los monocitos cultivados en RPMI únicamente (Figuras 2A-2F) se utilizaron como un control negativo. Se examinaron las DC CDllc+- para la expresión superficial de CD14, HLA-DR, CD40, CD83, CD80, y CD86 mediante citometria de flujo. Los histogramas abiertos representan la tinción de las DC con el isótopo control mAb, y los histogramas sombreados representan la tinción de las DC con mAb especifico.

Las Figuras 3?-3?: el LCM diferencia los monocitos con un fenotipo similar a una DC cuando se agregan a poblaciones enteras de PBMC. Las células CDllc+ se analizaron para la expresión de CD14 (Figura 3A) , HLA-DR (Figura 3B) , CD40 (Figura 3C) , CD80 (Figura 3D) , y CD86 (Figura 3E) a 0,3 y 5 días. Los datos representan la media de dos experimentos. La Figura : las DC generadas a partir de monocitos decantados cultivados en presencia del LCM son superiores en su capacidad para estimular las respuestas PBMC halogenéicas que aquellas cultivadas en ausencia de LCM. Las PBMC halogenéicas (células 1 x 105) se cultivaron en placas de cultivo con fondo en forma de U de 96 cavidades con células estimuladoras 1 x 104 según se indica por triplicado. La respuesta a la PBMC se expresa como índice de Estimulación (proporción del CPM promedio (conteos por minuto) de un MILR individual con el CPM promedio de las PBMC cultivadas solas en el medio control) . Las Figuras 5A-5B: el LCM aumenta la respuesta proliferativa de las PBMC enteras con el toxoide del tétanos . La PBMC enteras o las PBMC agotadas de monocitos se cultivaron en placas de cultivo de fondo en forma de U de 96 cavidades en el LCM con o sin 10 g/ml de la proteína de toxoide del tétanos y en RPMI con el antígeno. Las PBMC cultivadas en 10 pg/ml contuvieron cRPMT de ConcanavilinA que sirvió como el control positivo (datos no mostrados) . La respuesta se expresa como el índice de Estimulación (SI, por sus siglas en inglés) (proporción del CPM promedio del cultivo de PBMC con TT, LCM, o tanto TT como LCM (Figura 5A) con el CPM promedio de las PBMC cultivadas solas en cRPM (Figura 5B) ) . Los datos representan la media de dos experimentos. * Indica p <0.05.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS En un aspecto, la presente invención proporciona un método para intensificar la respuesta inmunologica a un antigeno de vacuna en un mamífero hospedero, que comprende administrar un medio acondicionado con linfocitos, el sobrenadante derivado de las células de linfocitos humanos cultivadas con medio de crecimiento, en combinación con el antígeno de la vacuna. De preferencia, el mamífero es un ser humano. Los métodos y protocolo de cultivo son estándares y se conocen en la técnica. Las células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMC, por sus siglas en inglés) humanas (u otro mamífero, que dependen del mamífero que será tratado) que se pueden obtener de cualquier fuente se diluyen en un medio para crecimiento de cultivos de tejido disponible comercialmente . Las células se incuban con un agente de activación que consiste' de perlas recubiertas con los anticuerpos para CD3/CD28.

