CN103446580B

CN103446580B - 一种肿瘤疫苗及其制备方法

Info

Publication number: CN103446580B
Application number: CN201210176820.7A
Authority: CN
Inventors: 黄波
Original assignee: HUBEI SOUNDNY BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: HUBEI SOUNDNY BIO TECH Co.,Ltd.
Priority date: 2012-05-31
Filing date: 2012-05-31
Publication date: 2016-08-03
Anticipated expiration: 2032-05-31
Also published as: WO2013178079A1; CN103446580A; US20150086639A1; US9844508B2

Abstract

本发明提供一种肿瘤疫苗及其制备方法。所述肿瘤疫苗包括源自凋亡肿瘤细胞的细胞囊泡和佐剂。本发明还提供一种肿瘤疫苗的制备方法，包括：使用紫外线照射肿瘤细胞，使肿瘤细胞凋亡，收集凋亡肿瘤细胞所释放的细胞囊泡，然后将所述细胞囊泡与所述佐剂混合形成所述肿瘤疫苗。本发明提供的肿瘤疫苗包含的肿瘤抗原谱广泛、全面，克服了现有的肿瘤疫苗不能对广泛的肿瘤细胞具有杀伤能力的缺陷，同时具有良好的使用安全性以及免疫的靶向性。

Description

一种肿瘤疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种疫苗，尤其涉及一种肿瘤疫苗。

背景技术

近年来，肿瘤作为一种严重威胁人们生命的疾病，其治疗方法已成为众多科研工作者致力于研究的课题，除了人们通常所知的化疗、手术切除等治疗方法，肿瘤疫苗作为一种新型治疗手段已引起越来越多的关注。

肿瘤疫苗主要通过激活患者自身免疫系统，利用肿瘤细胞或肿瘤抗原物质诱导机体的特异性细胞免疫和体液免疫反应，增强机体的抗癌能力，阻止肿瘤的生长、扩散和复发，以达到清除或控制肿瘤的目的。肿瘤疫苗根据其来源可分为肿瘤细胞疫苗、基因疫苗和多肽疫苗等。肿瘤细胞疫苗是从机体肿瘤组织中提取肿瘤细胞，灭活处理后使肿瘤细胞丧失致瘤性，但仍保持其免疫原性，然后对机体进行免疫；基因疫苗主要是将肿瘤抗原的基因装入DNA表达载体（通常是病毒DNA），将重组的载体注射机体后，表达肿瘤抗原蛋白对机体进行免疫；多肽疫苗是按照病原体抗原基因中已知或预测的某段抗原表位的氨基酸序列，通过化学合成技术制备成疫苗，然后注射机体进行免疫。

然而上述疫苗多数仅进入临床试验阶段，而没有进入临床使用阶段，存在的主要问题有：将DNA导入到特定细胞进行表达这一技术尚不成熟，并且使用外源DNA的安全性问题尚未解决；由于肿瘤细胞呈现高度异质性，属于同一类型肿瘤的多个瘤细胞上可以表达不同的抗原，由一种肿瘤抗原(例如：多肽疫苗所使用的抗原)所激活的T细胞只能杀伤一部分的肿瘤细胞，不表达该抗原的瘤细胞则不能被杀伤；肿瘤细胞疫苗虽然可以包含几乎全部的肿瘤抗原，但目前的研究表明其激活T细胞的作用有限，将其作为疫苗的效果并不理想。

因此，如何提供一种肿瘤疫苗，不存在使用安全性问题并且能对几乎全部的肿瘤抗原有效，成为有待解决的问题。

发明内容

本发明提供了一种细胞囊泡在制备肿瘤疫苗中的应用，将源自凋亡肿瘤细胞的细胞囊泡作为肿瘤疫苗的抗原，从而利于解决肿瘤疫苗不能对全部的肿瘤抗原有效，靶向性差以及使用安全性的问题。

本发明还提供一种肿瘤疫苗，采用源自凋亡肿瘤细胞的细胞囊泡提供抗原，所得到的肿瘤疫苗包含的肿瘤抗原谱广泛、全面，也利于提高临床治疗的靶向性和安全性。

本发明还提供了一种肿瘤疫苗的制备方法，实现了将源自凋亡肿瘤细胞的细胞囊泡作为疫苗实体制备肿瘤疫苗。

本发明提供一种细胞囊泡在制备肿瘤疫苗中的应用，所述细胞囊泡为源自凋亡肿瘤细胞的细胞囊泡。

作为本领域的基础知识，细胞是由细胞膜包裹细胞内容物构成，而细胞膜是由磷脂双分子层中间镶嵌蛋白质分子所组成，其球状结构则通过细胞内被称为细胞骨架的蛋白纤维丝所形成的向心牵拉力得以维持。当细胞受到外界因素（例如：紫外线等）刺激细胞发生凋亡时，细胞骨架附着细胞膜部位的部分蛋白纤维丝断裂或失去附着，向心牵拉力突然消失，使得局部细胞膜结构在外向拉力作用下，向外膨胀、突出并包裹细胞内容物以囊泡形式释放到细胞外的介于细胞和分子之间的亚层次结构中，可以形成一种基本呈纳米级的微颗粒，即本发明所述的“细胞囊泡”。

