CN114606190A - 用于细胞杀伤及出泡的纳米试剂、细胞微米囊泡及其制备方法和应用 - Google Patents

用于细胞杀伤及出泡的纳米试剂、细胞微米囊泡及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于细胞杀伤及出泡的纳米试剂、细胞微米囊泡及其制备方法和应用。该纳米试剂由透明质酸、第四代聚酰胺‑胺树枝状高分子、阿霉素和酪氨酸激酶抑制剂组成。该纳米试剂可实现高效的细胞核药物递送、诱导细胞凋亡并使各类细胞转化为微米级的囊泡，转化率达100％，重点实现了无需外场刺激即可高效诱导细胞产生均一且稳定的微米囊泡，经小鼠体内静脉注射后，该试剂可实现高效的肿瘤富集。另外，本发明还证明了该试剂诱导肿瘤细胞形成的细胞微米囊泡具有良好的免疫刺激效果，可以激活免疫系统进行肿瘤杀伤。由于该试剂具有良好的安全性，并能普适性地诱导各类细胞形成微米囊泡，有望成为一种新型的免疫刺激材料。

Description

用于细胞杀伤及出泡的纳米试剂、细胞微米囊泡及其制备方 法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于细胞杀伤及出泡的纳米试剂、细胞微米囊泡及其制备方法和应用。
背景技术
如今，癌症仍然是对人类生命的致命威胁，而传统的癌症治疗方法包括手术、化疗和放疗的治愈率有限，副作用严重。近年来，癌症免疫治疗在癌症治疗中显示出巨大的前景。各种癌症免疫治疗方法，如免疫检查点阻断疗法、肿瘤疫苗和嵌合抗原受体T细胞疗法，已被广泛研究并取得了理想的效果。其中，肿瘤疫苗能引起肿瘤特异性免疫刺激，是最重要的免疫治疗策略之一，在癌症治疗方面有着巨大的潜力。但是，截止目前，肿瘤疫苗的应用仍局限于癌症预防阶段，而在癌症患者中引发实质性的免疫反应仍然是一个巨大的挑战，主要是由于这些疫苗的免疫原性不足、免疫抑制肿瘤微环境和这些疫苗所含抗原与特定患者肿瘤的相关性较低等原因造成的。因此，如何开发出一种既可以有效刺激患者机体免疫反应，又能保证安全性的肿瘤疫苗是一个亟待解决的问题。另外，肿瘤细胞来源的囊泡结构具有良好的生物相容性和肿瘤靶向性，并包含了所有的肿瘤危险刺激因子。近年来，肿瘤细胞来源的囊泡被广泛研究并应用于纳米药物的包裹、小分子药物的递送和肿瘤疫苗等领域并取得了不错的进展。然而，尽管目前已经报道了几种产生细胞源性囊泡的策略，但其中大多数都需要复杂和严格的物理刺激条件(如光照)，因此不适合用于原位产生癌细胞来源的囊泡。此外，这些方法的囊泡生成率较低，囊泡的大小和形状不均匀，严重阻碍了癌细胞衍生囊泡的临床应用。因此，发展能简便且高效地制备细胞来源囊泡的方法是一个重要的研究方向。
发明内容
发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种用于细胞杀伤和诱导细胞出泡的纳米试剂，实现了无需外场刺激即可高效诱导细胞产生均一且稳定的微米囊泡，同时本发明所述的纳米试剂可以实现高效的细胞核药物递送、诱导细胞凋亡并使细胞转化为微米级的囊泡。
本发明还提供所述的纳米试剂的制备方法和应用。
本发明的第三个目的提供所述纳米试剂制备的细胞微米囊泡及其制备方法和应用。
技术方案：为实现上述发明目的，本发明所述的一种用于细胞杀伤及出泡的纳米试剂，所述试剂为主要由透明质酸、第四代聚酰胺-胺(PAMAM G4)树枝状高分子、阿霉素和酪氨酸激酶抑制剂(如阿帕替尼、拉帕替尼、索拉非尼或达沙替尼)四种成分构成。
其中，所述透明质酸、树枝状高分子、阿霉素和酪氨酸激酶抑制剂的质量比为5-20：10-30：2：1。
