CN1787835A - 人淋巴细胞疫苗佐剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种得自人淋巴细胞的佐剂。该佐剂可以和传统的疫苗或癌症免疫疗法一起使用，以增强患者的免疫系统对疫苗或其它免疫治疗剂的应答。该佐剂得自从培养的活化淋巴细胞收集的上清液。

Description

人淋巴细胞疫苗佐剂
技术领域
本发明涉及一种得自人淋巴细胞的佐剂。该佐剂可以和传统的疫苗或癌症免疫疗法一起使用，以增强患者的免疫系统对疫苗或其它免疫治疗剂的应答。
背景技术
免疫学佐剂和疫苗一起用于增加对抗原的免疫应答。一方面，免疫学佐剂发挥作用的一种方式就是通过将巨噬细胞吸引到抗原，从而使巨噬细胞可以将抗原提呈到部位淋巴结并启动有效的抗原响应。佐剂本身亦可作为抗原载体，或者可以通过其它机理影响免疫应答，诸如储存作用、细胞因子诱导、补体激活、招募免疫系统的不同细胞群、传输抗原到不同的抗原提呈细胞、调节HLA I类或II类分子的表达和刺激以产生不同的抗体亚型。许多较新的疫苗仅产生微弱的免疫性，因而需要存在佐剂。
具有佐剂活性的物质为公知的。矾(Alum)(Al(OH)3)和类似的铝凝胶为经许可用于人的佐剂。Glenny在1926年首次发现了矾的佐剂活性(Chemistry and Industry，Jun.15，1926；J.Path.Bacteriol，34，267)。氢氧化铝和磷酸矾(一起通称为铝)常规地用作人和家畜疫苗中的佐剂。已充分确定了矾在增强抗体对白喉和破伤风类毒素应答方面的功效，近来，HBsAg疫苗以矾作为佐剂。
也知道其它物质具有佐剂活性，并且这些物质包括：完全弗氏佐剂，一种矿物油包水型乳剂，其在油相中含有死的干的分支杆菌；不完全弗氏佐剂，一种不含分支杆菌的较弱制剂；皂角苷，一种从Quillia saponaria树萃取的膜活性葡糖苷；非离子阻滞共聚物表面活性剂，非代谢的合成分子，其趋向于将蛋白质结合到细胞表面；ISCOMS，含有Quil A(皂角苷)的脂质胶束，其在生理上讲下模仿感染微粒；以及胞壁酰二肽，一种白细胞刺激分子，为死分支杆菌的一种活性成分。在癌症治疗中，一种已知佐剂为卡介苗(BCG)，其与多种抗癌疫苗方案一起使用。也已经发现当GM-CSF与自体肿瘤细胞一起使用时为一种有效的佐剂。
对于所有的这些试剂，毒性、不能接受的慢性反应和/或低效能(就BCG来说)成为当前限制它们用作潜在佐剂的特征。因此，在癌症治疗和其它疾病治疗中，一直都需要可促进对疫苗的人免疫应答的新佐剂。
在研发佐剂时，一类研究致力于树突状细胞。树突状细胞(DC)为专业抗原提呈细胞(APC)，具有可启动体内外初级免疫应答的独特能力(1-3)。它们衍生自骨髓(DC1)或淋巴(DC2)前体，并以其不成熟形式遍及全身，分布在常遇到环境病原体的组织中(皮肤、粘膜、肠上皮细胞等)(1，2，4-7)。然而，DC1和DC2在外周循环中包含的单核细胞占总数的百分数较小，CD14+/CD11c+/HLA-DR+单核细胞形式的DC1前体相对丰富，大约组成了单核血细胞的10％-15％(11-15)。
未成熟的DC表达了大量的涉及抗原捕获、DC活化/成熟和抗原提呈的表面结构(1，2，8)。一旦DC遇到抗原，它们经历一种成熟过程，该过程的特征在于HLA I类和II类分子以及共刺激分子上调，并在T和B淋巴细胞上与同源受体发生反应，导致产生抗原特异性细胞和体液的免疫应答(1，2，9，10)。
DC被视为免疫系统中的初级APC。可分离这些细胞和/或其前体以及在体外对它们进行研究的能力大大增加了有关它们在天然的和获得性免疫中的作用方面的知识(1，2)。体外产生人DC的典型方式就是从外周血中分离和富集CD14+单核细胞，并在GM-CSF和IL-4中培养多个时间周期，随后用许多细胞因子使之最终成熟，包括IL-2、IL-6、IL-7、IL-13、IL-15、TNFα、IL-1β(16，36)或包含脂多糖、PGE2、1型干扰素或双链RNA在内的多种其它试剂(20-24)。
