DE602004013291T2

DE602004013291T2 - Dendritische zelle mit alpha-glycosylceramid-derivat und antigen zur verwendung bei der unterdrückung von immunreaktionen

Info

Publication number: DE602004013291T2
Application number: DE602004013291T
Authority: DE
Inventors: Isao Takasaki-shi SERIZAWA; Yasunori Shibuya-ku YAMAGUCHI; Hiromi Takasaki-shi EHARA
Original assignee: Kirin Pharma KK
Current assignee: Kirin Pharma KK
Priority date: 2003-03-03
Filing date: 2004-03-03
Publication date: 2009-05-14
Anticipated expiration: 2024-03-04
Also published as: ATE393213T1; WO2004078957A1; EP1605039A4; DE602004013291D1; EP1605039B1; US20060239979A1; JPWO2004078957A1; EP1605039A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die medizinische Verwendung zur Behandlung von Erkrankungen, einschließlich zahlreicher Autoimmunerkrankungen, Transplantatabstoßung, Transplantat-gegen-Wirt-Erkrankung und zahlreiche allergische Erkrankungen mit einer dendritischen Zelle, die ein α-Glycosylceramidderivat und ein Antigen präsentiert.
KRN7000 (Tetrahedron Lett., 34: 5591–5592, 1993; Tetrahedron Lett., 34: 5593–5596, 1993; Tetrahedron, 50: 2771–2784, 1994), das als eines der Derivate von Agelasphin synthetisiert wird, das aus einem Meeresschwamm stammt, ist als ein Ligand eines nicht variablen T-Zell-Rezeptors (TCR) identifiziert worden, der in natürlichen Killer-T(NKT)-Zellen exprimiert wird (Science, 278: 1626–1629, 1997; J. Exp. Med., 188: 1521–1528 1998; J. Exp. Med. 188: 1529–1534, 1998).
α-Glycosylceramidderivate, einschließlich KRN7000, sind Sphingoglycolipide, in denen hydrophile Saccharide, wie Galactose und Glycose und hydrophobe Ceramide, die Fettsäure-Sphingosinbase umfassen, in einer alpha-Konfiguration verbunden sind, und es wurde berichtet, dass sie starke anti-tumorigene Wirkung zeigen, indem NKT-Zellen als Ligand stimuliert werden (Oncol. Res., 7: 529–534, 1995; Cancer Res., 58: 1202–1207, 1998). Das α-Glycosylceramidderivat als Glycolipid-Antigen wird in die Antigen präsentierenden Zellen (APC) einschließlich dendritischer Zellen (DC) eingebaut, dann über einen nicht-TAP(Transporter, der mit der Antigenpräsentierung assoziiert ist)-Pfad prozessiert, welcher dafür bekannt ist, dass er für die Prozessierung von Protein-Antigenen verantwortlich ist, und auf APC-Membranen durch das Haupt-Histokompatilitäts-Antigen (MHC) der Klasse 1b-verwandte nicht-polymorphe Molekül CD1d präsentiert. Die NKT-Zellen werden durch die Erkennung des α-Glycosylceramidderivats, das durch CD1d auf APC präsentiert wird, mit Hilfe des TCR aktiviert, der keine Diversität besitzt, und auf der Membran dieser NKT-Zellen zu finden ist. Es ist berichtet worden, dass menschliche NKT-Zellen effizient mit menschlichen, aus Monozyten stammenden PC kultiviert werden können, die ein α-Glycosylceramidderivat auf Grundlage des obigen Prinzips angebaut haben (Hum. Immunol., 60: 10–19, 1999). Es ist ebenfalls berichtet worden, dass Interleukin-7 (IL-7) oder IL-15 NKT-Zellen in vitro synergistisch zusammen mit dem α-Glycosylceramidderivat proliferieren lassen (Hum. Immunol., 61: 357–365, 1999).
