JP2003533486A - ヒト樹状細胞による外因性抗原のクラスｉ提示を増加させる方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 原発性癌および転移性癌に対する免疫療法応答のためにＴ細胞を活性化するヒト樹状細胞の使用のための方法および組成物を開示する。１つの実施形態において、カルメット−ゲラン杆菌（ＢＣＧ）と組み合わせて腫瘍関連抗原またはその抗原フラグメントに暴露されたヒト樹状細胞が癌患者に投与され、インビボで主にＣＤ８^＋ Ｔ細胞応答を活性化させる。代替の実施形態において、ヒト樹状細胞は、ＢＣＧと組み合わせてインビトロで腫瘍関連抗原かまたは特異的抗原ペプチドに暴露され、そしてプライムされたかまたはプライムされていないＴ細胞と共にインキュベートまたは培養されて、インビトロで主にＣＤ８^＋ Ｔ細胞応答を活性化させる。次いで活性化されたＴ細胞は癌患者に投与される。ＢＣＧと組み合わせた抗原は、主にＣＤ８^＋ Ｔ細胞応答を提供するＭＨＣ−クラスＩ区画を通して樹状細胞によりプロセシングされる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （関連出願に対する相互参照） 本願は、２０００年５月１２日に出願された米国仮特許出願番号６０／２０３
，７５８（これは、本明細書中に参考として援用される）に対して優先権を主張
する。

【０００２】 （発明の背景） 免疫系は、原発性癌細胞および転移性癌細胞の両方を含む腫瘍細胞を殺すよう
に機能し得ることが十分に証明されている。確かに、免疫系が腫瘍性癌細胞の存
在を認識する証拠は、腫瘍組織において浸潤するリンパ球の存在によって支持さ
れている（Ｈａｓｋｉｌｌら、Ｃｏｎｔｅｍｐ．Ｔｏｐ．Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌ
．８：１０７−１７０（１９７８）；ＶｏｓｅおよびＭｏｏｒｅ，Ｓｅｍｉｎ．
Ｈｅｍａｔｏｌ．２２：２７−４０（１９８５））。免疫細胞の存在にも関わら
ず、腫瘍は、しばしば打ち勝ち、そして生存するだけでなく、無制限の増殖を有
して遠位部位に転移する。

【０００３】 標的細胞のＴ細胞活性化および認識の理解における最近の進歩は、Ｔ細胞媒介
癌免疫治療の発達におけるいくらかの進歩を可能にした（Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｃ
ｅｌｌ ７１：１０６５−１０６８（１９９２）；Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｃｕｒｒ．
Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：６１９−６２３（１９９２））。

【０００４】 免疫系は、単一の多分化能前駆細胞から、リンパ球および骨髄細胞の主要サブ
グループに発達する。リンパ球は、Ｂ細胞およびＴ細胞から構成される。骨髄細
胞は、マクロファージ、単球および好中球を含む。免疫細胞は、外来抗原を循環
および捜索し、そしてこれらを除去する。

【０００５】 リンパ球サブグループにおいて、免疫応答は、表面分子ＣＤ４^＋の発現につい
て陽性であるヘルパーＴ細胞（Ｔ_Ｈ）およびＣＤ８^＋について陽性の表面である
細胞障害性Ｔ細胞（Ｔ_Ｃ）の活性化を導く。Ｔ細胞は、抗原性フラグメントに結
合する主要組織適合性（ＭＨＣ）のクラスＩまたはクラスＩＩ分子を発現する抗
原提示細胞（ＡＰＣ）との相互作用を介して活性化される。関連した抗原性アミ
ノ酸配列は、プロセシングされた抗原に特異的に由来する。

【０００６】 ＡＰＣは、抗原の供給源に依存して抗原を提示する２つの代替的な方法を使用
する。外因性の可溶性抗原は、小胞にエンドサイトーシスされ、そして低ｐＨに
よって分解される。次いで、生じるペプチドフラグメントは、ＭＨＣクラスＩＩ
タンパク質に指向され、そして細胞表面上に提示される。ＭＨＣクラスＩに関す
る提示は、抗原がサイトゾル中で分解され、そして小胞体へのＴＡＰ輸送系によ
って輸送されることを必要とする。代表的に、これは、例えば、ウイルス感染ま
たは細胞輸送の場合において、抗原がサイトゾル中に存在することを必要とし、
次いで得られたペプチドは、ＭＨＣクラスＩと結合する。

【０００７】 抗原−ＭＨＣ複合体は、抗原ならびにＣＤ４およびＣＤ８表面分子を認識する
特異的Ｔ細胞レセプターによって認識される。ＣＤ４およびＣＤ８は各々、ＭＨ
Ｃの１つのクラスのみの保存された領域と相互作用する。ＭＨＣクラスＩＩは、
ＣＤ４との相互作用に起因してＴ_Ｈ細胞によって認識されるが、ＭＨＣクラスＩ
提示は、ＣＤ８との相互作用を介するＴＣ細胞の活性化に制限される。

【０００８】 未処置または初回抗原刺激を受けたＴ細胞の活性化は、規定の機構に従う。内
因性抗原は、ＭＨＣクラスＩ上で提示され、そして可溶性外因性抗原は、ＡＰＣ
によってＭＨＣクラスＩＩ上に提示される。ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラス
ＩＩ抗原複合体は、それぞれＣＤ８またはＣＤ４と相互作用し、また抗原に特異
的なＴ細胞レセプターと相互作用する。この特定の相互作用の際、β−ミクログ
ロブリンおよびＣＤ２８のような二次分子は、次いで適切な免疫応答を及ぼすＴ
細胞の活性化を引き起こす。

【０００９】 感作されたかまたは「初回刺激された」ＣＤ４^＋Ｔ細胞は、Ｂ細胞および種々
のＴ細胞サブセットの活性化および補充に関与するケモカインを生成する。感作
されたＣＤ８^＋Ｔ細胞は、リンホカインに応答して多数増加し、そして適合する
ＭＨＣクラスＩ分子と結合する特異的な抗原性フラグメントを発現するいずれの
細胞も破壊し得る（Ｊｏｎｄａｌら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ５：２９５−３０２（
１９９６））。

【００１０】 腫瘍浸潤リンパ球は、癌性腫瘍が、癌関連抗原または癌特異的抗原を発現し得
る細胞を根絶し得るＣＤ８^＋ＣＴＬを誘導し、それにより、腫瘍の広がりおよび
疾患の発症の進行を制限するという証拠である。しかし、腫瘍は、頻繁に増殖お
よび転移し、この自然の免疫に打ち勝つ。多数の特定の癌に指向される免疫療法
のための種々の方法は、この天然の免疫応答を増強することが示唆されているが
、主な困難性は、ＭＨＣクラスＩを介して可溶性のヒト腫瘍関連抗原または組織
特異的抗原を提示するＡＰＣを誘導することである。近年の実験は、インビトロ
でのＣＴＬの活性化が、インビボでの同系の腫瘍の増殖からの強力な保護を与え
得ることをマウスの系において実証している（Ｆｉｅｌｄｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：９４８２−９４８７（１９９８））。
しかし、マウス免疫系における実験は、ヒト免疫応答を完全に予測するのではな
い。現在のところ、可溶性タンパク質抗原またはタンパク様抗原と共にインキュ
ベートしたＡＰＣを使用して、原発性癌または転移性癌に対する効果的なヒトＣ
ＴＬ免疫療法応答を首尾良く誘発する治療方法は存在しない。

【００１１】 抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、効果的な免疫応答を誘発する際に特に重要である
。定義によると、ＡＰＣは、抗原特異的Ｔ細胞レセプターを有するＴ細胞に対し
て抗原を提示するだけでなく、Ｔ細胞活性化のために必要な全てのシグナルを提
供する。Ｔ細胞活性化に必要なシグナルは、不完全に定義されているが、おそら
く種々の細胞表面分子およびサイトカインまたは増殖因子を含む。さらに、未処
理または初回刺激されていないＴ細胞の活性化に必要な因子は、以前に初回刺激
された記憶Ｔ細胞の再活性化に必要な因子とは異なり得る。Ｔ細胞活性化のため
に抗原を提示しそしてそれと共にそのシグナルを送達するＡＰＣの能力は、補助
細胞機能と一般にいわれる。単球およびＢ細胞は、コンピテントなＡＰＣである
ことが示されているが、インビトロでのこれらの抗原提示能力は、以前に感作さ
れたＴ細胞の再活性化に限定されないようである。従って、これらは、機能的に
未処理または初回刺激されていないＴ細胞集団を直接活性化し得ない。

【００１２】 用語「樹状細胞」は、種々のリンパ様組織および非リンパ様組織において見出
される形態学的に類似の細胞型の多様な集団をいう（Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ａｎｎ
．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：２７１−２９６（１９９１））。これらの細胞
としては、脾臓のリンパ様樹状細胞、上皮のランゲルハンス細胞、および血液循
環中のベール細胞が挙げられる。これらは、これらの形態、高レベルの表面ＭＨ
ＣクラスＩＩ発現、ならびにＴ細胞、Ｂ細胞、単球およびナチュラルキラー細胞
上に発現される特定の他の表面マーカーの非存在に基づいて集団的に分類される
が、樹状細胞が共通の前駆物質に由来するか否か、または同じ様式でＡＰＣとし
て全て機能するか否かは、現在知られていない。樹状細胞は、一次Ｔリンパ球応
答および一次Ｂリンパ球応答を刺激し得る免疫系の最も強力なＡＰＣである（Ｂ
ａｎｃｈｅｒｅａｕら、Ｎａｔｕｒｅ ３９２：２４５−２５２（１９９８））
。

【００１３】 研究によって、多数の供給源由来（ヒト末梢血液由来を含む）のヒトＤＣの単
離および拡大のための方法が記載されている（Ｍａｃａｔｏｎｉａら、Ｉｍｍｕ
ｎｏｌｏｇｙ ７４：３９９−４０６（１９９１）；Ｏ’Ｄｏｈｅｒｔｙら、Ｊ
．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：１０６７−１０７８（１９９３）（単離）；および
Ｍａｒｋｏｗｉｃｚら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８５：９５５−９６１（
１９９１）；Ｒｏｍａｎｉら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：８３−９３（１９
９４）；Ｓａｌｌｕｓｔｏら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：１１０９−１１１
８（１９９４）；Ｂｅｒｈａｒｄら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５：１０９９−
１１０４（１９９５）（拡大））。ＰＣＴ公開ＷＯ９４／０２１５６は、抗原特
異的Ｔ細胞媒介応答を誘導する抗原を提示するヒトＤＣを単離するための方法を
記載する。養子細胞免疫治療および感染性疾患および癌に対する単離されたＤＣ
の使用が述べられている。

【００１４】 黒色腫（Ｎｅｓｔｌｅ，Ｆ．Ｏ．ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：３２８−３３２（
１９９８））；Ｂ細胞リンパ腫（Ｈｓｕ，Ｆ．Ｊ．ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２：５
２−５８（１９９６））；および前立腺癌（Ｍｕｒｐｈｙら、米国特許第５，７
８８，９６３号；Ｍｕｒｐｈｙら、Ｐｒｏｓｔａｔｅ ２９：３７１−３８０（
１９９６）；Ｓａｌｇａｌｌｅｒら、Ｐｒｏｓｔａｔｅ ３５：１４４−１５１
（１９９８））に対する関連抗原を用いてパルスした樹状細胞の使用に関する臨
床試験が開始されている。

【００１５】 外因性抗原プロセシングは、ＭＨＣクラスＩＩ上の抗原提示を生じるが、内因
性プロセシング経路は、ＭＨＣクラスＩを利用する（Ｊｏｎｄａｌら、Ｉｍｍｕ
ｎｉｔｙ，５：２９５−３０２（１９９６））。抗原のＭＨＣクラスＩＩ提示に
よるＴ_Ｈ細胞の活性化は、治療的に成功したが、マウスモデルにおける実験は、
提示がＭＨＣクラスＩによる場合、有意により多くの強力な癌保護が生じること
を示唆する。しかし、マウスモデルにおける成功は、必ずしもヒト細胞を使用す
る成功を予想せず、そしてヒトＡＰＣによる可溶性外因性抗原のＭＨＣクラスＩ
提示の報告は全く存在しない。

【００１６】 ＭＨＣクラスＩ（いくつかの細菌およびウイルス抗原を含む）上に提示される
可溶性抗原の小さいサブグルーブが存在するが、多数の抗原（例えば、外因性可
溶性ヒト腫瘍関連抗原または組織特異的抗原を含む）のＭＨＣクラスＩ提示を確
実に誘導する方法は、報告されている。ＭＨＣクラスＩ上に提示される可溶性抗
原および目的の抗原の融合タンパク質を作製するための技術が開発されているが
、このプロセスは、効果的に実施するための有意な時間および分子操作を必要と
する。外因性抗原のＭＨＣクラスＩプロセシングは、現在の免疫療法において有
意な改善を潜在的に示し得る。

【００１７】 前立腺癌は、アメリカ人男性において現在診断される最も一般的な形態の癌で
ある。これは、成人男性の間での癌の死亡の主要な原因として肺癌に次いで２番
目である。全ての新規に診断された前立腺癌患者のおよそ３分の１が、転移性ま
たは局所的に進行した疾患を提供する。現在、転移性疾患のための利用可能な治
療法（ホルモン、化学療法、および放射線アプローチを含む）は、患者の有意な
割合において、治療的可能性を達成しない。局在化した癌、前立腺切除および放
射線治療を有する患者にとって、現在の処置の基準は、２０％と５０％との間の
失敗率を生じる。進行した疾患において伴われるような、これらの主要な処置の
失敗に対する選択性は、数が少なく、そして臨床的利益において制限されている
。

【００１８】 免疫認識に関与する機構の解明によって、抗癌治療における新しいそして刺激
的なストラテジーが、利用可能である。特に有望なのは、抗腫瘍応答を評価する
樹状細胞（ＤＣ）によって提示された抗原を利用する癌ワクチンである。しかし
、最近の研究によって、細胞性免疫応答を最大化するために、ＤＣの主要組織適
合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩプロセシング区画への可溶性の外因性腫瘍関
連抗原の送達を増強することが重要であることが示されている。本発明は、当該
分野におけるこれらおよび他の必要性を述べる。