许多研究者已表明这些在体外生成的单核细胞衍生的DC为潜在的抗原提呈细胞(APC)，能够启动初级的以及恢复抗原特异性的CD4+和CD8+T细胞响应(27-30)。最近的体外研究已产生了一个有关DCl生物学的相当广泛的信息体，并阐明了这些在体内产生抗原特异性免疫应答的过程(1-2)。在外围组织中，未成熟DC在危险信号中获取抗原物质，启动了由DC和附近的其它细胞型生成的复杂的细胞因子/趋化因子环境(31)。由DC产生的可溶性介体可以以自分泌或旁分泌方式发生作用。T细胞在与抗原武装的DC发生相互作用后产生其它的细胞因子和趋化因子，如同由释放出的细胞因子活化其它免疫细胞那样(32-35)。这种复杂的相互作用网可以依次创造一种可促进从其单核细胞前体中产生DC的环境。
几个研究者已描述了可使用多种无细胞培养物的上清液，也称为″条件培养基″作为DC成熟剂。这些培养基或多或少含有明确限定的细胞因子混合物(12，25，26)。已表明含有IFNα、IL-1β、IL-6和TNFα的单核细胞条件培养基(MCM)可诱导CD83、p55具有成熟DC特征的表面分子的表达(26)。然而，当将这些细胞因子组合以相当于在条件培养基中发现的浓度加入到未成熟DC中时，与MCM相比，它们在使成熟DC时的有效性较小。这些结果暗示出需要其它成分以实现未成熟DC的完全成熟。
在一次研究中，Kato等通过用粘附到塑料表面的抗CD3单克隆抗体培养分离的T细胞而制备了条件培养基(称为TCCM)(25)。该培养基能够使从在GM-CSF和IL-4中培养的单核细胞生成的未成熟DC成熟。有趣地是，抗CD3的不同克隆诱导出不等量的可溶性CD40配基和IFNγ，并且这些差别反映为培养基使DC成熟的能力。
尽管MCM和TCCM为使DC最终成熟的非常有效的介体，但是未报道它们将单核细胞分化为未成熟DC的能力。发明人注意到在一件报道中采用来自CpG-A寡核苷酸刺激的PBMC培养基观察这种活性(33)。已很好地确定了CpG-A可通过PBMC中的一种次要细胞成分血浆细胞状DC诱导1型干扰素产生(IFNα/IFNβ)(6，37-39)。在被引用的研究中，IFNa抗体减少但没有废除培养基的活性，暗示出其它的细胞因子可能参与了单核细胞分化的诱导。由于已知IFNa在可影响单核细胞分化的其它细胞型(包括T细胞)中诱导生成细胞因子，因此这是完全可能的(6，38，39)。
考虑到当将可促使树突状细胞成熟的化合物或成分与疫苗抗原一起给药时，会导致更多的抗原提呈细胞将疫苗抗原提呈到T淋巴细胞和B细胞，从而促进对疫苗抗原的免疫应答。
发明内容
本发明通过提供基于人淋巴细胞产品的新佐剂而解决了上述需求，可提供免疫潜能并增加对疫苗抗原免疫应答的数量和质量。
在本发明的一个方面，从来自体外刺激培养的人外周血单核细胞收集的上清液物质中获得佐剂。在培养过程中激活首次用于实验的T细胞。该佐剂发挥作用以增强疫苗启动、创造、加强免疫和/或维持对人和其它动物或植物种中的试剂的免疫应答能力。
本发明提供了一种佐剂，其基于从用抗CD3/CD28包被珠刺激的外周血单核细胞中获得的细胞因子和趋化因子的混合物。如本文所用的，术语″淋巴细胞条件培养基(LCM)″将用于指这种佐剂。已经发现LCM为一种高效的条件培养基，具有使单核细胞衍生的DC成熟并将单核细胞变为强APC的能力。该佐剂可提供一种快速、经济以及可能更″生理的″方法，以便从体外前体细胞中得到大量DC1，并因而LCM可作为一种有效的疫苗佐剂发挥功能。认为在启动体内免疫应答后，PBMC衍生的产品可以提供所需的细胞因子环境，以便从其前体中快速产生DC1。
