CN108295250B - 一种口服肿瘤疫苗及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种细胞囊泡在制备口服肿瘤疫苗中的应用方法。所述口服肿瘤疫苗为源自凋亡肿瘤细胞的细胞囊泡，首先对免疫对象进行抗酸剂预处理，然后将所述细胞囊泡通过口腔灌注接种的方式进行免疫预防。本发明中的口服肿瘤疫苗，极易被肠道吸收，引起强烈免疫应答，使用效果远高于注射肿瘤疫苗。

Description

一种口服肿瘤疫苗及其用途
技术领域
本发明涉及一种口服疫苗，具体涉及一种口服肿瘤疫苗。
背景技术
近年来，肿瘤作为一种严重威胁人们生命的疾病，其治疗方法已成为众多科研工作者致力于研究的课题，除了人们通常所知的化疗、手术切除等治疗方法，肿瘤疫苗作为一种新型治疗手段已引起越来越多的关注。
应用细胞囊泡作为肿瘤疫苗优势巨大，众所周知细胞是由细胞膜包裹细胞内容物构成，而细胞膜是由磷脂双分子层中间镶嵌蛋白质分子所组成，其球状结构则通过细胞内被称为细胞骨架的蛋白纤维丝所形成的向心牵拉力得以维持。当细胞受到外界因素(例如：紫外线等)刺激细胞发生凋亡时，细胞骨架附着细胞膜部位的部分蛋白纤维丝断裂或失去附着，向心牵拉力突然消失，使得局部细胞膜结构在外向拉力作用下，向外膨胀、突出并包裹细胞内容物以囊泡形式释放到细胞外的介于细胞和分子之间的亚层次结构中，可以形成一种基本呈纳米级的微颗粒，即本发明所述的“细胞囊泡”。
肿瘤疫苗在机体内的主要作用是诱导肿瘤特异性的T细胞的产生和活化，实现上述作用的基本过程包括：抗原提呈细胞摄取并加工肿瘤抗原，然后将该肿瘤抗原提呈给肿瘤特异性的T细胞，后者在识别肿瘤抗原后被激活并扩增，达到肿瘤部位，对机体的肿瘤细胞进行特异性杀伤。其中抗原提呈细胞对肿瘤抗原的有效摄取是完成上述过程的前提，由于抗原提呈细胞在摄取外来物时，对体积大小有严格要求，体积较小的多肽分子，以及体积较大的整个肿瘤细胞都难以被抗原提呈细胞摄取。细胞囊泡通常可以界于100～1000纳米，非常适合被抗原提呈细胞摄取，利用这样的细胞囊泡制成肿瘤疫苗，进入机体后，能够容易地被抗原提呈细胞捕获，使得肿瘤抗原能够被有效提呈给肿瘤特异性T细胞，并激活这些T细胞，同时由于本发明使用的细胞囊泡可以包含其肿瘤细胞源的几乎全部的肿瘤抗原(所述“全部的肿瘤抗原”指一种类型肿瘤中所有肿瘤细胞的抗原)，从而能对有肿瘤发生趋势的个体进行免疫，使对所有肿瘤抗原具有抵抗力，预防肿瘤的发生。
肠道表面覆盖着由单层上皮细胞构成的黏膜，内表面积巨大，具有高效率的黏膜吸收和物质运输能力。大量弥散分布在肠黏膜的上皮细胞和固有层的免疫细胞和免疫分子、以及肠系膜淋巴结等肠相关性淋巴组织等组成了强大的肠道黏膜免疫系统。肠道黏膜免疫系统可以大量吸收抗原，由其丰富的抗原提呈细胞传递抗原，诱导引起免疫应答。
肿瘤疫苗根据使用方法可以将其分为注射用疫苗，划痕用疫苗，口服用疫苗。口服用疫苗无需使用注射器进行侵入式的免疫接种方式，具有简单方便、安全性高的优点。中国专利ZL201210176820.7公开了一种肿瘤疫苗及其制备方法。该专利提供了一种细胞囊泡在制备肿瘤疫苗中的应用，将源自凋亡肿瘤细胞的细胞囊泡作为肿瘤疫苗的抗原，解决了肿瘤疫苗不能对全部的肿瘤抗原有效，靶向性差以及使用安全性的问题。然而，该专利中细胞囊泡作为肿瘤疫苗的接种方式是皮下注射，不具有口服疫苗的相对便捷性和安全性，对于腹部肿瘤的免疫预防效果不佳。
因此，如何提供一种口服疫苗，具有特异性的预防和抵抗肿瘤的效果又不存在使用安全性问题，实施过程操作简便。并且能对几乎全部的肿瘤抗原有效，成为有待解决的问题。