Es ist entdeckt worden, dass NKT-Zellen intermediäre TCR-Zellen sind, welche moderate Konzentrationen des TCR exprimieren, und natürlichen Killer(NK)-Zellen ähnlich, da diese Zellen eine große granuläre Lymphozyten(LGL)-verwandte Form zeigen, regelmäßig IL-2 Rezeptor β-Kette exprimieren und Perforingranula besitzen, aber dass diese Zellgruppe von den NK-Zellen klar verschieden ist, da die NKT-Zellen TCR besitzen (Watanabe, H. et al., J. Immunol., 155, 2972, 1995). Zusätzlich ist gezeigt worden, dass NK1.1+TCR^Int(NKT)-Zellen, welche NK1.1 exprimieren, unter den TCR^Int-Zellen durch Interleukin-12 (IL-12) aktiviert werden, und eine wichtige Effektorzelle bei der Unterdrückung zirkulierender Metastasen und eines Tumors in der Leber oder Lunge in Mäusen sind (Hashimoto, W. et al., J. Immunol., 154, 4333, 1995; Anzai, R. et al., Immunol., 88, 82, 1996). So werden die NKT-Zellen als die Zelle angesehen, die eine wichtige Rolle bei der Eliminierung von Krebszellen, Parasiten, Protozoen und intrazellulären infektiösen Bakterien spielt, wie beispielsweise Listerien und Tuberkulosebazillen (Seki, S. et al., Clin. Immunol., 28, 1069, 1996). Des Weiteren sind die NKT-Zellen als Zellen bekannt, die stark verantwortlich sind für die akute Abstoßung von Knochenmarks-Transplantaten (Yankelevich, B. et al., J. Immunol., 142, 3423, 1989), bei der Kontrolle der Produktion von IgE-Antikörpern, der Kontrolle der Differenzierung von Th1/Th2 von Helfer-T-Zellen (Yoshimoto, T. et al., J. Exp. Med., 179, 1285, 1994) und ähnlichen. Wie oben beschrieben wurde, sind die NKT-Zellen die Zellgruppe, die kürzlich als neue Zellgruppe, die für eine Vielzahl von Biomechanismen verantwortlich ist, Aufmerksamkeit auf sich gezogen hat.
Vα14⁺NKT-Zellen sind eine Unterklasse der NKT-Zellen. Viele der Vα14⁺NKT-Zellen exprimieren Vα14Jα281mRNA, und dieses Protein dient als TCR-α-Kette. Es ist kürzlich gezeigt worden, dass die Vα14⁺NKT-Zellen stark dafür verantwortlich sind, dass sich eine Autoimmunerkrankung entwickelt. D. h., dass MRL/I-lpr/lpr-Mäuse, welche eine Modellmaus für Autoimmunerkrankungen (menschlichen systemischen Lupus erythematosus) ist, welche die Anhäufung abnormaler Lymphozyten 17–20 Wochen nach der Geburt verursachen, und es ist gezeigt worden, dass die Vα14⁺NKT-Zellen in diesen Mäusen die Selektivität vor der Entwicklung der Autoimmunerkrankung absenken (Mieza, M. A. et al., J. Immunol., 156, 4035, 1996). Es ist berichtet worden, dass ein ähnliches Phänomen auch in gld-Mäusen auftritt, und in (NZB × NZW) F1-Mäusen, und dass die Vα14⁺NKT-Zellen stark an der Entwicklung von Autoimmunerkrankungen beteiligt sind (Makino., Y. et al., Clin. Immunol, 28, 1487, 1996). Zusätzlich und interessanterweise ist ein analoges Phänomen auch in menschlichen Fällen beobachtet worden. Das bedeutet, dass beobachtet wurde, dass ein menschliches Homolog, die Vα24JαQα-Kette, welche homolog zur Mauskette Vα14Jα281 ist, bei 20–50% der CD4-/CD8-T-Zellen im peripheren Blut gesunder Individuen vorhanden ist, aber bei Sclerodermie-Patienten stark erhöht ist (Sumida, T. et al., J. Exp. Med., 182, 1163, 1995). Wie oben erwähnt, ist bekannt, dass Maus-Vα14⁺NKT-Zellen oder menschliche Vα24JαQαT-Zellen für eine Vielzahl von Autoimmunerkrankungen verantwortlich sind, bei denen die ätiologischen Gene oder die genetischen Hintergründe verschieden sind. Demgemäß ist von IL-12, welches eine Wirkung der Aktivierung von NKT-Zellen besitzt, wie oben beschrieben wurde, erwartet worden, dass es ein pharmazeutisches Mittel für Autoimmunerkrankungen, wie systemischen Lupus erythematosus (SLE) und systemische Sclerodermie (SSc) ist. Jedoch ist beobachtet worden, dass abnorme Lymphozyten (CD3⁺ B220⁺ CD4 CD8 doppelt negative T-Zellen) in der Milz und den Lymphknoten von MRL/I-lpr/lpr-Mäusen, denen IL-12 injiziert wurde, merklich erhöht waren, wenn sie mit nicht injizierten Mäusen verglichen wurden (Takeki Tsutsui et al., Proceedings of Annual Meeting of the Japanese Society for Immunology, 347, 1996).
