JP2007531703A - ヒトリンパ球由来のワクチンアジュバント - Google Patents
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Abstract
本発明は、ヒトリンパ球由来のアジュバントに関する。本発明のアジュバントは伝統的なワクチンまたは癌免疫療法と併用して、ワクチンまたはその他の免疫治療薬に対する患者の免疫系の応答を増強するために使用できる。本発明のアジュバントは、培養した活性化リンパ球から収集した上清に由来する。
【選択図】図４
【選択図】図４
Description
本発明はヒトリンパ球に由来のアジュバントに関する。該アジュバントは、ワクチンまたはその他の免疫治療薬に対する患者の免疫系の応答を増強するために従来のワクチンまたは癌免疫療法との併用で使用できる。
免疫アジュバントは抗原に対する免疫応答を増加させるためにワクチンと併用して使用されている。免疫アジュバントの作用機序の１つは、マクロファージを抗原に引き付けることであり、その結果、該マクロファージが抗原を局所リンパ節に提示して有効な抗原応答を開始させる。アジュバントはまた、それ自体が抗原に対する担体として作用してもよく、または、貯留効果、サイトカイン誘導、補体活性化、免疫系の種々の細胞集団の漸増、種々の抗原提示細胞への抗原デリバリー、ＨＬＡクラスＩまたはクラスＩＩ分子の調節、及び、種々の抗体サブタイプの産生刺激、のような別の機序によって免疫応答に影響を及ぼしてもよい。新しいワクチンの多くは免疫原性が極めて弱いので、アジュバントを存在させる必要がある。
アジュバント活性を有する材料は公知である。ミョウバン（Ａｌ（ＯＨ）3）及び同様のアルミニウムゲルは人体に使用することが認可されたアジュバントである。ミョウバンのアジュバント活性は１９２６年にＧｌｅｎｎｙによって初めて発見された（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，Ｊｕｎ．１５，１９２６；Ｊ．Ｐａｔｈ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，３４，２６７）。水酸化アルミニウム及びリン酸アルミニウム（まとめてミョウバンと呼ばれる）はヒト用及び動物用のワクチンにアジュバントとして常用されている。ジフテリア及び破傷風のトキソイドに対する抗体応答を増加させるミョウバンの効力には定評があり、またより最近には、ＨＢｓＡｇワクチンにもミョウバンがアジュバントとして使用されている。
アジュバント活性を有している別の材料も知られている。これらの材料としては、殺傷し乾燥したマイコバクテリアを油相に含有させた油中水型のミネラルオイルエマルジョンであるフロイント完全アジュバント；マイコバクテリアを含まないもっと弱い配合物であるフロイント不完全アジュバント；セッケンボク（Ｑｕｉｌｌｉａ ｓａｐｏｎａｒｉａ）から抽出した膜活性グルコシドであるサポニン；細胞表面にタンパク質を結合させ易い非代謝合成分子である非イオン性ブロックコポリマー界面活性剤；Ｑｕｉｌ Ａ（サポニン）を取り込んだ脂質ミセルであり感染性粒子の物理的な模擬体であるＩＳＣＯＭＳ；及び、殺傷マイコバクテリアの活性成分の１つであり白血球刺激分子として作用するムラミルジペプチド、が挙げられる。癌療法に公知のアジュバントは、種々の抗癌ワクチン戦略と併用して使用されるカルメット−ゲランの桿菌（ＢＣＧ）である。ＧＭ−ＣＳＦもまた自家腫瘍細胞と併用して使用したときに有効なアジュバントであることが知見されている。
これらの補佐物質はいずれも、許容できない慢性反応及び／または低い力価（ＢＣＧの場合）という特徴を示すので、有力なアジュバントとして使用することに制約があるのが現状である。従って、癌療法及びその他の疾病治療の双方でワクチンに対するヒトの免疫応答を補強する新しいアジュバントが現在も益々要望されている。
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アジュバント開発の１つの方向は樹状細胞の研究である。樹状細胞の本来の任務は抗原提示細胞（ＡＰＣ）であり、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏで一次免疫応答を開始させるという特有の能力を有している（非特許文献１−３）。これらは骨髄性（ＤＣ１）またはリンパ性（ＤＣ２）の前駆体に由来し、それぞれの免疫形態で、周囲の病原体と遭遇し易い全身の組織（皮膚、粘膜、腸の上皮、など）に分布している（非特許文献１，２，４−７）。ＤＣ１及びＤＣ２は末梢循環中の単核細胞総数の比較的少ないパーセンテージを占めるが、ＣＤ１４＋／ＣＤ１１ｃ＋／ＨＬＡ−ＤＲ＋単球の形態のＤＣ１前駆体は比較的多量に存在し、単核血液細胞の約１０％−１５％を構成している（非特許文献１１−１５）。
未成熟ＤＣは、抗原取得、ＤＣ活性化／成熟及び抗原提示に関与する多彩な表面構造を発現する（非特許文献１，２，８）。ＤＣはいったん抗原に遭遇すると、ＨＬＡクラスＩ及びＩＩの分子と共存刺激分子との正の調節を特徴とする成熟プロセスを経由し、Ｔ及びＢリンパ球のコグネイト受容体と相互作用して、抗原特異的な細胞性及び体液性の免疫応答を生じさせる（非特許文献１，２，９，１０）。
ＤＣは免疫系の主要なＡＰＣであると考えられている。これらの細胞及び／またはそれらの前駆体を単離し、それらをｉｎ ｖｉｔｒｏで研究することができたので、先天性免疫及び後天性免疫におけるそれらの役割に関する知識の範囲が広がった（非特許文献１，２）。ｉｎ ｖｉｔｒｏでヒトＤＣを産生する従来の方法では、末梢血からＤＣ１４＋−単球を単離して富化し、それらをＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４中で種々の期間培養し、次いでＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＴＮＦα、ＩＬ−１βのような多くのサイトカインと共に（非特許文献１６，３６）、または、リポ多糖、ＰＧＥ2、１型インターフェロンまたは二重鎖ＲＮＡのような種々の別の補佐物質と共に（非特許文献２０−２４）最終成熟させている。
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ産生したこれらの単球由来のＤＣが抗原特異的ＣＤ４＋及びＣＤ８＋のＴ細胞の一次応答及び記憶応答を開始させ得る強力な抗原提示細胞（ＡＰＣ）であることを多くの研究者が証明した（非特許文献２７−３０）。最近のｉｎ ｖｉｔｒｏ研究がＤＣ１の生物学に関して膨大な量の情報を提供し、抗原特異的免疫応答がｉｎ ｖｉｖｏで生じるプロセスが解明された（非特許文献１−２）。末梢組織では、未成熟ＤＣが抗原性物質を危険シグナルとして捕捉し、ＤＣ及び近傍の他の細胞型によって産生される複合的なサイトカイン／ケモカイン環境を創出する。ＤＣによって産生された可溶性メディエーターは自己分泌的またはパラ分泌的に作用し得る。Ｔ細胞は、放出されたサイトカインによって活性化される他の免疫細胞と同様に、抗原を備えたＤＣとの相互作用後に追加のサイトカイン及びケモカインを産生する（非特許文献３２−３５）。この複合的な相互作用ネットワークは更に、ＤＣの単球前駆体によるＤＣの産生を促進する環境を作り出す。
