KR20060023519A - 인간 림프구 백신 면역 보강제 - Google Patents

인간 림프구 백신 면역 보강제 Download PDF

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KR20060023519A
KR20060023519A KR1020057015491A KR20057015491A KR20060023519A KR 20060023519 A KR20060023519 A KR 20060023519A KR 1020057015491 A KR1020057015491 A KR 1020057015491A KR 20057015491 A KR20057015491 A KR 20057015491A KR 20060023519 A KR20060023519 A KR 20060023519A
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monocytes
adjuvant
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켄이치로 하스미
딘 레오 맨
그롤리치 핸키 킴
크리스티나 미셸 홀트
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하스미 엘엘씨 (디비에이 슈코카이 인터내셔널)
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Abstract

본 발명은 인간 림프구로부터 유래되는 면역 보강제에 관한 것이다. 본 면역 보강제는 백신 또는 다른 면역 요법제에 대한 환자의 면역계의 반응의 증강을 위하여 전통적인 백신 또는 암 면역 요법과 조합되어 사용될 수 있다.
백신, 면역 보강제, 인간 림프구, 조절 배지, 면역 반응

Description

인간 림프구 백신 면역 보강제{HUMAN LYMPHOCYTE VACCINE ADJUVANT}
본 발명은 인간 림프구로부터 유래되는 면역 보강제 (adjuvant)에 관한 것이다. 본 면역 보강제는 백신 또는 다른 면역 요법제에 대한 환자의 면역계의 반응의 증강을 위하여 전통적인 백신 또는 암 면역 요법과 조합되어 사용될 수 있다.
면역학적 면역 보강제가 항원에 대한 면역 반응의 증대를 위하여 백신과 병용된다. 면역학적 면역 보강제가 기능하는 하나의 방식은 대식 세포가 항원을 국부적인 림프절에 제시하고 효과적인 항원 반응을 개시할 수 있도록 항원에 대식 세포를 항원으로 끌어당김으로써 하는 것이다. 면역 보강제는 또한 그 자신이 항원의 담체로 작용할 수도 있거나 다른 기전, 예를 들어 저장 효과 (depot effect), 사이토카인 유도, 보체 활성화, 면역계의 상이한 세포 집단의 모집, 상이한 항원 제시 세포로의 항원 전달, HLA 클래스 I 또는 클래스 II 분자의 발현의 조절 및 상이한 항체 아형의 생성을 위한 자극에 의해 면역 반응에 영향을 줄 수도 있다. 보다 새로운 백신 중 다수는 단지 약하게 면역원성이며 따라서 면역 보강제의 존재를 필요로 한다.
면역 보강제 활성이 있는 물질이 잘 알려져 있다. 명반 (Al(OH)3), 및 유사 한 알루미늄 겔이 인간에 대한 사용이 허가된 면역 보강제이다. 명반의 면역 보강제 활성은 1926년에 Glenny에 의해 최초로 발견되었다 (Chemistry and Industry, Jun. 15,1926 ; J. Path. Bacteriol, 34,267). 수산화알루미늄 및 인산알루미늄 (총체적으로 명반으로 일반적으로 칭함)이 인간용 및 수의학적 백신에 있어서 면역 보강제로 일상적으로 사용된다. 디프테리아 및 파상풍 유독소에 대한 항체 반응의 증가에 있어서의 명반의 효능은 잘 확립되어 있으며, 더욱 최근에는 HBsAg 백신이 명반으로 면역 보강되었다.
다른 물질도 면역 보강제 활성이 있는 것으로 공지되어 있으며, 이들은 오일 상 중에 사멸시킨 건조 마이코박테리아 (mycobacteria)를 포함하는 광유중수 에멀젼인 프로인트 (Freund) 불완전 면역 보강제; 마이코박테리아를 포함하지 않는 보다 약한 제형인 프로인트 불완전 면역 보강제; 퀼리아 사포나리아 (Quillia saponaria) 나무로부터 추출된 막 활성 글루코시드인 사포닌; 단백질을 세포 표면에 결합시키는 경향이 있는 비-대사 합성 분자인 비이온성 블록 공중합체 계면활성제; 물리적인 면에서 감염성 입자를 모방하는 Quil A (사포닌)가 혼입된 지질 미셀인 ISCOMS; 및 사멸된 마이코박테리아의 활성 성분 중 하나인 백혈구 자극 분자인 무라밀 디펩티드를 포함한다. 암 요법에 있어서 공지된 면역 보강제는 다양한 항암 백신 전략과 조합되어 사용되는 바실루스 칼메트 구에린 (bacillus calmette guerin, BCG)이다. GM-CSF도 자가 종양 세포와 조합하여 사용시 효과적인 면역 보강제인 것으로 밝혀졌다.
이러한 약제 모두에 있어서, 독성, 허용될 수 없는 만성 반응 및/또는 낮은 효험 (BCG의 경우)이 잠재적인 면역 보강제로서의 그의 사용을 현재 제한하는 특징들이다. 따라서 암 요법 및 기타 질환 치료 둘 모두에 있어서 백신에 대한 인간 면역 반응의 증가를 위한 새로운 면역 보강제가 계속적으로, 그리고 현재 필요하다.
면역 보강제 개발에 있어서의 한가지 연구 방향은 수지상 세포 연구에 관한 것이었다. 수지상 세포 (dendritic cells, DC)는 생체 내에서, 그리고 시험관 내에서 일차 면역 반응을 개시하는 독특한 능력이 있는 전문적인 항원 제시 세포 (antigen presenting cells, APC)이다 (참고 문헌 1-3). 이들은 골수 (DC1) 또는 림프 (DC2) 전구체로부터 유래되며 환경적 병원체 (피부, 점막, 소화 기관 상피 등)와 보통 조우하는 조직에 있어서 신체 전반에 걸쳐 미성숙 형태로 분포되어 있다 (참고 문헌 1, 2, 4-7). DC1 및 DC2는 말초 혈액 순환물 중 단핵 세포의 총 수의 작은 퍼센트로 포함되는 반면, CD14+/CD11c+/HLA-DR+ 단구의 형태의 DC1 전구체는 비교적 풍부하여 단핵 혈액 세포의 약 10% 내지 15%를 구성한다 (참고 문헌 11-15).