【００１９】 （発明の要旨） 本発明は、原発性癌および転移性癌に対する免疫療法応答においてＴ細胞の樹
状細胞活性化のための方法および組成物を提供する。ヒトドナーから得られたＤ
Ｃは、抗原単独によって誘導される応答と比較して、インビボでのＭＨＣクラス
Ｉ関連細胞障害性Ｔ細胞応答を増加するアジュバントと組み合わせて、可溶性の
組織関連抗原、組織特異的抗原、腫瘍関連抗原、または腫瘍特異的抗原への曝露
後、それが必要な癌患者に投与される。あるいは、ＤＣへの曝露に使用された抗
原は、組織関連抗原、組織特異的抗原、または腫瘍関連抗原のフラグメントであ
り得る。１つの実施形態において、ＤＣは、アジュバントおよび可溶性の組織関
連抗原、組織特異的抗原、もしくは腫瘍抗原、またはそれらのフラグメントに同
時に曝露される。この応答は、Ｔ細胞（Ｔ_Ｈ）および細胞障害性Ｔ細胞（Ｔ_Ｃ）
活性化を含む。あるいは、ヒトＴ細胞は、インビトロで前述のＤＣと共に培養さ
れ、そして引き続きインビトロで活性化されたＴ細胞は、それが必要な癌患者に
投与される。

【００２０】 本発明の１つの実施形態において、カルメット−ゲラン菌（ＢＣＧ）（Ｍｙｃ
ｏｂａｃｔｅｒｉａ ｂｏｖｉｓ）は、ＭＨＣクラスプロセシングを得るために
、抗原（すなわち、可溶性の腫瘍もしくは組織特異的タンパク質抗原またはそれ
らの抗原性フラグメント）と共にアジュバントとして使用される。外因性抗原は
、通常、抗原提示細胞（ＡＰＣ）におけるＭＨＣクラスＩＩ区画によって保有さ
れ、そして内因性抗原は、ＭＨＣクラスＩ区画によって保有される。驚くべきこ
とに、本発明は、ＢＣＧのようなアジュバントと共に可溶性抗原（ヒト腫瘍抗原
または組織特異的抗原を含む）を用いてＤＣをパルスする場合、ＭＨＣクラスＩ
提示の増強が生じることを見出した。従って、ＢＣＧのようなアジュバントの存
在は、代表的に、ＭＨＣクラスＩ区画におけるＤＣ可溶性腫瘍抗原プロセシング
を増加し、そして対応して、抗原単独が投与される個体と比較して、より高い割
合のＣＤ８^＋Ｔ細胞を活性化する。

【００２１】 別の実施形態において、ＤＣは、ＢＣＧおよび細菌外毒素（例えば、リポ多糖
（ＬＰＳ））の組み合わせの存在下で、可溶性抗原（ウイルス抗原、細菌抗原、
組織抗原、組織特異的抗原、腫瘍関連抗原、または腫瘍特異的抗原を含む）に曝
露される。１つの実施形態によると、外科的試料から回収された前立腺腫瘍細胞
分解物は、抗原として使用され得る。例えば、前立腺癌患者自身の腫瘍のサンプ
ル（生検または外科的切除において得られる）は、抗原の細胞溶解産物を提供す
るために使用され得る。さらに、精製された前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ、Ｐ
ＳＭ抗原としてもまた知られる）（これは、モノクローナル抗体７Ｅ１１−Ｃ．
５と特異的に反応する）は、抗原として使用され得る。さらなる抗原としては、
組織関連タンパク質抗原、組織特異的タンパク質抗原、腫瘍関連タンパク質抗原
もしくは腫瘍特異的タンパク質抗原（すなわち、ＰＳＭＡ、前立腺ムチン抗原、
前立腺特異的抗原、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、ＰＤ４１抗原などの
ような）が挙げられる。１つの実施形態によると、アミノ酸配列Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｖａｌ（配列番号１）（
ＰＳＭ−１と命名される）（これは、ＰＳＭＡのアミノ酸残基４〜１２に対応す
る）を有する抗原性ペプチドは、抗原として使用され得る。さらに、アミノ酸配
列Ａｌａ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｖａｌ
（配列番号２）（ＰＳＭ−２と命名される）（これは、ＰＳＭＡのアミノ酸残基
７１１〜７１９に対応する）を有する抗原性ペプチドは、抗原として使用され得
る。

【００２２】 別の実施形態によると、ＰＳＭの抗原性ペプチドフラグメントから選択される
抗原性ペプチドは、特定のハプロタイプの結合モチーフと一致する。さらなる実
施形態によると、このペプチドは、ＤＣによって提示されるように選択され、Ｐ
ＳＡの各ペプチドについて示されたハプロタイプと一致しそして特定のハプロタ
イプの結合モチーフと一致している患者のＴ細胞を活性化する。

【００２３】 代替の実施形態において、ＭＨＣクラスＩ抗原ロードＤＣ（上述のように）は
、初回刺激されるかまたは未処理のＴ細胞と共にインビトロでインキュベートさ
れ、関連したＴ細胞応答を活性化する。活性化されたＴ細胞は、免疫療法のため
に引き続いて患者（すなわち、癌）に投与される。いずれかの場合において、Ｄ
Ｃを有利に使用して、例えば、感染または原発性もしくは転移性ヒト癌に対する
応答を阻害する免疫療法増殖を誘発する。特に、このヒト癌は、前立腺癌である
。

【００２４】 別の実施形態において、本発明は、腫瘍細胞増殖阻害応答を生成する方法を提
供し、この方法は、有効量の活性化Ｔ細胞を、それが必要な癌患者に投与する工
程であって、Ｔ細胞がインビトロで活性化される、工程を包含する。インビトロ
活性化は、ＭＨＣクラスＩプロセシングを増強するために、ＬＰＳと組み合わせ
てかまたは組み合わせないのいずれかで、ＢＣＧと組み合わせて、組織関連抗原
、組織特異的抗原、腫瘍関連抗原、腫瘍特異的抗原またはその抗原性フラグメン
トへのヒト樹状細胞の曝露を含む。さらなる実施形態において、本発明は、腫瘍
増殖または癌細胞増殖阻害応答を生成する方法を提供し、この方法は、ＬＰＳと
組み合わせてかまたは組み合わせないのいずれかで、ＢＣＧと組み合わせて、組
織関連抗原、組織特異的抗原、腫瘍関連抗原、腫瘍特異的抗原またはそれらの抗
原性フラグメントへインビボでの曝露された、有効量のヒト樹状細胞を、それが
必要な癌患者に投与する工程を包含し、その結果、投与後に、ヒトＤＣが、腫瘍
もしくは癌細胞に対する、主にＣＤ８^＋Ｔ細胞免疫応答を誘発するかまたは既存
の免疫応答を増強する。

【００２５】 本発明の方法および組成物に有用な抗原は、以下を含むがこれらに限定されな
い；本明細書中に示されるような、患者の生検由来の可溶性抽出物、外科的切除
間に得られた腫瘍細胞由来の可溶性抽出物、腫瘍型に関連する組織関連抗原また
は組織特異的抗原、組換え精製腫瘍抗原、組換え精製組織関連抗原または組換え
精製組織特異的抗原など。

【００２６】 本発明はさらに、特定の実施形態におけるアジュバントおよび関連抗原に曝露
された単離されたヒト樹状細胞を含む組成物を提供し、この樹状細胞は、凍結保
存された単離されたヒト樹状細胞であり、そして原発性癌および／または転移性
癌に対する免疫治療応答を誘発するために有用である延長した寿命のヒト樹状細
胞である。

【００２７】 （発明の詳細な説明） 本発明は、抗原に対する免疫治療応答のためにＴ細胞を活性化する樹状細胞（
ＤＣ）の使用についての方法および組成物を提供する。この抗原は、ウイルスも
しくは細菌の抗原、組織抗原、腫瘍関連抗原、または他の、例えば、原発性癌も
しくは転移癌に関連する抗原を含む、任意の抗原であり得る。ヒトドナーから得
たＤＣを、患者に投与して、インビボにおいて関連するＴ細胞応答を活性化し、
引き続いて、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ処理を促進する因子
または薬剤と組み合わせて、ウイルス、細菌、または組織関連抗原、組織特異的
な抗原、腫瘍もしくは癌に関連する抗原、または腫瘍特異的な抗原に曝露する。
この抗原は、上記の抗原の１つのフラグメントであり得る。さらに、そして必要
に応じて、この方法および組成物は、ＤＣ成熟を誘導する。抗原単独で提供され
たのと比べて、少なくとも２５％、そして５０％をさらに上回るＴ細胞が、Ｔ細
胞のＤＣ活性化を促進するように作用する因子または薬剤は、ＣＤ８^＋である。
あるいは、ＤＣを、インビトロにおいてＭＨＣクラスＩ処理およびＤＣの成熟を
促進する因子とともに、組織特異的抗原、癌抗原、またはいずれかの抗原の抗原
性フラグメントに曝露し、そして引き続いてプライムされたＴ細胞またはプライ
ムされていないＴ細胞とともにインキュベートされて、インビトロにおいて関連
のＴ細胞応答を活性化する。次いで、この活性化Ｔ細胞を、それが必要な癌患者
に投与する。いずれの場合においても、ＤＣを有利に使用して、原発性または転
移性の癌腫瘍に対する応答を阻害する免疫治療的増殖を惹起する。

【００２８】 単に説明を簡単にするために、本発明の詳細な説明を、以下の節に分ける：（
１）抗原の供給源、（２）樹状細胞（寿命が延びたＤＣまたは凍結保存ＤＣを含
む）を入手するかまたは単離するための方法；および（３）インビトロおよびイ
ンビボにおいて、ウイルス、細菌、または癌に対して細胞傷害性Ｔ細胞およびヘ
ルパーＴ細胞を刺激するためのＤＣの適用または使用方法。

【００２９】 抗原反応性Ｔ細胞は、癌を含む抵抗性の疾患において重要である抗原特異的エ
フェクター細胞である。抗原反応性Ｔ細胞、ＣＤ８^＋は、ＭＨＣクラスＩ分子に
よって提示された抗原を認識する。ＭＨＣクラスＩ分子は、ほぼ全ての細胞型で
発現される。抗原反応性Ｔ細胞、ＣＤ４^＋は、ＭＨＣクラスＩＩ分子によって提
示される抗原を認識する。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、樹状細胞、内皮細胞、単球
、マクロファージ、およびリンパ球を含む種々の細胞型において発現される。抗
原反応性Ｔ細胞が、標的細胞を殺傷する能力は、抗原性因子および遺伝的因子に
よって制限される。標的細胞の溶解のために、標的細胞は、もともとＴ細胞の刺
激を誘導したのと同じ抗原、およびこのＴ細胞と同じクラスのＭＨＣ分子を保有
しなければならない。

【００３０】 本発明は、疾患または障害（例えば、ウイルスもしくは細菌感染、または癌）
の予防または処置において用いられ得る抗原に対して反応性のＴ細胞を生成する
方法に関する。本発明は、ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ Ｇｕｅｒｉｎ
（ＢＣＧ）が、ＭＨＣクラスＩ処理した外因性の可溶性抗原を刺激し、引き続い
て抗原単独を投与された個体と比べて、ＣＤ８^＋Ｔ細胞の優先的な活性化を少な
くとも２５％に、そしてさらに活性化合物Ｔ細胞集団の５０％より大きく増大す
るという驚くべき発見によって可能になった。ＣＤ８^＋Ｔ細胞の割合は、２５％
、５０％、それ以上まで増大し得、そして総Ｔ細胞応答の７５％より大きくさえ
なり得る。

【００３１】 代替的実施形態として、ウイルス、細菌、組織関連抗原、組織特異的抗原、腫
瘍関連もしくは腫瘍特異的抗原、またはそれらの抗原性フラグメントを有するＢ
ＣＧは、抗原反応性Ｔ細胞増殖を再刺激するためにインビトロ培養に複数回、添
加され得る。本発明の方法によって生成される抗原反応性Ｔ細胞は、感染細胞も
しくは癌細胞、または他の標的細胞（場合によっては）、または同じ抗原および
類似のＭＨＣ分子（これでＴ細胞が準備される）を保有する任意の細胞を、特異
的に、標的化、殺傷、または溶解し得る。本発明の抗原反応性Ｔ細胞はまた、１
つ以上の測定可能サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−β、
ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−３、および／ま
たはＧＭ−ＣＳＦ）を分泌し得る。これらのサイトカインの生成を用いて、イン
ビトロにおける特異的なＴ細胞活性化をモニターし得る。

【００３２】 以前には、ＢＣＧは、標的免疫原に対する血清学的または抗体免疫応答を増大
するためのアジュバントとして作用するための種々のワクチン組成物の成分とし
て用いられてきた。さらに、樹状細胞は、ＢＣＧミコバクテリアを含む粒子を内
部移行することが示されている（Ｉｎａｂａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：
４７９〜４８８（１９９３））。ミコバクテリア積載樹状細胞は、プライムされ
たＴ細胞、次いでＢＣＧのパルスに曝露される成熟樹状細胞の対応する培養物に
抗原を提示するのがさらに強力であることが示されている。（Ｉｎａｂａら、前
出、（１９９３））。

【００３３】 ＢＣＧによる樹状細胞活性化は、ホモタイプ凝集、表面抗原の上方制御、エン
ドサイトーシス活性の下方調節、および腫瘍壊死因子αの放出に関与すると特徴
付けられている。（Ｔｈｕｒｎｈｅｒら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ７０：１
２８〜１３４（１９９７））。樹状細胞成熟抗原ＣＤ８３およびＴ細胞同時刺激
因子であるＣＤ８６（Ｂ７−２）について、増強した発現が証明されている。Ｔ
ＮＦ−αの分泌の誘導は、少なくとも部分的には、ＢＣＧの取り込み後の樹状細
胞において観察された表現型変化および機能的変化の原因であったことが示され
た。ＩＬ−８ ｍＲＮＡ発現およびＩＬ−８タンパク質分泌の刺激はまた、ＢＣ
ＧのＴ細胞効果と関連していた。（Ｒａｍｏｎｅｒら、Ｊ．Ｕｒｏｌｏｇｙ １
５９：１４８８〜１４９２（１９９８））。