肿瘤疫苗在基体内的主要作用是诱导肿瘤特异性的T细胞的产生和活化，实现上述作用的基本过程包括：抗原提呈细胞(如:树突状细胞)摄取并加工肿瘤抗原，然后将该肿瘤抗原提呈给肿瘤特异性的T细胞，后者在识别肿瘤抗原后被激活并扩增，达到肿瘤部位，对基体的肿瘤细胞进行特异性杀伤。其中抗原提呈细胞对肿瘤抗原的有效摄取是完成上述过程的前提，由于抗原提呈细胞(如:树突状细胞)在摄取外来物时，对体积大小有严格要求，体积较小的多肽分子，以及体积较大的整个肿瘤细胞都难以被抗原提呈细胞摄取。细胞囊泡通常可以界于100-1000纳米，非常适合被抗原提呈细胞(如:树突状细胞)摄取，利用这样的细胞囊泡制成肿瘤疫苗，进入机体后，能够容易地被抗原提呈细胞捕获，使得肿瘤抗原能够被有效提呈给肿瘤特异性T细胞，并激活这些T细胞，同时由于本发明使用的细胞囊泡可以包含其肿瘤细胞源的几乎全部的肿瘤抗原(所述“全部的肿瘤抗原”指一种类型肿瘤中所有肿瘤细胞的抗原)，从而能对患有癌症个体的所有肿瘤细胞进行广泛的杀伤，同时也能对有肿瘤发生趋势的个体进行免疫，使对所有肿瘤抗原具有抵抗力，预防肿瘤的发生。

本发明采用源自凋亡肿瘤细胞的细胞囊泡作为肿瘤疫苗的抗原，所述细胞囊泡推荐的是源自于与所要杀伤或预防的肿瘤细胞同种类型的肿瘤细胞，这些肿瘤细胞例如可以是商购可获得的肿瘤细胞系。使用细胞囊泡的肿瘤疫苗相比于使用外源性DNA载体或氨基酸序列的肿瘤疫苗，能降低对机体的毒副作用。

在本发明的方案中，所述细胞囊泡的获得是通过外界条件的刺激使肿瘤细胞凋亡，例如，使用紫外线照射肿瘤细胞，使肿瘤细胞凋亡后收集得到所述细胞囊泡。本领域技术人员也可根据所要治疗的肿瘤类型的不同，选择适合的肿瘤细胞的凋亡方法，为保全细胞中的肿瘤抗原，选择不使细胞发生化学变化的凋亡方法是有利的，同时本发明所述诱导肿瘤细胞凋亡，可以按照本领域技术人员公知的判断标准，例如观察肿瘤细胞缩小、变暗，即可认为其已经凋亡。

进一步的，对于凋亡肿瘤细胞所释放的细胞囊泡的收集可使用超速离心机在低温条件下或室温条件下进行分离。优选的，通过离心机，以100-100000g的离心力，收集细胞囊泡。收集过程的温度没有特殊的限制，只要能保证细胞囊泡不被降解即可，一般的可在低温条件下（4℃左右）进行收集。

在本发明方案中，在使用紫外线照射肿瘤细胞使肿瘤细胞凋亡之前，还包括对肿瘤细胞进行培养，所述培养指在含有满足正常肿瘤细胞生长所需物质的培养基(例如DMEM培养液)中对肿瘤细胞进行的培养。

进一步的，所述细胞囊泡的粒径为100～1000纳米。

进一步的，所述肿瘤疫苗为用于卵巢癌、黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌、肝癌、膀胱癌、白血病或胶质瘤等其他类型肿瘤的肿瘤疫苗。