数名の研究者は、“ならし培地”とも呼ばれる種々の無細胞培養上清をＤＣ成熟補佐物質として使用することを記載している。これらの培地は、多少とも明確に定義されたサイトカイン混合物を含有している（非特許文献１２，２５，２６）。ＩＦＮα、ＩＬ−１β、ＩＬ−６及びＴＮＦαを含有している単球ならし培地（ＭＣＭ）が成熟ＤＣに特徴的な表面分子であるＣＤ８３及びｐ５５の発現を誘導することが証明された（非特許文献２６）。しかしながら、これらのサイトカインの組合せをならし培地中に見出される濃度と同等の濃度で未成熟ＤＣに加えると、ＤＣを成熟させる効果がＭＣＭに比較して少なかった。これらの結果は、未成熟ＤＣの完全成熟に影響を及ぼす追加成分が必要であったことを示唆する。
１つの研究でＫａｔｏらは、単離したＴ細胞を、プラスチック表面に付着させた抗ＣＤ３モノクローナル抗体と共に培養することによってならし培地（ＴＣＣＭと命名）を調製した（非特許文献２５）。この培地は、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４中で培養した単球から産生された未成熟ＤＣを成熟させることが可能であった。注目すべきは、抗ＣＤ３の種々のクローンが異なる量の可溶性ＣＤ４０リガンドとＩＦＮγとを誘導し、これらの差がＤＣを成熟させる培地の能力に反映したことである。
ＭＣＭ及びＴＣＣＭは最終的なＤＣ成熟の極めて有効なメディエーターではあるが、単球を未成熟ＤＣに分化させるそれらの能力は報告されなかった。発明者らは、ＣｐＧ−Ａオリゴヌクレオチドで刺激したＰＢＭＣに由来の培地でこの活性が観察されたという１つの報告書を発見した（非特許文献３３）。ＣｐＧ−ＡがＰＢＭＣ中の微量細胞成分である形質細胞系ＤＣによる１型インターフェロン（ＩＦＮα／ＩＦＮβ）の産生を誘導することは確認されている（非特許文献６，３７−３９）。引用した研究では、ＩＦＮαに対する抗体はこの培養培地の活性を低下はさせたが阻止はしなかった。これは、追加のサイトカインが単球分化の誘導に関与したであろうことを示唆する。ＩＦＮαが単球分化に影響を及ぼす別の細胞型（例えばＴ細胞）中でサイトカインの産生を誘導することは既知であるから、その可能性は高いと考えられる（非特許文献６，３８，３９）。
樹状細胞のこのような成熟を促進する化合物または組成物は、ワクチン抗原と併用投与されたときに、ワクチン抗原をＴリンパ球及びＢ細胞に提示する抗原提示細胞の数を増加させ、これによって、ワクチン抗原に対する免疫応答を増進させると考えられる。
本発明は、ヒトリンパ球の産生物を基剤とし、免疫増強効果を与えまたワクチン抗原に対する免疫応答を質量ともに向上させる新規なアジュバントを提供することによって上記の要望に解決を与える。
本発明の１つの特徴によれば、アジュバントは、ｉｎ−ｖｉｔｒｏで刺激し培養したヒト末梢血単核細胞から収集した上清材料に由来する。無垢のＴ細胞は培養プロセス中に活性化される。アジュバントは、ヒト及びその他の動物または植物種の体内の物質に対する免疫応答を開始、惹起、補強及び／または持続させるワクチンの能力を増強する役割を果たす。
本発明は、抗ＣＤ３／ＣＤ２８をコートしたビーズによって刺激された末梢血単核細胞から得られたサイトカイン及びケモカインの混合物を基剤とするアジュバントを提供する。本文中に使用した場合、“リンパ球ならし培地（ＬＣＭ）”という用語は、このアジュバントを意味する。ＬＣＭが単球由来のＤＣを成熟させ単球を強力なＡＰＣにする能力をもつ極めて効果のあるならし培地であることが知見された。アジュバントは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで前駆体細胞から大量のＤＣ１を誘導する迅速で費用効果が高く、また、恐らくはより“生理的な”方法を提供でき、従って、ＬＣＭは有効なワクチンアジュバントとして機能できる。ＰＢＭＣ由来の産生物は、ｉｎ ｖｉｖｏの免疫応答の開始後にＤＣ１をそれらの前駆体から迅速に産生するために必要なサイトカイン培地を提供し得る。
ＬＣＭ調製物中で同定されたサイトカイン及びケモカインは、ＡＰＣ並びに応答しているＴ及びＢ細胞に対するそれらの自己分泌またはパラ分泌効果によって免疫応答の生成に関与することが知られている。ＬＣＭ中で観察されるサイトカインの濃度は、単球を未成熟ＤＣに分化させるためまたはＤＣをｉｎ ｖｉｔｒｏで成熟させるために常用されているサイトカインの濃度よりもかなり低い（非特許文献１６，２２）。ＬＣＭは、Ｔ細胞をＴＨ１応答に向かって分極させることが知られているサイトカイン（ＩＦＮγ、ＩＬ−１２）及び可溶性ＣＤ４０リガンド、並びに、Ｔ細胞をＴＨ２応答に向かって分極させるサイトカイン（ＩＬ−４及びＩＬ−１０）を含有している（非特許文献５，４０，４１）。これらの後者のサイトカインはまた、抗原を提示する未成熟のＤＣ及びＴ細胞の培養物中に存在するときには、Ｔ細胞アネルギーを誘導するであろう。しかしながら、ＬＣＭ中のＩＬ−１０及び少量のＩＬ−４の存在は、ＴＴに対するＴ細胞の記憶応答を阻止しなかった。Ｔ細胞応答はむしろ増加した。これは、ＴＨ１サイトカインの効果が優勢であることをはっきりと証明する。
プロ炎症性サイトカインに加えて、高濃度のケモカインがＬＣＭ中で検出された。これらのケモカインは、炎症プロセスに関連してリンパ系細胞及び非リンパ系細胞によって産生される（非特許文献３５，４２）。一例として、ＲＡＮＴＥＳはＣＤ８＋−Ｔ細胞によって産生され、次いでこれが、Ｔ細胞及び単球を活性化する別のサイトカイン及びケモカイン（ＭＩＰ１β、ＩＬ−２、ＩＬ−６、及び１型インターフェロン）の産生を誘導する（非特許文献４３）。これらのサイトカイン及びケモカインの誘導は、抗原提示に関連してＴ細胞がｉｎ ｖｉｖｏでＡＰＣによって活性化されたときに生じる状態を表す。Ｔ細胞受容体及びＣＤ２８の結合によってＴ細胞が活性化すると、Ｔ細胞は、単球が未成熟のＤＣに分化し局部リンパ系器官に移動することに影響を及ぼすことが知られたサイトカイン及びケモカインを放出する。これらの可溶性因子はまた、ＤＣ前駆体とその他のＡＰＣとを初期抗原遭遇の環境（危険シグナル）に引き付ける。活性化Ｔ細胞及び下流のバイスタンダー細胞によって産生されたサイトカイン及びケモカインが共同して、アジュバントの望ましい特性である免疫応答カスケードを増幅すると予測できた。種々のサイトカイン、特にＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−２がワクチン用アジュバントとして作用する能力を有しているという認識が高まりつつある。