【００３４】 今日まで、ＢＣＧは、種々の抗原（癌細胞および癌関連抗原を含む）と組み合
わせて投与されてきたが、ＢＣＧと組み合わせた組織特異的抗原、またはＢＣＧ
およびＭＨＣクラスＩ応答を誘導するＬＰＳで活性化された樹状細胞に曝露され
た場合、ＣＤ８^＋Ｔ細胞の優先的な活性化の実証または認識はなかったようであ
る。

【００３５】 抗原反応性Ｔ細胞は、自系に（すなわち、Ｔ細胞（またはこのＴ細胞の親細胞
）が起源したのと同じ個体に）、または同系に（すなわち、癌または感染した細
胞が最初に得られた個体の一卵性双生児に）；または同種異系に（抗原性細胞お
よびＴ細胞がもともと得られた個体と少なくとも１つの共通のＭＨＣ対立遺伝子
を共有する個体に）インビボで投与され得る。

【００３６】 本明細書において用いる場合、用語「抗原性細胞」とは、被験体において免疫
応答を惹起し得る、任意の細胞、代表的には感染した細胞、または癌細胞、そし
て詳細には、前立腺癌細胞をいう。抗原性細胞の供給源、および本発明の方法に
おける使用のための抗原性細胞の調製の方法を、本節において考察している。

【００３７】 本明細書において用いる場合、用語「パルスした（ｐｕｌｓｅｄ）」とは、イ
ンビトロでの免疫のプロセスを含む。インビトロ免疫のプロセスは、以下を含む
がこれに限定されない種々の方法で実施され得る：抗原でパルスされた樹状細胞
（ＳｔｅｅｌおよびＮｕｔｍａｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：３５１〜３６
０（１９９８）；Ｔａｏら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：４２３７〜４２４４
（１９９７）；ＤｏｚｍｏｒｏｖおよびＭｉｌｌｅｒ，Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．１７８：１８７〜１９６（１９９７）；Ｉｎａｂａら，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ
．１６６：１８２〜１９４（１９８７）；Ｍａｃａｔｏｎｉａら，Ｊ．Ｅｘｐ
Ｍｅｄ．１６９：１２５５〜１２６４（１９８９）；Ｄｅ Ｂｒｕｉｊｎら、Ｅ
ｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：３０１３〜３０２０（１９９２））、ペプチ
ドでロードされたＲＭＡ−Ｓ細胞（多数の「空の」細胞表面クラスＩ ＭＨＣ分
子を発現する変異細胞）（Ｄｅ Ｂｒｕｉｊｉｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．２１：２９６３〜２９７０（１９９１）；Ｄｅ Ｂｒｕｉｊｎら，Ｅｕｒ．
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：３０１３〜３０２０（１９９２）；Ｈｏｕｂｉｅｒ
ｓら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：２０７２〜２０７７（１９９３））
、およびマクロファージ食作用ペプチドロードされたビーズ（Ｄｅ Ｂｒｕｉｊ
ｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：１２７４〜１２８５（１９９５））
、および浸透圧的に抑制された抗原性細胞（ＰＣＴ公開ＷＯ９８／１５６１６）
。従ってプライミングはまず、抗原性分子に対してナイーブな免疫細胞の曝露を
生じる。

【００３８】 本明細書において用いる場合、用語「パルスする（ｐｕｌｓｉｎｇ）」とは、
プライムされた免疫細胞をインビトロでＢＣＧ、あるいはＢＣＧおよびＬＰＳ、
ならびに、ウイルス抗原、細菌抗原、組織特異的抗原、腫瘍抗原、またはこの抗
原の抗原性フラグメントに曝露するプロセスをいう。ＢＣＧおよびウイルス抗原
、細菌抗原、組織特異的、または腫瘍関連抗原とは、本明細書において用いる場
合、ＢＣＧおよび抗原性分子の非共有的混合物を含む。

【００３９】 用語、「抗原」および「抗原性分子」とは、本明細書において用いる場合、免
疫治療のためにＴ細胞を活性化する、樹状細胞による提示のために有用な、ウイ
ルス、細菌、組織関連もしくは組織特異的および腫瘍関連もしくは腫瘍特異的タ
ンパク質抗原を含む。詳細には、感染するウイルスもしくは細菌、または前立腺
細胞もしくは前立腺関連抗原（すなわち、前立腺腫瘍脈管構造におけるＰＳＭＡ
）に対する免疫応答を発達させるために。

【００４０】 １つの実施形態に従って、外科標品から回収した前立腺腫瘍細胞溶解産物を、
抗原として用い得る。例えば、生検または外科切除で得た、癌患者自身の腫瘍の
サンプルを、抗原の細胞溶解産物を提供するために用い得る。あるいは、前立腺
癌患者の腫瘍細胞の膜調製物を用い得る。

【００４１】 なお別の実施形態に従って、モノクローナル抗体７Ｅ１１−Ｃ．５と特異的に
反応する（一般的には、Ｈｏｒｏｓｚｅｗｉｃｚら、Ｐｒｏｇ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｒｅｓ．３７：１１５〜１３２（１９８３）、米国特許第５，１６２，５
０４号、米国特許第５，７８８，９６３号、Ｆｅｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ａｓ
ｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．３２：（Ａｂｓ．１４１８）２３８（１９９１
）を参照のこと）、精製した前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ、ＰＳＭ抗原として
も公知）を、抗原として用い得る。ＰＳＭＡ抗原をコードする遺伝子のクローニ
ングは、Ｉｓｒａｅｌｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４：１８０７〜１８１１
に記載されている。例えば、酵母細胞における、クローニングされた遺伝子の発
現により、本発明による使用のためのＰＳＭＡ抗原の即座に使用できる供給源が
提供され得る。

【００４２】 さらになお別の実施形態において、ＰＳＭＡのアミノ酸残基４〜１２に相当す
る、アミノ酸残基配列Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｓｅ
ｒ Ａｌａ Ｖａｌ（配列番号１）を有する抗原性ペプチド（ＰＳＭ−Ｐ１と命
名）を、抗原として用い得る。別の実施形態に従って、ＰＳＭＡのアミノ酸残基
７１１〜７１９に相当する、アミノ酸残基配列Ａｌａ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｖａｌ（配列番号２）を有する抗原性ペプ
チド（ＰＳＭ−Ｐ２と命名）を、抗原として用い得る。

【００４３】 別の実施形態に従って、アミノ酸残基配列Ｘａａ Ｌｅｕ（またはＭｅｔ）Ｘ
ａａ Ｘａａ Ｘａａ Ｘａａ Ｘａａ Ｘａａ Ｖａｌ（またはＬｅｕ）を有
する抗原性ペプチド（ＰＳＭ−ＰＸと命名）（ここで、Ｘａａは、任意のアミノ
酸残基を示す）を、抗原として用い得る。このペプチドは、ＨＬＡ−Ａ０２０１
結合モチーフ（すなわち、ＨＬＡ−Ａ２患者において見出された「アンカー残基
」ロイシン（Ｌｅｕ）およびバリン（Ｖａｌ）を有する９〜１０アミノ酸残基の
結合モチーフ）と似ている（Ｇｒｅｙら、Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｒｖｅｙｓ ２２
：３７〜４９（１９９５））。このペプチドを代表的にＨＬＡ−Ａ２^＋患者のた
めの抗原として用いる。（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｃｏ
ｍｍｉｔｔｅｅ「Ａｌｌｅｌｅ Ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ」、セクション６．３
、Ｔｓｕｊｉ，Ｋら（編）、Ｔｏｋｙｏ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、
第１０６６〜１０７７頁を参照のこと）。

【００４４】 なお別の実施形態において、表１Ａ（下記）に列挙されるペプチドから選択し
た抗原性ペプチドは、抗原として用いられ得る。表１Ａに列挙されるペプチドは
、ＰＳＭのフラグメントに相当するアミノ酸残基配列を有し、そして特定のハプ
ロタイプの結合モチーフに適合していた。１つの実施形態に従って、このペプチ
ドは、樹状細胞によって提示されて、表１Ａにおける各ペプチドに示されたハプ
ロタイプに適合した患者のＴ細胞を活性化するように選択される。

【００４５】 （表１Ａ） （ＰＳＭペプチド^＊）

【００４６】

【表１】 ^＊「ＰＳＭペプチド」とは、ＰＳＭＡのフラグメントに対応するアミノ酸配列（
ａ／ｋ／ａ ＰＳＭ）を有するペプチドをいう。^＊＊ 「最初のアミノ酸残基」とは、このペプチドの最初のアミノ酸が対応するＰ
ＳＭのアミノ酸の残基番号をいう。

【００４７】 本発明の別の実施形態において、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）（Ｐｅｐｓｉｄ
ｅｒｏら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４０：２４２８〜２４３２（１９８０）；Ｍ
ｃＣｏｒｍａｃｋら、Ｕｒｏｌｏｇｙ ４５：７２９〜７４４（１９９５））を
抗原として用い得る。

【００４８】 別の実施形態に従って、表１Ｂ（下記）に列挙したペプチドから選択した抗原
性ペプチドを、抗原として用い得る。表１Ｂにおけるペプチドは、ＰＳＡのフラ
グメントに対応するアミノ酸残基配列を有し、そして表１Ｂに示される特定のハ
プロタイプの結合モチーフに適合していた。１つの実施形態に従って、このペプ
チドは、樹状細胞によって提示されて、表１Ｂにおける各ペプチドについて示さ
れたハプロタイプに適合する患者のＴ細胞を活性化する。

【００４９】 （表１Ｂ） （ＰＳＡペプチド^＊）

【００５０】

【表２】 ^＊「ＰＳＭペプチド」とは、ＰＳＡのフラグメントに対応するアミノ酸配列を有
するペプチドをいう。^＊＊ 「最初のアミノ酸残基」とは、このペプチドの最初のアミノ酸が対応するＰ
ＳＡのアミノ酸の残基番号をいう。

【００５１】 なお別の実施形態に従って、モノクローナル抗体ＰＤ４１によって認識され、
Ｗｒｉｇｈｔ（米国特許第５，２２７，４７１号および同第５，３１４，９９６
号；Ｂｅｃｋｅｔｔら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１：１３２６〜１２２２（１
９９１））に記載される、前立腺ムチン抗原を、抗原として用い得る。あるいは
、ハイブリドーマ細胞株ＡＴＣＣ ＨＢ １１０９４によって生成された抗体に
結合する抗原を含み、そしてＰＤ４１ムチン抗原を発現する、前立腺腫瘍細胞の
粗溶解産物を、抗原として用い得る。

【００５２】 本発明の方法において用いられ得るさらなる前立腺抗原としては、以下が挙げ
られるがこれらに限定されない：前立腺の６回膜貫通上皮抗原（ＳＴＥＡＰ；Ｈ
ｕｂｅｒｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：１４５
２３〜１４５２８（１９９９））、前立腺癌腫瘍抗原（ＰＣＴＡ−１；Ｓｕら、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：７２５２〜７２５７（
１９９６））；前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ；Ｒｅｉｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１７３５〜１７４０（１９９８））。
各抗原の抗原性フラグメントもまた、本発明の範囲に包含されると考えられる。

【００５３】 さらなる抗原としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ウイルス
中和抗原、または抗原性ペプチド。さらに、細菌タンパク質、糖タンパク質、糖
脂質、または炭水化物、およびそれらの抗原性フラグメントは、本発明の一部で
あると考えられる。

【００５４】 本発明に従って、細胞性免疫療法は、１つ以上の個体、より代表的には同じ被
験体から抗原性細胞および免疫細胞を得ることによって、そして本発明の方法に
よって免疫細胞集団内でＴ細胞を刺激することによって、進展される。このＴ細
胞のインビトロ刺激、続く、抗原反応性ＣＤ４^＋および／またはＣＤ８^＋Ｔ細胞
の細胞培養におけるクローン増殖、ならびに被験体への抗原反応性Ｔ細胞の投与
が、有用な治療および予防のストラテジーを構成する。被験体に注入された場合
、本発明の抗原反応性Ｔ細胞は、抗原性細胞と同じ抗原を保有する標的細胞を、
インビボで、特異的に標的するか、そして／または直接的に殺傷し、これによっ
て癌の発達および／または腫瘍細胞増殖を阻害するか、またはレシピエントにお
ける病原因子の伝播を防止もしくは制限し得る。

【００５５】 本発明の１つの実施形態では、抗原性細胞、活性化されるべきＴ細胞および抗
原反応性Ｔ細胞のレシピエントは、同じＭＨＣ（ＨＬＡ）ハプロタイプを有する
。別の実施形態では、本発明は、Ｔ細胞（またはより代表的には全ての免疫細胞
）および抗原を最初に誘導した同じ被験体における、癌の処置、腫瘍細胞増殖の
阻害または癌の発達の予防のために自己由来抗原を用いてインビトロで刺激され
た自己Ｔ細胞の使用に関する。１つの特定の局面では、免疫細胞および抗原性細
胞は、細胞免疫治療の必要性があるヒト被験体から単離される。

【００５６】 本発明の別の実施形態では、Ｔ細胞およびレシピエントは、同じハプロタイプ
を有し、一方、抗原性細胞はＴ細胞およびレシピエントに対して同種異系である
が、少なくとも１つのＭＨＣ対立遺伝子が一致する。すなわち、抗原性細胞は、
Ｔ細胞を活性化するために用いられ、このＴ細胞は次いで、Ｔ細胞を最初に得て
、かつ抗原性細胞およびＴ細胞が少なくとも１つだが全てではないＭＨＣ対立遺
伝子を共有するレシピエントに投与される。本発明のそれほど代表的ではない実
施形態では、抗原性細胞、Ｔ細胞およびレシピエントは全て互いに関して同種異
系であるが、全てが、抗原性細胞、Ｔ細胞およびレシピエントの間で共有される
少なくとも１つの共通のＭＨＣ対立遺伝子を有する。