Andererseits sind β-Galactosylceramide, β-Glucosylceramide und ähnliche, in denen verschiedene Saccharide durch eine β-Bindung an das Ceramid geknüpft sind, in lebenden Organismen vorhanden (Svennerholm, L. et al., Biochem. Biophys. Acta, 280, 626, 1972; Karlsson, K. -A. et al., Biochim. Biophys. Acta, 316, 317, 1973). Zusätzlich ist bekannt, dass α-Galactosylceramide eine bemerkenswerte immunaktivierende Wirkung und Anti-Tumor-Wirkung haben (Morita, M. et al., J. Med. Chem., 38, 2176, 1995), und dass diese Wirkungen von α-Galactosylceramiden und α-Glucosylceramiden viel stärker sind, als die von β-Galactosylceramiden und β-Glucosylceramiden (Motoki, K. et al., Biol. Pharm. Bull., 18, 1487, 1995). Des Weiteren ist ebenfalls bekannt, dass die Verbindung mit α-Glycosylceramidstruktur nach ihrer Verabreichung in vivo radioprotektive Wirkungen (Motoki, K. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 5, 2413, 1995), inhibitorische Wirkungen bei der B16-Melanom-Lungenmetastasierung (Kobayashi, E. et al., Oncology Res., 7, 529, 1995) und bei der Kolon 26 Kolon-Karzinom oder EL-4 T-Lymphom-Lebermetastasierung (Kazuhiro Motoki et al., Proceedings of Annual Meeting of The Japanese Cancer Association, 523, 1996), sowie auch Wirkungen der Erhöhung der Plättchen und der weißen Blutzelle (Motoki, K. et al., Biol. Pharm. Bull., 19, 952, 1996) aufweist. Es ist ebenfalls berichtet worden, dass das α-Glycosylceramidderivat zur Behandlung von Typ I Diabetes in NOD-Mäusen (Hong, S. et al., Nat. Med., 7, 1052, 2001; Sharif, S. et al., Nat. Med., 7, 1057, 2001), bei der EAE (Singh, A. K. et al., J. Exp. Med., 194, 1801, 2001) oder einem Autoimmunerkrankungs-Modell in Mäusen wirksam ist.
Zusätzlich wird α-Glycosilceramidderivat durch CD1d präsentiert, das auf DC stark exprimiert wird. Es ist berichtet worden, dass DC, die ex vivo mit dem α-Glycosylceramidderivat behandelt worden sind, starke anti-tumorigene Wirkung in Mäusen haben, wenn dieses verabreicht wird. In diesem Phänomen aktiviert das α-Glycosylceramidderivat, das von DC präsentiert wird, die NKT-Zellfraktion effizient und beschleunigt die Produktion von Cytokinen, wie Interferon-γ oder IL-4.
DC sind dafür bekannt, dass sie sowohl CD4⁺ T-Zellen und CD8⁺ T-Zellen aktivieren (Inaba et al., J. Exp. Med., 172, 631, 1990; Inaba et al., Int. Rev. Immunol., 6, 197, 1990; Porgador und Gilboa, J. Exp. Med., 182, 255, 1995). DC ist in einer unreifen Form in nicht-lymphatischen Geweben verteilt und besitzt in dieser Form starke Aktivität hinsichtlich der Prozessierung von Antigen. Nach der Prozessierung von Antigen migrieren die DC in Lymphknoten, in die sie gehören, und präsentieren das Antigen im T-Zellbereich den T-Zellen und aktivieren die T-Zellen.