ＰＢＭＣ由来のならし培地の製造によって、大量の未成熟ＤＣをそれらの前駆体から産生し、単球由来のＤＣを成熟させることが可能になる。この迅速で費用効果的な方法は、未来のワクチン開発及びアジュバントとしての用途に重要な役割を果たし得る。更に、ＬＣＭに含有された多種多様なサイトカイン及びケモカインは、より生理的な刺激を示唆しており、Ｔ細胞が抗原に遭遇したときにｉｎ ｖｉｖｏで見出されるのと同様のサイトカイン環境を提供する。
本発明は、ワクチンに対する免疫応答を増強するために上清または細胞を基剤とするアジュバントをワクチン抗原と併用して使用する方法を提供する。
従って、本発明の目的は、ワクチンに対する免疫応答を増強し得るワクチンアジュバントを提供することである。
本発明の別の目的は、ヒトのリンパ球に由来するワクチンアジュバントを提供することである。
本発明の別の目的は、刺激し培養したヒトのリンパ球から収集した上清に由来するワクチンアジュバントを提供することである。
本発明の追加の目的は、宿主動物にワクチンと併用してアジュバントを投与することによってワクチンアジュバントを使用するという方法を提供することである。
本発明のこれらの目的及びその他の目的は、以下の記載、図面及び特許請求の範囲からより容易に明らかにされるであろう。
従って、本発明の目的は、ワクチンに対する免疫応答を増強し得るワクチンアジュバントを提供することである。
本発明の別の目的は、ヒトのリンパ球に由来するワクチンアジュバントを提供することである。
本発明の別の目的は、刺激し培養したヒトのリンパ球から収集した上清に由来するワクチンアジュバントを提供することである。
本発明の追加の目的は、宿主動物にワクチンと併用してアジュバントを投与することによってワクチンアジュバントを使用するという方法を提供することである。
本発明のこれらの目的及びその他の目的は、以下の記載、図面及び特許請求の範囲からより容易に明らかにされるであろう。
１つの特徴によれば、本発明は、哺乳動物体内のワクチン抗原に対する免疫応答を増強するために、リンパ球ならし培地、すなわち、増殖培地で培養した活性化ヒトリンパ球細胞に由来の上清を、ワクチン抗原と併用して投与する方法を提供する。好ましくは哺乳動物がヒトである。培養方法及びプロトコルは標準的であり当業界で公知である。ヒト（または、治療される哺乳動物次第ではその他の哺乳動物）の何らかのソースから得られる末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を市販の組織培養増殖培地で希釈する。細胞を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体をコートしたビーズから成る活性化剤と共にインキュベートする。約３日目に、細胞とビーズとを培養培地から分離し、細胞とビーズとを必要に応じて追加の増殖培地に再浮遊させる。細胞を採集するために、細胞を遠心管に再浮遊させてペレット化した後、上清をピペットによって取り出し、以後の使用に備えて保存する。
本文中で使用した“上清”という用語は、上述の方法で培養細胞から取り出した液体を意味する。本文中で“リンパ球ならし培地”及び“上清”という用語は互換的に使用されており、培養細胞から取り出した液体を意味する。上清を特性決定するための試験を実施すると、約１００，０００ドルトン未満の平均分子量をもつ分子を含有していることが知見された。
投与はワクチン接種に使用される公知の方法によって行う。適当なデリバリー方法の非限定例は、筋肉内注射、皮内注射及び皮下注射である。典型的には、約１０μｇ−約５００μｇを抗原と共に投与する。投与は、抗原の種類及び望ましい免疫応答のレベル次第で、週一回、隔週一回、月一回または年一回とすることができる。免疫応答の増強は、例えば、免疫感作後の細胞性免疫（例えば、Ｔ細胞増殖）を検定しかつ抗体価を測定する当業界で公知の標準的アッセイを行うことによって観察できる。
本発明は、多種多様なワクチンと共に使用するのに適している。ワクチンの非限定例は、麻疹、流行性耳下腺炎、風疹、インフルエンザ、ヘモフィルス・インフルエンゼＢ型のワクチン、ジフテリア、破傷風、百日咳、肺炎球菌多糖のワクチン、髄膜炎菌多糖のワクチン、黄色ブドウ球菌ワクチン、呼吸器合胞体ウイルス、ストレプトコッカス、パラインフルエンザマイコプラズマ肺炎、癩菌、ノカルジア、レジオネラ、シュードモナス、コレラのワクチン、腸チフス熱、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ワクチン、ロタウイルス、大腸菌、赤痢菌、Ｅ型肝炎、リステリア、ランブル鞭毛虫、トキソカラ症、鞭虫症、回虫症、アメーバ症、嚢虫症、ｂ型肝炎の組換え体及び血漿由来のワクチン、ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２；ＨＴＬＶＩ及びＨＴＬＶ−ＩＩ、エプスタイン−バールウイルス、Ｃ型肝炎、Ｂ型ヘルペス、ヒトパピローマウイルス、単純疱疹１型及び２型、クラミジア、淋病、トレポネーマ（梅毒）、炭疽、狂犬病、住血吸虫、ペスト、黄熱病のワクチン、日本脳脊髄炎、ダニ媒介脳脊髄炎のワクチン、マラリア、リーシュマニア症、ライム病、リンパ性フィラリア症及びオンコセルカ症、トリパノソーマ症及びアメリカトリパノソーマ症、リケッチア及び発疹チフス熱、デング熱、アデノウイルスのワクチン、水痘帯状疱疹ワクチン、サイトメガロウイルス、コロナウイルス及び鼻炎ウイルス、ストレプトバシルス、アレルギーペプチド、感染病ペプチドのワクチン、癌ペプチドワクチン、自己免疫ペプチドワクチン、及び、癌細胞の表面または内部の抗原、ペプチド、ＤＮＡフラグメント及び／またはその他の分子種を利用する癌ワクチン、などである。
以下の実施例は本発明の代表例であり、本発明がこれらの実施例に限定されないことを理解されたい。実験には以下の材料及び方法を使用した。
細胞
ならし培地の調製に使用したヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、一般人の健康な供血者の白血球除去血輸血用製品から、リンパ球分離培地（Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ，ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．， Ａｕｒｏｒａ，ＯＨ）中の密度勾配遠心分離法によって分離した。２０％のヒトＡＢ血清（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｗｏｏｄｌａｎｄ，ＣＡ）と１０％のＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）とを含有しているＲＰＭＩ−１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）中で全自動細胞フリーザー（Ｇｏｒｄｉｎｉｅｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，Ｒｏｓｅｖｉｌｌｅ，ＭＩ）を使用して細胞を生存可能に凍結し、使用するまで液体窒素の蒸気相に保存した。向流遠心エルトリエーションによってＰＢＭＣから単球を単離し、直ちに使用するか、または、後で使用するために１０％のＤＭＳＯと５％のグルコース（Ｓｉｇｍａ）とを含有しているウシ胎仔血清（Ｓｕｍｍｉｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）中で保存した。