作为优选，透明质酸、树枝状高分子、阿霉素和酪氨酸激酶抑制剂的质量比为6.9：14.7：2：1。
本发明所述用于诱导细胞出泡的试剂的制备方法，包括以下步骤：
本发明所述的用于细胞杀伤及出泡的纳米试剂(其中的酪氨酸激酶抑制剂为阿帕替尼)的制备方法，包括以下步骤：
(1)向盐酸阿霉素的甲醇溶液中加入三乙胺，得到阿霉素的甲醇溶液；
(2)将树枝状高分子、阿霉素和阿帕替尼三种组分共溶于甲醇，并混合均匀；
(3)将混合溶液用氮气吹干；
(4)向以上干燥过的混合物中加入去离子水进行水化，涡旋形成纳米颗粒；
(5)将步骤(4)中得到的纳米颗粒离心去除沉淀；
(6)一边涡旋，一边向步骤(5)中得到的纳米颗粒悬浮液中加入透明质酸，形成所述纳米试剂；
(7)将步骤(5)中得到的纳米试剂在截留分子量为250kDa的透析袋透析20-24小时，除去未结合的透明质酸。
本发明所述的用于细胞杀伤及出泡的纳米试剂(其中的酪氨酸激酶抑制剂为拉帕替尼、索拉非尼或达沙替尼)的制备方法，包括以下步骤：
(1)向盐酸阿霉素的二甲基亚砜溶液中加入三乙胺，得到阿霉素的二甲基亚砜溶液；
(2)将阿霉素和拉帕替尼(或索拉非尼、达沙替尼)两种组分共溶于二甲基亚砜，并混合均匀；
(3)将混合溶液滴入到树枝状高分子的水溶液中，涡旋形成纳米颗粒；
(4)将步骤(3)中得到的纳米颗粒以5000rpm离心10分钟，去除沉淀；
(5)一边涡旋，一边向步骤(4)中得到的纳米颗粒悬浮液中加入透明质酸，形成所述纳米试剂；
(6)将步骤(4)中得到的纳米试剂在截留分子量为250kDa的透析袋透析20-24小时，除去未结合的透明质酸。
本发明所述的纳米试剂所制备的细胞微米囊泡。
本发明所述细胞微米囊泡的制备方法，包括以下步骤：
(1)将本发明描述的纳米试剂加入细胞培养液中，培养4小时以上(一天效果更佳)，可以使细胞形成大量的细胞囊泡；
(2)将步骤(1)中得到的细胞及细胞囊泡用刮刀收集，离心分钟去除大的细胞碎片；
(3)将步骤(2)中得到的细胞囊泡上清液超滤(100kDa，3000rpm)并用磷酸缓冲液(PBS)清洗3次，得到细胞囊泡溶液。
本发明所述的细胞微米囊泡在制备机体免疫刺激试剂中的应用。
作为优选，所述机体免疫刺激试剂包括肿瘤疫苗刺激制剂。
本发明所述的纳米试剂可以实现高效的细胞核药物递送、诱导细胞凋亡并使细胞转化为微米级的囊泡。在静脉给药后，该纳米试剂能够实现高效的肿瘤递送。此外，该纳米试剂安全性良好，可促使各类不同细胞形成微米囊泡，有望成为一种可普适性地制备细胞微米囊泡的材料。
由本发明所述的纳米试剂制备的细胞微米囊泡，具有极高的产率和均一的大小，并保留了细胞表面的特征抗原。
另外，使用本发明所描述的纳米试剂制备的癌细胞来源的微米囊泡经过皮下注射后，还具有激活机体抗肿瘤免疫应答反应的效果，有望作为微米肿瘤疫苗进行进一步的临床应用。
已经报道过的产生细胞囊泡的方法很多都需要外场(如光照)的刺激。而本发明所述的纳米试剂仅需和细胞孵育，无需任何外场刺激即可诱导各种细胞大量产生均一且稳定的微米囊泡。本发明首次实现了不需要外场(如光照等)刺激情况下细胞囊泡的大量诱导，为细胞来源微米囊泡的制备提供了新的策略。另外，由于该纳米试剂经小鼠尾静脉注射后，可以高效地在肿瘤中富集，并在肿瘤组织内原位产生细胞微米囊泡并引发机体的抗肿瘤免疫响应，因而该纳米试剂也提供了一种原位制备肿瘤细胞来源的微米囊泡的方法。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)纳米试剂制备方法简便：该纳米试剂制备过程中不涉及化学反应以及复杂的提纯过程；