本发明还提供了一种肿瘤疫苗，包括源自凋亡肿瘤细胞的细胞囊泡和佐剂。

进一步的，所述佐剂为铝佐剂。

进一步的，所述肿瘤疫苗的剂型包括注射剂。

进一步的，所述肿瘤细胞包括卵巢癌细胞、黑色素瘤细胞、乳腺癌细胞、肺癌细胞、胃癌细胞、结肠癌细胞、肝癌细胞、膀胱癌细胞、白血病细胞或胶质瘤细胞。

在本发明的一个具体实施方案中，所述细胞囊泡通过使用紫外线照射肿瘤细胞，使肿瘤细胞凋亡后收集获得。

本发明还提供了所述的肿瘤疫苗的制备方法，包括：制取所述细胞囊泡，并与佐剂制成所述肿瘤疫苗的过程。

进一步的，所述的肿瘤疫苗的制备方法，包括使用紫外线照射肿瘤细胞，使肿瘤细胞凋亡，收集凋亡肿瘤细胞所释放的细胞囊泡，然后将所述细胞囊泡与所述佐剂混合形成所述肿瘤疫苗。

在本发明的具体方案中，优选通过可行的方法使所收集的细胞囊泡的粒径基本为100-1000纳米的微颗粒。例如，对于凋亡肿瘤细胞所释放的细胞囊泡的收集可使用超速离心机在低温条件下或室温条件下进行分离。优选的，通过离心机，以100-100000g的离心力，收集细胞囊泡。收集过程的温度没有特殊的限制，只要能保证细胞囊泡不被降解即可，一般的可在低温条件下（4℃左右）进行收集。

在使用紫外线照射肿瘤细胞使肿瘤细胞凋亡之前，还可以对肿瘤细胞先进行培养（孵育），所述培养指在含有满足正常肿瘤细胞生长所需物质的培养基(例如DMEM培养液)中对肿瘤细胞进行的培养。

本发明提供的肿瘤疫苗可以是任何适于临床应用的剂型和用药规格，例如，可以是注射剂。所述肿瘤疫苗的制备方法还包括按照常规的疫苗制备方法制成所需要的剂型，例如制成注射剂，可以是通过加入生理盐水制成注射针剂，也可以制成粉针剂等。

本发明提供的肿瘤疫苗可以通过皮下或肌肉注射给药，对个体进行免疫，以抑制肿瘤发生或杀伤肿瘤细胞。

本发明提供的方案具有以下优点：

（1）本发明提供的肿瘤疫苗，其细胞囊泡大小可达到100-1000纳米，非常适合树突状细胞摄取，利于提高抗原提呈细胞向T细胞提呈抗原的效率，并增强肿瘤特异性T细胞对肿瘤细胞靶向杀伤力。

（2）本发明提供的肿瘤疫苗，其细胞囊泡包含的肿瘤抗原谱广泛、全面，能实现对几乎所有肿瘤细胞的有效杀伤。

（3）本发明提供的肿瘤疫苗，能对多种肿瘤细胞有效杀伤，并且对机体的毒副作用小，使用安全。

（5）本发明提供的肿瘤疫苗，可以作为治疗性疫苗也可以作为预防性疫苗，在不同的肿瘤治疗阶段使用，通过激活机体免疫系统，预防肿瘤的发生或对已有肿瘤细胞进行有效杀伤。

附图说明

图1A显示了肿瘤细胞没有经凋亡处理产生的细胞囊泡图片，图1B显示了肿瘤细胞经凋亡处理产生的细胞囊泡图片。

图2显示了细胞囊泡可被树突状细胞摄取。

图3显示树突状细胞摄取细胞囊泡后，上调表达共刺激信号分子。

图4A和图4B显示了树突状细胞摄取细胞囊泡后诱导肿瘤特异性T细胞活化、增殖。

图5显示活化的肿瘤特异性T细胞对肿瘤细胞进行杀伤。

图6显示肿瘤细胞囊泡免疫小鼠，诱导小鼠产生强烈免疫反应。

图7A和图7B显示肿瘤细胞囊泡免疫荷瘤小鼠，抑制肿瘤生长，延长荷瘤小鼠的存活时间。

图8显示了本发明方案的实施对肝肾功能无影响。

图9显示了本发明肿瘤疫苗的抗瘤效应。

图10显示了肿瘤细胞囊泡免疫荷有不同肿瘤的小鼠，均可抑制肿瘤生长。

具体实施方式

本发明使用的术语“细胞囊泡”是指由肿瘤细胞凋亡后所形成、呈现为一种微颗粒囊状形态。

下述实施例中使用的各种肿瘤细胞、药物及实验动物：

李斯特菌、小鼠肝癌细胞系H22(BALB/c遗传背景)、小鼠黑色素瘤细胞系B16（C57BL/6遗传背景）、小鼠乳腺癌细胞系4T1（BALB/c遗传背景）、小鼠结肠癌细胞系MC26（BALB/c遗传背景）、小鼠骨髓细胞均可从美国ATCC公司或中国典型物保藏中心CCTCC购买。