細胞
ならし培地の調製に使用したヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、一般人の健康な供血者の白血球除去血輸血用製品から、リンパ球分離培地（Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ，ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．， Ａｕｒｏｒａ，ＯＨ）中の密度勾配遠心分離法によって分離した。２０％のヒトＡＢ血清（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｗｏｏｄｌａｎｄ，ＣＡ）と１０％のＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）とを含有しているＲＰＭＩ−１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）中で全自動細胞フリーザー（Ｇｏｒｄｉｎｉｅｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，Ｒｏｓｅｖｉｌｌｅ，ＭＩ）を使用して細胞を生存可能に凍結し、使用するまで液体窒素の蒸気相に保存した。向流遠心エルトリエーションによってＰＢＭＣから単球を単離し、直ちに使用するか、または、後で使用するために１０％のＤＭＳＯと５％のグルコース（Ｓｉｇｍａ）とを含有しているウシ胎仔血清（Ｓｕｍｍｉｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）中で保存した。
ＬＣＭの調製
低温保存したＰＢＭＣを、２０％のヒトＡＢ血清（ｈＡＢ）を補充したＲＰＭＩ−１６４０で解凍し、１０％のｈＡＢを含有しているＲＰＭＩ−１６４０で２回洗浄した。細胞を、ｃＲＰＭＩ［１０％のｈＡＢ、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１％のペニシリンストレプトマイシン溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２０ｍＭのＨｅｐｅｓバッファ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＲＰＭＩ］、または、２ｍＭのＬ−グルタミン、１％のペニシリンストレプトマイシン溶液、２０ｍＭのＨｅｐｅｓバッファを補充したＸ−Ｖｉｖｏ １５（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）に再浮遊させた。ＣＤ３／ＣＤ２８Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｄｙｎａｌ，Ｌａｋｅ Ｓｕｃｃｅｓｓ，ＮＹ）を１×１０6個のＰＢＭＣあたり７５μｌの量で細胞に添加し、培養物を５％のＣＯ2中、３７℃で３日間インキュベートした。その後、無細胞上清を収集し、使用するまで２−８℃で保存した。ＬＣＭはｃＲＰＭＩで１：１に希釈して使用した。
低温保存したＰＢＭＣを、２０％のヒトＡＢ血清（ｈＡＢ）を補充したＲＰＭＩ−１６４０で解凍し、１０％のｈＡＢを含有しているＲＰＭＩ−１６４０で２回洗浄した。細胞を、ｃＲＰＭＩ［１０％のｈＡＢ、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１％のペニシリンストレプトマイシン溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２０ｍＭのＨｅｐｅｓバッファ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＲＰＭＩ］、または、２ｍＭのＬ−グルタミン、１％のペニシリンストレプトマイシン溶液、２０ｍＭのＨｅｐｅｓバッファを補充したＸ−Ｖｉｖｏ １５（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）に再浮遊させた。ＣＤ３／ＣＤ２８Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｄｙｎａｌ，Ｌａｋｅ Ｓｕｃｃｅｓｓ，ＮＹ）を１×１０6個のＰＢＭＣあたり７５μｌの量で細胞に添加し、培養物を５％のＣＯ2中、３７℃で３日間インキュベートした。その後、無細胞上清を収集し、使用するまで２−８℃で保存した。ＬＣＭはｃＲＰＭＩで１：１に希釈して使用した。
エルトリエーションによって分離した単球の培養
エルトリエーションによって分離した単球をｃＲＰＭＩで洗浄し、等容のＬＣＭとｃＲＰＭＩとに５×１０5細胞／ｍｌの濃度で再浮遊させ、２４ウェルプレート（Ｄｅｎｖｉｌｌｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．， Ｍｅｔｕｃｈｅｎ，ＮＪ）に入れ、５％のＣＯ2中、３７℃で５−６日間培養した。あるいは、単球を、７５０Ｕ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）及び７２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含有するｃＲＰＭＩ中で３−４日間培養し、次いで、ならし培地またはサイトカインの組合せ［１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１β、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦα、０．９１ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１μｇ／ｍｌのＰＧＥ2（Ｓｉｇｍａ）］（成熟用カクテル））を添加して更に４８時間培養した。成熟用カクテルを陽性対照として使用し、ｃＲＰＭＩ単独で培養した単球を陰性対照として使用した。