미성숙 DC는 항원 획득, DC 활성화/성숙화, 및 항원 제시에 연루된 숙주의 표면 구조를 발현한다 (참고 문헌 1, 2, 8). 일단 DC가 항원을 조우하면, 이들은 HLA 클래스 I 및 II 분자와, 공동-자극 분자의 상향 조절을 특징으로 하는 성숙 과정을 겪으며 T 및 B 림프구 상의 동계 수용체와 상호작용하여, 항원 특이적인 세포성 및 체액성 면역 반응을 생성한다 (참고 문헌 1, 2, 9, 10).
DC는 면역계에 있어서 일차 APC인 것으로 생각된다. 이 세포 및/또는 그의 전구체를 단리하고 이들을 시험관 내에서 연구하는 능력은 선천성 및 후천성 면역성에 있어서의 그의 역할에 대한 지식에 상당한 중요성을 더하였다 (참고 문헌 1, 2). 시험관 내에서 인간 DC를 생성하는 고전적인 방법은 말초 혈액으로부터 CD14+-단구를 단리 및 풍부화하고 이를 다양한 기간 동안 GM-CSF 및 IL-4에서 배양하고 이어서 IL-2, IL-6, IL-7, IL-13, IL-15, TNFα, IL-1β를 포함하는 다수의 사이토카인 (참고 문헌 16, 36) 또는 리포폴리사카라이드, PGE2, 제1형 인터페론, 또는 이중 가닥 RNA를 포함하는 다양한 다른 제제 (참고 문헌 20-24)로 최종 성숙하게 하는 것이다.
무수한 연구자들이 이러한 시험관 내에서 생성된 단구-유래 DC가 일차 및 리콜 (recall) 항원-특이적 CD4+ 및 CD8+ T 세포 반응을 개시할 수 있는 강력한 항원 제시 세포 (APC)라는 것을 밝혀내었다 (참고 문헌 27-30). 최근의 시험관내 연구에 의하면 DC1의 생물학적 특성과 관련하여 오히려 광범위한 정보체가 생성되었으며 항원 특이적 면역 반응을 생체 내에서 생성하는 공정이 밝혀졌다 (참고 문헌 1-2). 주위 조직에 있어서 미성숙 DC는 DC 및 부근의 다른 세포 형태에 의해 생성되는 복합 사이토카인/케모카인 환경을 개시하는 위험 신호의 연계 속에서 항원성 물질을 획득한다 (참고 문헌 31). DC에 의해 생성되는 용해성 매개체는 자가 분비 또는 측분비 방식으로 작용할 수도 있다. T 세포는 방출된 사이토카인에 의해 활성화되는 다른 면역 세포가 그러하듯이 항원이 갖추어진 (armed) DC와의 상호 작용 후에 추가의 사이토카인 및 케모카인을 생성한다 (참고 문헌 32-35). 이러한 복합 적인 상호 작용 네트워크는 다시 단구 전구체로부터의 DC의 생성을 촉진하는 환경을 생성할 수도 있다.
여러 연구자들이 DC 성숙화제로 "조절 배지"로도 칭해지는 다양한 무세포 배양 상청액의 사용을 기술하고 있다. 이러한 배지는 다소의 잘 규정된 사이토카인 혼합물을 포함한다 (참고 문헌 12, 25, 26). IFNα, IL-1β, IL-6, 및 TNFα를 포함하는 단구 조절 배지 (monocyte conditioned media, MCM)는 성숙 DC의 특징인 표면 분자인 CD83 및 p55의 발현을 유도하는 것으로 밝혀졌다 (참고 문헌 26). 그러나 이러한 사이토카인들의 조합물을 상기 조절 배지에서 발견되는 것에 비견되는 농도로 미성숙 DC에 첨가할 경우 이는 MCM에 비하여 DC의 성숙화에 있어서 덜 효과적이었다. 상기 결과는 추가의 성분이 미성숙 DC의 완전한 성숙에 영향을 주는 데에 필요하다는 것을 시사한다.
하나의 연구에 있어서 Kato 등은 단리된 T 세포를 플라스틱 표면에 점착된 항-CD3 단일클론 항체와 함께 배양함으로써 조절 배지 (TCCM으로 명명)를 제조하였다 (참고 문헌 25). 상기 배지는 GM-CSF 및 IL-4에서 배양된 단구로부터 생성된 미성숙 DC를 성숙화할 수 있었다. 흥미롭게도 상이한 클론의 항-CD3은 상이한 양의 용해성 CD40 리간드 및 IFNγ를 유도하였으며 이러한 차이는 상기 배지의 DC 성숙화 능력에 반영되었다.
MCM 및 TCCM은 최종 DC 성숙화에 매우 효과적인 매개체이지만 단구를 미성숙 DC로 분화시키는 능력은 보고되지 않았다. 본 발명자들은 이 활성이 CpG-A 올리고뉴클레오티드로 자극한 PBMC로부터의 배지에서 관찰되었다는 하나의 보고를 알고 있다 (참고 문헌 33). CpG-A가 PBMC에 있어서 보다 적은 성분인 플라스마사이토이드 (plasmacytoid) DC에 의해 제1형 인터페론 (IFNα/IFNβ) 생성을 유도한다는 것은 잘 확립되어 있다 (참고 문헌 6, 37-39). 인용된 연구에 있어서 IFNα에 대한 항체는 감소되었지만 이 배양 배지의 활성은 방해받지 않았는데 이는 추가의 사이토카인이 단구 분화의 유도에 참여할 수도 있음을 시사하는 것이다. 이는 IFNα가 단구 분화에 영향을 줄 수도 있는 다른 세포 형태 (T 세포 포함)에서 사이토카인의 생성을 유도하는 것으로 알려져 있기 때문에 확실히 가능하다 (참고 문헌 6, 38, 39).