(2)纳米试剂具有良好的稳定性、肿瘤靶向性及载药效果：该纳米试剂由透明质酸包裹，其可以赋予整个纳米试剂良好的生物相容性和生理条件下稳定的性质，并具有肿瘤细胞靶向性(针对CD44过表达的肿瘤细胞)；
(3)纳米试剂具有高效的细胞核药物递送效率和癌细胞杀伤效果：由于透明质酸能够增强肿瘤细胞的内吞，表面多氨基的树枝状高分子具有“质子海绵”效应，可以促进药物的溶酶体逃逸。所以纳米试剂包裹的阿霉素等药物可以高效地进入细胞核中发挥抗癌疗效，实现更加高效的细胞核药物递送和细胞杀伤。
(4)细胞微米囊泡制备方法简便：该细胞微米囊泡只需使用本发明所述的纳米试剂孵育细胞并纯化即可得到，不需要现有大多数技术所述的复杂和严格的物理刺激条件(如光照)；
(5)细胞微米囊泡具有极高的产量(由细胞转变为微米囊泡的转化率达100％，主要通过显微镜视野中全部细胞都变成微米囊泡)和良好的均一性；
(6)对于肿瘤细胞来源的囊泡，其很好地保留了细胞相关抗原并携带了肿瘤危险因子；制备的微米囊泡能够很好地靶向小鼠的淋巴结；
(7)对于肿瘤细胞来源的囊泡，其具有良好的免疫刺激效果，制备的微米囊泡可以激活免疫系统进行肿瘤杀伤，有望用作癌症疫苗。
综上，本发明制备的纳米试剂具有良好的稳定性和生物相容性、优异的肿瘤靶向性和高效的细胞核药物递送，极大地提升了化疗药物阿霉素的肿瘤治疗效果，有望成为一种普适性的化疗药物细胞核递送载体。该纳米试剂同时又可以简便并高效地制备细胞微米囊泡。由本发明中的纳米试剂制得的细胞微米囊泡(以肿瘤细胞囊泡为例)具有良好的均一性、保留了细胞相关抗原且携带了肿瘤危险因子、并具有良好的免疫刺激效果，因此相关技术有望成为一种普适性的肿瘤疫苗的制备方法。
附图说明
图1是本发明纳米试剂的结构示意图；
图2是本发明纳米试剂的透射电子显微镜图像；
图3是本发明纳米试剂的水合动力学直径示意图；
图4是本发明纳米试剂的细胞内分布情况示意图(其中，Hoechst通道是为了观察细胞核，阿霉素通道是为了观察纳米试剂中的阿霉素，叠加通道为Hoechst通道和阿霉素通道的叠加，该叠加通道是为了观察阿霉素和细胞核的共定位)；
图5是本发明纳米试剂对小鼠乳腺癌细胞的细胞毒性示意图；
图6是本发明纳米试剂(其中的酪氨酸激酶抑制剂为阿帕替尼)诱导小鼠乳腺癌细胞、小鼠黑色素瘤细胞、人乳腺癌细胞和耐药的人乳腺癌细胞产生的细胞来源微米囊泡的光学显微镜图像(其中，阿霉素通道是为了观察纳米试剂中的阿霉素，叠加通道为明场和阿霉素通道的叠加)；
图7是本发明中酪氨酸激酶抑制剂为拉帕替尼、达沙替尼或索拉非尼的纳米试剂诱导小鼠乳腺癌细胞产生的细胞来源微米囊泡的光学显微镜图像(其中，阿霉素通道是为了观察纳米试剂中的阿霉素，叠加通道为明场和阿霉素通道的叠加)；
图8是本发明纳米试剂的小鼠体内成像图；
图9是本发明纳米试剂的小鼠主要器官体外成像图；
图10是本发明纳米试剂的肿瘤治疗效果统计图；
图11是本发明纳米试剂诱导的小鼠乳腺癌细胞来源的微米囊泡在尾根部皮下注射后的体内成像图；
图12是尾根部皮下注射本发明纳米试剂诱导的小鼠乳腺癌细胞来源的微米囊泡后，小鼠淋巴结中树突状细胞的成熟情况图；
图13是注射本发明纳米试剂诱导的小鼠乳腺癌细胞来源的微米囊泡后，小鼠淋巴结中T细胞的亚型分布情况图；
图14是尾静脉注射磷酸缓冲液或纳米试剂后的小鼠主要器官的苏木精-伊红染色图；
图15是尾静脉注射磷酸缓冲液或纳米试剂后的小鼠各项血常规指标图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