エルトリエーションによって分離した単球をｃＲＰＭＩで洗浄し、等容のＬＣＭとｃＲＰＭＩとに５×１０5細胞／ｍｌの濃度で再浮遊させ、２４ウェルプレート（Ｄｅｎｖｉｌｌｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．， Ｍｅｔｕｃｈｅｎ，ＮＪ）に入れ、５％のＣＯ2中、３７℃で５−６日間培養した。あるいは、単球を、７５０Ｕ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）及び７２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含有するｃＲＰＭＩ中で３−４日間培養し、次いで、ならし培地またはサイトカインの組合せ［１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１β、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦα、０．９１ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１μｇ／ｍｌのＰＧＥ2（Ｓｉｇｍａ）］（成熟用カクテル））を添加して更に４８時間培養した。成熟用カクテルを陽性対照として使用し、ｃＲＰＭＩ単独で培養した単球を陰性対照として使用した。
フローサイトメトリー
細胞をｃＲＰＭＴで一回洗浄し、５％のｈＡＢを含有している１×ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に再浮遊させ、室温（２２−２５℃）で１５分間インキュベートして、Ｆｃ受容体をブロックした。次に細胞を洗浄し、洗浄用バッファ（１％のｈＡＢと０．１％のＮａＮ3とを加えた１×ＰＢＳ）に再浮遊させ、フルオロクロムを接合したＣＤ１４、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ４０、ＣＤ８３、ＣＤ８０、ＣＤ８６に対する抗体（ＢＤ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＳａｎＧｉｅｇｏ，ＣＡ）及び適切なアイソタイプ対照抗体で標識した。４℃で３０分間維持した後、細胞をバッファで洗浄し、１％のパラホルムアルデヒドを含む１×ＰＢＳに固定保存した。ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーターを使用してフローサイトメトリーデータを取得し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＳａｎＪｏｓｅ，ＣＡ）で分析した。アイソタイプ対照サンプルに応じてゲートを設定した。
細胞をｃＲＰＭＴで一回洗浄し、５％のｈＡＢを含有している１×ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に再浮遊させ、室温（２２−２５℃）で１５分間インキュベートして、Ｆｃ受容体をブロックした。次に細胞を洗浄し、洗浄用バッファ（１％のｈＡＢと０．１％のＮａＮ3とを加えた１×ＰＢＳ）に再浮遊させ、フルオロクロムを接合したＣＤ１４、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ４０、ＣＤ８３、ＣＤ８０、ＣＤ８６に対する抗体（ＢＤ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＳａｎＧｉｅｇｏ，ＣＡ）及び適切なアイソタイプ対照抗体で標識した。４℃で３０分間維持した後、細胞をバッファで洗浄し、１％のパラホルムアルデヒドを含む１×ＰＢＳに固定保存した。ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーターを使用してフローサイトメトリーデータを取得し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＳａｎＪｏｓｅ，ＣＡ）で分析した。アイソタイプ対照サンプルに応じてゲートを設定した。
サイトカイン及びケモカインの分析
市販のエンザイムリンクトイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ； Ｒ＆Ｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を製造業者の指針通りに使用してＬＣＭ中のサイトカイン及びケモカインを定量した。ＰＧＥ2の濃度もＥＬＩＳＡ（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）によって測定した。すべての測定は重複で行った。
市販のエンザイムリンクトイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ； Ｒ＆Ｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を製造業者の指針通りに使用してＬＣＭ中のサイトカイン及びケモカインを定量した。ＰＧＥ2の濃度もＥＬＩＳＡ（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）によって測定した。すべての測定は重複で行った。
アロジェニックＭＬＲ
培養物から樹状細胞を採取し、ｃＲＰＭＩで２回洗浄し、９６ウェルのＵ底培養プレート（Ｄｅｎｖｉｌｌｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）で、ウェルあたり１０4、１０3及び１０2個の細胞濃度で平板培養した。アロジェニック応答性ＰＢＭＣを各ウェルに１ｘ１０5細胞／ウェルの割合で総量２００μｌ加えた。すべての条件の平板培養を三重複試験として行った。細胞を５％のＣＯ2中、３７℃で３日間インキュベートし、１．０μＣｉのトリチウム標識チミジン（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）で１６時間パルスし、全自動マルチウェルハーベスター（Ｔｏｍｔｅｃ，Ｏｒａｎｇｅ，ＣＴ）を使用して採取した。応答性細胞に取り込まれたトリチウム標識チミジンの量は、ＭｉｃｒｏＢｅｔａ ＴｒｉＬｕｘ液体シンチレーションカウンター（Ｗａｌｌａｃ，Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ）を使用して測定した。
培養物から樹状細胞を採取し、ｃＲＰＭＩで２回洗浄し、９６ウェルのＵ底培養プレート（Ｄｅｎｖｉｌｌｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）で、ウェルあたり１０4、１０3及び１０2個の細胞濃度で平板培養した。アロジェニック応答性ＰＢＭＣを各ウェルに１ｘ１０5細胞／ウェルの割合で総量２００μｌ加えた。すべての条件の平板培養を三重複試験として行った。細胞を５％のＣＯ2中、３７℃で３日間インキュベートし、１．０μＣｉのトリチウム標識チミジン（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）で１６時間パルスし、全自動マルチウェルハーベスター（Ｔｏｍｔｅｃ，Ｏｒａｎｇｅ，ＣＴ）を使用して採取した。応答性細胞に取り込まれたトリチウム標識チミジンの量は、ＭｉｃｒｏＢｅｔａ ＴｒｉＬｕｘ液体シンチレーションカウンター（Ｗａｌｌａｃ，Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ）を使用して測定した。