BALB/c小鼠，C57BL/6小鼠，购自武汉大学医学实验动物中心，体重18克左右；

羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）、PKH26、抗小鼠CD80、CD86、MHCII的抗体购自Sigma公司，细胞因子GM-CSF和IL-4购自PeproTech公司，T细胞分离试剂盒购自R&DSystems公司、伽马干扰素检测试剂盒、肿瘤细胞杀伤检测试剂盒购自Abcam公司。

实施例1：肿瘤细胞经凋亡处理后产生了细胞囊泡。

1、实验材料和试剂

H22小鼠肝癌细胞，荧光染料：羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（可商购获得,带有绿色荧光），紫外线装置为常规细胞超净工作台所有。

2、实验步骤

1）在DMEM细胞培养液中培养H22小鼠肝癌细胞，使细胞量达到2×10⁷；

2）将上述H22小鼠肝癌细胞进行羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂荧光染料染色后，加入新鲜培养液，然后将上述H22小鼠肝癌细胞分为两组(H22-1组、H22-2组)，其中一组H22-1使用紫外线照射60分钟，另一组H22-2不做处理，在培养液中正常培养；

3）在紫外线照射后的48小时，所有的H22-1组H22小鼠肝癌细胞出现明显变小、暗淡的状态，确认这些肿瘤细胞已经被紫外线诱导凋亡，收集上述凋亡肿瘤细胞的细胞囊泡：包括分离取上清后进行逐步离心，即先以500rpm、1000rpm、5000rpm的转速各离心10分钟，之后以14000ｇ的离心力离心1分钟，以除去细胞及碎片，取离心后的上清再以14000g的离心力离心1小时，得到来自H22小鼠肝癌细胞凋亡所产生的囊泡，作为实验组；

按照相同方法对收集正常培养条件下培养的H22-2组细胞，作为对照组，虽然这组细胞没有经紫外线处理，但由于正常细胞死亡也会释放少量细胞囊泡，因此收集其作为对照组。

3、实验结果

将来自上述实验组的细胞囊泡和对照组的细胞囊泡使用0.9%（g/ml）的生理盐水重悬后，分别涂片后在双光子荧光显微镜下观察，从图1可以看出，作为对照组，来自没有使用紫外线处理的H22小鼠肝癌细胞囊泡非常少，涂片后仅能观察到极少绿色细胞囊泡（见图1A），作为实验组，来自使用紫外线处理的H22小鼠肝癌细胞囊泡，涂片后观察到大量绿色细胞囊泡（见图1B），证实肿瘤细胞经紫外线处理后，释放了细胞囊泡，大小在1μm左右。

改变使肿瘤细胞凋亡的处理方法，可以得到同样的结果。

实施例2：诱导肿瘤细胞产生的细胞囊泡可被树突状细胞摄取。

1、实验材料和试剂

使用的H22小鼠肝癌细胞以及紫外线装置同实施例1，羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）（绿色荧光染料），PKH26（红色荧光染料）。

2、实验步骤

1）按实施例1所述方法培养H22小鼠肝癌细胞，使细胞量达到1×10⁷；使用羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂对上述H22小鼠肝癌细胞进行染色，然后加入新鲜培养液，使用紫外线照射60分钟，在紫外线照射后的48小时，H22小鼠肝癌细胞出现明显变小、暗淡的状态，确认这些肿瘤细胞已经被紫外线诱导凋亡，按实施例1所述方法收集带有绿色荧光的紫外线诱导产生的细胞囊泡;

2）取小鼠骨髓细胞在培养液中进行培养，使细胞量达到10⁶/ml，加入细胞因子GM-CSF和IL-4培养6天，骨髓细胞被诱导为树突状细胞，对树突状细胞使用红色荧光染料PKH26进行染色。

3）将上述带绿色荧光的紫外线诱导产生的细胞囊泡和带红色荧光的树突状细胞在37℃条件下进行孵育。

3、实验结果

将绿色荧光细胞囊泡和红色荧光树突状细胞孵育4小时后，清洗树突状细胞3次，对细胞进行涂片，然后在荧光显微镜下观察，可见经诱导肿瘤细胞产生的绿色荧光细胞囊泡能进入红色荧光树突状细胞（见图2），表明上述紫外线照射诱导凋亡获得的细胞囊泡能够被树突状细胞摄取。