已知在LCM制品中鉴定的细胞因子和趋化因子通过影响APC以及相应的T和B细胞之自分泌或旁分泌而参与免疫应答的产生。在LCM中发现的细胞因子浓度明显低于通常用于在体外将单核细胞分化为未成熟DC或使DC成熟的细胞因子浓度(16，22)。LCM含有细胞因子(IFNγ、IL-12)和已知的可将T细胞向TH1应答极化的可溶性CD40配基以及将T细胞向TH2应答极化的细胞因子(IL-4和IL-10)(5，40，41)。后面的这些细胞因子，当出现在抗原提呈的未成熟DC和T细胞的培养物中时，也可以诱导T细胞无力。然而，在LCM中存在IL-10和少量IL-4不仅不废除对TT的T细胞召回应答，反而增大了T细胞应答，明显证明了TH1细胞因子的影响占主导地位。
除炎前细胞因子之外，在LCM中检测出高浓度的趋化因子。在炎症过程中，这些趋化因子由淋巴细胞和非淋巴细胞产生(35，42)。作为实例，RANTES由CD8+-T细胞产生并依次诱导产生其它活化T细胞和单核细胞的细胞因子和趋化因子(MIP1β、IL-2、IL-6和1型干扰素)(43)。这些细胞因子和趋化因子的诱导可代表抗原呈递过程中T细胞在体内被APC激活时所发生的。继T细胞通过T细胞受体和和CD28连接活化后，T细胞释放出已知的可影响单核细胞分化为未成熟DC并向部位淋巴器官迁移的细胞因子和趋化因子。这些可溶性因子也可以将DC前体和其它APC吸引到原始抗原所遇到的环境中(危险信号)。可预期，由活化的T细胞和下游的旁观细胞所产生的细胞因子和趋化因子一起放大免疫应答级联反应，其为佐剂的一种期望特性。对多种细胞因子可用作疫苗佐剂的能力的认识增强，特别是GM-CSF和IL-2。
产生PBMC衍生的条件培养基具有从其前体产生大量未成熟DC并使单核细胞衍生的DC成熟的能力。在研制未来的疫苗时，这种快速、划算的方法可发挥重要作用，并用作佐剂。此外，在LCM中含有广泛的细胞因子和趋化因子暗示一种更为生理的刺激物，提供了一种类似于一旦T细胞遇到抗原时可在体内发现的细胞因子环境。
本发明提供了一种将佐剂(包括上清液和以细胞为基础的)与疫苗抗原一起使用的方法，以增强对疫苗的免疫应答。
因此，本发明的一个目的就是提供一种能增强对疫苗之免疫原应答的疫苗佐剂。
本发明的另一目的是提供一种得自人淋巴细胞的疫苗佐剂。
本发明的另一目的是提供一种从刺激培养的人淋巴细胞收集的上清液中获得的疫苗佐剂。
本发明的另一目的就是提供一种通过将佐剂与疫苗一起施用于宿主动物而使用疫苗佐剂的方法。
通过下面的描述、附图和附加的权利要求书，本发明的这些和其它目的将会变得更加明显。
附图说明
图1A-1E：LCM在仅采用LCM培养的单核细胞中诱导出DC样表型。在不同的时间点分析CD14(图1A)、HLA-DR(图1B)、CD40(图1C)、CD80(图1D)和CD86(图1E)的表达。数据表示9次实验的平均值±SEM。*表示p＜0.05，并且**表示p＜0.005。
图2A-2X：LCM对未成熟单核细胞衍生的DC成熟的影响。将淘选的单核细胞用GM-CSF/IL-4培养3-4天，然后单独加入培养基(图2G-2L)、LCM(图2M-2R)或成熟“鸡尾酒”(图2S-2X)48小时。将仅在cRPMI中培养的单核细胞用作阴性对照(图2A-2F)。对于CD14、HLA-DR、CD40、CD83、CD80和CD86的表面表达，采用流式细胞计测定CD11c+-DC。空白柱状图代表用同功型对照mAb染色DC，阴影柱状图代表用特异性mAb染色DC。
图3A-3E：当加入到全部PBMC群时，LCM将单核细胞分化为DC样表型。在第0、3和5天时，对于CD14(图3A)、HLA-DR(图3B)、CD40(图3C)、CD80(图3D)和CD86(图3E)的表达而分析CD11c+细胞。数据表示两次实验的平均值。