백신 항원과 조합하여 투여시 수지상 세포의 상기 성숙을 촉진하는 화합물 또는 조성물은 더욱 많은 항원 제시 세포를 생성할 것이며 이는 T 림프구 및 B 세포에 백신 항원을 제시함으로써 백신 항원에 대한 면역 반응을 지지할 것으로 생각된다.
발명의 요약
본 발명은 인간 림프구 생성물을 기반으로 하며 면역 강화 작용을 제공하고 백신 항원에 대한 면역 반응의 양 및 품질을 증가시키는 새로운 면역 보강제를 제공함으로써 상기 필요성을 해결한다.
본 발명의 일 태양에 있어서 면역 보강제는 시험관 내에서 자극 배양된 인간 말초 혈액 단핵 세포로부터 수집되는 상청액 물질로부터 유래된다. 실험을 받은 적이 없는 (naive) T-세포는 배양 공정 동안 활성화된다. 본 면역 보강제는 인간 및 기타 동물 또는 식물 종에 있어서 약제에 대한 면역 반응을 개시, 생성, 증대 및/또는 지속시키는 백신의 능력을 증강시키는 작용을 한다.
본 발명은 항CD3/CD28-코팅 비드로 자극된 말초 혈액 단핵 세포로부터 수득되는 사이토카인과 케모카인의 혼합물을 기반으로 하는 면역 보강제를 제공한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이 "림프구 조절 배지 (lymphocyte conditioned medium, LCM)"이라는 용어는 이 면역 보강제를 나타내기 위하여 사용된다. LCM은 단구 유래의 DC를 성숙하게 하고 단구가 강력한 APC가 되게 하는 능력을 갖는 고도로 효과적인 조절 배지이다. 본 면역 보강제는 시험관 내에서 전구체 세포로부터 다량의 DC1이 유래되게 하는 신속하며 비용 효과가 크고 아마도 더욱 "생리학적인" 방법을 제공할 수 있으며, 따라서 LCM은 효과적인 백신 면역 보강제로 기능할 수 있다. PBMC 유래의 생성물은 생체 내에서의 면역 반응 개시 후 전구체로부터 DC1을 신속하게 생성하는 데에 필요한 사이토카인 환경을 제공할 수도 있다고 생각된다.
LCM 제제에서 동정되는 사이토카인 및 케모카인은 APC 및 반응 T 및 B 세포에 대한 자가 방출 또는 외분비 효과에 의한 면역 반응의 생성에 참여하는 것으로 알려져 있다. LCM에서 발견되는 사이토카인의 농도는 시험관 내에서 단구의 미성숙 DC로의 분화 또는 DC의 성숙에 보통 사용되는 사이토카인의 농도보다 상당히 더 작다 (참고 문헌 16, 22). LCM은 TH1 반응 쪽으로 T 세포를 분극화하는 것으로 알려진 사이토카인 (IFNγ, IL-12) 및 용해성 CD40과, TH2 반응 쪽으로 T 세포를 분극화하는 사이토카인 (IL-4 및 IL-10)을 포함한다 (참고 문헌 5, 40, 41). 상기 후자의 사이토카인은 또한 항원 제시 미성숙 DC 및 T 세포의 배양물에 존재시 T 세 포 애너지 (anergy)를 유도할 수도 있다. 그러나 LCM 중의 소량의 IL-4 및 IL-10의 존재는 TT에 대한 T 세포 리콜 반응을 방해하지 못하며, 오히려 T 세포 반응은 증가하였는데, 이는 TH1 사이토카인의 효과가 우세하다는 것을 명백히 입증하는 것이다.
전염증성 사이토카인 외에도 고농도의 케모카인이 LCM에서 탐지되었다. 이러한 케모카인은 염증 과정의 정황에서 림프성 세포와 비-림프성 세포에 의해 생성된다 (참고 문헌 35, 42). 예로서, RANTES는 CD8+-T 세포에 의해 생성되며 이는 다시 T 세포와 단구를 활성화하는 다른 사이토카인 및 케모카인 (MIP1β, IL-2, IL-6, 및 제1형 인터페론)의 생성을 유도한다 (참고 문헌 43). 이러한 사이토카인 및 케모카인의 유도는 항원 제시의 정황에 있어서 생체 내에서 APC에 의해 T 세포가 활성화될 경우 일어나는 것 중 대표적인 것일 수도 있다. T 세포 수용체 및 CD28 라이게이션을 통한 T 세포 활성화 후에 T 세포는 단구의 미성숙 DC로의 분화와, 그의 국부적 림프계 기관으로의 이동에 영향을 주는 것으로 알려진 사이토카인 및 케모카인을 방출한다. 상기 용해성 인자는 또한 DC 전구체 및 다른 APC를 초기의 항원 조우 환경 (위험 신호)로 끌어당길 수도 있다. 활성화된 T 세포와, 하류의 방관자 세포(bystander cell)에 의해 생성되는 사이토카인 및 케모카인은 함께 면역 반응 캐스케이드를 확대시킬 것으로 기대될 수 있는데 이는 면역 보강제의 바람직한 특성이다. 백신의 면역 보강제로 작용하는 여러 사이토카인, 특히 GM-CSF 및 IL-2의 능력이 점점 더 알려지고 있다.
PBMC 유래의 조절 배지의 생성은 다량의 미성숙 DC를 그의 전구체로부터 생 성하고 단구 유래의 DC를 성숙하게 하는 능력을 가진다. 이러한 신속하면서도 비용 효율이 높은 방법은 미래의 백신의 개발에 있어서, 그리고 면역 보강제로 사용하는 데 있어서 중요한 역할을 할 수 있다. 또한 LCM에 포함된 광범위한 사이토카인 및 케모카인은 보다 생리적인 자극을 제안하는데, 이는 일단 T 세포가 항원과 조우하면 생체 내에서 발견될 수도 있는 것과 유사한 사이토카인 환경을 제공한다.