【００５７】 本発明に従って、抗原反応性Ｔリンパ球を作製するための方法は、生の免疫細
胞をプライミングし、プライミングした免疫細胞にＢＣＧおよび組織関連抗原、
組織特異的抗原、腫瘍関連抗原または腫瘍特異的抗原（ＬＰＳを有するかまたは
有さない）をパルスし（ここで、免疫細胞は、ＡＰＣ（例えば、樹状細胞である
がこれに限定されない）である）、そしてこのプライミングされたＴ細胞をパル
スされた細胞とともに共存培養することを含む。１つの実施形態では、プライミ
ングされた免疫細胞は、パルスする前にＡＰＣについて富化される。別の実施形
態では、プライミングされた免疫細胞は分離されて、富化または精製されたＴ細
胞集団またはＡＰＣ集団が作製される。特定の実施形態では、プライミングされ
た免疫細胞は分離されて、パルスする前に富化または精製されたＣＤ４^＋Ｔ細胞
集団が作製される。パルスされた細胞のＴ細胞との共存培養は、特定のＴ細胞の
刺激を導き、このＴ細胞は、ぞれぞれ、抗原反応性ＣＤ４^＋Ｔ細胞または抗原反
応性ＣＤ８^＋Ｔ細胞へと成熟する。

【００５８】 いずれの特定の化学的モデルまたは機構に対しても本発明を限定しないが、本
明細書中に記載された結果は、ＡＰＣを含むパルスされた免疫細胞（ウイルス性
抗原、細菌性抗原、組織関連抗原もしくは組織特異的抗原、腫瘍関連抗原もしく
は腫瘍特異的抗原、または上記で示したようなそれらの抗原性フラグメントでパ
ルスされた細胞）を伴うＢＣＧが、ウイルス、細菌細胞、感染細胞または腫瘍細
胞に対してインビトロでＣＤ８^＋Ｔ細胞の特異的活性化を誘導することを独自に
可能にされることを示唆する。本明細書中に記載される結果はさらに、成熟促進
因子を添加して免疫応答の持続期間を増強し得ることを示唆する。ＢＣＧは、エ
ンドサイトーシスからの抗原の排除に付随して、表面成熟マーカーＣＤ８３およ
びＣＤ８６のＤＣ発現を増大させるのに役立つ。さらに、リポ多糖（ＬＰＳ）も
また、エンドサイトーシス活性をダウンレギュレートし、そしてＤＣの成熟を促
進し、免疫応答の持続期間を潜在的に増大させる。

【００５９】 本発明の別の実施形態では、この方法はさらに、抗原反応性Ｔ細胞をフィーダ
ー細胞および照射抗原性細胞とともに、必要に応じて１以上のサイトカイン（例
えば、精製されたＩＬ−２、コンカナバリンＡ刺激脾臓細胞上清）を含む組成物
の存在下で培養することによる、インビトロでの抗原反応性Ｔ細胞の再刺激を含
み得る。培養物へのＡＰＣおよび可溶性の外因性抗原（すなわち、ウイルス性抗
原、細菌性抗原、腫瘍関連抗原もしくは組織特異的抗原、またはいずれかの抗原
の抗原性フラグメント）を伴うＢＣＧの添加によるインビトロでのＴ細胞の再刺
激を用いて、Ｔ細胞集団の増殖を促進し得る。

【００６０】 別の実施形態では、Ｔ細胞は、ＢＣＧおよびウイルス性抗原、細菌性抗原、組
織特異的抗原もしくは腫瘍抗原またはいずれかの抗原の抗原性フラグメント（Ｌ
ＰＳを有するかまたは有さない）の存在下で、末梢血から精製された照射された
脾臓細胞またはＡＰＣをフィーダー細胞として用いて刺激される。このようにし
て、時々再刺激することによって、安定な抗原特異的なＴ細胞培養物またはＴ細
胞株が、長期間にわたってインビトロで維持され得る。このようにして作製され
たＴ細胞培養物またはＴ細胞株は保存され得、そして（例えば、低温保存剤（ｃ
ｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅ）を用いた処方および冷凍によって）貯蔵され
る場合、これを用いて抗原反応性Ｔ細胞を長期の使用のために所望の間隔で再度
供給し得る。

【００６１】 本発明の特定の実施形態に従って、抗原反応性ＣＤ８^＋Ｔ細胞が作製され得、
そしてこれを予防的に用いて腫瘍の進行（ウイルス、細菌または腫瘍細胞の増殖
）もしくは発達を妨げ得るか、または癌の寛解を誘導し得る。抗原反応性ＣＤ４^＋ Ｔ細胞がまた作製され得、そしてこれを予防的に用いて腫瘍の進行もしくは発
達（腫瘍細胞の増殖）を妨げ得るか、または癌の寛解を誘導し得る。別の実施形
態では、Ｔ細胞は治療的に用いられて癌を処置し得る。代表的に、抗原反応性Ｔ
細胞を作製するために用いられる抗原性細胞は、この抗原性細胞が投与されるべ
き被験体に対して同系である（例えば、この被験体から入手される）。しかし、
被験体に対して同系である抗原性細胞が使用のために利用可能でない場合、本発
明の方法は、その細胞の意図されるレシピエントと同じＨＬＡハプロタイプを有
するような抗原性細胞が、レシピエントから収集された非癌性細胞（例えば、正
常細胞）を用いてインビトロで調製され得ることを提供する。なお別の実施形態
では、腫瘍細胞の溶解産物または調製物は、本発明の抗原反応性Ｔ細胞の再刺激
のために使用され得る。

【００６２】 別の実施形態では、例えば、発癌物質（例えば、化学物質）および／もしくは
放射線での処理またはトランスフォーミングウイルスの感染によって正常細胞を
誘導して、癌性またはトランスフォーム型にし得、次いで直接的にパルスするた
めにこれを使用し得るか、またはこれを使用して、ＢＣＧとの組合せもしくはＬ
ＰＳと組み合わせたＢＣＧとの組合せで樹状細胞をパルスするための溶解産物を
調製し得る。

【００６３】 別の実施形態では、このような組織関連または組織特異的；癌性またはトラン
スフォームされた細胞などの溶解産物または調製物を用いて、免疫細胞またはＡ
ＰＣをインビトロでパルスし得る。なお別の実施形態では、このような細胞の溶
解産物または調製物は、本発明の抗原反応性Ｔ細胞の再刺激のために用いられ得
る。

【００６４】 さらに、別の実施形態では、目的の抗原のクローニングされた遺伝子が利用可
能である場合、被験体由来の正常細胞は、この遺伝子で形質転換またはトランス
フェクトされ得、その結果、目的の抗原はこの細胞において組換え的に発現され
、次いでこのような細胞は、プライミング反応、パルス反応および／または再刺
激反応において用いられ得る。それほど代表的でない局面では、使用するための
抗原性細胞は、同系ではないが、意図されるレシピエントと共通の少なくとも１
つＭＨＣ対立遺伝子を有する細胞から調製され得る。

【００６５】 免疫応答では、抗原誘導性Ｔ細胞活性化のプロセスは、インビボで、代表的に
は二次リンパ組織（例えば、リンパ節および脾臓）で生じる。本発明に従うこと
によって、目的の任意の抗原性細胞を用いて、Ｔ細胞をインビトロでプライミン
グし得、能動免疫における使用が安全ではないと考えられている癌細胞または感
染細胞でさえもプライミングし得る。次いで、このようなプライミングされたＴ
細胞は、ウイルス性抗原、細菌性抗原、組織特異的抗原、腫瘍抗原、またはいず
れかの抗原の抗原性フラグメントおよびＢＣＧでパルスされたＡＰＣに暴露され
る。特定の実施形態では、ＣＤ８^＋抗原反応性Ｔ細胞は、免疫治療のための細胞
供給源としてインビトロで増やされる。従って、本発明の１つの利点は、抗原特
異的Ｔ細胞がインビトロで増やされて、疾患の処置または予防のために使用され
得る、免疫治療のための細胞供給源を作製し得ることである。

【００６６】 本発明によって提供されるように、免疫治療の多くの利点が存在する。腫瘍塊
は、手術後に最小であり、そして免疫治療はこの状況において最も有効である。
特定の実施形態では、本発明の方法は、手術前または手術後のいずれかで癌患者
の免疫能を増強し、そして癌細胞に対する細胞媒介性腫瘍特異的免疫を増強する
ことに関し、この目的は、癌細胞の増殖の阻害および身体中の残りの癌細胞の全
体的根絶である。別の局面では、ヒト癌細胞に対して反応性の抗原反応性Ｔ細胞
は、単独で、または手術、化学療法、放射線治療もしくは他の抗癌治療と組み合
わせて用いられて、転移物または微小転移物を根絶し得るか、または骨髄移植の
間に骨髄から癌細胞を除去し得る。例えば、転移物または微小転移物の増殖を根
絶または阻害するために、本発明によって提供される抗原反応性Ｔ細胞（代表的
に、ＣＤ３^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞またはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞）は、転移物もしく
は微小転移物を有するかまたは転移物もしくは微小転移物を有することが疑われ
る被験体にインビボで投与される。

【００６７】 例示として、骨髄移植の間に骨髄から癌細胞を除去するために、ドナー由来の
骨髄を、本発明によって提供される抗原反応性Ｔ細胞とインビトロで接触させ、
その結果、この抗原反応性Ｔ細胞は、骨髄中のあらゆる残りの癌細胞を溶解し、
その後、この骨髄は、被験体に、造血再構築の目的で投与される。骨髄移植は代
表的に自己性である。１つの実施形態では、抗原反応性Ｔ細胞は、ＣＤ３^＋ＣＤ
８^＋Ｔ細胞またはＣＤ３^＋ＣＤ４＋Ｔ細胞である。あるいは、抗原反応性Ｔ細胞
の投与は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞およびＣＤ８^＋Ｔ細胞の両方を含む。

【００６８】 さらに、癌患者が麻酔をして手術を受け、続いて化学療法を受ける場合、患者
が経験する、得られる免疫抑制は、手術前の期間における細胞免疫治療によって
低下され得、それによって、感染合併症の発生数を低下させ得る。腫瘍細胞が手
術時に循環中に脱落し、従ってこの時点で適用される有効な免疫治療がこれらの
細胞をインビボで除去し得る可能性もまた存在する。従って、本発明は、予防ま
たは処置の方法を提供し、この方法は、癌患者が受ける手術および／または化学
療法の前、その間、および／またはその後に、この患者の癌細胞の抗原に対して
反応性の、本発明によって提供される抗原反応性Ｔ細胞をこの癌患者に投与する
工程を包含する。

【００６９】 多数の抗原または抗原性組成物が、本発明に従って、免疫治療のためにＴ細胞
を活性化するＤＣによる提示のために有用である。１つの実施形態では、手術標
本から回収された前立腺癌腫瘍細胞溶解産物は、抗原として用いられる。例えば
、生検でまたは手術切除で入手された癌患者自体の腫瘍のサンプルは、抗原につ
いての細胞溶解産物を提供するために用いられ得る。あるいは、癌患者（例えば
、前立腺癌患者）の腫瘍細胞または確立された細胞株の膜調製物は、抗原として
用いられ得る。本発明の方法において有用なさらなる抗原（ウイルス性抗原およ
び細菌性抗原を含む）は、上記で詳細に考察される。

【００７０】 本発明に従って、ＤＣは、ＤＣを所望のウイルス性抗原、細菌性抗原、組織関
連抗原もしくは組織特異的抗原、前立腺癌関連抗原、またはこれらの抗原の抗原
性フラグメントとともにインビトロ培養培地中でインキュベートすることによっ
て、これらの抗原に暴露され得る。１つの実施形態では、ＢＣＧ単独と組み合わ
せたか、またはＢＣＧおよびＬＰＳと組み合わせた、水性の可溶性形態または水
性の懸濁形態の抗原は、細胞培養培地に添加される。本明細書中に実証されるよ
うに、ＤＣは、ＭＨＣ−クラスＩに関連してＴ細胞に対する好首尾の提示のため
に抗原を有利に取り込む。

【００７１】 別の実施形態では、抗原は、飲細胞小胞の浸透圧溶解およびｐＨ感受性リポソ
ームの使用などを含むがそれらに限定されない代替方法によってＤＣの細胞質ゾ
ルへ導入される。一般に、（Ｏｋａｄａら，Ｃｅｌｌ ２９：３３（１９８２）
；Ｐｏｓｔｅら，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１４：３３（１９７６
）；Ｒｅｄｄｙら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １４１：１５７（１
９９１））を参照のこと。

【００７２】 （樹状細胞の単離） ヒト樹状細胞（ＤＣ）は、これらが存在する任意の組織（非リンパ組織（例え
ば、皮膚の表皮（ランゲルハンス細胞））およびリンパ組織（例えば、脾臓、骨
髄、リンパ節および胸腺）を含む）から入手される。ＤＣはまた、血液（血液Ｄ
Ｃ）およびリンパ（ベール細胞）を含む循環器系からも単離され得る。ヒト末梢
血は、ヒトＤＣの容易に利用できる即座の供給源であり、そして本発明の特定の
実施形態による供給源として用いられる。臍帯血は、ヒトＤＣの別の供給源であ
り、前立腺癌についての高い危険性がわかっている家族に子供が生まれた場合、
臍帯血は、必要な場合、後の使用のために低温保存され得るＤＣの供給源として
用いられ得る。