图4：由存在LCM时培养的淘选单核细胞所生成的DC刺激异源PBMC应答的能力优于不存在LCM时培养的那些。异源PMBC(1×105细胞)培养在具有1×104个刺激物细胞的96孔U型底培养物微量滴定板内，如一式三份所显示的。PBMC应答以刺激指数表示(单个MILR的平均CPM(计数/分钟)与仅在对照培养基中培养的PBMC的平均CPM的比)。
图5A-5B：LCM增大了全部PBMC对破伤风类毒素的增殖应答。在有或无10μg/ml破伤风类毒素蛋白质的LCM中以及在具有抗原的cRPMI中，将全部PBMC或耗尽单核细胞的PBMC在96孔U型底培养微量滴定板内培养。在含有10μg/ml伴刀豆球蛋白A的cRPMT中培养的PBMC作为阳性对照(数据未示出)。应答以刺激指数(SI)表示(用TT、LCM或TT和LCM一起培养的PBMC培养物的平均CPM(图5A)与仅在cRPM中培养的PBMC的平均CPM(图5B)的比)。数据表示两次实验的平均值。*表示p＜0.05。
优选实施例的详细说明
一方面，本发明提供了一种可增强宿主哺乳动物中对疫苗抗原免疫应答的方法，包括将淋巴细胞条件培养基，即从用生长培养基培养的活化人淋巴细胞中获得的上清液，与疫苗抗原一起给药。优选地，所述哺乳动物为人。培养方法和步骤为标准的并为本领域公知的。将可从任何来源获得的人(或其它哺乳动物，取决于要治疗的哺乳动物)外周血单核细胞(PBMC)稀释在可从市场上购买的组织培养物生长培养基中。细胞用由CD3/CD28抗体包被珠组成的活化剂孵育。大约在第3天时，从培养基中分离细胞和珠，并且按需要将细胞和珠再次悬浮于其它生长培养基中。为了获得细胞，将它们再次悬浮在离心管中并球形化，之后，可以用吸量管抽取上清液并储存备用。
如本文所用的，术语″上清液″指以如上所述方式从培养的细胞中抽取的液体。″淋巴细胞条件培养基″和″上清液″在本文中交替使用，并指从培养的细胞中抽取的液体。进行研究以确定上清液的特征，并发现含有平均分子量小于约100,000道尔顿的分子。
通过用于接种疫苗的已知方法给药，并且适合的传输方法包括，但不局限于，肌内、经皮和皮下注射。典型地，将约10μg-约500μg与抗原一起施用。施用可以是每周一次、两周一次、每月一次或每年一次，取决于抗原和预期的免疫应答水平。例如，通过进行本领域公知的标准分析观察到免疫应答增强，该分析可用来评估细胞免疫性(如T细胞增殖)并在免疫后测定抗体滴度。
本发明适用于各种疫苗，包括，但不局限于，麻疹、腮腺炎、风疹、流感、流感嗜血杆菌B型疫苗、白喉、破伤风、百日咳、肺炎球菌多糖疫苗、脑膜炎球菌多聚糖疫苗、金黄色葡萄球菌疫苗、呼吸合胞体病毒、链球菌、副流感病毒肺炎支原体、麻风分支杆菌、诺卡氏菌属、军团菌、假单胞菌、霍乱疫苗、伤寒症、脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎疫苗、轮状病毒、大肠杆菌、志贺氏杆菌、戊型肝炎、李斯特氏杆菌、兰伯贾第虫、弓蛔虫病、鞭虫病、蛔虫病、阿米巴病、囊虫病、乙型肝炎重组细胞和血浆衍生的疫苗、HIV-1和HIV-2、HTLVI和HTLV-II、EB病毒、丙型肝炎、疱疹B、人乳头状瘤病毒、1型和2型单纯疮疹、衣原体、淋病、密螺旋体(梅毒)、炭疽热、狂犬病、血吸虫病、瘟疫、黄热病疫苗、乙型脑炎和蜱传脑炎疫苗、疟疾、利什曼病、莱姆病、淋巴丝虫病和盘尾丝虫病、锥虫病和查加斯病、立克次氏体和斑疹伤寒发热、登革热、腺病毒疫苗、水痘带状疱疹疫苗、细胞巨化病毒、冠状病毒和鼻病毒、链球杆菌、敏感症肽、传染病肽疫苗、癌肽疫苗、自体免疫肽疫苗，以及利用抗原、肽、DNA片断和/或其它在癌细胞表面或内部的任何分子的癌疫苗。
实施例
以下实施例用于举例说明本发明，并且无论如何也不应当解释为对本发明的限制。采用以下的材料和方法进行实验：