Aproximadamente en el día 3, las células y las perlas se separan del medio de cultivo y las células y las perlas se vuelven a suspender en medio de crecimiento adicional según sea necesario. Para recolectar las células, las mismas se volvieron a suspender en tubos de centrifugación y se granularon, después de lo cual el sobrenadante se puede extraer con una pipeta y almacenar para uso posterior. En el sentido en el que se utiliza en la presente, el término "sobrenadante" se refiere a la extracción liquida de células cultivadas, de la manera descrita anteriormente. "Medio acondicionado con linfocitos" y "sobrenadante" se utilizan en la presente de manera indistinta, y es en referencia a la extracción liquida de las células cultivadas. Los estudios se han llevado a cabo para caracterizar el sobrenadante, y se ha encontrado que contienen moléculas que tienen pesos moleculares promedio menores a aproximadamente 100,000 daltons . La administración se realiza mediante métodos conocidos utilizados para vacunación, y los métodos para administración adecuados incluyen de manera enunciativa: inyección intramuscular, intercutánea, y subcutánea. Típicamente, se administran entre aproximadamente 10 pg hasta 500 ig en combinación con el antigeno. La administración puede ser semanal, quincenal, mensual o anual, dependiendo del antigeno y el nivel de respuesta inmunológica deseado. El mejoramiento de la respuesta inmunológica se puede observar, por ejemplo, al conducir análisis estándar conocidos en la técnica que valoren la inmunidad celular (tal como por ejemplo, proliferación de linfocitos T) y las concentraciones de anticuerpos medida después de la inmunización. La presente invención es adecuada para utilizarse con una gran variedad de vacunas, incluyendo de manera enunciativa: vacunas contra sarampión, parotiditis, rubéola, influenza, haemophilus influenzae tipo B, vacunas contra difteria, el tétanos, la tosferina, y de polisacáridos neumocósicos, vacunas contra polisacáridos meningocósicos , vacunas contra staphylococcus aure s, virus de sincitial respiratorio, vacunas contra estreptococos, paxalnfluenza mycoplasmapneumoniae, mycobacteriumleprae, nocardia, legionela, pseudomonas, cólera, fiebre tifoidea, virus de la polio, hepatitis A, vacunas contra rotavirus, escherichia coli, shígella, hepatitis E, listeria, giardia lamblxa, toxocariasis , tricuriasis, ascariasis, amibiasis, cisticercosis, hepatitis b recombinante y derivadas de plasma, vacunas contra VIH-1 y VIH-2; HTLVI y HTLV-II, Epstein-Barr, hepatitis C, herpes B, virus del papiloma humano, herpes simple tipo 1 y 2, clamidia, gonorrea, treponema (sífilis), ántrax, rabias, esquistosomiasis, peste, fiebre amarilla, vacunas contra la encefalitis japonesa y la encefalitis portada por garrapatas, vacunas contra malaria, leishmaniasis, enfermedad de lyme, filariasis y oncocerciasis linfática, tripanosomiasis y enfermedad de chaga, fiebre por rickettsia y tifoidea, fiebre del dengue, adenovirus, vacunas contra varicella, vacunas contra citomegalovirus , coronavirus y rinovirus, estreptobacilo, péptido de alergia, péptido de una enfermedad infecciosa, vacuna contra péptido de cáncer, vacuna contra péptido auto-inmune, y vacunas contra el cáncer que utilizan fragmentos de ADN de antígenos, péptídos y/o cualquier otra especie molecular sobre la superficie o dentro de la célula cancerígena.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar la invención y no se deben interpretar como limitantes de la invención de ninguna forma. Los experimentos se llevaron a cabo utilizando los siguientes materiales y métodos: Células Las células mononucleares sanguíneas periféricas humanas (PBMC) utilizadas para la preparación del medio acondicionado se separaron de productos por leucaféresis de donadores sanos normales mediante centrifugación en gradiente por densidad en un Medio para Separación de Linfocitos (ICN Biomedicals Inc., Aurora, OH). Las células se congelaron viablemente en RPMI-1640 (Invitrogen Corp., Grand Island, NY) que contuvo suero ?? humano al 20% (Gemini Bio-Products , Woodland, CA) y DMSO al 10% (Sigma, St. Louis, MO) utilizando un congelador de células automatizado (Gordinier Electronics Roseville, MI) y se almacenaron en la fase de vapor de nitrógeno liquido hasta que se utilizaron. Los monocitos se aislaron de las PBMC mediante decantación centrifuga a contracorriente y se utilizaron inmediatamente o se congelaron viablemente en suero fetal de bovino (Summit Biotechnology) que contuvo DMSO al 10% y glucosa al 5% (Sigma) para utilizarse después .