抗原刺激アッセイ
感作していない正常なヒトＰＢＭＣ（（１×１０5／１００μｌのｃＲＰＭＩ）を、１０μｇ／ｍｌの破傷風トキソイド（Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐ．，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）を添加または不添加の１００μｌのＬＣＭまたは１００μｌのｃＲＰＭＩを加えた９６ウェルのＵ底培養プレートで平板培養した。１０μｇ／ｍｌのコンカナバリンＡ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を加えたｃＲＰＭＩ中で培養したＰＢＭＣを陽性対照とした。すべての条件の平板培養を三重複試験として行った。５％のＣＯ2中、３７℃で３及び５日間培養し、１．０μＣｉのトリチウム標識チミジンで１６時間パルスし、全自動マルチウェルハーベスターを使用して採取した。応答細胞に取り込まれたトリチウム標識チミジンの量を、ＭｉｃｒｏＢｅｔａ ＴｒｉＬｕｘ液体シンチレーションカウンターを使用して測定した。
感作していない正常なヒトＰＢＭＣ（（１×１０5／１００μｌのｃＲＰＭＩ）を、１０μｇ／ｍｌの破傷風トキソイド（Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐ．，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）を添加または不添加の１００μｌのＬＣＭまたは１００μｌのｃＲＰＭＩを加えた９６ウェルのＵ底培養プレートで平板培養した。１０μｇ／ｍｌのコンカナバリンＡ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を加えたｃＲＰＭＩ中で培養したＰＢＭＣを陽性対照とした。すべての条件の平板培養を三重複試験として行った。５％のＣＯ2中、３７℃で３及び５日間培養し、１．０μＣｉのトリチウム標識チミジンで１６時間パルスし、全自動マルチウェルハーベスターを使用して採取した。応答細胞に取り込まれたトリチウム標識チミジンの量を、ＭｉｃｒｏＢｅｔａ ＴｒｉＬｕｘ液体シンチレーションカウンターを使用して測定した。
ＬＣＭＤは追加のサイトカインの非存在下で単球をＤＣに分化させる
ｉｎ ｖｉｔｒｏ前駆体からヒトＤＣを大量に産生及び成熟させる極めて有効なサイトカインカクテルを調製するために、我々は、材料及び方法の項に記載した手順で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８刺激したＰＢＭＣ（ＬＣＭ）から培養上清を製造し、ＰＢＭＣから得られた高度に精製されたヒト単球に対するそれらの効果を向流遠心によって調査した。ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４が存在しないＬＣＭ中で単球を培養し、分化し成熟したＤＣの特徴である細胞表面マーカーの発現をフローサイトメトリーで検査した。培養以前に、単球はＣＤ１１ｃとＣＤ１４及びＨＬＡ−ＤＲとを構成的に発現していた。ＬＣＭ中での培養の結果、３日目までにＣＤ１４を発現している細胞のパーセントが有意に減少し、５日後にはこのマーカーを発現している細胞はわずかしか残っていなかった（図１Ａ）。ＬＣＭ中で培養した細胞では培地単独で培養した細胞に比べて、ＨＬＡ−ＤＲ（図１Ｂ）、ＣＤ４０（図１Ｃ）、ＣＤ８０（図１Ｄ）及びＣＤ８６（図１Ｅ）のＭＦＩが終始正の調節を示した。９回の実験のうちの４回で、少ないパーセンテージのＣＤ８３+ＤＣが観察された。しかしながら、これらの結果は有意ではなかった。総合的に考察すると、ＬＣＭは単球を抗原獲得に最適な発達段階の１つである表現型的に未成熟のＤＣに分化させる。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ前駆体からヒトＤＣを大量に産生及び成熟させる極めて有効なサイトカインカクテルを調製するために、我々は、材料及び方法の項に記載した手順で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８刺激したＰＢＭＣ（ＬＣＭ）から培養上清を製造し、ＰＢＭＣから得られた高度に精製されたヒト単球に対するそれらの効果を向流遠心によって調査した。ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４が存在しないＬＣＭ中で単球を培養し、分化し成熟したＤＣの特徴である細胞表面マーカーの発現をフローサイトメトリーで検査した。培養以前に、単球はＣＤ１１ｃとＣＤ１４及びＨＬＡ−ＤＲとを構成的に発現していた。ＬＣＭ中での培養の結果、３日目までにＣＤ１４を発現している細胞のパーセントが有意に減少し、５日後にはこのマーカーを発現している細胞はわずかしか残っていなかった（図１Ａ）。ＬＣＭ中で培養した細胞では培地単独で培養した細胞に比べて、ＨＬＡ−ＤＲ（図１Ｂ）、ＣＤ４０（図１Ｃ）、ＣＤ８０（図１Ｄ）及びＣＤ８６（図１Ｅ）のＭＦＩが終始正の調節を示した。９回の実験のうちの４回で、少ないパーセンテージのＣＤ８３+ＤＣが観察された。しかしながら、これらの結果は有意ではなかった。総合的に考察すると、ＬＣＭは単球を抗原獲得に最適な発達段階の１つである表現型的に未成熟のＤＣに分化させる。
ＬＣＭはＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４中で培養した単球を成熟させる
ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４との存在下で単球からｉｎ ｖｉｖｏで産生された未成熟ＣＤを成熟させるＬＣＭの能力を試験した。エルトリエーションによってＰＢＭＣから得られた単球を、ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４とを含有する培地中で３−４日間培養し、次いでＬＣＭを添加するか、または、ＩＬ−１β、ＴＮＦα、ＩＬ−６及びＰＧＦ2を含有している標準成熟用カクテル（材料と方法の項参照）を添加した。４８時間後にフローサイトメトリーを行った。図２及び表１に示すように、ＬＣＭと成熟用カクテルとの双方が、同時刺激性因子であるＨＬＡ−ＤＲの発現と、成熟ＤＣの特徴であると一般に認められているＣＤ８３の発現とを誘導した。これらの結果は、ＬＣＭが未成熟単球由来ＤＣの最終的成熟を促進できることを示す。合計４名の異なる供血者から得られたＬＣＭのＤＣ成熟活性は極めて恒常的であった（データ示さず）。
ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４との存在下で単球からｉｎ ｖｉｖｏで産生された未成熟ＣＤを成熟させるＬＣＭの能力を試験した。エルトリエーションによってＰＢＭＣから得られた単球を、ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４とを含有する培地中で３−４日間培養し、次いでＬＣＭを添加するか、または、ＩＬ−１β、ＴＮＦα、ＩＬ−６及びＰＧＦ2を含有している標準成熟用カクテル（材料と方法の項参照）を添加した。４８時間後にフローサイトメトリーを行った。図２及び表１に示すように、ＬＣＭと成熟用カクテルとの双方が、同時刺激性因子であるＨＬＡ−ＤＲの発現と、成熟ＤＣの特徴であると一般に認められているＣＤ８３の発現とを誘導した。これらの結果は、ＬＣＭが未成熟単球由来ＤＣの最終的成熟を促進できることを示す。合計４名の異なる供血者から得られたＬＣＭのＤＣ成熟活性は極めて恒常的であった（データ示さず）。
表１：最後の４８時間にＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４にＬＣＭを加えて培養した単球（＋ＬＣＭ）または加えずに培養した単球（−ＬＣＭ）におけるＣＤ４０、ＣＤ８３、ＣＤ８０及びＣＤ８６のＭＦＩと発現パーセントとの統計的評価。８回の実験の平均±標準偏差としてデータを表し、対応のある両側スチューデントｔ検定によって統計的有意性を決定する。
ＰＢＭＣ中の単球はＬＣＭと共に培養されたときにアクセサリー分子を発現する
ｉｎ ｖｉｖｏ末梢血が含有している種々の細胞集団の分布及び表現型に対するＬＣＭの効果を試験するために、全ＰＢＭＣをＬＣＭ中で３日間または５日間培養した。これらの２つの時点でＣＤ３＋、ＣＤ４＋−、ＣＤ８＋、ＣＤ５６＋及びＣＤ１９＋細胞のパーセンテージの差は見られなかった（データ示さず）。また、活性化マーカーであるＣＤ２５を同時発現しているＣＤ３＋のパーセンテージは５日間の培養期間中は増加しなかった（データ示さず）。しかしながら、ＣＤ１１ｃの発現によって同定された単球におけるＣＤ１４の発現は３日目に減少し、５日目までにはほぼ完全に負の調節が行われていた（図３Ａ）。対照的に、ＣＤ１１ｃ＋細胞におけるＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ４０、ＣＤ８０及びＣＤ８６の発現については正の調節が行われていた（図３）。したがって、ＬＣＭは高度に精製された単球及び全ＰＢＭＣ内部の単球をＤＣ様表現型の細胞に分化させる。
ｉｎ ｖｉｖｏ末梢血が含有している種々の細胞集団の分布及び表現型に対するＬＣＭの効果を試験するために、全ＰＢＭＣをＬＣＭ中で３日間または５日間培養した。これらの２つの時点でＣＤ３＋、ＣＤ４＋−、ＣＤ８＋、ＣＤ５６＋及びＣＤ１９＋細胞のパーセンテージの差は見られなかった（データ示さず）。また、活性化マーカーであるＣＤ２５を同時発現しているＣＤ３＋のパーセンテージは５日間の培養期間中は増加しなかった（データ示さず）。しかしながら、ＣＤ１１ｃの発現によって同定された単球におけるＣＤ１４の発現は３日目に減少し、５日目までにはほぼ完全に負の調節が行われていた（図３Ａ）。対照的に、ＣＤ１１ｃ＋細胞におけるＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ４０、ＣＤ８０及びＣＤ８６の発現については正の調節が行われていた（図３）。したがって、ＬＣＭは高度に精製された単球及び全ＰＢＭＣ内部の単球をＤＣ様表現型の細胞に分化させる。
ＬＣＭ中のサイトカイン及びケモカインの濃度
ＬＣＭ中のサイトカイン及びケモカインの濃度（表２）を標準ＥＬＩＳＡ法で定量し、ＤＣの産生または成熟に常用のサイトカイン濃度に比較した（表３）。ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４、炎症性サイトカイン（ＩＬ−１β，ＩＬ−６，ＰＧＥ2，ＴＮＦα，ＩＦＮγ）、ケモカイン（ＭＣＰ−１，ＭＩＰＩ，ＲＡＮＴＥＳ）及びｓＣＤ４０Ｌのような可溶性メディエーター群をすべて同定した（表２）。顕著に観察されたのは、ＬＣＭ中のＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４の濃度が、単球から成熟ＤＣを産生させる標準プロトコルに使用されるこれらの２つのサイトカインの濃度よりも有意に低いことであった（表３）。未成熟ＤＣへのｉｎ−ｖｉｔｒｏ分化中の単球に対するＩＬ４の作用の１つは、ＣＤ１４の発現の負の調節である。ＬＣＭ中のＩＬ−４のレベルが低いと、ＬＣＭ中で培養された単球におけるＣＤ１４の負の調節が比較的緩慢になる（図１Ａ、３Ａ）。また、ＬＣＭと成熟用カクテルという２つの成熟補佐物質が未成熟ＤＣに同等の効果を与える場合であっても、炎症性サイトカインの濃度はＬＣＭ中のほうが成熟用カクテル中よりも低い値であった。
ＬＣＭ中のサイトカイン及びケモカインの濃度（表２）を標準ＥＬＩＳＡ法で定量し、ＤＣの産生または成熟に常用のサイトカイン濃度に比較した（表３）。ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４、炎症性サイトカイン（ＩＬ−１β，ＩＬ−６，ＰＧＥ2，ＴＮＦα，ＩＦＮγ）、ケモカイン（ＭＣＰ−１，ＭＩＰＩ，ＲＡＮＴＥＳ）及びｓＣＤ４０Ｌのような可溶性メディエーター群をすべて同定した（表２）。顕著に観察されたのは、ＬＣＭ中のＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４の濃度が、単球から成熟ＤＣを産生させる標準プロトコルに使用されるこれらの２つのサイトカインの濃度よりも有意に低いことであった（表３）。未成熟ＤＣへのｉｎ−ｖｉｔｒｏ分化中の単球に対するＩＬ４の作用の１つは、ＣＤ１４の発現の負の調節である。ＬＣＭ中のＩＬ−４のレベルが低いと、ＬＣＭ中で培養された単球におけるＣＤ１４の負の調節が比較的緩慢になる（図１Ａ、３Ａ）。また、ＬＣＭと成熟用カクテルという２つの成熟補佐物質が未成熟ＤＣに同等の効果を与える場合であっても、炎症性サイトカインの濃度はＬＣＭ中のほうが成熟用カクテル中よりも低い値であった。
表２：異なる４種類のＬＣＭ調製物中のサイトカインまたはケモカインの平均濃度をＥＬＩＳＡによって検定した。
表３：ＬＣＭ中に含有されていたＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ４の量を単球由来のＤＣの標準産生プロトコルで使用した量に比較する。また、ＬＣＭ及び成熟用カクテル中の選択されたプロ炎症性サイトカインの濃度を比較する。*