DC werden durch einen inflammatorischen Stimulus in den immun-aktivierten Zustand umgewandelt. Dieser Prozess wird als „Reifung" von DC bezeichnet, wobei der Phänotyp und die Funktionen der DC geändert werden (einschließlich des Anstiegs des Expressionsniveaus co-stimulatorischer Moleküle, Adhäsionsmoleküle und spezifischer Chemokine/Chemokinrezeptoren).
Es ist kürzlich berichtet worden, dass eine Immunreaktion nicht induziert wird, und eine Immunsuppression im Fall auftritt, wenn eine unreife DC verwendet wird ( USP 5,871,728 ; Lutz et al., Eur. J. Immunol., Jul; 30 (7): 1813–22, 2000). In dem Fall ist gezeigt worden, dass die immunologische Toleranz durch die Vorbehandlung mit DC induziert wird, und es ist von Steinmau et al. beschrieben worden, dass die Toleranz auch beim zuvor etablierten Immunsystem induziert wird, indem die Behandlung mit unreifen DC wiederholt durchgeführt wird ( WO 02/056830 ).
Es ist auch mit Hinblick auf DC, die einer Reifebehandlung unterzogen wurden, bekannt, dass eine unterdrückte Immunreaktion erzeugt wird, wenn diese halb gereiften DC intravenös injiziert werden (Gerald Schuler et al., Trends in immunology Vol. 23, Nr. 9, September 2002). Nach diesem Dokument wird die Halbreifung von DC in Abhängigkeit von Cytokinen induziert, welche für den Reifeprozess verwendet werden, wodurch eine Antigen-spezifische Immunsupprimierung etabliert wird, und daher kann vermutet werden, dass ein therapeutisches Verfahren, was für die Autoimmunerkrankung wirksam ist, erwartet werden kann.
Jedoch ist nicht berichtet worden, dass die Immunreaktion stark unterdrückt wird, wenn DC mit einem Antigen und gleichzeitig mit dem α-Glycosylceramidderivat behandelt werden. Es ist ebenfalls nicht berichtet worden, dass die Immunreaktion stark unterdrückt wird, wenn DC, die mit einem Antigen behandelt wurden, und DC, die mit dem α-Glycosilceramidderivat behandelt wurden, in Kombination verwendet werden.
Die Erfinder haben gefunden, dass die Entwicklung von experimenteller autoimmuner Encephalomyelitis (EAE) als Modell für Multiple Sklerose merklich durch die Injektion dendritischer Zellen (DC) unterdrückt wird, die mit einem Myelin-Antigen und einem α-Glycosylceramidderivat behandelt wurden. Diese Wirkung wird durch das Injizieren von DC, die sowohl mit dem Myelin-Antigen und dem α-Glycosylceramidderivat behandelt worden sind, beobachtet, aber nicht beim Injizieren von DC, die entweder mit dem Myelin-Antigen oder mit dem α-Glycosylceramidderivat allein behandelt wurden. Die supprimierende Wirkung liegt über der Wirkung der systemischen Verabreichung des α-Glycosylceramidderivats allein.
Die vorstelligen Erfinder haben auch herausgefunden, dass Symptome vom Typ II Collagen-induzierter Arthritis (CIA) als ein Modell für die rheumatoide Arthritis merklich durch die Injektion von DC unterdrückt werden, die mit Typ II Collagen vom Rind und einem α-Glycosylceramidderivat behandelt worden sind.
Des Weiteren haben die Erfinder gefunden, dass die Induktion spezifischer Antigen-spezifischer cytotoxischer CD8-positiver T-Lymphozyten (CTL) durch Injizieren von DC unterdrückt wird, die mit diesem Antigen und dem α-Glycosylceramidderivat behandelt wurden.