发明内容
由于口服疫苗较皮下注射操作方便，安全性更高。对特定的疾病(如脊髓灰质炎口服疫苗和肠道类病毒性疾病等)，口服接种疫苗的效果更好。本发明综合两者优点发现：口服肿瘤囊泡能够有效被黏膜上皮细胞吸收，并激活粘膜免疫应答，引起后续的特异性T细胞抗肿瘤免疫，对于某些腹部肿瘤(如卵巢癌、结肠癌、肝癌等)具有较好的免疫预防功效。
本发明的目的是提供一种细胞囊泡在制备口服肿瘤疫苗中的应用方法。
为此，本发明将抗酸剂和细胞囊泡联用，使得细胞囊泡能通过肠道黏膜系统被充分吸收，引起强烈的免疫应答。
胃腔含有大量盐酸，通过口服进入胃肠的细胞囊泡容易破裂，需要配合使用抗酸剂，确保细胞囊泡安全接触肠道黏膜系统。所述抗酸剂或者为碱性物质，能中和酸性，或者为质子泵抑制剂能抑制胃酸分泌。本发明筛选了包括碳酸氢钠、氢氧化铝、胃舒平的碱性抗酸药，包括奥美拉唑、兰索拉唑、雷贝拉唑的质子泵抑制剂。最终优选使用奥美拉唑。
本发明的应用方法保留了细胞囊泡作为疫苗的抗原性，使其通过肠道免疫在预防腹部肿瘤疾病方面效果突出。实验证明，相比于皮下接种的方式，使用细胞囊泡的肿瘤疫苗口服的方式更能明显抑制各种腹部肿瘤细胞导致的肿瘤的生长，延长小鼠的生存时间。
在本发明的方案中，所述细胞囊泡的获得是通过外界条件的刺激使肿瘤细胞凋亡，例如，使用紫外线照射肿瘤细胞，使肿瘤细胞凋亡后收集得到所述细胞囊泡。本领域技术人员也可根据所要治疗的肿瘤类型的不同，选择适合的肿瘤细胞的凋亡方法，为保全细胞中的肿瘤抗原，选择不使细胞发生化学变化的凋亡方法是有利的，同时本发明所述诱导肿瘤细胞凋亡，可以按照本领域技术人员公知的判断标准，例如观察肿瘤细胞缩小、变暗，即可认为其已经凋亡。
进一步的，对于凋亡肿瘤细胞所释放的细胞囊泡的收集可使用超速离心机在低温条件下或室温条件下进行分离。优选的，通过离心机，以100-100000g的离心力，收集细胞囊泡。收集过程的温度没有特殊的限制，只要能保证细胞囊泡不被降解即可，一般的可在低温条件下(4℃左右)进行收集。
在本发明方案中，在使用紫外线照射肿瘤细胞使肿瘤细胞凋亡之前，还包括对肿瘤细胞进行培养，所述培养指在含有满足正常肿瘤细胞生长所需物质的培养基(例如DMEM培养液)中对肿瘤细胞进行的培养。
进一步的，所述细胞囊泡的粒径为100～1000纳米。
进一步的，所述肿瘤疫苗为用于卵巢癌、黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌、肝癌、膀胱癌、白血病或胶质瘤等其他类型肿瘤的肿瘤疫苗。
进一步的，所述的肿瘤疫苗的制备方法，包括使用紫外线照射肿瘤细胞，使肿瘤细胞凋亡，收集凋亡肿瘤细胞所释放的细胞囊泡，然后将所述细胞囊泡与PBS混合形成所述肿瘤疫苗。
在本发明的具体方案中，优选通过可行的方法使所收集的细胞囊泡的粒径基本为100-1000纳米的微颗粒。例如，对于凋亡肿瘤细胞所释放的细胞囊泡的收集可使用超速离心机在低温条件下或室温条件下进行分离。优选的，通过离心机，以100-100000g的离心力，收集细胞囊泡。收集过程的温度没有特殊的限制，只要能保证细胞囊泡不被降解即可，一般的可在低温条件下(4℃左右)进行收集。
在使用紫外线照射肿瘤细胞使肿瘤细胞凋亡之前，还可以对肿瘤细胞先进行培养(孵育)，所述培养指在含有满足正常肿瘤细胞生长所需物质的培养基(例如DMEM培养液)中对肿瘤细胞进行的培养。
本发明也提供一种口服疫苗药盒，药盒中包含治疗有效量的肿瘤疫苗和抗酸剂，其中所述肿瘤疫苗为源自凋亡肿瘤细胞的细胞囊泡。本发明的药盒中还可以包括指导疫苗服用的药品说明书。