第四代聚酰胺-胺(PAMAM G4，CAS号为：163442-67-9)树枝状高分子(分子量为：14214.17)购于Merck公司，透明质酸购买于上海麦克林生化科技有限公司，阿帕替尼、达沙替尼、索拉非尼和三乙胺买于阿拉丁试剂(上海)有限公司，拉帕替尼购买于北京伊诺凯科技有限公司，盐酸阿霉素购买于北京华奉联博科技有限公司。
实施例中的磷酸缓冲液均为细胞用磷酸缓冲液，pH为7.4，离子强度为150mM。
小鼠乳腺癌细胞、小鼠黑色素瘤细胞、人乳腺癌细胞以及耐药的人乳腺癌细胞均购买于江苏凯基生物技术股份有限公司。
实施例1
步骤1：将5.8mg的阿帕替尼溶于1mL的甲醇，得到阿帕替尼的甲醇溶液。将5.8mg盐酸阿霉素溶于480μL的甲醇，加入20μL的三乙胺并混合均匀，得到阿霉素的甲醇溶液；
步骤2：用甲醇稀释第四代聚酰胺-胺(PAMAM G4)树枝状高分子的甲醇溶液，使其终浓度为14.2mg/mL，得到树枝状高分子的甲醇溶液；
步骤3：将250μL的阿帕替尼甲醇溶液和250μL的阿霉素甲醇溶液混合均匀，并一边涡旋一边滴入1.5mL的树枝状高分子甲醇溶液，混合均匀；
步骤4：将步骤3中的混合溶液用氮气吹干；
步骤5：往步骤4干燥后的混合物中加入10mL的去离子水进行水化(室温大约10-20s即可)，并涡旋形成纳米颗粒溶液；
步骤6：将步骤5中得到的纳米颗粒溶液以5000rpm离心10分钟，去除沉淀得到纳米颗粒悬浮液；
步骤7：往步骤6中得到的全部纳米颗粒悬浮液中一边涡旋一边滴入10mL的透明质酸水溶液(浓度为1mg/mL)，混合形成纳米试剂溶液；
步骤8：将步骤7中得到的纳米试剂溶液在截留分子量为250kDa的透析袋透析24小时，除去未结合的透明质酸，即得到本发明所述的纳米试剂。
实施例2
步骤1：将11.6mg的拉帕替尼(或索拉非尼、达沙替尼)溶于1mL的二甲基亚砜溶液，得到拉帕替尼的二甲基亚砜溶液。将5.8mg盐酸阿霉素溶于480μL的二甲基亚砜溶液，加入20μL的三乙胺并混合均匀，得到阿霉素的二甲基亚砜溶液；
步骤2：将142mg的第四代聚酰胺-胺(PAMAM G4)树枝状高分子溶于10mL的去离子水，得到树枝状高分子的水溶液；
步骤3：将125μL的拉帕替尼(或索拉非尼、达沙替尼)的二甲基亚砜溶液和250μL的阿霉素二甲基亚砜溶液混合均匀，并一边涡旋一边滴入1.5mL的树枝状高分子水溶液，混合均匀，再加入8.125mL的去离子水，得到纳米颗粒溶液；
步骤4：将步骤3中得到的纳米颗粒溶液以5000rpm离心10分钟，去除沉淀得到纳米颗粒悬浮液；
步骤5：往步骤4中得到的纳米颗粒悬浮液中一边涡旋一边滴入10mL的透明质酸水溶液(浓度为1mg/mL)，形成纳米试剂溶液。
步骤6：将步骤5中得到的纳米试剂溶液在截留分子量为250kDa的透析袋透析24小时，除去未结合的透明质酸，即得到本发明所述的纳米试剂。
实施例1和2中制备的纳米试剂的结构示意图见图1。其中透明质酸在纳米试剂的最外层，保证纳米试剂的生理环境稳定性和肿瘤靶向性；疏水性的小分子药物阿霉素和酪氨酸激酶抑制剂包裹在树枝状高分子的内部。
实施例3
实施例1制备的纳米试剂的形貌表征：
采用透射电子显微镜观察实施例1得到的纳米试剂分散液的形貌和粒径，采用电位粒度分析仪分析实施例1得到的纳米试剂的水合动力学直径，结果分别见图2和图3。结果表明，该纳米试剂的水分散性很好且粒径小于100nm，适合细胞摄取和体内递送。
实施例4
观察实施例1制得的纳米试剂与小鼠乳腺癌细胞相互作用后在细胞内的分布情况：