본 발명은 상청액 및 세포 둘 모두를 기반으로 하는 면역 보강제를 백신 항원과 조합하여 사용하여 백신에 대한 증강된 면역 반응을 제공하는 방법을 제공한다.
따라서 본 발명의 목적은 백신에 대한 면역원성 반응을 증강시킬 수 있는 백신 면역 보강제를 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 인간 림프구로부터 유래되는 백신 면역 보강제를 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 자극 배양된 인간 림프구로부터 수집되는 상청액으로부터 유래되는 백신 면역 보강제를 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 숙주 동물에게 면역 보강제를 백신과 조합하여 투여함으로써 백신 면역 보강제를 사용하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 상기 및 기타 목적은 하기의 상세한 설명, 도면 및 첨부된 청구의 범위로부터 보다 쉽게 명백해질 것이다.
도 1a-1e: LCM은 단독의 LCM과 함께 배양된 단구에 있어서 DC-유사 표현형을 유도한다. CD14 (도 1a), HLA-DR (도 1b), CD40 (도 1c), CD80 (도 1d) 및 CD86 (도 1e)의 발현을 상이한 시점에서 분석하였다. 데이터는 9회의 실험의 평균±SEM을 나타낸다. *은 p<0.05임을 나타내며, **는 p<0.005임을 나타낸다.
도 2a-2x: 단구 유래의 미성숙 DC의 성숙에 대한 LCM의 영향. 세척한 (elutriated) 단구를 GM-CSF/IL-4와 함께 3-4일 동안, 이어서 배지 단독 (도 2g-2l), LCM (도 2m-2r), 또는 성숙화 칵테일 (Maturation Cocktail) (도 2s-2x)을 첨가하여 48시간 동안 배양하였다. 단독의 cRPMI에서 배양한 단구 (도 2a-2f)를 음성 대조로 사용하였다. CD11c+-DC를 유세포 분석법으로 CD14, HLA-DR, CD40, CD83, CD80, 및 CD86의 표면 발현에 대하여 조사하였다. 빈 (open) 도수 분포도는 DC가 이소형 대조 mAb로 염색됨을 나타내며, 흐린 (shaded) 도수 분포도는 DC가 특이적 mAb로 염색됨을 나타낸다.
도 3a-3e: LCM은 PBMC의 전 집단에 첨가시 단구를 DC-유사 표현형으로 분화시킨다. CD11c+ 세포를 0일, 3일 및 5일에 CD14 (도 3a), HLA-DR (도 3b), CD40 (도 3c), CD80 (도 3d), 및 CD86 (도 3e)의 발현에 대하여 분석하였다. 데이터는 2회의 실험의 평균을 나타낸다.
도 4: LCM의 존재 하에 배양된 세척 단구로부터 생성되는 DC는 동종 (allogeneic) PBMC 반응을 자극하는 그의 능력에 있어서 LCM의 부재 하에 배양된 것보다 탁월하다. 동종 PBMC (1 x 105개의 세포)를 나타낸 바와 같이 1 x 104개의 자극 세포와 함께 96웰의 U자형 바닥의 배양 플레이트에서 삼중으로 배양하였다. PBMC 반응은 자극 지수 (대조 배지에서 단독으로 배양된 PBMC의 평균 CPM (카운트/분)에 대한 개개의 MILR의 평균 CPM의 비)로 표현한다.
도 5a-5b: LCM은 파상풍 유독소에 대한 전 PBMC의 증식성 반응을 증대시킨다. 전 PBMC 또는 단구가 제거된 PBMC를 10 ㎍/ml의 파상풍 유독소를 포함하거나 포함하지 않는 LCM 및 항원을 포함하는 cRPMI에서 96웰의 U자형 바닥의 배양 플레이트에서 배양하였다. 10 ㎍/ml의 콘카나빌린A를 포함하는 cRPMT에서 배양한 PBMC가 양성 대조로 기능하였다 (데이터는 예시하지 않음). 반응은 자극 지수 (SI) (cRPM에서 단독으로 배양한 PBMC의 평균 CPM에 대한 TT, LCM, 또는 TT 및 LCM 둘 모두와 함께 배양한 PBMC의 평균 CPM의 비 (도 5b))로 표현한다. 데이터는 2회의 실험의 평균을 나타낸다. *는 p<0.05임을 나타낸다.
바람직한 실시 형태의 상세한 설명
일 태양에 있어서 본 발명은 숙주 포유류에 있어서 백신 항원에 대한 면역 반응을 증강시키는 방법으로서, 성장 배지로 배양한 활성화된 인간 림프구 세포로부터 유래되는 상청액인 림프구 조절 배지를 백신 항원과 조합하여 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 바람직하게는 포유류는 인간이다. 배양 방법 및 프로토콜은 표준적인 것이며 당업계에 공지되어 있다. 임의의 공급원 (source)으로부터 수득가능한 인간 (또는 치료할 포유류에 따라 다른 포유류)의 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)는 구매가능한 조직 배양 성장 배지에 희석된다. 세포는 CD3/CD28에 대한 항체로 코팅된 비드로 구성되는 활성화제와 함께 인큐베이션된다. 약 3일째에 세포 및 비드를 배양 배지로부터 분리하고 세포 및 비드를 필요할 경우 추가 의 성장 배지에 재현탁시킨다. 세포의 수확을 위하여 세포를 원심 분리용 튜브에 재현탁시키고 펠렛화한 후 상청액을 피펫으로 배수시키고 이후의 사용을 위하여 보관할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 "상청액"이라는 용어는 상기한 방식으로 배양 세포를 없앤 액체를 나타낸다. "림프구 조절 배지" 및 "상청액"은 본 명세서에서 서로 바꾸어서 사용될 수 있으며 배양 세포를 없앤 액체를 나타낸다. 상청액을 특성화하기 위하여 연구를 실시하였으며, 상청액은 평균 분자량이 약 100,000 달톤 미만인 분자를 포함하는 것으로 밝혀졌다.