有益效果：
(1)本发明提供的肿瘤疫苗及其应用，针对腹部肿瘤的预防效果较皮下接种免疫的效果更佳。
(2)本发明提供的肿瘤疫苗药盒，可以作为预防性疫苗，通过口服的方式免疫接种，使用方便，安全性高。
附图说明
图1：口服疫苗诱导的特异性免疫应答；
A：分泌IFNγ的CD3+CD8+细胞比例；
B：分泌IFNγ的CD3+CD4+细胞比例；
图2：口服肿瘤囊泡联合抗酸剂的效果；
图3：口服疫苗对肺癌模型的作用；
图4：口服疫苗对结肠癌模型的瘤结节数的影响；
图5：口服疫苗对结肠癌模型的生存期的影响；
图6：口服疫苗对肝腹水模型的作用；
图7：口服疫苗对肝癌模型的作用；
图8：口服疫苗对卵巢癌模型的作用。
具体实施方式
本发明使用的术语“细胞囊泡”是指由肿瘤细胞凋亡后所形成、呈现为一种微颗粒囊状形态。
下述实施例中使用的各种肿瘤细胞、药物及实验动物：
抗酸剂为商业购买；
小鼠肝癌细胞系H22(BABL/c遗传背景)、小鼠肝癌细胞系Hepa1-6(C57BL/6遗传背景)、小鼠黑色素瘤细胞系B16(C57BL/6遗传背景)、小鼠卵巢癌癌细胞系ID-8(C57BL/6遗传背景)、小鼠结肠癌细胞系CT-26(BABL/c遗传背景)均可从美国ATCC公司或中国典型物保藏中心CCTCC购买。
BABL/c小鼠，C57BL/6小鼠，购自购自北京维通利华实验动物技术有限公司，体重18克左右。
PKH26、抗小鼠CD8、CD4、CD3、IFN-γ的抗体购自Sigma公司，淋巴细胞刺激因子PMA购自PeproTech公司。
PBS缓冲液1L：0.2g KCl+8.0g NaCl+3.58g Na2HPO4+0.24g KH2PO4
注：以下实施例中，对照组简称为control。
抗酸剂的筛选：
本发明中可用于与肿瘤疫苗联合的抗酸剂可以是包括碳酸氢钠、氢氧化铝、胃舒平的碱性抗酸药，包括奥美拉唑、兰索拉唑、雷贝拉唑的质子泵抑制剂，最终确定的优选的抗酸剂为奥美拉唑。
以下实施例中以奥美拉唑作为具体使用的抗酸剂，其他的抗酸剂有类似的效果。
【实施例1】口服肿瘤囊泡被回肠上皮细胞吸收
1、实验材料和试剂
H22小鼠肝癌细胞，荧光染料：PKH26(可商购获得，带有红色荧光)，上皮细胞钙粘蛋白抗体(可商购获得，带有绿色荧光)，DAPI(细胞核染料，带有蓝色荧光)，荧光显微镜，紫外线装置为常规细胞超净工作台所有，实验用BABL/c小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，体重18克左右。
2、实验步骤
1)在DMEM细胞培养液中培养H22小鼠肝癌细胞，使细胞量达到2×107/ml；
2)将上述H22小鼠肝癌细胞进行PKH26荧光染料染色后，加入新鲜培养液，然后将上述H22小鼠肝癌细胞使用紫外线照射60分钟，然后在培养液中正常培养；
3)在紫外线照射后的48小时，所有的H22小鼠肝癌细胞出现明显变小、暗淡的状态，确认这些肿瘤细胞已经被紫外线诱导凋亡，收集上述凋亡肿瘤细胞的细胞囊泡：包括分离取上清后进行逐步离心，即先以500rpm、1000rpm、5000rpm的转速各离心10分钟，之后以14000g的离心力离心1分钟，以除去细胞及碎片，取离心后的上清再以14000g的离心力离心1小时，得到来自H22小鼠肝癌细胞凋亡所产生的囊泡，PBS重悬囊泡沉淀作为实验组；
对照组为PBS。