细胞
在淋巴细胞分离培养基(ICN Biomedicals Inc.，Aurora，OH)中，通过进行密度梯度离心，从来自正常健康供体的去除白细胞的产品中分离人外周血单核细胞(PBMC)，用于制备条件培养基。采用自动细胞冷冻机(Gordinier Electronics，Roseville，MI)，将细胞活着冷冻在含有20％人AB血清(Gemini Bio-Products，Woodland，CA)和10％DMSO(Sigma，St.Louis，MO)的RPMI-1640中(Invitrogen Corp.，Grand Island，NY)，并储存在液氮的气相中直至使用。通过逆流淘析离心法从PBMC中分离单核细胞并立即使用，或活着冷冻在含有10％DMSO和5％葡萄糖(Sigma)的胎牛血清(SummitBiotechnology)中备用。
制备LCM
在添加有20％人AB血清(hAB)的RPMI-1640中解冻冷藏的PBMC，用含有10％hAB的RPMI-1640清洗两次。将细胞再次悬浮在cRPMI[含有10％hAB、2mM L-谷氨酸(Invitrogen)、1％青霉素链霉素溶液(Invitrogen)、20mM Hepes缓冲液(Invitrogen)的RPMI-1640]或添加有2mM L-谷氨酸、1％青霉素链霉素溶液、20mM Hepes缓冲液的X-Vivo 15(Bio Whittaker，Walkersville，MD)中。将CD3/CD28 Dyna珠(Dynal，Lake Success，NY)加入到细胞中，对于每1×106PBMC，加入75μl珠，并且该培养基于37℃在5％CO2中孵育3天。随后，收集无细胞的上清液，并在使用前于2-8℃下储存。LCM在cRPMI中以1∶1稀释使用。
培养淘选的单核细胞
用cRPMI清洗淘选的单核细胞，以5×105细胞/ml的浓度再次悬浮在相同体积的LCM和cRPMI中，并在24孔的微量滴定板(Denville Scientific Inc.，Metuchen，NJ)内于37℃在5％CO2中培养5-6天。可供选择地，单核细胞在含有750U/ml GM-CSF(R&DSystems，Minneapolis，MN)和720U/ml IL-4(R & D Systems)的cRPMI中培养3-4天，随后加入条件培养基或细胞因子组合物[10ng/ml IL-1β、10ng/ml TNFα、0.91ng/ml IL-6(R&D Systems)、1μm/ml PGE2(Sigma)](成熟鸡尾酒)48小时。将成熟鸡尾酒作为阳性对照，并且将仅在cRPMI中培养的单核细胞用作阴性控制。
流式细胞计
在cRPMT中清洗细胞一次，再次悬浮在含有5％hAB的lx PBS中(Invitrogen)，并在室温(22-25℃)下孵育15分钟以阻滞Fc受体。接着清洗细胞，再次悬浮在清洗缓冲液中(1X PBS，含有1％hAB和0.1％NaN3)，并用对抗CD14、CD11c、CD40、CD83、CD80、CD86的荧光素偶连抗体(BD BioSciences，San Diego，CA)以及适当的同型对照抗体进行标记。于4℃下30分钟后，用缓冲液清洗细胞并固定在含1％多聚甲醛的1X PBS中。采用FACScan流动血细胞计数器获取流动血细胞数据，并采用CellQuest软件(Becton Dickinson，SanJose，CA)进行分析。门限根据同型对照样品进行设定。
细胞因子和趋化因子分析
根据生产商的指示，采用商业上通用的酶联免疫吸附分析来确定LCM中的细胞因子和趋化因子量(ELISA；R & D Systems，Minneapolis，MN)。也采用ELISA测定PGE2的浓度(CaymanChemical Co.，Ann Arbor，MI)。所有的测定均一式两份进行。