투여는 백신 접종에 사용되는 공지된 방법에 의한 것이며 적합한 전달 방법은 근육내, 피내 및 피하 주사를 포함하지만 그에 한정되는 것은 아니다. 일반적으로 약 10 ㎍ 내지 약 500 ㎍이 항원과 조합되어 투여된다. 투여는 항원 및 원하는 면역 반응 수준에 따라 매주, 2주, 매월 또는 매해 투여할 수 있다. 면역 반응의 증강은 예를 들어 면역화 후 세포 면역 (예를 들어 T 세포 증식)을 평가하고 항체 역가를 측정하는 당업계에 공지된 표준 분석법을 행함으로써 관찰될 수 있다.
본 발명은 홍역, 볼거리, 풍진, 독감, 헤모필루스 인플루엔자에 B형 (haemophilusinfluenzae type B) 백신, 디프테리아, 파상풍, 백일해, 폐구균 (pneumococcal) 다당류 백신, 수막구균 (meningococcal) 다당류 백신, 스타필로코쿠스 아우레우스 (staphylococcus aureus) 백신, 호흡기 신시티알 바이러스 (respiratory syncytial virus), 스트렙토코커스 (streptococcus), 파라인플루엔자 마이코플라스마 뉴코니아에 (parainfluenza mycoplasmapneumoniae), 마이코박테리 움 레프라에 (mycobacteriumleprae), 노카르디아 (nocardia), 레지오넬라 (legionella), 슈도모나스 (pseudomonas), 콜레라 백신, 장티푸스, 폴리오바이러스 (poliovirus), A형 간염 백신, 로타바이러스 (rotavirus), 에스케리키아 콜라이 (escherichia coli), 시겔라 (shigella), E형 간염, 리스테리아 (listeria), 기아르디아 람블리아 (giardia lamblia), 톡소카라증 (toxocariasis), 편충증, 회충증, 아메바증, 낭충증, B형 간염의 재조합 및 혈장 유래의 백신, HIV-1 및 HIV-2; HTLVI 및 HTLV-II, 엡스타인-바 (Epstein-Barr), C형 간염, B형 간염, 인간 파필로마 바이러스 (papillomavirus), 제1형 및 제2형 단순 포진, 클라미디아 (chlamydia), 임질, 트레포네마 (treponema) (매독), 탄저병 (anthrax), 광견병, 주혈 흡충병, 페스트 (plague), 황열병 백신, 일본 뇌염 및 진드기 매개 뇌염 (tickborne encephalitis) 백신, 말라리아, 리슈마니아증 (leishmaniasis), 라임병 (lyme disease), 림프 사상충증 및 회선사상충증, 트리파노소마병 (trypanosomiasis) 및 샤가스병 (chagas' disease), 리케차 (rickettsia) 및 발진 티푸스, 뎅기열, 아데노바이러스 백신, 바리셀라 조스터 (ㅊvaricella zoster) 백신, 사이토메갈로바이러스 (cytomegalovirus), 코로나바이러스 (coronaviruses) 및 리니오바이러스 (rhinioviruses), 스트렙토바실러스 (streptobacillus), 알러지 펩티드, 감염성 질환용 펩티드 백신, 암용 펩티드 백신, 자가면역 펩티드 백신, 및 항원, 펩티드, DNA 단편 및/또는 암 세포 내의, 또는 표면 상의 임의의 기타 분자 종을 이용한 암 백신을 포함하지만 그에 한정되지는 않는 매우 다양한 백신과 함께 사용하기에 적합하다.
하기의 실시예는 본 발명을 예시하려는 것이며 본 발명을 어떠한 방식으로든 한정하는 것으로 파악되어서는 아니된다. 실험은 하기 재료 및 방법을 사용하여 실시하였다.
세포
조절 배지의 제조에 사용한 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)는 림프구 분리 배지 (Lymphocyte Separation Medium) (ICN Biomedicals Inc., 미국 오하이오주 오로라 소재)에서 밀도 구배 원심 분리에 의해 정상적인 건강한 공여체의 백혈구 성분 채집술에 의한 생성물로부터 분리하였다. 이 세포를 자동 세포 동결기 (Gordinier Electronics, 미국 미주리주 로즈빌 소재)를 사용하여 20%의 인간 AB 혈청 (Gemini Bio-Products, 미국 캘리포니아주 우드랜드 소재) 및 10%의 DMSO (Sigma, 미국 미시간주 세인트 루이스 소재)를 포함하는 RPMI-1640 (Invitrogen Corp., 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재)에서 생존가능하게 동결시키고 사용할 때까지 액체 질소의 증기 상에서 보관하였다. 단구를 역류 원심 분리 세정 (elutriation)으로 PBMC로부터 단리하고 즉시 사용하거나 이후의 사용을 위하여 10% DMSO 및 5% 글루코스 (Sigma)를 포함하는 소 태아 혈청 (Summit Biotechnology)에 생존가능하게 동결시켰다.
LCM 의 제조
냉동 보존된 PBMC를 20%의 인간 AB 혈청 (hAB)이 보충된 RPMI-1640에서 해동시키고 10%의 hAB를 포함하는 RPMI-1640으로 2회 세척하였다. 세포를 cRPMI [10% hAB, 2mM L-글루타민 (Invitrogen), 1% 페니실린 스트렙토마이신 용액(Invitrogen), 20 mM Hepes 완충제 (Invitrogen)가 보충된 RPMI-1640] 또는 2mM L-글루타민, 1% 페니실린 스트렙토마이신 용액, 20 mM Hepes 완충제가 보충된 X-Vivo 15 (BioWhittaker, 미국 매릴랜드주 워커스빌 소재)에 재현탁시켰다. CD3/CD28 Dynabeads (Dynal, 미국 뉴욕주 레이크 석세스 소재)를 매 1 x 106개의 PBMC에 대하여 75 ㎕의 비드로 세포에 첨가하고 배양물을 5% CO2에서 37℃에서 3일 동안 인큐베이션하였다. 이어서 무세포 상청액을 수집하고 사용 이전에 2-8℃에서 보관하였다. LCM을 cRPMI에 1:1로 희석시켜 사용하였다.