【００７３】 ＤＣは、ＤＣが存在するいずれの組織（ヒト末梢血を含む）でも少数で生じる
ので、ＤＣは、使用のために富化または単離されなければならない。反復した密
度勾配分離、ポジティブ選択、ネガティブ選択またはそれらの組合せを伴う多数
の手順のうちのいずれかを用いて、富化された集団または単離されたＤＣを入手
し得る。ヒト末梢血からＤＣを単離するためのこのような方法の例としては、以
下が挙げられる：（Ｏ’Ｄｏｈｅｒｔｙら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：１０
６７−１０７８（１９９３）；ＹｏｕｎｇおよびＳｔｅｉｎｍａｎ，Ｊ．Ｅｘｐ
．Ｍｅｄ．１７１：１３１５−１３３２（１９９０）；Ｆｒｅｕｄｅｎｔｈａｌ
およびＳｔｅｉｎｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８
７：７６９８−７７０２（１９９０）；Ｍａｃａｔｏｎｉａら，Ｉｍｍｕｎｏｌ
．６７：２８５−２８９（１９８９）ならびにＭａｒｋｏｗｉｃｚおよびＥｎｇ
ｌｅｍａｎ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８５：９５５−９６１（１９９０）
）。ヒツジ赤血球および／またはウシ胎児血清への細胞の暴露を回避する、ヒト
末梢血からＤＣを単離するための方法は、ＰＣＴ公開ＷＯ９４／０２１５６に記
載されている。リンパ組織からＤＣを単離するための方法の一例は、（Ｍａｃａ
ｔｏｎｉａら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６９：１２５５−１２６４（１９８９）
）に記載されている。

【００７４】 一旦、ＤＣが入手されたら、これらは適切な培養培地中で培養されて、細胞集
団へと増殖されるか、ならびに／または最適な抗原取り込み、プロセシングおよ
び提示のための状態にＤＣが維持される。

【００７５】 インビトロ培養においてＤＣの適切な状態の「成熟度」の維持もまた提供する
、１つの実施形態は、ＤＣを、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ
−ＣＳＦ）およびインターロイキン４（ＩＬ−４）の両方の存在下で培養するこ
とである。１つの例では、各々約５００単位／ｍｌの濃度でのＧＭ−ＣＳＦとＩ
Ｌ−４との組合せである。近年の研究は、成熟ＤＣに対する「未成熟」ＤＣによ
る最適な抗原提示を明らかにする（Ｋｏｃｈら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：
９３−１００（１９９５））。未成熟ＤＣは、本発明の特定の実施形態に従って
用いられ得る。近年の実験は、成熟したパルスされたＤＣが、Ｔ細胞応答を刺激
する能力を、未成熟なパルスされたＤＣよりも１０倍まで長く保持することを示
した。

【００７６】 以下の実施例に例示されるように、ヒトＤＣを前立腺癌患者の末梢血から単離
し、そして約５日間のインビトロ培養の後、前立腺癌特異的Ｔ細胞とコンピテン
トであり、かつ前立腺癌特異的Ｔ細胞を活性化し得るＤＣを回収した。本発明の
１つの実施形態に従って、ＤＣは、処置されるべき癌患者から入手される。この
ＤＣは、ＬＰＳを伴うかまたは伴わないＢＣＧの存在下で、本明細書中に提供さ
れる種々の抗原のうちの１つでパルスされ、次いで、これを使用して、癌免疫治
療および／または腫瘍増殖阻害のために、インビトロまたはインビボのいずれか
で患者の自己Ｔ細胞を活性化する。

【００７７】 代替の実施形態に従って、ＤＣは、癌に罹患していないことが既知の健常個体
から入手される。個体の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）上の関連のＨＬＡ抗原（Ｍ
ＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩの両方、例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ
、ＨＬＡ−ＣおよびＨＬＡ−ＤＲ）が同定され、そして癌患者とのＨＬＡの一致
を提供するＤＣが単離され、そして上記の通りに増殖される。例えば、特定の例
では、放射線および／または化学療法剤で処置された後期前立腺癌患者はしばし
ば、充分なＤＣも効率的なＤＣも提供することができない。従って、ＨＬＡが一
致した健常な個体（例えば、兄弟姉妹）由来のＤＣが上記の方法のうちのいずれ
かを用いて入手および増殖され得、そしてＢＣＧの存在下で関連の抗原とともに
インビトロでインキュベートされて、活性化された天然ＤＣを形成し得、次いで
このＤＣを用いて、活性化されたＴ細胞を免疫治療のために惹起し得るか、およ
び／またはＨＬＡが一致した前立腺癌患者における腫瘍増殖を阻害し得る。

【００７８】 本発明の別の実施形態に従って、「寿命の延長された樹状細胞」が使用される
。ヒト細胞は、通常、アポトーシスを経る前に約５０〜７０集団倍化に限定され
た、インビトロでの有限の寿命を有する。本明細書中で使用される場合、用語「
寿命の延長された樹状細胞」は、インビトロ細胞培養培地中で長期にわたって（
少なくとも約１００回のさらなる集団倍化を含むがこれらに限定されない）増殖
し得るように遺伝的に改変されたＤＣを意味することを意図する。寿命が延びた
ＤＣは、例えば、前立腺癌患者の末梢血から得られたＤＣのＥＢＶ−トランスフ
ォーメーションによって、または当業者に公知の技術を用いた、特定の細胞周期
調節遺伝子（サイクリンＡ、サイクリンＢ、サイクリンＤもしくはサイクリンＥ
または網膜芽細胞腫タンパク質をコードする遺伝子を含むがこれらに限定されな
い）のＤＣへの挿入によって、入手される。

【００７９】 米国特許第５，７８８，９６３号に提示される実施例に例示されるように、寿
命が延びたＤＣは、単離されたＤＣ集団のＥＢＶトランスフォーメーションによ
って入手されている。このような寿命の延びたＤＣは、本発明の方法に従って有
用である。

【００８０】 本発明の別の実施形態に従って、ＤＣは、例えば、関連の抗原に対する暴露の
前または暴露後のいずれかでの低温保存によって保存され得る。使用され得る低
温保存剤としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ジメチルスルホ
キシド（ＤＭＳＯ）（ＬｏｖｅｌｏｃｋおよびＢｉｓｈｏｐ，Ｎａｔｕｒｅ １
８３：１３９４−１３９５（１９５９）；Ａｓｈｗｏｏｄ−Ｓｍｉｔｈ，Ｎａｔ
ｕｒｅ １９０：１２０４−１２０５（１９６１））、グリセロール、ポリビニ
ルピロリドン（Ｒｉｎｆｒｅｔ，Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：５７６（１
９６０））、ポリエチレングリコール（ＳｌｏｖｉｔｅｒおよびＲａｖｄｉｎ，
Ｎａｔｕｒｅ １９６：５４８（１９６２））、アルブミン、デキストラン、ス
クロース、エチレングリコール、ｉ−エリトリトール、Ｄ−リビトール、Ｄ−マ
ンニトール（Ｒｏｗｅら，Ｆｅｄ．Ｐｒｏｃ．２１：１５７（１９６２））、Ｄ
−ソルビトール、ｉ−イノシトール、Ｄ−ラクトース、塩化コリン（Ｂｅｎｄｅ
ｒら，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏ．１５：５２０（１９６０））、アミノ酸（
ＰｈａｎおよびＢｅｎｄｅｒ，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２０：６５１（１９
６０））、メタノール、アセトアミド、モノ酢酸グリセロール（Ｌｏｖｅｌｏｃ
ｋ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．５６：２６５（１９５４））および無機塩（Ｐｈａｎ
およびＢｅｎｄｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１０４：
３８８（１９６０）；ＰｈａｎおよびＢｅｎｄｅｒ，Ｒａｄｉｏｂｉｏｌｏｇｙ
，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｈｉｒｄ Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ
Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｒａｄｉｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｉｌｂｅｒｙ，Ｐ
．Ｌ．Ｔ．編，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ，Ｌｏｎｄｏｎ，ｐ．５９（１９６１）
）。

【００８１】 制御された低速度の冷却が重要である。異なる凍結防止剤（Ｒａｐａｔｚら，
Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ ５：１８−２５（１９６８））および異なる細胞型は
、骨髄−幹細胞の生存およびそれらの移植能力に対する冷却速度の効果について
、異なる最適冷却速度を有する（例えば、ＲｏｗｅおよびＲｉｎｆｒｅｔ，Ｂｌ
ｏｏｄ ２０：６３６（１９６２）；Ｒｏｗｅ，Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ ３：
１２−１８（１９６６）；Ｌｅｗｉｓら，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ７：１７−
３２（１９６７）；ならびにＭａｚｕｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ １６８：９３９−９
４９（１９７０）を参照のこと）。水が氷に変わる融解相の熱が最小であるべき
である。冷却手順は、例えば、プログラム可能な凍結デバイスまたはメタノール
浴手順の使用によって実行され得る。プログラム可能な凍結装置は、最適冷却速
度の決定を可能にし、標準的な再現可能な冷却を容易にする。プログラム可能な
制御された速度のフリーザー（例えば、ＣｒｙｏｍｅｄまたはＰｌａｎａｒ）は
、所望の冷却速度曲線への凍結管理の調整を可能にする。

【００８２】 綿密な凍結の後、細胞は、長期の低温保存容器に迅速に移され得る。特定の実
施形態において、サンプルは、液体窒素（−１９６℃）またはその蒸気（−１６
５℃）中で低温で保存され得る。このような保存は、高性能の液体窒素冷凍装置
の利用可能性によって大きく促進される。

【００８３】 造血幹細胞（特に、骨髄または末梢血由来の造血幹細胞）の操作、低温保存、
および長期保存に関する考慮および手順は、本発明の方法によって調製されたＤ
Ｃに対して広く適用可能である。このような考察は、例えば、以下の参考文献（
これらは、本明細書中に参考として援用される）中に見出され得る：Ｇｏｒｉｎ
，Ｃｌｉｎｉｃｓ ｉｎ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ １５：１９−４８（１９８
６）；Ｂｏｎｅ−Ｍａｒｒｏｗ Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ，Ｃｕｌｔｕｒｅ
ａｎｄ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ａ
Ｐａｎｅｌ，Ｍｏｓｃｏｗ，Ｊｕｌｙ ２２−２６，１９６８，Ｉｎｔｅｒｎ
ａｔｉｏｎａｌ Ａｔｏｍｉｃ Ｅｎｅｒｇｙ Ａｇｅｎｃｙ，Ｖｉｅｎｎａ，
１０７−１８６頁。生存可能な細胞の他の低温保存方法、またはその改変方法が
、利用可能であり、そして使用が想定される：例えば、冷却金属−鏡技術；Ｌｉ
ｖｅｓｅｙおよびＬｉｎｎｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３２７：２５５（１９８７）；
Ｌｉｎｎｅｒら，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．３４：１１２３
−１１３５（１９８６）；Ｓｅｎｋｅｎらの米国特許第４，１９９，０２２号、
Ｓｃｈｗａｒｔｚの米国特許第３，７５３，３５７号、Ｆａｈｙの米国特許第４
，５５９，２９８号、Ｌｉｖｅｓｅｙらの米国特許第５，３６４，７５６号もま
た参照のこと）。

【００８４】 凍結細胞は、代表的に急速に解凍され（例えば、３７〜４１℃に維持された温
浴中）、そして解凍の際に直ぐに冷却される。解凍の際の細胞の凝集を回避する
ために、細胞を処理することが望ましくあり得る。凝集を回避するために、種々
の手順が使用され得、これには、凍結前および／または凍結後の、ＤＮａｓｅの
添加（Ｓｐｉｔｚｅｒら，Ｃａｎｃｅｒ ４５：３０７５−３０８５（１９８０
））、低分子量デキストランおよびシトレートの添加、ヒドロキシエチルデンプ
ンの添加（Ｓｔｉｆｆら，Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ ２０：１７−２４（１９８
３））などが挙げられるが、これらに限定されない。凍結防止剤は、ヒトにおい
て毒性である場合、解凍されたＤＣの個体への投与前に除去されなければならな
い。凍結防止剤を除去するための１つの方法は、微々たる濃度への希釈による方
法である。一旦、凍結ＤＣが解凍され、そして回収されると、これらは、非凍結
ＤＣに関して上記されるように、Ｔ細胞を活性化するために使用される。

【００８５】 （適用または使用方法） 単に説明を容易にするために、以下の考察は、当業者によって明確に理解され
るように、本発明の方法の特定の用途の例示である。本明細書中に提供される実
施例は、本質的にいずれの抗原（全ての細胞型に対するウイルスおよび細菌を含
む）に対しても使用され得る本発明の範囲を制限することを意図しない。

【００８６】 上記に考察したように、本発明の１つの実施形態に従って、本明細書中に開示
される方法のいずれかによって可溶性の外因性前立腺特異的抗原およびＢＣＧに
曝露された単離ヒトＤＣは、前立腺癌に対してインビトロでＴ細胞を活性化する
ために使用され得る。詳細には、Ｔ細胞応答は、２５％より多いＣＤ８^＋Ｔ細胞
を含む活性化Ｔ細胞の集団を提供する、ＭＨＣクラスＩ指向型応答である。ＤＣ
は、抗原への曝露の直後に使用されて、Ｔ細胞を刺激し得る。あるいは、ＤＣは
、抗原およびＴ細胞への同時曝露前に、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の組み合わ
せの存在下で維持され得る。

【００８７】 Ｔ細胞またはＴ細胞のサブセットは、応答細胞としての使用のために種々のリ
ンパ性組織から入手され得る。このような組織としては、脾臓、リンパ節ならび
に末梢血および臍帯血が挙げられるが、これらに限定されない。細胞は、混合さ
れたＴ細胞集団としてか、または精製されたＴ細胞サブセットとして、抗原に曝
露されたＤＣと共培養され得る。例えば、精製ＣＤ８^＋ Ｔ細胞を抗原に曝露さ
れたＤＣと共に培養して、前立腺特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を誘
発することが、望ましくあり得る。さらに、インビトロ細胞培養の間のＣＤ４^＋ Ｔ細胞の初期の排除によって、ＣＤ８^＋ Ｔ細胞およびＣＤ４^＋ Ｔ細胞の両
方の混合培養におけるＣＤ４^＋細胞の過剰な増殖を回避し得る。Ｔ細胞精製は、
ポジティブ選択、および／またはネガティブ選択（ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、Ｃ
Ｄ８などに対する抗体の使用が挙げられるが、これらに限定されない）によって
達成され得る。