4)将来自上述实验组的细胞囊泡和对照组PBS，分别经口腔灌注免疫通过抗酸剂预处理的BABL/c小鼠。抗酸剂的使用方法为：每次口服肿瘤疫苗前1h使用奥美拉唑0.05mg灌胃预处理小鼠。1小时后分离小鼠的回肠组织，4％多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片后经常规免疫组化染色，用绿色染料标记的上皮细胞钙粘蛋白抗体标记回肠上皮细胞，DAPI染细胞核，切片封片后在荧光显微镜下观察。
3、实验结果
结果显示，作为对照组，PBS经口腔免疫BABL/c小鼠的回肠上皮细胞切片仅能观察到绿色的上皮细胞和蓝色的细胞核。作为实验组，来自使用紫外线处理的H22小鼠肝癌细胞囊泡口服免疫小鼠后，在回肠部位观察到大量红色的细胞囊泡，证实了细胞囊泡经口服免疫小鼠后被其回肠上皮细胞所吸收。
【实施例2】口服疫苗诱导小鼠的特异性免疫应答
1、实验材料和试剂
B16小鼠黑色素瘤细胞，荧光标记的抗小鼠CD8、CD4、CD3、IFN-γ的抗体，实验用C57/BL6小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，体重18克左右。
2、实验步骤
1)按实施例1所述方法获得B16小鼠黑色素瘤细胞囊泡(B16-MP)；
2)将正常喂养的30只C57/BL6小鼠分为等量3组：
其中一组作为抗酸剂联用实验组，使用上述制备的细胞囊泡分别进行口腔灌注免疫C57/BL6小鼠，每次口服肿瘤疫苗前1h使用奥美拉唑0.05mg灌胃预处理小鼠：具体为第一天免疫第一次(施用含有5×107细胞囊泡的0.05ml PBS)，第二天免疫第二次(施用含有5×107/ml细胞囊泡的0.05ml PBS)，第七天免疫第三次(施用含有5×107细胞囊泡的0.05mlPBS)；
另一组作为注射实验组，左侧腹皮下接种B16肿瘤疫苗(其中每毫升小鼠黑色素瘤疫苗含细胞囊泡5×107，含铝佐剂0.05mg)，使用上述制备的小鼠黑色素瘤细胞B16肿瘤疫苗进行左侧腹部皮下免疫：具体为第一天免疫第一次，第二天免疫第二次，第七天免疫第三次，(每次施用黑色素瘤细胞B16肿瘤疫苗的使用量为0.05ml)；
还有一组C57/BL6小鼠作为对照组，施用PBS安慰剂，具体为第一天施用第一次(施用0.05ml PBS)，第二天施用第二次(施用0.05ml PBS)，第七天施用第三次(施用0.05mlPBS)；
2)第14天解剖小鼠，取出各组小鼠肠系膜淋巴结研磨，将分散的淋巴细胞在DMEM培养液中进行培养，并加入终浓度80nM的淋巴细胞激活剂PMA；
3)5小时后收集抗酸剂联用实验组、注射实验组和对照组淋巴细胞，采用荧光标记的抗小鼠CD8、CD4、CD3、IFN-γ的抗体对3组肠系膜淋巴结细胞进行标记。
3、实验结果
流式结果显示，与对照组相比，口服肿瘤细胞囊泡的小鼠体内肠系膜淋巴结内T淋巴细胞迅速增殖分化。具有IFN-γ分泌功能的T淋巴细胞的比例显著增加(见图1)，注射肿瘤囊泡刺激T细胞的增殖和分化的强度较弱，证实了本发明的口服肿瘤囊泡对于T细胞强烈的刺激作用，引起机体的免疫反应。
【实施例3】口服肿瘤囊泡联合抗酸剂的效果
1、实验材料和试剂
B16小鼠黑色素瘤细胞来源同实施例2，实验用C57/BL6小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，体重18克左右。
2、实验步骤
1)通过实施例1方法获得H22小鼠黑色素瘤细胞的细胞囊泡(B16-MP)；
2)将正常喂养的30只C57/BL6小鼠分为等量3组：