ＬＣＭをｃＲＰＭＩで１：１に希釈して細胞に加えたので、この表に示したＬＣＭのサイトカイン濃度は表２の濃度の１／２であることに留意されたい。
ＬＣＭをｃＲＰＭＩで１：１に希釈して細胞に加えたので、この表に示したＬＣＭのサイトカイン濃度は表２の濃度の１／２であることに留意されたい。
ＬＣＭ中で培養された単球はアロジェニックＰＢＭＣを刺激する
単球由来のＤＣの機能的特徴は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでアロジェニック応答を有効に誘導する能力を有していることである。ＬＣＭの非存在下もしくは存在下で５日間培養した単球、または、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４を含有する培地で培養し次いでｃＲＰＭＩもしくはＬＣＭを加えた単球に対するＰＢＭＣのアロジェニック応答を測定した。図４に示すように、ＬＣＭ単独中で培養された単球によって生じた刺激指数（ＳＩ）は、ｃＲＰＭＩ単独中で培養された単球によって誘導された値のほぼ３倍であった。しかしながらＳＩは、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４中で培養しＬＣＭで成熟させた単球において最も高い値であった。これらの結果は、ＬＣＭが単球及び未成熟ＤＣをより効果的な抗原提示細胞にすることを証明する。
単球由来のＤＣの機能的特徴は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでアロジェニック応答を有効に誘導する能力を有していることである。ＬＣＭの非存在下もしくは存在下で５日間培養した単球、または、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４を含有する培地で培養し次いでｃＲＰＭＩもしくはＬＣＭを加えた単球に対するＰＢＭＣのアロジェニック応答を測定した。図４に示すように、ＬＣＭ単独中で培養された単球によって生じた刺激指数（ＳＩ）は、ｃＲＰＭＩ単独中で培養された単球によって誘導された値のほぼ３倍であった。しかしながらＳＩは、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４中で培養しＬＣＭで成熟させた単球において最も高い値であった。これらの結果は、ＬＣＭが単球及び未成熟ＤＣをより効果的な抗原提示細胞にすることを証明する。
ＬＣＭは破傷風トキソイドに対するＰＢＭＣ応答を増強する
記憶抗原破傷風トキソイド（ＴＴ）に対するＰＢＭＣの増殖応答試験に加えて、ＬＣＭの存在下または非存在下の試験も行った（図５Ａ）。ＬＣＭ及び別のサイトカインの非存在下でＴＴに対してＰＢＭＣが示した応答は低いレベルであった。しかしながら、ＬＣＭを添加すると、６日目にＴＴに対する応答は有意に増加した。特異的抗原の非存在下であってもＬＣＭ単独でＰＢＭＣ中のＤＮＡ合成を誘導したことは注目に値する重要なことである。しかしながら特異的抗原に対する応答は有意に増加した。観察されたＴＴに対する応答が単球によって仲介されたものであるか否かを判断するために、免疫磁気ビーズによってＣＤ１４＋細胞を欠失させたＰＢＭＣを使用して実験を繰り返した。図５Ｂに示すように、ＬＣＭの添加または不添加にかかわりなくＴＴに対する応答は存在しなかった。単球を除去した実験でＳＩの値が高いのは（図５Ｂ）、別の細胞型、特にＣＤ３＋細胞の数が相対的に増加するからであろう（データ示さず）。これらの結果は、単球によって仲介される応答を生じるＴＩサンド（ＴＩ’ｓａｎｄ）に対するＰＢＭＣの応答能力をＬＣＭが増強することを明らかに示す。
記憶抗原破傷風トキソイド（ＴＴ）に対するＰＢＭＣの増殖応答試験に加えて、ＬＣＭの存在下または非存在下の試験も行った（図５Ａ）。ＬＣＭ及び別のサイトカインの非存在下でＴＴに対してＰＢＭＣが示した応答は低いレベルであった。しかしながら、ＬＣＭを添加すると、６日目にＴＴに対する応答は有意に増加した。特異的抗原の非存在下であってもＬＣＭ単独でＰＢＭＣ中のＤＮＡ合成を誘導したことは注目に値する重要なことである。しかしながら特異的抗原に対する応答は有意に増加した。観察されたＴＴに対する応答が単球によって仲介されたものであるか否かを判断するために、免疫磁気ビーズによってＣＤ１４＋細胞を欠失させたＰＢＭＣを使用して実験を繰り返した。図５Ｂに示すように、ＬＣＭの添加または不添加にかかわりなくＴＴに対する応答は存在しなかった。単球を除去した実験でＳＩの値が高いのは（図５Ｂ）、別の細胞型、特にＣＤ３＋細胞の数が相対的に増加するからであろう（データ示さず）。これらの結果は、単球によって仲介される応答を生じるＴＩサンド（ＴＩ’ｓａｎｄ）に対するＰＢＭＣの応答能力をＬＣＭが増強することを明らかに示す。
上述の知見は、ＬＣＭが高度に精製された単球及び全ＰＢＭＣ中の単球をＤＣ様表現型にすることを示す。更に、未成熟の単球由来のＤＣは、ＬＣＭ中で培養された後で成熟ＤＣ表現型に発達した。機能的には、これらのＬＣＭ由来のＤＣは、それらの単球前駆体に比べてアロジェニックＰＢＭＣを刺激する能力が増加しており、ＴＴに対する応答が有意に増加した。観察されたＬＣＭの効果は、ならし培地中で同定された一群のプロ炎症性サイトカイン及びケモカインによって説明できる。
上記では、説明の目的で本発明の特定実施態様を記載したが、本発明の細部に関しては特許請求の範囲に定義された本発明の範囲を逸脱しない多くの変更が可能であることは当業者に明らかであろう。
Claims (11)
- 哺乳動物体内の抗原に対する免疫応答を増強するために、リンパ球ならし培地を前記抗原と併用して前記哺乳動物に投与する方法。
- 前記リンパ球ならし培地が抗ＣＤ３／ＣＤ２８をコートしたビーズと共に培養した無垢のＴ細胞に由来する請求項１に記載の方法。
- 前記抗原がＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２である請求項１に記載の方法。
- 前記抗原がＢ型肝炎である請求項１に記載の方法。
- 前記抗原が破傷風トキソイドである請求項１に記載の方法。
- 前記抗原が前立腺特異的抗原である請求項１に記載の方法。
- 前記抗原がＡ型肝炎である請求項１に記載の方法。
- 前記抗原がジフテリアである請求項１に記載の方法。
- 前記リンパ球ならし培地の投与量が約１０μｇ−約５００μｇである請求項１に記載の方法。
- 前記投与が、皮内注射、皮下注射及び筋肉内注射とそれらの併用から成るグループから選択される請求項１に記載の方法。
- 前記投与が、週一回、隔週一回、月一回及び年一回とそれらの併用から成るグループから選択される請求項１に記載の方法。
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