【００８８】 １つの実施形態に従って、Ｔ細胞は、ＤＣが入手された前立腺癌患者と同じ患
者から入手され得る。インビトロにおける刺激または活性化後、自己Ｔ細胞が、
患者に投与されて、前立腺癌の腫瘍増殖を減速または阻害する既存の免疫応答を
刺激および／または増大する。例えば、Ｔ細胞は、静脈内注入によって、約１０^８ 〜１０^９細胞／ｍ^２（体表面の面積）の用量で投与され得る（Ｒｉｄｅｌｌら
，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：２３８−２４１（１９９２）を参照のこと）。注入
は、所望の間隔（例えば、毎月）で繰り返され得る。レシピエントは、Ｔ細胞注
入の間および後に、有害な影響のいずれの徴候に関してもモニターされる。

【００８９】 別の実施形態に従って、Ｔ細胞は、前立腺患者から入手され、そしてＴ細胞を
刺激するために使用されるＤＣは、ＨＬＡ適合した健康なドナーから入手される
。なお別の実施形態に従って、Ｔ細胞およびＤＣの両方は、ＨＬＡ適合した健康
なドナー（例えば、前立腺癌患者の同胞）から入手される。本実施形態は、例え
ば、患者が、放射線療法および／または化学療法剤で処置され、かつ十分なＤＣ
または効果的なＤＣを提供し得なかった後期の前立腺癌患者である場合、有利で
あり得る。刺激後のＴ細胞は、上記のように投与される。

【００９０】 本発明の方法の特定の例において、種々の方法論を用いて樹状細胞（ＤＣ）に
負荷されたＰＳＭＡが、抗原特異的様式で自己Ｔ細胞および同種異系Ｔ細胞を刺
激し得る抗原提示細胞を生成した。これらの方法論としては、以下が挙げられる
：１）リポ多糖類（ＬＰＳ）有りまたは無しでの、ＰＳＭＡタンパク質およびカ
ルメット−ゲラン杆菌（ＢＣＧ）を用いたＤＣの約６日間のオーバーナイト処理
、ならびに２）高張性培地を用いたＤＣの約７日間の浸透圧負荷。ＢＣＧによっ
て刺激されたＤＣは、上昇したＣＤ８３発現およびＣＤ８６発現を示し、一方Ｌ
ＰＳは、ＤＣの成熟をさらに促進する。浸透性負荷が、高張性培地を用いて達成
されて、ファゴサイトーシスおよびマクロピノサイトーシスを増加した。

【００９１】 ＰＳＭＡ充填されたＤＣ（ＢＣＧ±ＬＰＳまたは浸透圧充填を用いて調製され
た）を用いたインビトロでの２週間の刺激、およびＰＳＭＡを用いて外因性にパ
ルスしたＰＢＭＣを用いた１週間以上の再刺激の後、免疫原に対する特異的な反
応性が、実証された（図１〜６）。

【００９２】 本発明の別の実施形態に従って、前立腺癌患者から単離されたＤＣは、インビ
トロで培養され、次いで、ＭＨＣクラスＩ抗原提示（これは、ＣＤ８^＋ ＣＴＬ
の相対数を増加する）を獲得するのに十分な様式で、前立腺組織特異的抗原、前
立腺癌抗原、またはいずれかの抗原の抗原性フラグメントに曝露される。拡大ま
たは低温保存のいずれかの後、ＤＣは、患者に投与して戻され、インビボにおい
て患者の癌細胞に対して免疫応答を刺激する（Ｔ細胞活性化を含む）。患者の自
己の樹状細胞を用いるこの手段を使用することによって、以下の利点が提供され
る：（１）外来ＤＮＡが利用されない；（２）種々のウイルスベクターを用いた
ｃＤＮＡ発現の目的のための細胞感染が、排除される；（３）抗原が、樹状細胞
に取り込まれる可溶性タンパク質の形態で樹状細胞に対して提示され、、そして
細胞表面のＭＨＣ／ペプチド提示のためにプロセスされる；（４）樹状細胞が、
その表面上にＢ７を発現し、このｃＤＮＡを樹状細胞にトランスフェクトする必
要性を解消する；（５）樹状細胞表面上での内因性Ｂ７（Ｂ７．１および／また
はＢ７．２のいずれか）の使用が、Ｔ細胞をＩＬ−２または他のサイトカインと
共に（サイトカイン自体の形態でか、またはそのｃＤＮＡの特定の細胞へのトラ
ンスフェクションのいずれか）提供する必要性を排除する；（６）全ての手順が
、患者自体の細胞を用いて実行される。

【００９３】 上記のように得たＤＣを、インビトロで、前立腺特異的抗原、前立腺癌抗原ま
たはいずれかの抗原の抗原性フラグメント（例えば、約０．１μｇ〜約１０００
μｇでのＰＳＭＡ）に、ＢＣＧ（約２×１０^５〜１×１０^６単位／ｍｌ 終濃度
）と組合わせてかまたはＬＰＳ（４０単位／ｍｌ）とあわせたＢＣＧと組合わせ
て曝露し、洗浄し、患者に投与して免疫応答を誘発するか、または既存の免疫応
答を増強する。従って、ＤＣは、抗前立腺癌ワクチンおよび／または免疫治療剤
を構成する。前立腺特異的抗原を提示するＤＣは、約１０^６〜１０^８細胞の用量
で静脈内注入を介して患者に投与される。患者の免疫応答は、モニターされ得る
。注入は、患者の測定された免疫応答に基づいて、所望の間隔で繰り返され得る
。

【００９４】 以下の実施例は、前立腺患者から入手し、ＢＣＧおよびＬＰＳの組合わせまた
はＢＣＧ単独の存在下で抗原（例えば、自己腫瘍溶解産物またはペプチドの形態
）を用いてパルスしたヒト樹状細胞が、ヒト前立腺癌抗原に対する抗原特異的細
胞傷害性Ｔ細胞および体液性免疫応答を刺激することを、実証する。これらの実
施例は、例示目的のためのみに示され、そして本発明の範囲のいかなる様式でも
制限することを意図しない。

【００９５】 （実施例１） 以下の実施例は、ヒト樹状細胞の単離および培養を記載する。抗原特異的な細
胞傷害性Ｔ細胞応答の刺激を実証するために、単離した樹状細胞を、ＢＣＧと組
合わせて腫瘍細胞溶解産物および部分的に精製した腫瘍細胞溶解産物と接触させ
た。

【００９６】 （患者の樹状細胞の培養） ヒトＤＣの培養は、本明細書中の前に記載したように、および米国特許第５，
７８８，９６３号（本明細書中に参考として援用される）中に記載されたように
確立した。簡単に言うと、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａ
ｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）上での標準的な
遠心分離によってリンパ球に富む「軟膜」から得た。プラスチックに接着したＰ
ＢＭＣ（３７℃で約１時間）を、２％ 自己血清、５０Ｕ／ｍｌ ペニシリン、
５０μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０ｍＭ Ｈ
ＥＰＥＳ、０．１ｍＭ 非必須アミノ酸、および１ｍＭ ピルビン酸を補充また
は補充していないＡＩＭ−Ｖ（「培養培地」と称する；これらは全てＢｏｅｈｒ
ｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ，Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｖｅｒｖｉｅｒ
ｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍから）中、１０００Ｕ／ｍｌまたは５００Ｕ／ｍｌの各顆粒
球マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）（Ｌｅｕｃｏｍａｘ^ＴＭ １．１１×１０^７Ｕ／ｍｇ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒ
ｌａｎｄより））および５００Ｕ／ｍｌのインターロイキン−４（ＩＬ−４）（
Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｋ
ｅｎｉｌｗｏｒｔｈ，ＮＪ）の存在下で、６〜７日間培養した。

【００９７】 （患者のＤＣの表現型決定（ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）） 表面抗原（Ａｇ）発現を決定するために、細胞（５０μｌ中１０^５ＤＣ）を、
完全培地中の一次モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を用いて標識し、その後、ヤギ
抗マウスＩｇのＦＩＴＣ結合体化Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント（Ｄａｋｏ，Ｇｌ
ｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）によって標識した。以下のモノクローナル抗体
が使用され得るが、同じ特異性を有する多数の他の抗体が、周知である：Ｇ４６
−２．６（ＩｇＧ_１、抗ＨＬＡ−ＡＢＣ）、Ｌ２４３（ＩｇＧ_２ａ、抗ＨＬＡ−
ＤＲ）、ＨＢ−１５ａ（ＩｇＧ_２ｂ、抗ＣＤ８３）、ＢＵ６３（ＩｇＧ_１、抗Ｃ
Ｄ８６）。洗浄は、０．２％ アルブミンを含むＨＢＳＳ中であった。最後の洗
浄後、細胞を、０．２％ アルブミンおよび２％ ホルムアルデヒドを含むＨＢ
ＳＳ中で保存した。サンプルを、ＦＡＣＳｃａｎ（登録商標）（Ｂｅｃｔｏｎ−
Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で分析した。データを、Ｂｅｃ
ｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ製のＣｅｌｌＱｕｅｓｔｅ（登録商標）ソフトウェ
アを用いて分析し、そして表示させた。

【００９８】 （腫瘍細胞溶解産物の調製） 以下のように、ＢＣＧおよびＬＰＳを使用して、ＤＣのＭＨＣクラスＩ負荷を
刺激した：１〜１００μｇのＬＮＣａＰ由来のＰＳＭＡまたは部分的に精製され
た組換えＰＳＭＡ（ｒＰＳＭＡ）を、滅菌マクロチップを用いたピペッティング
によって６日目のＤＣの培養培地に添加した。同じときに、ＢＣＧ（０．２〜１
．６×１０^６Ｕ／ｍｌ 終濃度；Ｔｉｃｅ−ＢＣＧ，Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎ
ｉｋａ，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）およびＬＰＳ（４０Ｕ／ｍｌ 終濃度）（複製の
フラスコ中）を、同じ方法を用いて培養培地に添加した。次いで、ＣＯ_２インキ
ュベーターに戻す前に、培養培地を穏やかに混合した。

【００９９】 浸透圧負荷を、以下のように実行した：７日目のＤＣを、リン酸緩衝化生理食
塩水（ＰＢＳ）を用いた勢いのあるピペッティングによって収集し、次いで、機
械的に取り除く前にＰＢＳを用いてインキュベートした。ＤＣを、低速度で遠心
分離し、そして全ての上清を、吸引を用いて除去した。細胞ペレットを、最終容
積１００μｌまでの所望の量のＰＳＭＡおよびＰＢＳ中に再懸濁した。その後、
１００μｌの高張性培地（１Ｍ スクロースおよび２０％ グリセロール）を添
加し、そして細胞懸濁液を、ピペットマイクロチップを用いて混合した。次いで
、細胞を、１５ｍｌの遠心管中、３７℃の温浴に１０分間置いた。インキュベー
ション後、ＤＭＥＭまたはＡＩＭ−Ｖを用いてこの管を充填し、次いで、この管
をさらに３分間３７℃の温浴に戻すことによって、等張性状態を回復させた。次
いで、細胞を遠心分離し、そして所望の濃度で培養培地中に再懸濁した。

【０１００】 ＰＳＭＡ負荷されたＤＣを用いたインビトロでの２週間の刺激、およびＰＳＭ
Ａを用いて外因性にパルスしたＰＢＭＣを用いた１週間以上の再刺激の後、免疫
原に対する特異的な反応性が、実証された（図１〜５）。培養１８日目までに、
患者９２由来のエフェクター細胞は、ＰＳＭＡを提示する自己ＤＣを特異的に認
識したが、無関係のタンパク質オボアルブミン（ＯＶＡ）または未処理ＤＣは認
識しなかった（図１Ａ）。患者９２のエフェクター細胞はまた、患者１０５およ
びＩ．Ｔ．由来の同種異系ＤＣを特異的に認識した（図１Ｂおよび図１Ｃ）。患
者１０５およびＩ．Ｔ．の両方由来のエフェクター細胞は、ＰＳＭＡを提示する
自己ＤＣおよび同種異系ＤＣの両方を用いた共培養の後に、特異的な様式でサイ
トカインを分泌した。

【０１０１】 この観察されたＰＳＭＡによって制限される活性は、有意なＣＤ８^＋ Ｔ細胞
成分を含む（図２Ａ〜図２Ｃ）。示されるように、患者１０５由来のエフェクタ
ー細胞がＤＣ（これは、ＢＣＧの存在下でＰＳＭＡが負荷された）を用いて刺激
された場合、サイトカイン分泌は、ＬＰＳが刺激の間に含まれたか否かに関わら
ず、有意にＣＤ８媒介性であった（図２Ａおよび図２Ｂ）。エフェクター細胞が
、浸透圧負荷後のＰＳＭＡを発現するＤＣを用いて刺激された場合、観察された
反応性に対して、ＣＤ８^＋ Ｔ細胞およびＣＤ４^＋ Ｔ細胞の相対的な寄与に統
計学的に有意な差異は存在しなかった（図２Ｃ）。患者９２およびＩ．Ｔ．由来
の等しく刺激されたエフェクターを用いて類似の知見が得られた（データは示さ
ず）。これらの結果は、ＬＰＳ有りまたはＬＰＳ無しでのＢＣＧの使用が、ここ
で教示されるように、細胞傷害性Ｔ細胞に偏った免疫応答をもたらす（すなわち
、Ｔ細胞の５０％以上がＣＤ８^＋であった）ことを実証する。

【０１０２】 ＰＳＭＡ負荷されたＰＢＭＣ（浸透圧負荷を用いた）を用いたさらなる再刺激
後、患者１０５由来の特異的エフェクターを、これらのエフェクターが用量依存
的様式でサイトカインを分泌する能力を有したか否かを決定するために、評価し
た（図３）。０日目および１０日目の初回刺激について、ＤＣへのＰＳＭＡ負荷
の間にＢＣＧまたはＢＣＧ＋ＬＰＳが存在した場合、このエフェクターによって
分泌されたサイトカインの量は、自己ＤＣ標的に浸透圧的に負荷されたＰＳＭＡ
の量に直接関連した（図３Ａおよび３Ｂ）。最大量のＩＦＮγ分泌は、試験され
たＰＳＭＡのうちの最も高い濃度がＤＣに負荷された場合に、最大値に達するこ
となく観察された。インビトロにおける全ての刺激を、１０μｇのＰＳＭＡを負
荷したＤＣまたはＰＢＭＣを用いて実行した。このタンパク質量は、強力なＴ細
胞刺激およびＴ細胞活性化に十分であった。ＰＳＭＡの最大濃度を３０μｇに増
加して実験を繰り返した場合、プラトーに達した（図３Ｃ）。