实施例3：树突状细胞摄取细胞囊泡后，上调表达共刺激信号分子。

1、实验材料和试剂

使用的H22小鼠肝癌细胞同实施例1，树突状细胞同实施例2，荧光标记的抗小鼠CD80、CD86、MHCII的抗体。

2、实验步骤

1）树突状细胞的培养方法同实施例2；H22小鼠肝癌细胞的细胞囊泡通过实施例1方法制备，使树突状细胞摄取H22小鼠肝癌细胞的方法同实施例2。

2）将H22小鼠肝癌细胞的细胞囊泡和树突状细胞进行孵育48小时，将摄取了细胞囊泡的树突状细胞作为实验组；同时，将单独的树突状细胞孵育48小时，作为对照组。

3）收集实验组和对照组树突状细胞，采用荧光标记的抗小鼠CD80、CD86、MHCII的抗体对两组树突状细胞进行标记。

3、实验结果

结果显示，与对照组树突状细胞(没有摄取肿瘤细胞囊泡的树突状细胞，即单独DC)相比，摄取了肿瘤细胞囊泡的树突状细胞(囊泡/DC)显著上调共刺激分子CD80和CD86以及MHCII类分子（见图3），证实本发明的细胞囊泡可以有效诱导树突状细胞成熟，上调表达共刺激信号分子。

实施例4：摄取了细胞囊泡的树突状细胞可诱导肿瘤特异性T细胞增殖、活化。

1、实验材料和试剂

H22小鼠肝癌细胞同实施例1，小鼠骨髓细胞同实施例2，T细胞分离试剂盒、检测T细胞活化性能的伽马干扰素检测试剂盒。

2、实验步骤

1)使用实施例1方法获得来自凋亡H22小鼠肝癌细胞的细胞囊泡；使用实施例2方法获得树突状细胞；

2）在DMEM培养液中培养H22小鼠肝癌细胞，将3×10⁵H22小鼠肝癌细胞皮下接种BALB/c小鼠，共6只，15天后，取小鼠脾脏，采用T细胞分离试剂盒从BALB/c小鼠脾脏中分离T细胞（其中含有肝癌特异性T细胞），以下简称肿瘤特异性T细胞；

将2000个李斯特菌静脉注射BALB/c小鼠，共6只，7天后，取小鼠脾脏，采用T细胞分离试剂盒从BALB/c小鼠脾脏中分离T细胞（其中含有李斯特菌特异性T细胞），以下简称李斯特菌特异性T细胞。

3）将步骤1获得的H22小鼠肝癌细胞的细胞囊泡与树突状细胞进行孵育48小时，将摄取了细胞囊泡的树突状细胞作为实验组；同时，将单独的树突状细胞孵育48小时，作为对照组。

4）将实验组树突状细胞分为两等份，分别与上述李斯特菌特异性T细胞和肿瘤特异性T细胞以1:10比例进行共培养72小时后，采用氚标记的胸腺嘧啶核苷法，利用氚标记胸腺嘧啶核苷方法检测T细胞增殖；采用ELISA法，利用伽马干扰素检测试剂盒检测培养上清中伽马干扰素的水平；

同时将对照组树突状细胞为两等份，分别与上述李斯特菌特异性T细胞和肿瘤特异性T细胞以1:10比例进行共培养72小时后，采用氚标记的胸腺嘧啶核苷法，利用氚标记胸腺嘧啶核苷方法检测T细胞增殖；采用ELISA法，利用伽马干扰素检测试剂盒检测培养上清中伽马干扰素的水平。

3、实验结果

由图4A可以看出，没有摄取细胞囊泡的树突状细胞(即单独DC)对肿瘤特异性T细胞(即肿瘤T)增殖作用很小，摄取了细胞囊泡的树突状细胞(即囊泡/DC)能够有效诱导肿瘤特异性T细胞增殖，二者之间的p<0.001，表现出显著的差异，即摄取了细胞囊泡的树突状细胞对诱导肿瘤特异性T细胞增殖的作用显著高于没有摄取细胞囊泡的树突状细胞，并且二者对李斯特菌特异性T细胞(即李斯特T)的增殖几乎都没有作用；图4B显示，没有摄取细胞囊泡的树突状细胞对诱导肿瘤特异性T细胞产生伽马干扰素作用很小；摄取了细胞囊泡的树突状细胞能够有效诱导肿瘤特异性T细胞产生伽马干扰素，二者之间的p<0.001，表现出显著的差异，即摄取了细胞囊泡的树突状细胞对诱导肿瘤特异性T细胞产生伽马干扰素的作用显著高于没有摄取细胞囊泡的树突状细胞，并且二者对李斯特菌特异性T细胞产生伽马干扰素几乎都没有作用。