小鼠乳腺癌细胞(接种浓度为5万个每毫升，每孔接种200μL)于8孔板中37℃培养24小时后，将纳米试剂按阿霉素浓度3.6μg/mL分散于RPMI-1640完全培养基并加入8孔板(200μL/孔)中，于37℃、5％CO2环境中孵育2小时后弃去原培养基。将细胞核染料Hoechst33342按10μg/mL分散于磷酸缓冲液并加入8孔板(200μL/孔)，37℃孵育10分钟，再用磷酸缓冲液清洗两次后补加新鲜的RPMI-1640完全培养基，并通过共聚焦荧光显微镜进行观察。
共聚焦荧光显微镜成像观测，同时用不同的通道观测阿霉素和细胞核的共定位情况：阿霉素在552nm的激发光下发出橙红色荧光，细胞核染料Hoechst 33342在405nm的激发光下发出蓝色荧光，结果见图4。由图4可见，该纳米试剂在与小鼠乳腺癌细胞共孵育后阿霉素可以快速、大量地进入细胞核，说明该纳米试剂可以有效地将阿霉素递送进入癌细胞的细胞核。
实施例5
评价实施例1制得的纳米试剂对小鼠乳腺癌细胞的毒性：
小鼠乳腺癌细胞(接种浓度为5万个每毫升，每孔接种100μL)在96孔板中培养24小时后弃去原有培养基，分别加入100μL的含游离盐酸阿霉和/或阿帕替尼的RPMI-1640完全培养基(其中盐酸阿霉素浓度为0.45、0.9、1.8、3.6、7.2和14.4μg/mL，阿帕替尼浓度为0.22、0.45、0.9、1.8、3.6和7.2μg/mL)，不含阿霉素的实施例1制备的纳米试剂(其中阿帕替尼浓度与上述一致)的RPMI-1640完全培养基、不含阿帕替尼的实施例1制备的纳米试剂(其中阿霉素浓度与上述一致)的RPMI-1640完全培养基、以及实施例1制备的纳米试剂(其中阿帕替尼和阿霉素浓度与上述一致)的RPMI-1640完全培养基，在37℃、5％CO2的条件下孵育24小时。最后利用MTT检测法评价这些材料的细胞毒性，结果见图5。
图5的实验结果表明，相比于其他对照组，本发明实施例1纳米试剂能够对癌细胞造成更为高效的杀伤，这证明了该纳米试剂中的药物阿霉素和阿帕替尼的协同抗癌效果。另外，纳米试剂的细胞毒性要远高于同浓度的游离的药物和单一的阿帕替尼或者阿霉素纳米试剂，证明了所制备的纳米试剂高效的药物递送和抗癌效果。
实施例6
评价实施例1和2制得的纳米试剂诱导小鼠乳腺癌细胞、小鼠黑色素瘤细胞、人乳腺癌细胞以及耐药的人乳腺癌细胞产生微米囊泡的效果：
以上细胞株于8孔板中(接种浓度为5万个每毫升，每孔接种100μL)培养24小时后，将纳米试剂按阿霉素浓度14.5μg/mL分散于RPMI-1640完全培养基并加入8孔板(200μL/孔)中，于37℃、5％CO2环境中孵育4小时后并通过共聚焦荧光显微镜进行观察。
共聚焦荧光显微镜成像观测：阿霉素在552nm的激发光下发出橙红色荧光，结果见图6和图7。由图6可见，实施例1中的纳米试剂在与不同细胞株共孵育后均可导致大量的细胞外微米囊泡的产生，并且这些囊泡大小均一，其中几乎不含阿霉素(552nm激发没有荧光)。由图7可见，实施例2中的不同纳米试剂都可以诱导小鼠的乳腺癌细胞产生微米囊泡。
实施例7
提取和纯化实施例6得到的细胞外微米囊泡：
用刮刀挂下并收集实施例6中诱导小鼠乳腺癌细胞产生的含有细胞碎片和细胞外微米囊泡的培养基。1000rpm离心5分钟，去除底部的细胞碎片。上清液使用(100kDa，3000rpm)的超滤管超滤纯化(大部分液体被超滤下去即可)，并用磷酸缓冲液清洗三次，得到细胞外微米囊泡的悬浮液。
为了用于体内成像，可以使用疏水的DiD染料标记得到的细胞外囊泡(将5μL的DiD(浓度为1mg/mL)的二甲基亚砜溶液加入到1mL的细胞外囊泡的PBS悬浮液中)，并用同样的方法超滤纯化，得到DiD染料标记的细胞外微米囊泡的悬浮液。