【０１０３】 ＰＳＭＡ特異的細胞溶解の中程度のレベルが、検出された（図４Ａおよび４Ｂ
）。培養の３２日目に、患者Ｉ．Ｔ．由来のエフェクター細胞は、ＯＶＡを提示
する自己ＤＣに対する２３％または未処理標的に対する１９％と比較して、４０
：１のエフェクター：標的比で、ＰＳＭＡを提示する自己ＤＣの３７％の溶解を
示した（図４Ａ）。培養の３９日目に、患者９２由来のエフェクター細胞は、Ｏ
ＶＡを提示する自己ＤＣに対する１４％または未処理標的に対する１０％と比較
して、３６：１のエフェクター：標的比で、ＰＳＭＡを提示する自己ＤＣ溶解の
２３％の溶解を示した（図４Ｂ）。

【０１０４】 インタクトな可溶性タンパク質を用いて浸透圧的に負荷されたＤＣを用いて、
インビトロで刺激されたＴ細胞によって認識されるＰＳＭＡ由来のペプチドの特
異性をまた、決定した。患者９２由来のエフェクター細胞（これは、インビトロ
での刺激後にＰＳＭＡ特異的であった）を用いて、ＰＳＭＡ：ＰＳＭ−Ｐ１由来
のＨＬＡ−Ａ２^＋ペプチドまたはインフルエンザＭ１タンパク質のいずれかを用
いて外因性にパルスした抗原提示細胞株Ｔ２との共培養後に、サイトカイン分泌
を測定した（図６Ａおよび図６Ｂ）。

【０１０５】 さらなる実験において、インフルエンザＭ１タンパク質またはペプチド（抗原
フラグメントを含む）が浸透圧的にかまたは直接的に負荷され、そしてＢＣＧ単
独またはインターフェロンγとの組合わせのいずれかの存在下で成熟された樹状
細胞が、Ｖ_β１７ Ｔ細胞サブセットによるインターフェロンγの産生によって
測定されるように、Ｔ細胞媒介活性を刺激し得ることを実証した。

【０１０６】 （実施例２） 本実施例は、樹状細胞が、低温保存後にその機能を保持しているか否かを試験
する。免疫療法アプローチは複数の処置を含むので、この特性は特に重要であり
、そして各患者についての全てのＤＣを一度の調製の間に調製し、そして抗原を
負荷し、次いで、その後の注入のために等分および低温保存することが好ましい
。ＤＣの凍結および解凍は、ＣＤ８^＋ Ｔ細胞アクチベーターとしてのそれらの
効果を制限し得ることが可能であった。

【０１０７】 樹状細胞を、前立腺癌患者のＰＢＭＣから単離し、そして上述のように５００
Ｕ／ｍｌ ＧＭ−ＣＳＦおよび５００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−４の存在下で、７日間培
養した。７日目に、単離されたＤＣを収集し、そして９０％ウシ胎仔血清および
１０％ジメチルスルホキシドを用いて低温保存した。低温保存されたＤＣを、そ
の後一定期間凍結させて保存し、３７℃の水浴で解凍し、そして１５ｍｌポリプ
ロピレンチューブに移し、そして１２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。次いで
、解凍したＤＣを、１０％熱不活性化ヒト血清を含む培地に再懸濁し、そして計
数し、そして以下のように使用した。

【０１０８】 患者１０５由来の第７日目ＤＣに、浸透圧によりＰＳＭＡまたはＯＶＡを負荷
した（または未処理のままにした）。次いで、処理したＤＣを、上述のような９
０％ヒト血清および１０％ＤＭＳＯからなる標準的な凍結培地中で凍結させた。
同日に、第２のセットのＤＣ培養物を確立した。１週間後、新鮮な第７日目ＤＣ
を収集し、そして浸透圧によりＰＳＭＡまたはＯＶＡを負荷した（または未処理
のままにした）。さらに、その週の前に低温保存させたＤＣを標準的な技術によ
り解凍し、そしてすぐにＥＬＩＳＡにおいて使用した。患者１０５由来のＰＳＭ
Ａにより制限されたエフェクター細胞は、新鮮な標的および低温保存した標的の
両方に対して強い反応性を示した（図５）。この特定の実施例で教示するように
、低温保存は、抗原提示細胞として機能するＤＣの効果を減少させない。

【０１０９】 免疫療法を用いて強力な抗腫瘍応答を刺激することは、細胞障害性Ｔ細胞応答
を刺激する際の困難性に部分的に起因して、効力が制限されていた。本発明は、
この制限を克服する方法および組成物を記載する。本発明は、樹状細胞を、カル
メット−ゲラン杆菌（ＢＣＧ）の存在下で可溶性組織特異的抗原に曝露すること
を必要とし、その結果、ＢＣＧは、ＭＨＣ−クラスＩプロセシング経路に抗原を
向かわせることを補助して、主に細胞障害性Ｔ細胞応答を誘導する。Ｃｅｌｌａ
らによる近年の研究（Ｃｅｌｌａら、Ｎａｔｕｒｅ ３８８：７８２−７８７（
１９９７））はまた、抗原提示についての成熟プロセスの重要性を実証した。炎
症性刺激の非存在下で、ＤＣのＭＨＣ−クラスＩＩ分子上で提示された抗原の半
減期は、１０時間であった。対照的に、炎症性因子の存在下で抗原を用いてＤＣ
をパルスすることは、この抗原の半減期を１００時間に増加させた。より長い半
減期は、ＤＣが二次的リンパ器官にホーミングし、そして抗原特異的Ｔリンパ球
を活性化することを可能にする。

【０１１０】 （実施例３） この実施例では、癌患者から単離された樹状細胞を単離し、そして種々の濃度
のＢＣＧで処理した。数日の培養後、ＤＣを、１）飲細胞運動により粒子を取り
込む能力について、ならびに２）ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＣＤ８３
、ＣＤ８０、およびＨＬＡ−クラスＩを含む、特定の樹状細胞成熟マーカーの表
面発現について、試験した。

【０１１１】 樹状細胞を、上述のようにして患者５７から単離した。単離した細胞（１〜５
×１０^６）を８つのＴ−７５フラスコ中で約６日間培養した。ＢＣＧ（１×１０^６ ユニット／ｍｌ）を二連フラスコに添加し、１：２５０、１：２，５００、ま
たは１：２５，０００に希釈した。２つの残りの培養フラスコには、ＢＣＧを添
加しなかった。ＢＣＧを含まないＤＣを含む第１のセットの培養フラスコ、また
は１：２５０、１：２，５００、または１：２５，０００のＢＣＧ希釈物と共に
ＤＣを含む第１のセットの培養フラスコを、４８時間または７２時間のインキュ
ベーションの後に収集した。二連のセットの培養フラスコを合計７２時間の培養
後に収集した。各ＤＣ培養物を、１）飲細胞運動によりＦＩＴＣ／デキストラン
を取り込む能力について、ならびに２）ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８６、ＣＤ４０、Ｃ
Ｄ８３、ＣＤ８０、およびＨＬＡ−クラスＩを含む、特定のＤＣ成熟マーカーの
表面発現のレベルについて、分析した。

【０１１２】 標識したデキストラン粒子を飲細胞運動により取り込む能力を、以下の通りに
試験した：各ＤＣ培養フラスコの内容物を二連チューブに等分し、そして氷上に
て３０分間、ＡＩＭ−Ｖ培地中でインキュベートした。氷上でのインキュベーシ
ョン後、ＦＩＴＣ／デキストランを各チューブに添加し、約１ｍｇ／ｍｌの最終
濃度を達成した。１つのセットのチューブを３７℃にて１時間、５％ＣＯ_２中で
インキュベートし、二連のセットのチューブを氷上（０℃）で約１時間インキュ
ベートした。ＤＣを、フローサイトメトリーによる分析の前に、リン酸緩衝生理
食塩水（ＰＢＳ）中で３回洗浄した。ＤＣによる飲細胞運動の相対的な量を、０
℃でのバックグラウンドの取り込みを減算した後に比較した（表２）。

【０１１３】 ＤＣ成熟マーカーの分析のために、各ＤＣ培養物を、以下のモノクローナル抗
体対と共にインキュベートした：ＦＩＴＣ−抗ＨＬＡ−ＤＲ／ＰＥ−抗ＣＤ８６
；ＦＩＴＣ−抗ＣＤ４０／ＰＥ−抗ＣＤ８３；ＦＩＴＣ−抗ＣＤ８０／ＰＥ−抗
ＨＬＡ−クラスＩ；または標準的な方法を用いるＦＩＴＣ−／ＰＥ−アイソタイ
プ抗体コントロール。各ＤＣマーカーの表面発現を、フローサイトメトリーによ
り分析した（表３）。

【０１１４】

【表３】 １：２５０の濃度において、ＤＣは、４８時間培養および７２時間培養の両方
において、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＣＤ８３、およびＨＬＡ−クラスＩにおける有
意な増加を示した。ＢＣＧの効果は、７２時間でより顕著であった。例えば、Ｈ
ＬＡ−クラスＩは、１：２５０のＢＣＧにおいて４８時間後に２４％増加したが
、１：２５０のＢＣＧの７２時間後に９３％増加した。同様に、ＣＤ８３は、１
：２５０のＢＣＧにおいて４８時間で４０倍増加し、そして１：２５０のＢＣＧ
において７２時間後に５．７倍増加した。

【０１１５】 前述の発明は、理解の明確化の目的のために、説明および実施例によりいくら
か詳細に記載されているが、特定の変更および改変が、添付の特許請求の範囲内
で実施され得ることは明らかである。従って、本発明の範囲は、上述の説明を参
照して決定されるべきではなく、代わりに添付の特許請求の範囲およびそれらの
等価物の範囲全体を参照して決定されるべきである。

【０１１６】 本出願中で列挙される全ての刊行物および特許書類は、各々の個々の刊行物ま
たは特許書類が、個々にそのように表示される場合と同程度に、全ての目的のた
めにそれらの全体において参考として援用される。

【０１１７】 本発明は、上の発明の詳細な説明、発明の特定の実施形態の例示的な例および
添付の図面を参照して、より十分に理解され得る。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１Ａ〜図１Ｃは、ＬＮＣａＰ由来前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）ならびに
ＢＣＧ、またはＢＣＧおよびＬＰＳのいずれかを用いてパルスすることによって
以前に負荷した、自己（図１Ａ）または同種異系（図１Ｂおよび図１Ｃ）樹状細
胞による前立腺癌患者由来のＴ細胞の活性化を示すか、あるいは、Ｔ細胞は、Ｐ
ＳＭＡ単独を用いて浸透圧的に負荷した樹状細胞を用いてパルスした。患者９２
由来の１８日目の培養Ｔ細胞を洗浄し、そして２連で、５×１０^４細胞で９６ウ
ェルプレートに添加した。ＰＳＭＡ（白棒）もしくは卵白アルブミン（ＯＶＡ；
斜線棒）（または左側の未処理；交差棒）で浸透圧的に負荷した、患者１０５（
図１Ｂ）および患者Ｉ．Ｔ．（図１Ｃ）由来の自己ＤＣ（図１Ａ）または同種異
系ＤＣを、サイトカイン生成によって測定されるように、活性化について試験す
るために、１ウェル当り５×１０^４細胞でＴ細胞に添加した。インキュベーショ
ンの２４時間後、１５０μｌの上清を、各培養ウェルから取り出し、そして存在
するＩＦＮγの量を、ＥＬＩＳＡによって測定し、そしてｙ軸に対してプロット
した。

【図２】 図２Ａ〜図２Ｃは、ＣＤ８^＋Ｔ細胞群およびＣＤ４^＋Ｔ細胞群の両方を含む、
インビトロで活性化されたＴ細胞の特定の反応性を示す。患者１０５由来の２５
日目の培養Ｔ細胞を洗浄し、そして２連で１ウェル当り５×１０^４細胞で９６ウ
ェルプレートに添加した。ＤＣを、抗原（ＰＳＭＡまたはＯＶＡ）およびＢＣＧ
（図２Ａ）、ＢＣＧ＋ＬＰＳ（図２Ｂ）のいずれかを用いてパルスした。あるい
は、ＰＳＭＡまたはＯＶＡを浸透圧的に負荷した（図２Ｃ）。ＰＳＭＡ（ＤＣ＋
ＰＳＭＡ）、ＯＶＡ（ＤＣ＋ＯＶＡ）を用いてパルスしたか、または未パルス（
ＤＣ単独）の自己ＤＣを、１ウェル当り５×１０^４ＤＣで患者１０５のＴ細胞に
添加した。エフェクター細胞を、２連で、生理食塩水（ＮｏｍＡｂ；白棒）、ま
たは１μｇ／ｍｌ抗ＣＤ８ｍＡｂ（斜線棒）、または１μｇ／ｍｌ抗ＣＤ４ｍＡ
ｂ（交差棒）のいずれかと共にインキュベートした。ＩＦＮγ生成を、図１のよ
うに測定した。

【図３】 図３Ａ〜図３Ｃは、Ｔ細胞上で、ＢＣＧとか、またはＢＣＧおよびＬＰＳと組
み合わせた可溶性ＰＳＭＡを用いて、インビトロで活性化した樹状細胞の用量依
存効果を示す。前立腺癌患者１０５由来のＴ細胞を、ＬＮＣａＰ細胞に由来する
ＰＳＭＡの一連の希釈液と共に以前に充填した自己樹状細胞によって活性化した
。ＥＬＩＳＡを行ない、ＩＦＮγ分泌を評価した。３２日目または３９日目（図
３Ｃ）の培養細胞を洗浄し、２連で、１ウェル当り５×１０^４細胞で９６ウェル
プレートに添加した。ＰＳＭＡ（白棒）、ＯＶＡ（斜線棒）のいずれかでパルス
したか、または未パルス（交差棒）の自己ＤＣを、ＢＣＧまたはＢＣＧ＋ＬＰＳ
をを用いてかまたは用いずに、１ウェル当り５×１０^４細胞でＴ細胞に添加した
。ＢＣＧ、３２日目の培養物（図３Ａ）；ＢＣＧ＋ＬＰＳ、３２日目の培養物（
図３Ｂ）；ＢＣＧ、３９日目の培養物（図３Ｃ）。インキュベーションの２４時
間後、１５０μｌの上清を、各培養ウェルから取り出し、そして存在するＩＦＮ
γの量をＥＬＩＳＡによって測定した。