세정된 단구의 배양
세정 단구를 cRPMI로 세척하고 동일 부피의 LCM 및 cRPMI에 5 x 105개의 세포/ml의 농도로 재현탁시키고 5% CO2에서 37℃에서 24웰 플레이트 (Denville Scientific Inc., 미국 뉴방해주 메투첸 소재)에서 배양하였다. 대안적으로는 단구를 750 U/ml의 GM-CSF (R & D Systems, 미국 미네소타주 미니아폴리스 소재) 및 720 U/ml의 IL-4 (R & D Systems)를 포함하는 cRPMI에서 3-4일 동안, 이어서 조절 배지 또는 사이토카인의 조합물 [1O ng/ml의 IL-1β, 1O ng/ml의 TNFα, 0.91 ng/ml의 IL-6 (R & D Systems), 1 ㎍/ml의 PGE2 (Sigma)] (성숙화 칵테일)을 첨가하여 추가로 48시간 동안 배양하였다. 성숙화 칵테일은 양성 대조로 기능하며 단독의 cRPMI에서 배양한 단구는 음성 대조로 사용하였다.
유세포 분석법(Flow Cytometry)
세포를 cRPMT에서 1회 세척하고, 5% hAP를 포함하는 1x PBS (Invitrogen)에 재현탁시키고 Fc 수용체의 차단을 위하여 실온 (22-25℃)에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 이어서 세포를 세척 완충제 (1% hAB 및 0.1% NaN3를 포함하는 1x PBS)에서 세척, 재현탁시키고 CD14, CD11c, CD40, CD83, CD80, CD86에 대한 플루오로크롬-콘쥬게이션된 항체 (BD BioSciences, 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재), 및 적절한 이소형 대조 항체로 표지하였다. 4℃에서의 30분 후 세포를 완충제로 세척하고 1% 파라포름알데히드를 포함하는 1x PBS에서 고정시켰다. 유세포 분석에 의한 데이터는 FACScan 유세포 분석기를 사용하여 획득하고 CellQuest 소프트웨어 (BectonDickinson, 미국 캘리포니아주 산호세 소재)로 분석하였다. 게이트 (Gates)를 이소형 대조 샘플에 따라 설정하였다.
사이토카인 및 케모카인 분석
LCM 중 사이토카인 및 케모카인을 제조자의 지침에 따라 구매가능한 효소-결합 면역흡수 분석 (ELISAs; R & D Systems, 미국 미네소타주 미니아폴리스 소재)를 사용하여 정량화하였다. PGE2의 농도도 ELISA (Cayman Chemical Co., 미국 미주리주 안 아버 소재)로 측정하였다. 모든 측정은 이중으로 행하였다.
동종 MLR
수지상 세포를 배양물로부터 수확하고, cRPMI에서 2회 세척하고 96웰의 U자형 배양 플레이트 (Denville Scientific, Inc.)에 웰 당 104, 103, 및 102개의 세포 로 플레이팅하였다. 동종 반응체 PBMC를 각각의 웰에 1 x 105개의 세포/웰로 총 200 ㎕의 부피로 첨가하였다. 모든 조건의 것은 삼중으로 플레이팅하였다. 세포를 5% CO2에서 37℃에서 3일 동안 인큐베이션하고, 1.0 μCi의 삼중수소화 티미딘 (Perkin Elmer, 미국 매사추세츠주 보스톤 소재)으로 16시간 동안 펄싱하고 자동 다중 웰 수확기 (Tomtec, 미국 코네티컷주 오렌지 소재)를 사용하여 수확하였다. 반응 세포 내로 혼입된 삼중수소화 티미딘의 양은 MicroBeta TriLux 액체 신틸레이션 계수기 (Wallac, 핀란드 투르쿠 소재)로 측정하였다.
항원 자극 분석
프라이밍되지 않은 정상 인간 PBMC (1 x 105/100 ㎕ cRPMI)를 96웰의 U자형 바닥의 배양 플레이트 내로 플레이팅하고 여기에 10 ㎍/ml의 파상풍 유독소 (Accurate Chemical and Scientific Corp., 미국 뉴욕주 웨스트베리 소재)를 포함하거나 포함하지 않는 100 ㎕의 LCM 또는 100 ㎕의 cRPMI를 첨가하였다. 10 ㎍/ml의 콘카나발린A (Sigma, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)를 포함하는 cRPMI에서 배양한 PBMC는 양성 대조로 기능하였다. 모든 조건의 것을 삼중으로 플레이팅하고, 5% CO2에서 37℃에서 3일 및 5일 동안 인큐베이션하고, 1.0 μCi의 삼중수소화 티미딘으로 16시간 동안 펄싱하고 자동 다중 웰 수확기를 사용하여 수확하였다. 반응 세포 내로 혼입된 삼중수소화 티미딘의 양은 MicroBeta TriLux 액체 신틸레이션 계수기로 측정하였다.
LCMD 는 추가의 사이토카인의 부재 하에 단구를 DC 로 분화시킨다
다수의 인간 DC를 그의 시험관내 전구체로부터 생성 및 성숙하게 하기 위한 고도로 효과적인 사이토카인 칵테일을 제조하려고 노력하여 본 발명자들은 재료 및 방법에서 기술한 바와 같이 항-CD3/항-CD28 자극 PBMC로부터의 배양 상청액 (LCM)을 제조하고 역류 원심 분리에 의해 PBMC로부터 수득되는 고도로 정제된 인간 단구에 대한 그의 영향을 조사하였다. 단구를 GM-CSF 및 IL-4의 부재 하에 LCM에서 배양하고 분화 및 성숙된 DC의 특징이 되는 세포 표면 마커의 발현을 유세포 분석법으로 조사하였다. 배양 이전에 단구는 CD11c와, CD14 및 HLA-DR을 구성적으로 발현하였다. LCM에서의 배양에 의해 3일까지, 그리고 상기 마커를 발현하는 단지 약간의 세포만이 남아있는 날까지 CD14를 발현하는 세포의 퍼센트가 유의하게 감소되었다 (도 1a). HLA-DR (도 1b), CD40 (도 1c), CD80 (도 1d) 및 CD86 (도 1e)의 MFI 는 단독의 배지 상에서 배양한 세포에 비하여 LCM에서 배양한 세포 상에서 일관되게 상향 조절되었다. 9회의 실험 중 네 실험에서 작은 퍼센트의 CD83+ DC가 관찰되었지만, 이 결과는 유의한 것은 아니었다. 이를 종합해 보면, LCM은 단구를 미성숙 DC 표현형으로 분화시키는데, 이는 항원 획득에 최적인 발달 단계이다.