Preparación del LCM Las PBMC crioconservadas se descongelaron en RPMI-1640 complementado con suero AB humano al 20% (hAB) , se lavaron dos veces con MI-1640 que contuvo hAB al 10%. Las células se volvieron a suspender en cRPMI [RPMI-1640 complementado con hAB al 10%, L-glutamina 2 mM (Invitrogen) , Solución de Penicilina-Estreptomicina al 1% (Invitrogen) , Amortiguador Hepes 20 mM (Invitrogen) ] o X-Vivo 15 (Bio hittaker, Walkersville, MD) complementado con L-glutamina 2 mM, Solución de Penicilina-Estreptomicina al 1%, Amortiguador Hepes 20mM. CD3/CD28 Dynabeads (Dynal, Lake Success, NY) se agregaron a las células a 75 µ? de las perlas por cada 1 x 10s PB C y los cultivos se incubaron durante 3 días a 37 °C en C02 al 5%. Posteriormente, los sobrenadantes libres de células se recolectaron y se almacenaron a 2-8 °C antes de utilizarse. El LCM se utilizó a una dilución 1:1 en cRPMI .

Cultivo de monocitos decantados Los monocitos decantados se lavaron con cRPMI, se volvieron a suspender en volúmenes iguales de LCM y cRPMI a una concentración de 5 x 105 células/ml, y se cultivaron en placas de 24 cavidades (Denville Scientific Inc., Metuchen, NJ) a 37 °C en C02 al 5% durante 5-6 dias. Alternativamente, los monocitos se cultivaron en cRPMI que contuvo 750 U/ml de GM-CSF (R&D Systems, Minneapolis, MN) y 720 U/ml de IL-4 (R&D Systems) durante 3-4 dias después de la adición del medio acondicionado o una combinación de citosinas [10 ng/ml IL-?ß, 10 ng/ml TNFoc, 0.91 ng/ml IL-6 (R&D Systems), 1 g/ml de PGE2 (Sigma) ] (Cóctel de Maduración) durante unas 48 horas adicionales. El cóctel de maduración sirvió como un control positivo y los monocitos cultivados en cRPMI únicamente se utilizaron como un control negativo.

Citometría de flujo Las células se lavaron una vez en cRPMT, se volvieron a suspender en 1 x PBS (Invitrogen) que contuvo hAB al 5%, y se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente (22-25 °C) con el fin de bloquear los receptores de Fe. Las células luego se volvieron a lavar, se volvieron a suspender en amortiguador de lavado (IX PBS con hAB al 1% y N3 al 0.1%), y se marcaron con anticuerpos conjugados con fluorocromo (BD BioSciences, San Diego, CA) contra CD14, CDllc, CD40, CD83, CD80, CD86, y anticuerpos control con isotipos adecuados. Después de 30 minutos a 4°C, las células se lavaron con amortiguador y se fijaron en IX PBS paraformaldehido al 1%. Los datos citométricos de flujo se adquirieron utilizando un citómetro de flujo FACS y se analizaron con el software CellQuest (Becton Dickinson, San José, CA) . Las aberturas se ajustaron de acuerdo con las muestras para control de isotipos.

Análisis de citosinas y quimios nas Las citosinas y quimiosinas en el LCM se cuantificaron utilizando análisis inmunosorbentes vinculados a enzimas disponibles comercialmente (ELISAs; R & D Systems, Minneapolis, MN) de acuerdo con los lineamientos del fabricante. La concentración de PGE2 también se midió mediante ELISA (Cayman Chemical Co., Ann Arbor, MI) . Todas las determinaciones se realizaron por duplicado.

MLR alogenéico Las células dendriticas se recolectaron a partir de cultivos, se lavaron dos veces en cRPMI , y se colocaron en placas para cultivo con fondo en forma de ü de 96 cavidades (Denville Scientific, Inc.) a 104, 103, y 102 células por cavidad. A cada cavidad se agregaron PBMC respondedoras alogenéicas a 1 x 105 célula/cavidad en un volumen total de 200 µ? . Todas las condiciones se colocaron en placas por triplicado. Las células se incubaron durante 3 dias a 37 °C en CO2 al 5%, se pulsaron con timidina tritiada con Ci 1.0 µ (Perkin Elmer, Boston, MA) durante 16 horas, y se recolectaron utilizando un recolector de cavidades múltiples automatizadas (Tomtec, Orange, CT) . La cantidad de timidina tritiada incorporada en las células detectoras se midió utilizando el contador de centelleo en líquidos MicroBeta TriLux (Wallac, Turku, Finlandia) .