【図４】 図４Ａおよび図４Ｂは、ＰＳＭＡ発現ＤＣを用いてインビトロで刺激した前立
腺癌患者由来のＴ細胞の抗原特異的標的についての溶解性活性の刺激を示す。異
なる割合のエフェクター（Ｅ）（すなわち、Ｔ細胞）対標的（Ｔ）（すなわち、
自家樹状細胞）（Ｅ：Ｔ）を、４時間インキュベートした。自家ＤＣ（ＰＳＭＡ
（黒丸）もしくはＯＶＡ（黒四角）、または未処理（黒三角）を用いて浸透圧的
に充填した）を、^１１１Ｉｎで放射標識した。パーセント溶解を、以下の式を使
用して計算した：［（実験的放出−自発的放出）／（最大放出−自発的放出）］
×１００。患者Ｉ．Ｔ．、３２日目の培養物（図４Ａ）。患者９２、３９日目の
培養物（図４Ｂ）。

【図５】 図５Ａおよび図５Ｂは、ＬＮＣａＰ細胞から部分的に生成したＰＳＭＡ（約８
０％純粋）を用いてロードしたＰＳＭＡを用いて充填した、新鮮または凍結保存
したかのいずれかによって活性化した前立腺癌患者１０５由来のＴ細胞のＰＳＭ
Ａ特異的反応性を示す。３９日目の培養Ｔ細胞を洗浄し、そして２連で１ウェル
当り５×１０^４細胞で９６ウェルプレートに添加した。自家ＤＣ標的を、ＰＳＭ
Ａ、ＯＶＡを用いてパルスしたか、または未パルスで、そして１ウェル当り５×
１０^４細胞でＴ細胞に添加した。ＰＳＭＡ特異的反応性を、新鮮（白棒）ＤＣ標
的および凍結保存（斜線棒）ＤＣ標的の両方に対して観察した。エフェクターを
浸透圧的に充填されたＤＣまたはＢＣＧロードされたＤＣを用いて刺激したに関
わらず、ＰＳＭＡ特異的反応性が生じた。ＩＦＮγ生成を、図１におけるように
測定した。

【図６】 図６は、前立腺癌患者９２由来のＴ細胞が、ＰＳＭ−Ｐ１（白棒）、インフル
エンザマトリクスタンパク質Ｍ１（斜線棒）、またはなし（交差棒）のいずれか
を用いて２５μｇのペプチドで外因的に充填した、抗原提示細胞株Ｔ２によって
活性化され得ることを実証する。標準的ＥＬＩＳＡを実行してＩＦＮγ分泌を評
価する。４６日目の培養物（図６Ａ）または５３日目の培養物（図６Ｂ）。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 35/28 Ａ６１Ｋ 35/28 35/36 35/36 35/50 35/50 Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｐ 35/00 35/04 35/04 37/04 37/04 Ｃ１２Ｎ 5/06 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 5/00 ＺＮＡＥ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ボーイントン， アルトン エル． アメリカ合衆国 ワシントン 98053， レッドモンド， 274ティーエイチ アベ ニュー エヌ．イー． 2420 Ｆターム(参考） 4B065 AA93X AC20 BA30 BD39 CA44 4C085 AA03 BB01 CC03 DD23 DD88 EE01 GG02 4C087 BB37 BB42 BB43 BB44 BB70 NA14 ZB26

Claims (35)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 インビトロで腫瘍細胞に関連する抗原および該抗原の主要組
   織適合遺伝子複合体−（ＭＨＣ−）クラスＩプロセシングを促進する因子または
   薬剤に暴露された、単離されたヒト樹状細胞を含む、組成物。
2. 【請求項２】 前記樹状細胞が、暴露後に低温保存されている、請求項１に
   記載の組成物。
3. 【請求項３】 前記抗原が、患者から単離された腫瘍細胞の溶解産物、患者
   から単離された腫瘍細胞の膜調製物、精製された腫瘍特異的抗原、精製された腫
   瘍関連抗原、精製された組織関連抗原、精製された組織特異的抗原、またはそれ
   らの抗原フラグメントである、請求項１に記載の組成物。
4. 【請求項４】 前記抗原が、前立腺腫瘍関連抗原である、請求項３に記載の
   組成物。
5. 【請求項５】 前記抗原が、前立腺癌患者の前立腺腫瘍細胞の溶解産物、前
   立腺癌患者の前立腺腫瘍細胞の膜調製物、精製された前立腺特異的膜抗原（ＰＳ
   ＭＡ）、アミノ酸配列Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｓｅ
   ｒ Ａｌａ Ｖａｌ（配列番号１）を有するペプチド、アミノ酸配列Ａｌａ Ｌ
   ｅｕ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｖａｌ（配列番号２
   ）を有するペプチド、アミノ酸配列Ｘａａ Ｌｅｕ（またはＭｅｔ） Ｘａａ
   Ｘａａ Ｘａａ Ｘａａ Ｘａａ Ｘａａ Ｖａｌ（またはＬｅｕ）を有するペ
   プチドであって、ここで、Ｘａａが任意のアミノ酸を表す、ペプチド、精製され
   た前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、精製された前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ
   ）、前立腺の６回膜貫通上皮抗原（ＳＴＥＡＰ）、前立腺癌腫瘍抗原（ＰＣＴＡ
   −１）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、またはモノクローナル抗体ＰＤ４１に
   より認識される精製された前立腺粘液抗原である、請求項３に記載の組成物。
6. 【請求項６】 前記前立腺癌抗原が以下： 【化１】 である、請求項３に記載の組成物。
7. 【請求項７】 前記ヒト樹状細胞が、皮膚、脾臓、骨髄、胸腺、リンパ節、
   臍帯血、または末梢血から獲得された、請求項１に記載の組成物。
8. 【請求項８】 前記樹状細胞が、寿命の延長された樹状細胞である、請求項
   １に記載の組成物。
9. 【請求項９】 前記因子または薬剤が、カルメット−ゲラン杆菌（ＢＣＧ）
   、またはリポ多糖（ＬＰＳ）を伴ったＢＣＧを含む、請求項１に記載の組成物。
10. 【請求項１０】 腫瘍細胞増殖阻害応答を生じるための方法であって、該方
    法は、インビトロで抗原および該抗原の主要組織適合遺伝子複合体−（ＭＨＣ−
    ）クラスＩプロセシングを促進する因子または薬剤に暴露された有効量のヒト樹
    状細胞を、その必要がある患者に投与し、その結果、投与後に、ＭＨＣ−クラス
    Ｉに関係して該抗原を提示する該ヒト樹状細胞が、免疫応答を誘導するか、また
    は腫瘍細胞の増殖を阻害する既存の免疫応答を増強する工程、を包含する、方法
    。
11. 【請求項１１】 前記因子または薬剤が、カルメット−ゲラン杆菌（ＢＣＧ
    ）、またはリポ多糖（ＬＰＳ）を伴ったＢＣＧである、請求項１０に記載の方法
    。
12. 【請求項１２】 前記抗原が、患者から単離された癌腫瘍細胞の溶解産物、
    患者から単離された腫瘍細胞の膜調製物、精製された腫瘍特異的抗原、精製され
    た腫瘍関連抗原、精製された組織関連抗原、精製された組織特異的抗原、または
    それらの抗原フラグメントである、請求項１０に記載の方法。
13. 【請求項１３】 前記抗原が、前立腺腫瘍関連抗原である、請求項１２に記
    載の方法。
14. 【請求項１４】 前記前立腺腫瘍関連抗原が、前立腺癌患者の前立腺腫瘍細
    胞の溶解産物、前立腺癌患者の前立腺腫瘍細胞の膜調製物、精製された前立腺特
    異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、アミノ酸配列Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｔｈ
    ｒ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｖａｌ（配列番号１）を有するペプチド、アミノ
    酸配列Ａｌａ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｖ
    ａｌ（配列番号２）を有するペプチド、アミノ酸配列Ｘａａ Ｌｅｕ（またはＭ
    ｅｔ） Ｘａａ Ｘａａ Ｘａａ Ｘａａ Ｘａａ Ｘａａ Ｖａｌ（またはＬ
    ｅｕ）を有するペプチドであって、ここで、Ｘａａが任意のアミノ酸を表す、ペ
    プチド、精製された前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、精製された前立腺酸性ホスフ
    ァターゼ（ＰＡＰ）、前立腺の６回膜貫通上皮抗原（ＳＴＥＡＰ）、前立腺癌腫
    瘍抗原（ＰＣＴＡ−１）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、またはモノクローナ
    ル抗体ＰＤ４１により認識される精製された前立腺粘液抗原である、請求項１２
    に記載の方法。
15. 【請求項１５】 前記前立腺癌抗原が以下： 【化２】 である、請求項１２に記載の方法。
16. 【請求項１６】 前記ヒト樹状細胞が、前記患者の皮膚、脾臓、胸腺、骨髄
    、リンパ節、臍帯血、または末梢血から獲得された、請求項１０に記載の方法。
17. 【請求項１７】 前記ヒト樹状細胞が、末梢血から獲得された、請求項１０
    に記載の方法。
18. 【請求項１８】 前記樹状細胞が、前記患者とＨＬＡが一致した健常個体か
    ら獲得された、請求項１０に記載の方法。
19. 【請求項１９】 前記樹状細胞が、寿命の延長された樹状細胞である、請求
    項１０に記載の方法。
20. 【請求項２０】 前記ヒト樹状細胞が、前記患者への投与前に低温保存され
    、次いで解凍された、請求項１０に記載の方法。
21. 【請求項２１】 前記患者が、転移性前立腺癌に罹患している、請求項１０
    に記載の方法。
22. 【請求項２２】 腫瘍増殖阻害応答を生じるための方法であって、該方法は
    、有効量の活性化Ｔ細胞を、その必要のある患者に投与する工程を包含し、該Ｔ
    細胞は、インビトロで抗原および該抗原の主要組織適合遺伝子複合体−（ＭＨＣ
    −）クラスＩプロセシングを促進する因子または薬剤に暴露されたヒト樹状細胞
    への暴露によりインビトロで活性化された、方法。
23. 【請求項２３】 前記因子または薬剤が、カルメット−ゲラン杆菌（ＢＣＧ
    ）、またはリポ多糖（ＬＰＳ）を伴うＢＣＧである、請求項２２に記載の方法。
24. 【請求項２４】 前記腫瘍関連抗原が、患者の腫瘍細胞の溶解産物、患者の
    腫瘍細胞の膜調製物、精製された腫瘍特異的抗原、精製された膜抗原、精製され
    た組織特異的抗原、またはそれらの抗原フラグメントからなる群より選択される
    、請求項２２に記載の方法。
25. 【請求項２５】 前記抗原が、前立腺腫瘍関連抗原である、請求項２２に記
    載の方法。
26. 【請求項２６】 前記抗原が、前立腺癌患者の前立腺腫瘍細胞の溶解産物、
    前立腺癌患者の前立腺腫瘍細胞の膜調製物、精製された前立腺特異的膜抗原（Ｐ
    ＳＭＡ）、アミノ酸配列Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｓ
    ｅｒ Ａｌａ Ｖａｌ（配列番号１）を有するペプチド、アミノ酸配列Ａｌａ
    Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｖａｌ（配列番号
    ２）を有するペプチド、アミノ酸配列Ｘａａ Ｌｅｕ（またはＭｅｔ） Ｘａａ Ｘａａ Ｘａａ Ｘａａ Ｘａａ Ｘａａ Ｖａｌ（またはＬｅｕ）を有する
    ペプチドであって、ここで、Ｘａａが任意のアミノ酸を表す、ペプチド、精製さ
    れた前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、精製された前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡ
    Ｐ）、前立腺の６回膜貫通上皮抗原（ＳＴＥＡＰ）、前立腺癌腫瘍抗原（ＰＣＴ
    Ａ−１）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、またはモノクローナル抗体ＰＤ４１
    により認識される精製された前立腺粘液抗原である、請求項２２に記載の方法。
27. 【請求項２７】 前記抗原が以下： 【化３】 である、請求項２２に記載の方法。
28. 【請求項２８】 前記ヒト樹状細胞が、前記前立腺癌患者の皮膚、脾臓、骨
    髄、胸腺、リンパ節、臍帯血、または末梢血から獲得された、請求項２２に記載
    の方法。
29. 【請求項２９】 前記ヒト樹状細胞が、末梢血から獲得された、請求項２２
    に記載の方法。
30. 【請求項３０】 前記ヒト樹状細胞が、寿命の延長された樹状細胞である、
    請求項２２に記載の方法。
31. 【請求項３１】 前記ヒト樹状細胞が、インビトロで前記Ｔ細胞を活性化す
    るそれらの使用前に低温保存、解凍、および回復された、請求項２２に記載の方
    法。
32. 【請求項３２】 前記Ｔ細胞が、前記患者から獲得された、請求項２２に記
    載の方法。
33. 【請求項３３】 前記Ｔ細胞が、前記患者とＨＬＡが一致した健常個体から
    獲得された、請求項２２に記載の方法。
34. 【請求項３４】 前記患者が、転移性前立腺癌に罹患している、請求項２２
    に記載の方法。
35. 【請求項３５】 前記Ｔ細胞が、精製されたＣＤ８^＋ Ｔ細胞またはＣＤ４^＋ Ｔ細胞とＣＤ８^＋ Ｔ細胞との混合集団を含む、請求項２２に記載の方法。