LCM 은 GM - CSF / IL -4D에서 배양된 단구를 성숙하게 한다
GM-CSF 및 IL-4의 존재 하에 단구로부터 시험관 내에서 생성시킨 미성숙 DC를F 성숙하게 하는 LCM의 능력을 평가하였다. 세정에 의해 PBMC로부터 수득되는 단구를 GM-CSF 및 IL-4를 포함하는 배지에서 3-4일 동안 배양하고, 이어서 IL-1β, TNFα, IL-6 및 PGE2를 포함하는 표준 성숙화 칵테일 또는 LCM (재료 및 방법 참조)을 첨가하였다. 유세포 분석은 48시간 후에 수행하였다. 도 2 및 표 1에 예시되어 있는 바와 같이 LCM 및 성숙화 칵테일 둘 모두 공동 자극 분자인 HLA-DR, 및 일반적으로 받아들여지고 있는 성숙 DC의 표시인 CD83의 발현을 유도하였다. 이러한 결과는 LCM이 미성숙 단구 유래의 DC의 최종 성숙을 도울 수 있음을 나타낸다. 총 4명의 상이한 공여체로부터 수득되는 LCM의 DC 성숙화 활성은 매우 일관된 것이었다 (데이터는 예시하지 않음).
LCM을 포함하거나 포함하지 않는 GM-CSF 및 IL4에서 배양한 단구 상에서의 표면 마커의 발현
MFI 퍼센트
마커 (+)LCM (-)LCM p 값 (+)LCM (-)LCM p 값
CD40 110±43 37±16 0.003 95±3 5±26 0.003
CD83 18±12 9±5 0.026 17±11 5±2 0.014
CD80 55±37 13±7 0.007 56±21 15±6 0.0003
CD86 182±116 179±108 NS 90±7 86±19 NS
표 1: 마지막 48시간 동안 LCM을 첨가하거나 (LCM+) 첨가하지 않고 (-LCM) GM-CSF/IL-4와 함께 배양한 단구 상에서의 CD40, CD83, CD80, 및 CD86의 발현 퍼센트 및 ME1의 통계학적 평가. 데이터는 8회의 실험으로부터의 평균±SEM으로 표현하며 통계학적 유의성은 대응 양측 스튜던트 t 검정으로 결정하였다.
PBMC 중 단구는 LCM 과 함께 배양시 부대적 ( accessory ) 분자를 발현한다
생체 내에서 말초 혈액에 포함된 다양한 세포 집단의 분포 및 표현형에 대한 LCM의 영향을 조사하기 위하여, 전 PBMC를 LCM에서 3일 또는 5일 동안 배양하였다. 상기의 두 시점에서는 CD3+, CD4+-, CD8+, CD56+, 및 CD19+ 세포의 퍼센트에서의 차이가 전혀 발견되지 않았다 (데이터는 예시하지 않음). 또한 활성화 마커인 CD25를 공동 발현하는 CD3+ 세포의 퍼센트는 5일간의 배양 기간에 걸쳐 증가하지 않았다 (데이터는 예시하지 않음). 그러나 CD11c의 발현에 의해 확인되는 단구 상에서의 CD14의 발현은 3일에 감소되었으며 5일에는 거의 완전히 하향 조절되었다 (도 3a). 이와는 대조적으로 CD11c+ 세포 상에서의 HLA-DR, CD40, CD80 및 CD86의 발현은 상향 조절되었다 (도 3). 따라서 LCM은 전 PBMC 내의 단구 뿐만 아니라 고도로 정제된 단구도 DC-유사 표현형을 갖는 세포로 분화시킨다.
LCM 중의 사이토카인 및 케모카인의 농도
LCM 중의 사이토카인 및 케모카인의 농도 (표 2)를 표준 ELISA 방법으로 측정하고 DC의 생성 또는 성숙화에 보통 사용되는 사이토카인의 농도와 비교하였다 (표 3). GMCSF 및 IL-4, 염증성 사이토카인 (IL-1, IL-6, PGE2, TNFα, IFNγ), 케모카인 (MCP-1, MIP1, RANTES), 및 sCD40L을 포함하는 용해성 매개체의 전 배터리 (battery)를 확인하였다 (표 2). 놀랍게도 LCM 중의 GM-CSF 및 IL-4의 농도는 단구로부터의 미성숙 DC의 생성을 위한 표준 프로토콜에 사용되는 2종의 사이토카인의 농도보다 유의하게 더 낮았다 (표 3). 미성숙 DC로의 시험관 내 분화 동안 단구 상에서의 IL4의 작용 중 하나는 CD14 발현의 하향 조절이다. LCM 중 LI-4의 낮은 수준은 LCM에서 배양한 단구 상에서의 CD14의 비교적 느린 하향 조절을 설명할 수도 있다 (도 1a, 3a). 또한 심지어 성숙화제가 미성숙 DC에 대한 비견할만한 효과를 가진다 해도, 성숙화 칵테일에 비하여 LCM 중의 염증성 사이토카인의 농도가 더 낮았다.