Daher haben die Erfinder gefunden, dass die Immunreaktion von CD4-positiven T-Zellen oder CD8-positiven T-Zellen durch Injizieren von DC, die mit einem Antigen und einem α-Glycosylceramidderivat behandelt worden sind, in unterdrückender Weise reguliert werden kann.
Zusätzlich haben die Erfinder herausgefunden, dass die Immunreaktion von CD4-positiven T-Zellen oder CD8-positiven T-Zellen durch die Injizierung von DC unterdrückenderweise reguliert werden kann, die mit einem Antigen behandelt worden sind, und mit DC, die mit einem α-Glycosylceramidderivat behandelt worden sind, wenn sie in Kombination verwendet werden. Die vorliegende Erfindung beruht auf diesen Befunden.
Demgemäß sind die Ziele der vorliegenden Erfindung die medizinische Verwendung einer dendritischen Zelle, die in der Lage ist, die T-Zell-abhängige Immunreaktion, welche für ein Antigen spezifisch ist, zu unterdrücken (ein Verfahren zur Herstellung ist ebenfalls beschrieben) und die medizinische Verwendung einer Zellmischung, die in der Lage ist, die T-Zell-abhängige Immunreaktion, die für ein Antigen spezifisch ist, zu unterdrücken. Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die diese dendritische Zelle oder diese Zellmischung umfasst, ist ebenfalls beschrieben.
Die dendritische Zelle ist eine dendritische Zelle, die in der Lage ist, die T-Zell-abhängige Immunreaktion, die für ein Antigen spezifisch ist, zu unterdrücken, welche ein Antigenfragment dieses Antigens präsentiert, welches in der Immunreaktion einer T-Zelle präsentiert wird, und ein α-Glycosylceramidderivat.
Des Weiteren ist das Produktionsverfahren ein Verfahren zur Herstellung einer dendritischen Zelle, welche in der Lage ist, die T-Zell-abhängige Immunreaktion zu unterdrücken, die für ein Antigen spezifisch ist, welche ein Antigenfragment dieses Antigens, das einer T-Zelle in dieser Immunreaktion präsentiert wird, und ein α-Glycosylceramidderivat präsentiert, umfassend den Schritt des Kultivierens der dendritischen Zelle in Gegenwart eines α-Glycosylceramidderivats.
Zusätzlich ist die Zellmischung eine Zellmischung, die in der Lage ist, die T-Zell-abhängige Immunreaktion, die für ein Antigen spezifisch ist, zu unterdrücken, was umfasst, dass dendritische Zellen, die mindestens ein Antigenfragment des Antigens präsentieren, welches T-Zellen in der Immunreaktion präsentiert wird, und dendritische Zellen, die mindestens ein α-Glycosylceramidderivat präsentieren.
Außerdem ist die pharmazeutische Zusammensetzung eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung einer Erkrankung, die durch eine T-Zell-abhängige Immunantwort induziert wird, umfassend die dendritische Zelle oder die Zellmischung. Ein neues Verfahren zur Behandlung einer Vielzahl von Erkrankungen, die durch T-Zell-abhängige Immunreaktion induziert werden, wird vorgestellt.
1 stellt die Unterdrückung der Entwicklung von EAE durch die Verabreichung von DC dar, welche mit KRN7000 und in MOG-Peptid-Antigen beladen worden sind.
2 stellt die Unterdrückung des Anstiegs des Körpergewichts dar, was mit der Entwicklung von EAE zusammenhängt, durch Verabreichung von DC, die mit KRN7000 und MOG-Peptid-Antigen beladen wurden.
3 stellt Anti-Tumorwirkungen durch die Verabreichung von DC dar, welche mit Tumor-Antigen beladen wurden, und die Unterdrückung der Anti-Tumor-Aktivitäten durch Verabreichen von DC, welche mit KRN7000 und Tumor-Antigen beladen wurden.
4 stellt die induzierbare Produktion von Antigenspezifischem Interferon 7, durch Verabreichung von DC dar, die mit Tumor-Antigen beladen wurden, und die unterdrückte Produktion des Interferons durch DC, die mit KRN7000 und Tumor-Antigen beladen wurden.