实施例8
评价实施例1制得的纳米试剂的小鼠体内肿瘤富集效果：
取健康状况良好的6周龄BALB/c雌性小鼠若干只，并在其皮下注射小鼠乳腺癌细胞。当肿瘤体积达到50mm3左右时，测量小鼠体重，并根据小鼠实际体重计算所需的阿霉素剂量(为5mg/kg)。将含有上述阿霉素剂量的实施例1所得的纳米试剂通过尾静脉注射的方式注射到小鼠体内，并观察其在七天内的体内和各个器官中的荧光分布，结果见图8和图9。
图8和图9实验结果表明，该纳米试剂具有较好的肿瘤富集效果和较为理想的肿瘤滞留时间。
实施例9
评价实施例1制得的纳米试剂的体内抗癌效果：
取健康状况良好的6周龄BALB/c雌性小鼠若干只，并在其皮下注射小鼠乳腺癌细胞。当肿瘤体积达到50mm3左右时，测量小鼠体重，并根据小鼠实际体重计算所需的阿霉素剂量(为5mg/kg)。将磷酸缓冲液(对照组)、实施例1所得的纳米试剂、游离的阿霉素、只含有阿霉素的纳米试剂和只含有阿帕替尼的纳米试剂通过尾静脉注射的方式注射到小鼠体内，并观察和统计其肿瘤大小，结果见图10。
图10实验结果表明，实施例1制备的该纳米试剂具有优异的体内抗癌效果，即本发明的纳米试剂相比于其他对照组能够明显的延缓肿瘤的生长。
实施例10
评价实施例7所得的细胞微米囊泡的淋巴结靶向效果(以小鼠乳腺癌细胞来源的微米囊泡为例)：
取健康状况良好的6周龄BALB/c雌性小鼠若干只，在尾根部皮下注射实施例7中DiD标记的细胞外微米囊泡的悬浮液(100μL，蛋白浓度为10mg/mL)。皮下注射磷酸缓冲液的小鼠作为对照组。两天后，使用小动物活体成像仪观察微米囊泡的体内分布，结果见图11。
图11实验结果表明，微米囊泡在皮下注射后能够很好地靶向小鼠的淋巴结。
实施例11
评价实施例7所得细胞微米囊泡的免疫刺激效果(以小鼠乳腺癌细胞来源的微米囊泡为例)：
取健康状况良好的6周龄BALB/c雌性小鼠若干只，在尾根部皮下注射实施例7中DiD标记的细胞外微米囊泡的悬浮液(100μL，蛋白浓度为10mg/mL)。皮下注射磷酸缓冲液的小鼠作为对照组。两天后，取出淋巴结并研磨成为单细胞。用FITC标记的CD11c抗体、PE标记的CD80抗体和PE-Cy7标记的CD86抗体染色用于评价树突状细胞的成熟。用PE标记的CD3抗体、FITC标记的CD4抗体和PE-Cy7标记的CD8抗体染色用于评价T细胞的亚型，结果见图12和图13。
图12和图13实验结果表明，微米囊泡在皮下注射后能够很好地刺激小鼠淋巴结中树突状细胞的成熟(CD11c+CD80+CD86+)并增加杀伤性T细(CD3+CD8+)和辅助性T细胞(CD3+CD4+)的比例，这表明该微米囊泡可以激活小鼠的免疫系统进行肿瘤杀伤。
实施例12
评价实施例1所得纳米试剂的体内安全性：
取健康状况良好的6周龄BALB/c雌性小鼠若干只，测量小鼠体重，并根据小鼠实际体重计算所需的阿霉素剂量(为5mg/kg)。将含有上述阿霉素剂量的实施例1所得的纳米试剂通过尾静脉注射的方式注射到小鼠体内。对照组注射磷酸缓冲液。14天后，取小鼠的主要器官进行切片并进行苏木精-伊红染色，在共聚焦显微镜下观察其组织的健康情况，结果见图14。同时，取小鼠的血液进行血常规测试，结果见图15。
图14和图15实验结果表明，小鼠经尾静脉注射纳米试剂后各主要器官均无明显损伤，各项血常规指标均正常，这表明该纳米制剂具有良好的体内安全性。

Claims (10)