Análisis para estimulación de antigenos Las PBMC humanas normales sin cebar (1 X 105/100 µ? cRPMI) se colocaron en placas de cultivo con fondo en forma de U de 96 cavidades a las cuales se agregaron 100 µ? de LCM o 100 µ? de cRPMI con o sin 10 g/ml de toxoide del tétanos (Achúrate Chemical and Scientific Corp., Westbury, NY) . Las PBMC cultivadas en cRPMI con 10 µ?/??? es C ncanavalinA (Sigma, St. Louis, MO) sirvieron como un control positivo. Todas las condiciones se colocaron en placas por triplicado, se cultivaron a 37 °C en CO2 al 5% durante 3 y 5 dias, se pulsaron con timidina tritiada de 1.0 pCi durante 16 horas, y se recolectaron utilizando un recolector de múltiples cavidades automatizado. La cantidad de timidina tritiada incorporada en las células detectoras se midió utilizando el contador de centelleo en líquidos MicroBeta TriLux.

El LCMD diferencia monocitos de las DC en ausencia de citosinas adicionales En un esfuerzo para generar un cóctel de citosinas bastante eficaz para la preparación y maduración de muchas DC humanas a partir de sus precursores in vitro, se produjeron sobrenadantes de cultivo a partir de las PBMC (LCM) estimuladas con anti-CD3/anti-CD28 según se describe en los Materiales y Métodos y se investigó por su efecto sobre los monocitos humanos bastante purificados obtenidos de las PBMC mediante centrifugación a contra-flujo. Los monocitos se cultivaron en el LCM en ausencia de GM-CSF e IL-4 y la expresión de los marcadores superficiales celulares que caracteriza las DC diferenciadas y maduras se examinó mediante citometria de flujo. Antes del cultivo, los monocitos se expresaron constitutivamente CDllc, asi como también CD14 y HLA-DR. El cultivo en el LCM dio por resultado en una disminución significativa del porcentaje de células que expresan CD14 en el dia 3, y por los días únicamente permanecieron unas cuantas células que expresan este marcador (Figura 1A) . Los MFI de HLA-DR (Figura IB), CD40 (Figura 1C) , CD80 (Figura ID) y CD86 (Figura 1E) se sobre-regularon consistentemente sobre células cultivadas en el LCM en comparación con las células cultivadas en el medio solo. En 4 de 9 experimentos, se observó un pequeño porcentaje de CD83+ CD sin embargo, estos resultados no fueron significativos. Tomados juntos, LCM diferencia los monocitos en las DC inmaduras fenotipicamente, una etapa del desarrollo que es óptima para la adquisición de antigenos .

Monocitos maduros en LCM cultivados en GM-CSF/IL-4 Se valoró la capacidad del LCM para madurar las DC inmaduras que se generaron in vitro a partir de monocitos en presencia de GM-CSF e IL-4. Los monocitos obtenidos de PBMC mediante decantación se cultivaron durante 3-4 dias en medio que contenia GM-CSF e IL-4 seguido por la adición del LCM o un Cóctel para maduración estándar que contenía TL-?ß, TNFa, IL-6 y PGE2 (véase Materiales y Métodos) . 48 horas después se realizó la citometria de flujo. Como se muestra en la Figura 2 y la Tabla 1, tanto el LCM como el cóctel de maduración indujeron la expresión de HLA-DR, moléculas co-estimuladoras y CD83, en general firmas aceptadas para las DC maduras. Estos resultados indican que el LCM puede facilitar la maduración final de las DC derivadas de monocitos inmaduros. La actividad de maduración de las DC del LCM obtenida de un total de cuatro diferentes donadores fue muy consistente (Datos no mostrados) .

Expresión del marcador superf cial sobre monocitos cultivados en GM-CSF y 1L4 con o sin el LCM Tabla 1: Evaluación estadística de MEI y expresión porcentual de CD40, CD83, CD80 y CD86 sobre los monocitos cultivados con GM-CSF/IL-4 con (+LCM) o sin (-LCM) la adición del LCM durante las últimas 48 horas.

Los datos se expresan como la media SEM de 8 experimentos y la significancia estadística se determinó por la Prueba t de Student pareada de dos segmentos.