5 stellt die Unterdrückung der durch Typ II Collagen-induzierten Arthritis dar, indem DC verabreicht werden, die mit KRN7000 und Antigen beladen wurden.
6 stellt die Unterdrückung der Abnahme des Körpergewichts dar, welche mit der Entwicklung der Typ II Collagen-induzierten Arthritis zusammenhängt, durch die Verabreichung von DC, welche mit KRN7000 und Antigen beladen wurden.
7 stellt die Unterdrückung der EAE durch Verabreichung von DC, die sowohl mit KRN7000 und MOG-Peptid-Antigen beladen wurden, oder durch die Verabreichung einer Zellmischung von DC, die mit KRN7000 allein und DC, die mit MOG-Peptid allein beladen wurden nach Induktion der EAE dar.
8 stellt die Unterdrückung der Abnahme des Körpergewichts, das mit der Entwicklung von EAE zusammenhängt, durch Verabreichen von DC dar, welche sowohl mit KRN7000 und MOG-Peptid-Antigen beladen wurden, oder durch Verabreichung einer Zellmischung von DC, die mit KRN7000 allein und DC, die mit MOG-Peptid-Antigen allein beladen wurden.
9 stellt die Unterdrückung der Entwicklung einer verzögerten Hypersensitivität dar, welche durch OVA als Antigen verursacht wird, durch Verabreichung von DC, welche mit sowohl mit KRN7000 und OVA-Antigen beladen wurden.
Auf der dendritischen Zelle (DC) wird ein Antigenfragment eines Antigens, das T-Zellen in einer T-Zell-abhängigen Immunreaktion präsentiert wird, die für das Antigen spezifisch ist, und ein α-Glycosylceramidderivat präsentiert. Dadurch ist die DC in der Lage, die T-Zell-abhängige Immunreaktion, die für das Antigen spezifisch ist, zu unterdrücken. Die T-Zelle ist vorzugsweise, aber nicht beschränkt auf, CD4-positive T-Zellen und/oder CD8-positive T-Zellen.
Die Zellmischung umfasst dendritische Zellen, welche mindestens ein Antigenfragment eines Antigens präsentieren, das einer T-Zelle in einer T-Zell-abhängigen Immunreaktion, die für das Antigen spezifisch ist, präsentiert wird, und dendritische Zellen, die mindestens ein α-Glycosylceramidderivat präsentieren. Dadurch ist die Zellmischung in der Lage, die T-Zell-abhängige Immunreaktion, die für das Antigen spezifisch ist, zu unterdrücken. Die T-Zelle ist vorzugsweise, aber nicht beschränkt auf, eine CD4-positive T-Zelle und/oder CD8-positive T-Zelle.
In einer Ausführungsform umfasst die Zellmischung dendritische Zellen, die das Antigenfragment präsentieren (nachfolgend als „spezifische Antigen präsentierende DC" bezeichnet), und dendritische Zellen, die das α-Glycosylceramidderivat präsentieren (nachfolgend bezeichnet als „α-Glycosylceramidderivat präsentierende DC"). In einer anderen Ausführungsform umfasst die Zellmischung die spezifische Antigen präsentierende DC und/oder die α-Glycosylceramidderivat präsentierende DC und die DC.
DCs, die in der Zellmischung enthalten sind, sind auch in der Lage, die T-Zell-abhängige Immunreaktion zu unterdrücken, die für ein Antigen spezifisch ist, selbst wenn diese DCs in Kombination verwendet werden, und nicht in Form einer Mischung. Daher stellt die vorliegende Erfindung in einem weiteren Aspekt die medizinische Verwendung einer Kombination aus dendritischen Zellen dar, die in der Lage sind, die T-Zell-abhängige Immunreaktion, die für ein Antigen spezifisch ist, zu unterdrücken, welche umfasst, dass dendritische Zellen, die mindestens ein Antigenfragment präsentieren, das von diesem Antigen stammt, welches einer T-Zelle in dieser Immunreaktion präsentiert wird, und dendritische Zellen, die mindestens ein α-Glycosylceramidderivat präsentieren. Die T-Zelle ist vorzugsweise, aber nicht beschränkt auf, CD4-positive T-Zellen und/oder CD8-positive T-Zellen.