实施例5：活化的肿瘤特异性T细胞对肿瘤细胞进行杀伤。

1、实验材料和试剂

使用的H22小鼠肝癌细胞来源的细胞囊泡、树突状细胞、肿瘤特异性T细胞同实施例4，T细胞对肿瘤细胞杀伤检测试剂盒。

2、实验步骤

1）在DMEM培养液中培养H22小鼠肝癌细胞，将3×10⁵H22小鼠肝癌细胞皮下接种BALB/c小鼠，共6只，15天后，取小鼠脾脏，采用T细胞分离试剂盒从BALB/c小鼠脾脏中分离T细胞（其中含有肝癌特异性T细胞），即获得肿瘤特异性T细胞。

3）将上述肿瘤特异性T细胞分为两等份，分别与实验组的树突状细胞、对照组的树突状细胞以按10:1比例进行共培养7天后，收集分别经实验组树突状细胞和对照组树突状细胞诱导后的肿瘤特异性T细胞，即效应细胞，分为实验组效应细胞和对照组效应细胞。

4）以CFSE标记H22小鼠肝癌细胞作为靶细胞，分为等量两组，将其中一组靶细胞与实验组效应细胞按1:5、1:25、1:50比例分别进行孵育，4小时后，收集细胞，通过T细胞对肿瘤细胞杀伤检测试剂盒进行PE标记AnnexinV染色，流式细胞术分析CFSE阳性细胞中AnnexinV阳性细胞的比例，即为肿瘤细胞的杀伤率；

同时将另一组靶细胞与对照组效应细胞按1:5、1:25、1:50例分别进行孵育，4小时后，收集细胞，通过T细胞对肿瘤细胞杀伤检测试剂盒进行PE标记AnnexinV染色，流式细胞术分析CFSE阳性细胞中AnnexinV阳性细胞的比例，即为肿瘤细胞的杀伤率。

3、实验结果

由图5可以看出，当靶细胞与效应细胞比例为1:5时，实验组效应细胞与对照组效应细胞对靶细胞的杀伤率没有显著不同；当靶细胞与效应细胞比例为1:25时，实验组效应细胞与对照组效应细胞对靶细胞的杀伤率之间的p<0.05，表现出显著的差异，即相比于对照组效应细胞，实验组效应细胞具有对肿瘤细胞显著提高的杀伤能力；靶细胞与效应细胞比例为1:50时，实验组效应细胞与对照组效应细胞对靶细胞的杀伤率之间的p<0.01，表现出更加显著的差异，即相比于对照组效应细胞，实验组效应细胞具有对肿瘤细胞更加显著提高的杀伤能力。

实施例6：肿瘤细胞囊泡免疫小鼠，诱导小鼠产生强烈免疫反应。

1、实验材料和试剂

使用的H22小鼠肝癌细胞同实施例1，实验用BALB/c小鼠购自武汉大学医学实验动物中心，体重18克左右。

2、实验步骤

1）通过实施例1方法获得H22小鼠肝癌细胞的细胞囊泡；

2）将正常喂养的10只BALB/c小鼠分为等量两组：

其中一组作为实验组，使用上述制备的细胞囊泡进行皮下免疫：具体为第一天免疫第一次(施用含有5x10⁷细胞囊泡的0.05ml生理盐水)，第二天免疫第二次(施用含有5x10⁷细胞囊泡的0.05ml生理盐水)，第七天免疫第三次(施用含有5x10⁷细胞囊泡的0.05ml生理盐水)，第八天，观察小鼠腘窝淋巴结;

另一组BALB/c小鼠作为对照组，施用安慰剂：生理盐水，具体为第一天施用第一次(施用0.05ml生理盐水)，第二天施用第二次(施用0.05ml生理盐水)，第七天施用第三次(施用0.05ml生理盐水)，第八天，观察小鼠腘窝淋巴结。

3、实验结果

由图6可以看出，相比于对照组小鼠，经细胞囊泡皮下免疫后的实验组小鼠，腘窝淋巴结明显肿大，表明肿瘤细胞囊泡免疫小鼠，诱导小鼠产生强烈免疫反应。

实施例7：肿瘤细胞囊泡免疫小鼠，抑制肿瘤生长，延长荷瘤小鼠的存活时间。

1、实验材料和试剂

使用的H22小鼠肝癌细胞来源同实施例1，实验用BALB/c小鼠购自武汉大学医学实验动物中心，体重18克左右。

2、实验步骤

1）通过实施例1方法获得H22小鼠肝癌细胞的细胞囊泡；

2）将正常喂养的12只BALB/c小鼠分为等量两组：

其中一组作为实验组，使用上述制备的细胞囊泡进行右侧腹皮下免疫：具体为第一天免疫第一次(施用含有5x10⁷细胞囊泡的0.05ml生理盐水)，第二天免疫第二次(施用含有5x10⁷细胞囊泡的0.05ml生理盐水)，第七天免疫第三次(施用含有5x10⁷细胞囊泡的0.05ml生理盐水)，第八天，在小鼠左侧腹皮下接种3×10⁵H22肿瘤细胞，观察肿瘤的生成和小鼠存活时间;