异源MLR
从培养基中获取树突状细胞，在cRPMI中清洗两次，并以104、103和102细胞/孔的浓度放入96孔U型底培养基微量滴定板内(Denville Scientific，Inc.)。将总体积为200μl的异源应答器PBMC以1×105细胞/孔的浓度加入到每个孔中。所有条件均一式三份进行。细胞于37℃在5％CO2中孵育3天，脉冲式加入1.0μCi氚胸腺嘧啶脱氧核苷(Perkin Elmer，Boston，MA)16小时，并采用自动多孔获得器(Tomtec，Orange，CT)进行收集。采用MicroBeta TriLux液体闪烁计数器(Wallac，Turku，Finland)测定并入应答器细胞的含氚胸腺嘧啶脱氧核苷量。
抗原刺激分析
将未接触抗原的正常人PBMC(1×105/100μl cRPMI)放入96孔U型底培养物微量滴定板内，向其中加入含有或不含10μg/ml破伤风类毒素(Accurate Chemical and Scientific Corp.，Westbury，NY)的100μl LCM或100μl cRPMI。在含有10μg/ml伴刀豆球蛋白A(Sigma，St.Louis，MO)的cRPMI中培养的PBMC作为阳性控制。所有条件均一式三份进行，于37℃在5％CO2中培养3和5天，脉冲式加入1.0μCi氚胸腺嘧啶脱氧核苷16小时，并采用自动多孔获得器进行收集。采用MicroBeta TriLux液体闪烁计数器测定并入应答器细胞的氚胸腺嘧啶脱氧核苷量。
无其它细胞因子时，LCMD将单核细胞分化为DC
为了产生一种高效的细胞因子鸡尾酒，以便从其体外前体产生大量的人DC并使之成熟，我们从抗CD3/抗CD28刺激的PBMC(LCM)中产生培养基的上清液，如在物质和方法部分中所描述的，并研究了它们对通过逆流离心从PBMC中获得的高纯人单核细胞的影响。在无GM-CSF和IL-4存在的LCM中培养单核细胞，并采用流式细胞计测定具有分化和使DC成熟特征的细胞表面标记物的表达。培养前，单核细胞在构成上表达CD11c以及CD 14和HLA-DR。到第3天时，以及仅保留有表达该标记物的少数细胞的那些天时，在LCM中培养引起细胞表达CD 14的百分数明显下降(图1A)。与仅在培养基中培养的那些细胞相比，HLA-DR(图1B)、CD40(图1C)、CD80(图1D)和CD86(图1E)的MFI对在LCM中培养的细胞始终上调。在9次实验中，有4次观察到小百分比的CD83+DC；然而，这些结果不明显。总之，LCM将单核细胞分化为显型的未成熟DC，是获取抗原的最佳发育期。
LCM使在GM-CSF/IL-4中培养的单核细胞成熟
评估了LCM使未成熟DC成熟的能力，该未成熟DC是在GM-CSF和IL-4存在的情况下体外从单核细胞生成的。将通过淘析从PBMC中获得的单核细胞在含有GM-CSF和IL-4的培养基中培养3-4天，随后加入LCM或含有IL-1β、TNFa、IL-6和PGE2的标准成熟鸡尾酒(参见物质和方法部分)。48小时后，进行流式细胞分析。如图2和表1所示，LCM和成熟鸡尾酒诱导了HLA-DR、共刺激分子和CD83的表达，一般为成熟DC的认可信号。这些结果显示出LCM可促进未成熟单核细胞衍生DC的最终成熟。从全部的四个不同供体中获得的LCM的DC成熟活性非常一致(数据未示出)。
表1：表面标记物在有或无LCM的GM-CSF和1L4中培养的单核细胞上的表达
                   MFI                百分比
  标记物   (+)LCM   (-)LCM   p值   (+)LCM   (-)LCM   p值
  CD40   110±43   37±16   0.003   95±3   5±26   0.003