1.一种用于细胞杀伤及出泡的纳米试剂，其特征在于，所述纳米试剂包括透明质酸、第四代聚酰胺-胺树枝状高分子、阿霉素和酪氨酸激酶抑制剂。
2.根据权利要求1所述的用于细胞杀伤及出泡的纳米试剂，其特征在于，所述透明质酸、第四代聚酰胺-胺树枝状高分子、阿霉素和酪氨酸激酶抑制剂的质量比为5-20：10-30：2：1。
3.根据权利要求1所述的用于细胞杀伤及出泡的纳米试剂，其特征在于，所述酪氨酸激酶抑制剂优选为阿帕替尼、拉帕替尼、索拉非尼或达沙替尼中的一种或者多种。
4.一种权利要求1-3任一所述的用于细胞杀伤及出泡的纳米试剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)向盐酸阿霉素的甲醇溶液中加入三乙胺，得到阿霉素的甲醇溶液；
(2)将第四代聚酰胺-胺树枝状高分子、阿霉素和酪氨酸激酶抑制剂阿帕替尼三种组分共溶于甲醇，并混合均匀；
(3)将混合溶液用氮气吹干；
(4)向步骤(3)干燥过的混合物中加入去离子水进行水化，涡旋形成纳米颗粒；
(5)将步骤(4)中得到的纳米颗粒离心去除沉淀得到纳米颗粒悬浮液；
(6)一边涡旋，一边向步骤(5)中得到的纳米颗粒悬浮液中加入透明质酸，形成所述纳米试剂；
(7)将步骤(5)中得到的纳米试剂透析除去未结合的透明质酸；
或者：
(8)向盐酸阿霉素的二甲基亚砜溶液中加入三乙胺，得到阿霉素的二甲基亚砜溶液；
(9)将阿霉素和酪氨酸激酶抑制剂拉帕替尼或索拉非尼或达沙替尼两种组分共溶于二甲基亚砜，并混合均匀；
(10)将混合溶液滴入到第四代聚酰胺-胺树枝状高分子的水溶液中，涡旋形成纳米颗粒；
(11)将步骤(10)中得到的纳米颗粒离心去除沉淀得到纳米颗粒悬浮液；
(12)一边涡旋，一边向步骤(11)中得到的纳米颗粒悬浮液中加入透明质酸，形成所述纳米试剂；
(13)将步骤(12)中得到的纳米试剂在透析除去未结合的透明质酸。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(7)或者步骤(13)中纳米试剂在截留分子量为250kDa的透析袋透析20-24小时，除去未结合的透明质酸。
6.一种权利要求1-3所述的纳米试剂在制备癌细胞杀伤试剂或者药物中的应用。
7.一种利用权利要求1-3任一所述的纳米试剂所制备的细胞微米囊泡。
8.一种权利要求7所述细胞微米囊泡的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将纳米试剂加入细胞培养液中进行培养，可以使细胞形成大量的细胞微米囊泡；
(2)将步骤(1)中得到的细胞及细胞囊泡收集，离心取上清液，去除大的细胞碎片；
(3)将步骤(2)中得到的细胞囊泡上清液超滤并清洗得到细胞微米囊泡溶液。
9.一种权利要求7所述的细胞微米囊泡在制备机体免疫刺激试剂中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述机体免疫刺激试剂包括肿瘤疫苗刺激制剂。
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Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006115547A2 (en) * 2005-04-20 2006-11-02 Dendritic Nanotechnologies, Inc. Dendritic polymers with enhanced amplification and interior functionality