In einer Ausführungsform umfasst die Kombination die spezifische Antigen präsentierende DC und die α-Glycosylceramidderivat präsentierende DC. In einer anderen Ausführungsform umfasst die Kombination die spezifischen Antigen präsentierenden DC und/oder die α-Glycosylceramidderivat präsentierenden DC, und die DC gemäß der vorliegenden Erfindung.
Das α-Glycosylceramidderivat ist vorzugsweise, aber nicht beschränkt auf, die Verbindung, die in der folgenden Formel (I) dargestellt wird, oder ein Salz oder Solvat davon:
worin
R¹ H oder OH darstellt,
X eine ganze Zahl zwischen 7 und 27 darstellt,
R² einen Substituenten ausgewählt aus der Gruppe, die aus den folgenden (a) bis (e) besteht (worin Y eine ganze Zahl zwischen 5 und 17 ist), darstellt:

(a) -CH₂(CH₂)_YCH₃
(b) -CH(OH)(CH₂)_YCH₃
(c) -CH(OH)(CH₂)_YCH(CH₃)₂
(d) -CH=CH(CH₂)_YCH₃
(e) -CH(OH)(CH₂)_YCH(CH₃)CH₂CH₃, und

³

⁹

i) wenn R³, R⁶ und R⁸ H darstellen, stellt R⁴ H, OH, NH₂, NHCOCH₃ oder einen Substituenten dar, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den folgenden Gruppen (A) bis (D) besteht:
R⁵ OH oder einen Substituenten darstellt, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den folgenden Gruppen (E) und (F) besteht:
R⁷ OH oder einen Substituenten darstellt, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den folgenden Gruppen (A) bis (D) besteht:
R⁹ H, CH₃, CH₂OH oder einen Substituenten darstellt, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den folgenden Gruppen (A') bis (D') besteht:
ii) wenn R³, R⁶ und R⁷ H darstellen, stellt R⁴ H, OH, NH₂, NHCOCH₃ oder einen Substituenten dar, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den folgenden Gruppen (A) bis (D) besteht:
R⁵ stellt OH oder einen Substituenten dar, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den folgenden Gruppen (E) und (F) besteht:
R⁸ stellt OH oder einen Substituenten dar, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den folgenden Gruppen (A) bis (D) ausgewählt ist:
R⁹ stelt H, CH₃, CH₂OH oder einen Substituenten dar, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den folgenden Gruppen (A') bis (D') besteht:

In den Verbindungen der Formel (I) stellt X im Ceramidrest vorzugsweise eine ganze Zahl zwischen 11 und 25 dar. Y in R² stellt vorzugsweise eine ganze Zahl zwischen 9 und 17 dar, mehr bevorzugt zwischen 11 und 15.
Die bevorzugte Kombination für X und R² in dem Ceramidrest der Formel (I) sind Verbindungen, in denen X eine ganze Zahl zwischen 21 und 25 ist, und R² ein Substituent (b) ist (wobei Y eine ganze Zahl zwischen 11 und 15 ist), und Verbindungen, in denen X eine ganze Zahl zwischen 9 und 13 ist, und R² der Substituent (a) ist (wobei Y eine ganze Zahl zwischen 11 und 15 ist).
Bevorzugte Kombinationen für R³ bis R⁹ im Zuckerrest der Formel (I) sind Verbindungen, in denen R³ und R⁶ H sind, R⁴ OH ist oder irgendein Substituent der Gruppen (A) bis (D), R⁵ OH ist oder irgendein Substituent der Gruppen (E) oder (F), R⁷ und R⁸ jeweils H oder OH sind (aber R⁷ und R⁸ sind voneinander verschieden), und R⁹ ist CH₂OH, CH₃, H oder irgendein Substituent aus den Gruppen (A') bis (D').