  CD83   18±12   9±5   0.026   17±11   5±2   0.014
  CD80   55±37   13±7   0.007   56±21   15±6   0.0003
  CD86   182±116   179±108   NS   90±7   86±19   NS
表1：MEI的统计学评估以及CD40、CD83、CD80和CD86对最后48小时用含有(+LCM)或不含有(-LCM)LCM的GM-CSF/IL-4培养的单核细胞的表达百分数。数据以8次实验的平均值±SEM表示，并采用成对的二尾学生t试验测定统计学意义。
当用LCM培养时，PBMC中的单核细胞表达辅助分子
为研究LCM对体内外周血中含有的多种细胞群的分布和显型的影响，将全部的PBMC在LCM培养中3或5天。在这两个时间点，未发现CD3+、CD4+-、CD8+、CD56+和CD19+细胞的百分比有差别(数据未示出)。同样，CD3+细胞共表达CD25，一种活化标记物，其百分比在5天的培养期间没有增加(数据未示出)。然而，CD 14对单核细胞的表达，由其对CD11c的表达来鉴定，在第3天下降并且到第5天时几乎完全下调(图3A)。相反，HLA-DR、CD40、CD80和CD86对CD11c+细胞的表达上调(图3)。因此，LCM将高纯的单核细胞和全部PBMC内的单核细胞分化为具有类DC显型的细胞。
LCM中细胞因子和趋化因子的浓度
采用标准ELISA方法测定LCM中细胞因子和趋化因子的浓度(表2)，并与通常用于产生或使DC成熟的细胞因子的浓度对比(表3)。鉴定全部的可溶性介体组，包括GMCSF和IL-4、炎性细胞因子(IL-1β、IL-6、PGE2、TNFα、IFNγ)、趋化因子(MCP-1、MIP1、RANTES)和sCD40L(表2)。惊人地，GM-CSF和IL-4在LCM中的浓度显著低于标准的原始记录中用于从单核细胞产生未成熟DC使用的两种细胞因子的浓度(表3)。IL4对单核细胞在体外分化为未成熟DC期间的一种作用是下调CD14表达。IL-4在LCM中的低水平可以解释CD14对在LCM中培养的单核细胞的相对缓慢的下调(图1A、3A)。与成熟鸡尾酒相比，在LCM中也含有低浓度的炎性细胞因子，尽管两种成熟试剂对未成熟DC具有可比的影响。
表2：LCM中含有的细胞因子和趋化因子量
  细胞因子或趋化因子   含量(ng/ml)
  GM-CSF   23.98
  IFNα   0.00
  IFNγ   31.44
  IL-1β   0.07
  IL-2   5.91
  IL-3   1.04
  IL-4   0.28
  IL-6   2.17
  IL-8   47.97
  IL-b   0.66
  IL-12   0.01
  IL-15   0.00
  MCP-1   110.04
  M-CSF   8.69
  MIP-1α   127.20
  MIP-1β   157.89
  PGE2   1.54
  RANTES   20.64
  sCD40L   1.27
  SDF-1α   0.00
  TGFβ   0.00
  TNFα   6.43
表2：采用ELISA在四个不同的LCM制品中测定的细胞因子或趋化因子的平均浓度
表3：在LCM、GM-CSF/IL4培养基和成熟鸡尾酒中的细胞因子量
  加入到细胞培养物中的细胞因子量(ng/ml)
  LCM*   GM-CSF/IL4培养基
  GM-CSF   11.99   50.00
  IL-4   0.14   20.16
  LCM*   成熟鸡尾酒
  IL-1β   0.035   10.00
  IL-6   1.085   9.09