另一组BALB/c小鼠作为对照组，施用安慰剂：生理盐水，具体为第一天施用第一次(施用0.05ml生理盐水)，第二天施用第二次(施用0.05ml生理盐水)，第七天施用第三次(施用0.05ml生理盐水)，第八天，在小鼠左侧腹皮下接种3×10⁵H22肿瘤细胞，观察肿瘤的生成和小鼠存活时间。

3、实验结果

由图7A和图7B可以看出，相比于使用安慰剂处理的对照组小鼠，经细胞囊泡免疫的实验组小鼠，能够有效抑制肿瘤生成，使80%的小鼠无肿瘤生成，并显著延长了小鼠荷瘤生存时间。

实施例8：细胞囊泡免疫小鼠，对肝肾功能无影响。

1、实验材料和试剂

2、实验步骤

1）通过实施例1方法获得H22小鼠肝癌细胞的细胞囊泡；

2）将正常喂养的16只BALB/c小鼠分为等量两组：

其中一组作为实验组，使用上述制备的细胞囊泡进行右侧腹皮下免疫：具体为第一天免疫第一次(施用含有5x10⁷细胞囊泡的0.05ml生理盐水)，第二天免疫第二次(含有5x10⁷细胞囊泡的0.05ml生理盐水)，第七天免疫第三次(含有5x10⁷细胞囊泡的0.05ml生理盐水)，之后每天正常喂养;

另一组BALB/c小鼠作为对照组，施用安慰剂:生理盐水，具体为第一天施用第一次(0.05ml生理盐水)，第二天施用第二次(0.05ml生理盐水)，第七天施用第三次(0.05ml生理盐水)，之后每天正常喂养。

3）在第八天从小鼠尾静脉采血，检测血中谷丙转氨酶和肌酐含量。

3、实验结果

由图8可以看出，相比于使用安慰剂处理的对照组，经细胞囊泡免疫后的实验组小鼠，血中谷丙转氨酶和肌酐含量基本没有改变，表明细胞囊泡免疫肝肾功能基本无影响。

实施例9肿瘤疫苗的抗瘤效应

1、实验材料和试剂

2、实验步骤

1）通过实施例1方法获得H22小鼠肝癌细胞的细胞囊泡；

2）将正常喂养的20只BALB/c小鼠分为等量两组：

其中一组使用上述制备的细胞囊泡进行右侧腹皮下免疫，具体为第一天免疫第一次(施用含有5x10⁷细胞囊泡的0.05ml生理盐水)，第二天免疫第二次(施用含有5x10⁷细胞囊泡的0.05ml生理盐水)，第七天免疫第三次(施用含有5x10⁷细胞囊泡的0.05ml生理盐水)，第八天，在小鼠左侧腹皮下接种1×10⁶H22肿瘤细胞，观察肿瘤的生成情况；

另一组则使用上述制备的细胞囊泡与和佐剂(例如铝佐剂)混合后进行右侧腹皮下免疫：具体为第一天免疫第一次(施用含有5x10⁷细胞囊泡和0.05mg铝佐剂的0.05ml生理盐水)，第二天免疫第二次(施用含有5x10⁷细胞囊泡和0.05mg铝佐剂的0.05ml生理盐水)，第七天免疫第三次(施用含有5x10⁷细胞囊泡和0.05mg铝佐剂的0.05ml生理盐水)，第八天，在小鼠左侧腹皮下接种1×10⁶H22肿瘤细胞，观察皮下肿瘤结节的形成;

3、实验结果

由图9可以看出，施用细胞囊泡的肿瘤疫苗可使至少30%小鼠免于肿瘤形成，但是施用细胞囊泡联合佐剂的肿瘤疫苗，可使70%小鼠免于肿瘤发生，二者p<0.05,说明施用细胞囊泡联合佐剂的肿瘤疫苗较施用单独细胞囊泡的肿瘤疫苗，产生更好的抗肿瘤免疫效果。

实施例10本发明的方案对肝癌外的其它肿瘤类型同样有效

1、实验材料和试剂

不同肿瘤细胞系包括：小鼠黑色素瘤细胞系B16（C57BL/6遗传背景）、小鼠乳腺癌细胞系4T1（BALB/c遗传背景）、小鼠结肠癌细胞系MC26（BALB/c遗传背景）；实验用C57BL/6小鼠和BALB/c小鼠购自武汉大学医学实验动物中心，体重18克左右。