其中一组作为抗酸剂联用实验组，使用上述制备的细胞囊泡分别进行口腔灌注免疫C57/BL6小鼠，每次口服肿瘤疫苗前1h使用奥美拉唑0.05mg灌胃预处理小鼠：具体为第一天免疫第一次(施用含有5×107/ml细胞囊泡的0.05ml PBS)，第二天免疫第二次(施用含有5×107/ml细胞囊泡的0.05ml PBS)，第七天免疫第三次(施用含有5×107/ml细胞囊泡的0.05ml PBS)；
另一组作为无抗酸剂实验组，使用上述制备的细胞囊泡分别进行口腔灌注免疫C57/BL6小鼠，不使用抗酸剂预处理：具体为第一天免疫第一次(施用含有5×107/ml细胞囊泡的0.05ml PBS)，第二天免疫第二次(施用含有5×107/ml细胞囊泡的0.05ml PBS)，第七天免疫第三次(施用含有5×107/ml细胞囊泡的0.05ml PBS)；
还有一组C57/BL6小鼠作为对照组，施用PBS安慰剂，具体为第一天施用第一次(施用0.05ml PBS)，第二天施用第二次(施用0.05ml PBS)，第七天施用第三次(施用0.05mlPBS)；
第八天在以上3组C57/BL6小鼠尾静脉注射接种1×105B16肿瘤细胞；
3)观察小鼠的存活时间。
3、实验结果
结果显示，相比于使用安慰剂PBS处理的对照组小鼠和未使用抗酸剂预处理的囊泡组小鼠，使用0.05mg奥美拉唑抗酸剂预处理，1h后口服细胞囊泡B16-MP免疫的实验组小鼠，在注射黑色素瘤细胞后的生存时间得到明显延长(见图2)，该结果证明使用抗酸剂可以防止胃酸对细胞囊泡的降解，最大程度保证细胞囊泡被肠吸收，起到免疫预防的效果。
【实施例4】口服疫苗对肺癌模型的作用
1、实验材料和试剂
小鼠黑色素瘤细胞系B16(C57/BL6遗传背景)；实验用C57/BL6小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，体重18克左右。
2、实验步骤
1)通过实施例1方法获得小鼠黑色素瘤细胞的细胞囊泡(B16-MP)；
2)小鼠进行免疫：
将正常喂养的24只C57/BL6小鼠分为等量三组：
其中一组作为抗酸剂联用实验组，口服灌注接种B16肿瘤疫苗(其中每毫升小鼠黑色素瘤细胞疫苗含细胞囊泡5×107，每次口服肿瘤疫苗前1h使用奥美拉唑0.05mg灌胃预处理小鼠)，使用上述制备的小鼠黑色素瘤细胞B16肿瘤疫苗进行口腔灌注免疫：具体为第一天免疫第一次，第二天免疫第二次，第七天免疫第三次，(每次施用黑色素瘤细胞B16肿瘤疫苗的使用量为0.05ml)；
另一组作为注射实验组，左侧腹皮下接种B16肿瘤疫苗(其中每毫升小鼠黑色素瘤疫苗含细胞囊泡5×107，含铝佐剂0.05mg)，使用上述制备的小鼠黑色素瘤细胞B16肿瘤疫苗进行左侧腹部皮下免疫：具体为第一天免疫第一次，第二天免疫第二次，第七天免疫第三次，(每次施用黑色素瘤细胞B16肿瘤疫苗的使用量为0.05ml)；
还有一组C57/BL6小鼠作为对照组，施用PBS安慰剂，具体为第一天施用第一次，第二天施用第二次，第七天施用第三次，每次施用0.05ml PBS；
第八天，上述三组小鼠尾静脉注射接种1×105个小鼠黑色素瘤细胞B16；3)
观察小鼠的生存期。
3、实验结果
由图3可以看出，免疫预防后注射黑色素瘤细胞，口服接种肿瘤疫苗免疫小鼠较皮下接种免疫的小鼠存活期显著延长。
【实施例5】口服疫苗对结肠癌模型的作用
1、实验材料和试剂
小鼠结肠癌细胞系CT-26(BABL/c遗传背景)；实验用BABL/c小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，体重18克左右。
2、实验步骤