CN102429870A (zh) * 2011-12-21 2012-05-02 中国药科大学 一种喜树碱类药物的新型肿瘤靶向树状聚合物纳米载体
CN103446580A (zh) * 2012-05-31 2013-12-18 湖北盛齐安生物科技有限公司 一种肿瘤疫苗及其制备方法
CN106491561A (zh) * 2016-11-10 2017-03-15 苏州大学 基于pamam的联合携载阿霉素及耐药逆转剂的纳米递送系统的制备方法
CN107308457A (zh) * 2017-05-19 2017-11-03 四川大学 一种具有肿瘤微环境响应性降解的深层穿透纳米递药系统
CN109999197A (zh) * 2019-03-19 2019-07-12 西安交通大学 肿瘤靶向的纳米复合物、制备方法及其在声动力介导的肿瘤精准治疗中的应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006115547A2 (en) * 2005-04-20 2006-11-02 Dendritic Nanotechnologies, Inc. Dendritic polymers with enhanced amplification and interior functionality
CN102429870A (zh) * 2011-12-21 2012-05-02 中国药科大学 一种喜树碱类药物的新型肿瘤靶向树状聚合物纳米载体
CN103446580A (zh) * 2012-05-31 2013-12-18 湖北盛齐安生物科技有限公司 一种肿瘤疫苗及其制备方法
CN106491561A (zh) * 2016-11-10 2017-03-15 苏州大学 基于pamam的联合携载阿霉素及耐药逆转剂的纳米递送系统的制备方法
CN107308457A (zh) * 2017-05-19 2017-11-03 四川大学 一种具有肿瘤微环境响应性降解的深层穿透纳米递药系统
CN109999197A (zh) * 2019-03-19 2019-07-12 西安交通大学 肿瘤靶向的纳米复合物、制备方法及其在声动力介导的肿瘤精准治疗中的应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GUO ET AL.: "Co-delivery of cisplatin and doxorubicin by covalently conjugating with polyamidoamine dendrimer for enhanced synergistic cancer therapy", ACTA BIOMATERIALIA, pages 3 *
PICHOT ET AL.: "Dasatinib synergizes with doxorubicin to block growth, migration, and invasion of brease cancer cells", BR J CANCER. *
TANG ET AL.: "Apatinib-induced NF-κB inactivation sensitizes triple-negative breast cancer cells to doxorubicin", AM J TRANSL RES, vol. 12, no. 7 *

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