2、实验步骤

1）在DMEM培养液中分别培养上述肿瘤细胞系，使细胞量分别达到1×10⁸；使用紫外线照射60分钟，在紫外线照射后的48小时，各肿瘤细胞系细胞出现明显变小、暗淡的状态，确认这些肿瘤细胞已经被紫外线诱导凋亡，按实施例1所述方法收集来自各肿瘤细胞系凋亡肿瘤细胞的细胞囊泡。

2）分别将来自各肿瘤细胞系的细胞囊泡、佐剂(例如铝佐剂)与生理盐水混合，制成针对各肿瘤的肿瘤疫苗。

3）检测各肿瘤疫苗对荷有相应肿瘤的小鼠的抗瘤效应，下面以小鼠乳腺癌肿瘤疫苗(其中每毫升小鼠乳腺肿瘤疫苗含细胞囊泡5x10⁷，含铝佐剂0.05mg）为例说明检测方法：

将正常喂养的16只BALB/c小鼠分为等量两组，其中一组作为实验组，使用上述制备的小鼠乳腺癌肿瘤疫苗进行右侧腹皮下免疫：具体为第一天免疫第一次(施用人乳腺癌肿瘤疫苗的使用量为0.05ml)，第二天免疫第二次(人乳腺癌肿瘤疫苗的使用量为0.05ml)，第七天免疫第三次(人乳腺癌肿瘤疫苗的使用量为0.05ml)，第八天，在小鼠左侧腹皮下接种3×10⁵4T1小鼠乳腺癌肿瘤细胞，观察肿瘤的生成情况;

另一组BALB/c小鼠作为对照组，施用安慰剂:生理盐水，具体为第一天施用第一次(0.05ml生理盐水)，第二天施用第二次(0.05ml生理盐水)，第七天施用第三次(0.05ml生理盐水)，第八天，在小鼠左侧腹皮下接种3×10⁵4T1小鼠乳腺癌肿瘤细胞，观察皮下肿瘤结节的生成情况。

3、实验结果

由图10以看出，针对小鼠黑色素瘤细胞系B16（C57BL/6遗传背景）、小鼠乳腺癌细胞系4T1（BALB/c遗传背景）、小鼠结肠癌细胞系MC26（BALB/c遗传背景）的肿瘤细胞，相比于使用安慰剂处理的对照组小鼠，经各自肿瘤疫苗免疫后的实验组小鼠，能够显著抑制肿瘤生成，各实验组与对照组之间的p<0.05，由图10可以看出，80%左右的小鼠未见任何可触摸的瘤结节，显示无肿瘤生成。

Claims

1.细胞囊泡在制备肿瘤疫苗中的应用，所述细胞囊泡为源自凋亡肿瘤细胞的细胞囊泡，其中所述细胞囊泡在14000g的离心力下进行收集。

2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述细胞囊泡通过使用紫外线照射肿瘤细胞使肿瘤细胞凋亡后收集获得。

3.根据权利要求1所述的应用，其中，所述细胞囊泡的粒径为100～1000纳米。

4.根据权利要求1所述的应用，其中，所述肿瘤疫苗为用于卵巢癌、黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌、肝癌、膀胱癌、白血病或胶质瘤的肿瘤疫苗。

5.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其中，所述肿瘤疫苗包括源自凋亡肿瘤细胞的细胞囊泡和佐剂。

6.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其中，所述肿瘤疫苗的剂型包括注射制剂。

7.一种肿瘤疫苗，包括源自凋亡肿瘤细胞的细胞囊泡和佐剂，其中所述细胞囊泡在14000g的离心力下进行收集。

8.根据权利要求7所述的肿瘤疫苗，所述佐剂为铝佐剂。

9.根据权利要求7所述的肿瘤疫苗，所述肿瘤疫苗的剂型包括注射剂。

10.根据权利要求7所述的肿瘤疫苗，所述肿瘤细胞包括卵巢癌细胞、黑色素瘤细胞、乳腺癌细胞、肺癌细胞、胃癌细胞、结肠癌细胞、肝癌细胞、膀胱癌细胞、白血病细胞或胶质瘤细胞。

11.根据权利要求7-10任一项所述肿瘤疫苗，其中，所述细胞囊泡是通过使用紫外线照射肿瘤细胞，使肿瘤细胞凋亡后收集获得。

12.权利要求7-11任一项所述的肿瘤疫苗的制备方法，包括：制取所述细胞囊泡，并与佐剂制成所述肿瘤疫苗的过程。

13.根据权利要求12所述的肿瘤疫苗的制备方法，还包括制成注射剂的过程。