Los monocitos en las PBMC expresan moléculas accesorias cuando se cultivan con el LC Para investigar el efecto del LCM sobre la distribución y fenotipo de diversas poblaciones celulares contenidas en la sangre periférica in vivo, se cultivaron las PBMC enteras en el LCM durante 3 ó 5 dias. No se encontraron diferencias en los porcentajes de células CD3+, CD4+-, CD8+, CD56+, CD19+ y en estos dos puntos de tiempo (datos no mostrados) . También, los porcentajes de células CD3+ que co-expresan CD25, un marcador para activación, no aumentaron durante el período de 5 días de cultivo (datos no mostrados) . Sin embargo, la expresión de CD14 sobre los monocitos, identificados por su expresión de CDllc, disminuyó en el día 3 y se sub-reguló casi por completo en el día 5 (Figura 3A) . Por el contrario, la expresión de HLA-DR, CD40, CD80 y CD86 sobre las células CDllc+ se sobre-reguló (Figura 3) . De esta forma, el LCM diferencia monocitos altamente purificados así como también, monocitos dentro de las PBMC enteras en las células con un fenotipo similar a las DC.

Concentraciones de citosina y quimiosina en el LMC Las concentraciones de citosina y quimiosina en el LCM (Tabla 2) se determinaron mediante métodos ELISA estándar y se compararon con las concentraciones de citosinas utilizadas comúnmente para la generación o maduración de las DC (Tabla 3) . Se identificó una serie entera de mediadores solubles, entre los que se incluyen GMCSF e IL-4, citosinas inflamatorias (IL-?ß, IL-6, PGE2, TNFa, IFNy) , quimiosinas (MCP-1, MIPl, RANTES), y sCD40L (tabla 2) . Sorprendentemente, las concentraciones de GMCSF e IL-4 en el LCM fueron significativamente menores que las concentraciones de las dos citosinas utilizadas en los protocolos estándar para la generación de las DC inmaduras provenientes de monocitos (Tabla 3) . Una de las acciones del IL4 sobre los monocitos durante la diferenciación in vitxo de las DC inmaduras es la sub-regulación de la expresión CD14. El bajo nivel de IL-4 en el LCM puede tomarse en cuenta para disminuir relativamente la sub-regulación del CD14 sobre los monocitos cultivados en el LCM (Figura 1A, 3A) . Existieron también menores concentraciones de citosinas inflamatorias en el LCM en comparación con el cóctel de maduración, incluso aunque ambos agentes de maduración tuvieron efectos comparables sobre las DC inmaduras.

Cuantificación de citosinas y quimiosinas contenidas en el LCM Tabla 2: Concentración promedio de citosinas o quimiosinas en cuatro diferentes preparaciones del LC según se determina mediante ELISA Tabla 3 : Cantidades de citosinas en el medio LCM, GM- CSF/IL4, y el cóctel de maduración Tabla 3: las cantidades de GM-CSF e IL4 contenidas en el LCM se compararon con aquellas utilizadas en los protocolos estándar para la generación de las DC derivadas de monocitos, como son las concentraciones de citosinas pro-inflamatorias seleccionadas en el LCM y el cóctel de maduración. * Obsérvese que las concentraciones de citosinas para el LCM proporcionadas en esta tabla son la mitad de aquellas de la tabla 2: debido a que se agrega el LCM a las células a una dilución 1:1 en cRPMI .

Los monocitos cultivados en el LCM estimulan la PBMC alogenéicas . Se determinó una característica funcional de las DC derivadas de monocitos de su capacidad para inducir eficazmente respuestas alogenéicas in vitro. La respuesta alogenéica de las PBMC hacia monocitos que se hayan cultivado durante cinco días en ausencia o en presencia del LCM, o que se cultivaron en medio que contenga GM-CSF/IL-4 seguido por la adición de cRPMI o LCM. Como se muestra en la Figura 4, el índice de estimulación (SI) generado por los monocitos cultivados en el LCM solo fue de aproximadamente 3 veces el inducido por los monocitos que se hayan cultivado en cRPMI solo. Sin embargo, el SI fue mayor con los monocitos que se habían cultivado en GM-CSF/IL-4 y se maduraron con el LCM. Estos resultados demuestran que el LCM hace que los monocitos y las DC inmaduras sean células que presentan antígenos más eficaces.