1)通过实施例1方法获得小鼠结肠癌细胞囊泡(CT-26-MP)；
2)小鼠进行免疫：
将正常喂养的30只BABL/c小鼠分为等量三组：
其中一组作为抗酸剂联用实验组，口服灌注接种CT-26肿瘤疫苗(其中每毫升小鼠结肠癌细胞疫苗含细胞囊泡5××107，每次口服肿瘤疫苗前1h使用奥美拉唑0.05mg灌胃预处理小鼠)，使用上述制备的小鼠结肠癌细胞CT-26肿瘤疫苗进行口腔灌注免疫：具体为第一天免疫第一次，第二天免疫第二次，第七天免疫第三次，(每次施用结肠癌细胞CT-26肿瘤疫苗的使用量为0.05ml)；
另一组作为注射实验组，左侧腹皮下接种CT-26肿瘤疫苗(其中每毫升小鼠黑色素瘤疫苗含细胞囊泡5×107，含铝佐剂0.05mg)，使用上述制备的小鼠结肠癌细胞CT-26肿瘤疫苗进行左侧腹部皮下免疫：具体为第一天免疫第一次，第二天免疫第二次，第七天免疫第三次，(每次施用结肠癌细胞CT-26肿瘤疫苗的使用量为0.05ml)；
还有一组BABL/c小鼠作为对照组，施用PBS安慰剂，具体为第一天施用第一次，第二天施用第二次，第七天施用第三次，每次施用0.05ml PBS；
第八天，上述三组小鼠腹腔注射接种3×105个小鼠结肠癌细胞CT-26。
3)观察小鼠的瘤结节数目和小鼠的生存期；
3、实验结果
结果显示，免疫预防后注射结肠癌细胞，口服接种肿瘤疫苗免疫小鼠瘤结节较皮下接种免疫的方式明显减少(图4)，小鼠存活期显著延长(图5)。
【实施例6】口服疫苗对肝癌腹水肿瘤模型的作用
1、实验材料和试剂
小鼠肝癌细胞系H22(BABL/c遗传背景)；实验用BABL/c小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，体重18克左右。
2、实验步骤
1)通过实施例1方法获得H22小鼠肝癌细胞的细胞囊泡(H22-MP)；
2)小鼠进行免疫：
将正常喂养的30只BABL/c小鼠分为等量三组：
其中一组作为抗酸剂联用实验组，口服灌注接种H22肿瘤疫苗(其中每毫升小鼠肝癌细胞疫苗含细胞囊泡5×107，每次口服肿瘤疫苗前1h使用奥美拉唑0.05mg灌胃预处理小鼠)，使用上述制备的小鼠肝癌细胞H22肿瘤疫苗进行口腔灌注免疫：具体为第一天免疫第一次，第二天免疫第二次，第七天免疫第三次，(每次施用肝癌细胞H22肿瘤疫苗的使用量为0.05ml)；
另一组作为注射实验组，左侧腹皮下接种H22肿瘤疫苗(其中每毫升小鼠肝癌疫苗含细胞囊泡5×107，含铝佐剂0.05mg)，使用上述制备的小鼠肝癌细胞H22肿瘤疫苗进行左侧腹部皮下免疫：具体为第一天免疫第一次，第二天免疫第二次，第七天免疫第三次，(每次施用肝癌细胞H22肿瘤疫苗的使用量为0.05ml)；
还有一组BABL/c小鼠作为对照组，施用PBS安慰剂，具体为第一天施用第一次，第二天施用第二次，第七天施用第三次，每次施用0.05ml PBS；
第八天，往上述三组腹腔注射接种5×104个小鼠肝癌细胞H22；
3)观察小鼠的生存期。
3、实验结果
由图6可以看出，免疫预防后注射肝癌细胞，口服接种肿瘤疫苗免疫的小鼠较皮下接种免疫的小鼠存活期显著延长。
【实施例7】口服疫苗对肝癌模型的作用
1、实验材料和试剂
小鼠肝癌细胞系Hepa1-6(C57BL/6遗传背景)，实验用C57/BL6小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，体重18克左右。
2、实验步骤
1)通过实施例1方法获得Hepa1-6小鼠肝癌细胞的细胞囊泡(Hepa1-6-MP)；
2)小鼠进行免疫：