LCM에 포함되어 있는 사이토카인 및 케모카인의 정량화
사이토카인 또는 케모카인 양 (ng/ml)
GM-CSF 23.98
IFNα 0.00
IFNγ 31.44
IL-1β 0.07
IL-2 5.91
IL-3 1.04
IL-4 0.28
IL-6 2.17
IL-8 47.97
IL-b 0.66
IL-12 0.01
IL-15 0.00
MCP-1 110.04
M-CSF 8.69
MIP-1α 127.20
MIP-1β 157.89
PGE2 1.54
RANTES 20.64
sCD40L 1.27
SDF-1α 0.00
TGFβ 0.00
TNFα 6.43
표 2: ELISA에 의해 측정되는 4가지의 상이한 LCM 제제 중의 사이토카인 또는 케모카인의 평균 농도
LCM, GM-CSF/IL4 배지, 및 성숙화 칵테일 중의 사이토카인의 양
세포 배양물에 첨가되는 사이토카인의 양 (ng/ml)
LCM* GM-CSF/IL4 배지
GM-CSF 11.99 50.00
IL-4 0.14 20.16
LCM* 성숙화 칵테일
IL-1β 0.035 10.00
IL-6 1.085 9.09
PGE2 0.770 1000.00
TNFα 3.215 10.00
표 3: LCM 및 성숙화 칵테일 중의 선택된 전염증성 사이토카인의 농도와 마찬가지로, LCM에 포함되는 GM-CSF 및 IL4의 양을 단구 유래의 DC의 생성을 위한 표준 프로토콜에 사용한 양과 비교한다. * 본 표에 주어진 LCM에 대한 사이토카인의 농도는 LCM을 cRPMI에서 1:1로 희석시켜 세포에 첨가하기 때문에 표 2의 농도의 절반임을 주의.
LCM 에서 배양한 단구는 동종 PBMC 를 자극한다
단구 유래의 DC의 기능적 특징은 시험관 내에서 동종 반응을 효과적으로 유도하는 그의 능력이다. LCM의 부재 또는 존재 하에 5일 동안 배양하거나, GM-CSF/IL4를 포함하는 배지에서, 이어서 cRPMI 또는 LCM을 첨가하여 배양한 단구에 대한 PBMC의 동종 반응을 측정하였다. 도 4에 도시되어 있는 바와 같이 단독의 LCM에서 배양한 단구에 의해 생성된 자극 지수 (SI)는 단독의 cRPMI에서 배양한 단구에 의해 유도되는 것의 대략 3배였다. 그러나 SI는 GM-CSF/IL-4에서 배양하고 LCM으로 성숙시킨 단구에서 가장 높았다. 이러한 결과는 LCM이 단구 및 미성숙 DC를 더욱 효과적인 항원 제시 세포가 되게 한다는 것을 입증한다.
LCM 은 파상풍 유독소에 대한 PBMC 반응을 증강시킨다
또한 리콜 항원 파상풍 유독소 (TT)에 대한 PBMC의 증식성 반응을, 다시 LCM의 존재 또는 부재 하에 시험하였다 (도 5a). LCM 및 기타 사이토카인의 부재 하에서는 PBMC는 TT에 대한 낮은 수준의 반응을 나타내었지만, LCM을 첨가하면 TT에 대한 반응은 6일에 유의하게 증가하였다 (도 5a). LCM 단독은 심지어 특정 항원의 부재 하에서도 PBMC에서의 DNA 합성을 유도하였지만, 그럼에도 불구하고 특정 항원에 대한 반응은 유의하게 증대되었음을 지적하는 것이 중요하다. TT에 대한 관찰된 반응이 단구에 의해 매개되는지를 결정하기 위하여 면역자성 비드로 CD 14+ 세포를 제거한 PBMC를 사용하여 실험을 반복하였다. 도 5b에 도시되어 있는 바와 같이 LCM을 첨가하거나 첨가하지 않을 경우 TT에 대한 반응은 전혀 없었다. 단구를 제거한 실험에 있어서 보다 큰 SI는 다른 세포 형태, 특히 CD3+ 세포의 갯수에 있어서의 상대적인 증가에 의해 설명될 수 있다 (데이터는 예시하지 않음). 이러한 결과는 LCM이 PBMC의 TT에 대한 반응 능력을 증강시키며 이 반응은 단구에 의해 매개된다는 것을 명백하게 나타내는 것이다.
상기 발견은 LCM이 전 PBMC 중의 단구 및 고도로 정제된 단구가 DC-유사 표현형이 되게 함을 나타낸다. 또한 미성숙 단구 유래의 DC는 LCM에서의 배양 후 성숙 DC 표현형으로 발달했다. 기능적으로는 상기 LCM 유래의 DC는 그의 단구 전구체에 비하여 동종 PBMC의 자극 능력 증가를 나타내었으며 TT에 대한 반응을 유의하게 증대시켰다. 관찰된 LCM의 효과는 조절 배지에서 확인되는 전염증성 사이토카인 및 케모카인의 배터리에 의해 설명될 수 있다.
본 발명의 특정 실시 형태를 예시 목적으로 상기하였지만, 당업계의 숙련자에게는 본 발명의 상세한 설명의 다수의 변화가 첨부된 청구의 범위에 정의된 발명으로부터 벗어남이 없이 이루어질 수도 있음이 명백할 것이다.
참고 문헌:
Figure 112005046047077-PCT00001
Figure 112005046047077-PCT00002
Figure 112005046047077-PCT00003
Figure 112005046047077-PCT00004

Claims (11)

  1. 포유류에서 항원에 대한 면역 반응을 증강시키는 방법으로서, 림프구 조절 배지를 상기 항원과 조합하여 상기 포유류에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 림프구 조절 배지가 항CD3/CD28 코팅 비드와 함께 배양된 실험을 받은 적이 없는 (naive) T 세포로부터 유래되는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 항원이 HIV-1 또는 HIV-2인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 항원이 B형 간염(hepatitis-B)인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 항원이 파상풍 유독소인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 항원이 전립선 특이적 항원인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 항원이 A형 간염(hepatitis-A)인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 항원이 디프테리아인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 림프구 조절 배지의 투여량이 약 10 ㎍ 내지 약 500 ㎍인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 투여가 피내, 피하 및 근육내 주사와 그 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 투여가 매주, 2주, 매월 및 매해 투여와 그 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
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