El LCM intensifica la respuesta de las PBMC al toxoide del tétanos Además se probaron las respuestas proliferativas de las PBMC para la anulación del antígeno toxoide del tétanos ( T) , nuevamente en presencia o ausencia del LCM (Figura 5A) . En ausencia del LCM y otras citosinas, las PBMC mostraron bajos niveles de respuesta hacia TT; sin embargo con la adición del LCM la respuesta hacia TT aumentó significativamente en el día 6 (Figura 5a) . Es importante señalar que el LCM solo indujo la síntesis de ADN en las PBMC incluso en ausencia del antígeno específico; no obstante la respuesta al antígeno específico aumentó significativamente. Para determinar si la respuesta observada hacia TT se proporcionó por monocitos, los experimentos se repitieron utilizando las PBMC que se habían agotado de células CD14+ con perlas inmunomagnéticas . Según se ilustra en la Figura 5B, no hubo respuesta hacia TT con o sin la adición del LCM. El SI mayor en los experimentos donde se eliminaron monocitos (Figura 5B) se puede tomar en cuenta por el aumento relativo en los números de otros tipos celulares, en particular las células de CD3+ (datos no mostrados) . Estos resultados indican claramente que el LCM mejora la capacidad de las PBMC para responder a las TT y que la respuesta se suministra mediante monocitos. Los hallazgos anteriores indican que el LCM proporcionaron monocitos bastante purificados y monocitos en la PBMC enteras en un fenotipo similar a DC. Además, las DC derivadas de monocitos inmaduros desarrollaron un fenotipo de DC maduras después del cultivo en el LCM. Funcionalmente, éstas DC derivadas de LCM mostraron una capacidad aumentada para estimular las PBMC alogenéicas en comparación con sus precursores de monocitos y aumentaron significativamente la respuesta hacia TT. Los efectos observados del LCM se pueden tomar en cuenta por la serie de citosinas y quimiosinas pro-inflamatorias identificadas en el medio acondicionado. Mientras que las modalidades particulares de esta invención se han descrito anteriormente para fines de ilustración, será evidente para aquellos expertos en la técnica que se pueden realizar muchas variaciones de los detalles de la presente invención sin apartarse del alcance de la misma según se define en las reivindicaciones anexas.

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Claims (11)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito el presente invento, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes REIVINDICACIONES : 1. ün método para intensificar una respuesta inmunológica hacia un antigeno en un mamífero caracterizado porque comprende administrar un medio acondicionado con linfocitos en combinación con el antigeno al mamífero.
2. 2. El método según la reivindicación 1, caracterizado porque el medio acondicionado con linfocitos se deriva de linfocitos T que no han recibido tratamiento previo, cultivados con perlas recubiertas con anti-CD3/CD28.
3. 3. El método según la reivindicación 1, caracterizado porque el antígeno es HIV-1 o VIH-2.
4. 4. El método según la reivindicación 1, caracterizado porque el antígeno es hepatitis-B.
5. 5. El método según la reivindicación 1, caracterizado porque el antígeno es toxoide del tétano.
6. 6. El método según la reivindicación 1, caracterizado porque el antígeno es un antígeno próstata-específico .
7. 7. El método según la reivindicación 1, caracterizado porque el antígeno es hepatitis-A.
8. 8. El método según la reivindicación 1, caracterizado porque el antigeno es difteria.
9. 9. El método según la reivindicación 1, caracterizado porque la dosificación del medio ¦ acondicionado con linfocitos es de aproximadamente 10 ]iq hasta 500 ]ig .
10. 10. El método según la reivindicación 1, caracterizado porque la administración se selecciona del grupo que consiste de inyección intracutánea, subcutánea, e intramuscular y combinaciones de las mismas.
11. 11. El método según la reivindicación 1, caracterizado porque la administración se selecciona del grupo que consiste de semanal, quincenal, mensual, y anualmente y combinaciones de las mismas.