将正常喂养的30只C57/BL6小鼠分为等量三组：
其中一组作为抗酸剂联用实验组，口服灌注接种Hepa1-6肿瘤疫苗(其中每毫升小鼠肝癌细胞疫苗含细胞囊泡5×107，每次口服肿瘤疫苗前1h使用奥美拉唑0.05mg灌胃预处理小鼠)，使用上述制备的小鼠肝癌细胞Hepa1-6肿瘤疫苗进行口腔灌注免疫：具体为第一天免疫第一次，第二天免疫第二次，第七天免疫第三次，(每次施用肝癌细胞Hepa1-6肿瘤疫苗的使用量为0.05ml)；
另一组作为注射实验组，左侧腹皮下接种Hepa1-6肿瘤疫苗(其中每毫升小鼠肝癌疫苗含细胞囊泡5×107，含铝佐剂0.05mg)，使用上述制备的小鼠肝癌细胞Hepa1-6肿瘤疫苗进行左侧腹部皮下免疫：具体为第一天免疫第一次，第二天免疫第二次，第七天免疫第三次，(每次施用肝癌细胞Hepa1-6肿瘤疫苗的使用量为0.05ml)；
还有一组作为对照组，施用PBS安慰剂，具体为第一天施用第一次，第二天施用第二次，第七天施用第三次，每次施用0.05ml PBS；
第八天，上述三组小鼠尾静脉注射接种2×106个小鼠肝癌细胞Hepa1-6；3)观察小鼠的生存期。
3、实验结果
由图7可以看出，免疫预防后注射肝癌细胞，口服接种肿瘤疫苗免疫的小鼠较皮下接种免疫的小鼠存活期显著延长。
【实施例8】口服疫苗对ID-8卵巢癌模型的作用
1、实验材料和试剂
小鼠卵巢癌癌细胞系ID-8(C57/BL6遗传背景)，实验用C57/BL6小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，体重18克左右。
2、实验步骤
1)通过实施例1方法获得ID-8小鼠卵巢癌细胞的细胞囊泡(ID-8-MP)；
2)小鼠进行免疫：
将正常喂养的24只C57/BL6小鼠分为等量三组：
其中一组作为抗酸剂联用实验组，口服灌注接种ID-8肿瘤疫苗(其中每毫升小鼠卵巢癌细胞疫苗含细胞囊泡5×107，每次口服肿瘤疫苗前1h使用奥美拉唑0.05mg灌胃预处理小鼠)，使用上述制备的小鼠卵巢癌细胞ID-8肿瘤疫苗进行口腔灌注免疫：具体为第一天免疫第一次，第二天免疫第二次，第七天免疫第三次，(每次施用卵巢癌ID-8肿瘤疫苗的使用量为0.05ml)；
另一组作为注射实验组，皮下接种ID-8肿瘤疫苗(其中每毫升小鼠卵巢癌疫苗含细胞囊泡5×107，含铝佐剂0.05mg)，使用上述制备的小鼠卵巢癌细胞ID-8肿瘤疫苗进行左侧腹左侧腹部皮下免疫：具体为第一天免疫第一次，第二天免疫第二次，第七天免疫第三次，(每次施用卵巢癌细胞ID-8肿瘤疫苗的使用量为0.05ml)；
还有一组C57/BL6小鼠作为对照组，施用PBS安慰剂，具体为第一天施用第一次，第二天施用第二次，第七天施用第三次，每次施用0.05ml PBS；
第八天，上述三组小鼠腹腔接种5×106个小鼠卵巢癌细胞ID-8；
3)观察小鼠的生存期。
3、实验结果
由图8可以看出，免疫预防后接种卵巢癌细胞，口服接种肿瘤疫苗免疫的小鼠较皮下接种免疫的小鼠存活期显著延长。

Claims (1)

1.一种口服疫苗药盒，包括治疗有效量的肿瘤疫苗和抗酸剂，其中所述肿瘤疫苗为源自凋亡肿瘤细胞的细胞囊泡，所述肿瘤细胞选自结肠癌细胞系CT-26、肝癌细胞系H22和Hepa1-6、黑色素瘤细胞系B16和卵巢癌细胞系ID-8，所述抗酸剂为奥美拉唑，所述细胞囊泡通过使用紫外线照射肿瘤细胞使肿瘤细胞凋亡后收集获得，粒径为100～1000纳米。
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