  PGE2   0.770   1000.00
  TNFα   3.215   10.00
表3：将LCM中含有的GM-CSF和IL-4量与在标准原始纪录中采用的用于产生单核细胞衍生DC的量相比，如同在LCM和成熟鸡尾酒中选择的炎前细胞因子的GM-CSF浓度。*注意，对于LCM，在该表中给出的细胞因子浓度为表2中浓度的一半：这是由于LCM在cRPMI中以1∶1稀释后加入到细胞中。
在LCM中培养的单核细胞刺激异源PBMC
单核细胞衍生DC的功能性特性是其可有效地诱导体外异源应答的能力。测定了PBMC对单核细胞的异源应答，所述单核细胞已在LCM不存在或存在的情况下培养了5天，或者在含有GM-CSF/IL-4的培养基中培养，随后加入cRPMI或LCM。如图4所示，由仅在LCM中培养的单核细胞生成的刺激指数(SI)大约为由仅在cRPMI中培养的单核细胞所诱导的刺激指数的3倍。然而，SI在于GM-CSF/IL-4中培养并用LCM使之成熟的单核细胞中为最高的。这些结果证明LCM将单核细胞和未成熟DC变为更加有效的抗原提呈细胞。
LCM增强了PBMC对破伤风类毒素的应答
此外，同样在LCM存在或不存在的情况下，测定了PBMC对召回抗原破伤风类毒素(TT)的增殖响应(图5A)。不存在LCM和其它细胞因子时，PBMC表现出低水平的TT应答；然而，加入LCM后，对TT的应答在第6天显著增加(图5a)。重要的是指出LCM在PBMC中单独诱导了DNA合成，即使不存在特异性抗原；然而，对特异性抗原的应答显著增大。为确定观察到的TT应答是否由单核细胞介导，利用PBMC重复进行了实验，其已被带有免疫磁珠的CD 14+细胞耗尽。如图5B所示，加入或不加入LCM均对TT无应答。在去除单核细胞的实验中(图5B)SI较高可以用其它细胞型尤其是CD3+细胞数的相对增加来解释(数据未示出)。这些结果清楚地表明LCM增强了PBMC对TT作出响应的能力，并且该应答由单核细胞介导。
以上发现表明，LCM将高纯单核细胞和所有PBMC中的单核细胞变为DC样表型。此外，未成熟单核细胞衍生的DC在LCM中培养后发育为成熟的DC表型。就功能而言，与其单核细胞前体相比，这些LCM衍生的DC显示出刺激异源PBMC的能力增加，并显著增大了对TT的应答。所观察到的LCM的影响可以用在条件培养基中鉴定的炎前细胞因子和趋化因子的组合而进行解释。
尽管以上为了进行说明而描述了本发明的特定实施例，对本领域技术人员显而易见的是：在不偏离由附加的权利要求书所限定的本发明的前提下，可以对本发明的细节做多种变形。
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Claims (11)

1.一种用于增强哺乳动物中对抗原免疫应答的方法，包括将淋巴细胞条件培养基和所述抗原一起施用于所述哺乳动物。
2.根据权利要求1的方法，其中，所述淋巴细胞条件培养基得自用抗CD3/CD28包被珠培养的首次用于实验的T细胞。
3.根据权利要求1的方法，其中，所述抗原是HIV-1或HIV-2。
4.根据权利要求1的方法，其中，所述抗原是乙型肝炎。
5.根据权利要求1的方法，其中，所述抗原是破伤风类毒素。
6.根据权利要求1的方法，其中，所述抗原是前列腺特异性抗原。
7.根据权利要求1的方法，其中，所述抗原是甲型肝炎。
8.根据权利要求1的方法，其中，所述抗原是白喉。
9.根据权利要求1的方法，其中，所述淋巴细胞条件培养基的剂量为约10μg-约500μg。
10.根据权利要求1的方法，其中，所述施用选自皮内、皮下和肌肉注射及其组合。
11.根据权利要求1的方法，其中，所述施用选自每周一次、两周一次、每月一次和每年一次及其组合。
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