Bevorzugtere Kombinationen schließen Verbindungen ein, in denen R³ und R⁶ H sind, R⁴ und R⁵ OH sind, R⁷ und R⁸ jeweils H oder OH sind (aber R⁷ und R⁸ sind voneinander verschieden), und R⁹ CH₂OH ist oder irgendein Substituent der Gruppen (A') bis (D'), und Verbindungen, in denen R³, R⁶ und R⁸ H sind, R⁴, R⁵ und R⁷ OH und R⁹ CH₂OH sind.
Bevorzugte Beispiele der Verbindungen der Formel (I) schließen Verbindungen ein, in denen X eine ganze Zahl zwischen 21 und 25 ist, R² ein Substituent (b) ist (wobei Y eine ganze Zahl zwischen 11 und 15 ist), R³ und R⁶ H sind, R⁴ OH ist oder eine Gruppe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Gruppen (A) bis (D), R⁵ OH ist oder eine Gruppe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Gruppen (E) und (F), R⁷ und R⁸ jeweils H oder OH sind (aber R⁷ und R⁸ sind beide nicht der gleiche Substituent), und R⁹ ist CH₂OH oder eine Gruppe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Gruppen (A') bis (D').
Weitere bevorzugte Beispiele der Verbindungen der Formel (I) schließen Verbindungen ein, in denen X eine ganze Zahl zwischen 9 und 13 ist, R² Substituent (a) ist (worin Y eine ganze Zahl zwischen 11 und 15 ist), R³ und R⁶ H sind, R⁴ und R⁵ OH sind, R⁷ und R⁸ jeweils H oder OH sind (aber R⁷ und R⁸ sind beide nicht der gleiche Substituent), und R⁹ ist H, CH₃ oder CH₂OH.
Weitere bevorzugte Beispiele für Verbindungen der Formel (I) schließen Verbindungen ein, in denen X eine ganze Zahl zwischen 21 und 25 ist, R² Substituent (b) ist (wobei Y eine ganze Zahl zwischen 11 und 15 ist), R³ und R⁶ H sind, R⁴ und R⁵ OH sind, R⁷ und R⁸ jeweils H oder OH sind (aber R⁷ und R⁸ sind beide nicht der gleiche Substituent), und R⁹ ist CH₂OH oder eine Gruppe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Gruppen (A') bis (D').
Weitere bevorzugte Beispiele für Verbindungen der Formel (I) schließen Verbindungen ein, in denen X eine ganze Zahl zwischen 21 und 25 ist, R² Substituent (b) ist (wobei Y eine ganze Zahl zwischen 11 und 15 ist), R³, R⁶ und R⁸ sind H, R⁴, R⁵ und R⁷ sind OH und R⁹ ist CH₂OH.
Mehr bevorzugte Beispiele der Verbindungen der Formel (I) schließen ein:
(2S,3S,4R)-1-(α-D-Galactopyranosyloxy)-2-hexacosanoylamino-3,4-octadecanediol (KRN7000),
(2S,3R)-1-(α-D-Galactopyranosyloxy)-2-tetradecanoylamino-3-octadecanol (AGL-517)
(2S,3R)-1-(α-D-Glucopyranosyloxy)-2-tetradecanoylamino-3-octadecanol (AGL-563),
(2S,3R)-1-(6'-Deoxy-α-D-galactopyranosyloxy)-2-tetradecanoylamino-3-octadecanol (AGL-571),
(2S,3R)-1-(b-L-Arabinopyranosyloxy)-2-tetradecanoylamino-3-octadecanol (AGL-577),
O-α-D-Galactopyranosyl-(1-6)-O-α-D-galactopyranosyl-(1-1)-(2S,3S,4R)-2-amino-N-hexacosanoyl-1,3,4-octadecantriol (AGL-586),
O-α-D-Galactopyranosyl-(1-6)-O-α-D-glucopyranosyl-(1-1)-(2S,3S,4R)-2-amino-N-hexacosanoyl-1,3,4-octadecantriol (AGL-584),
O-α-D-Galactopyranosyl-(1-2)-O-α-D-galactopyranosyl-(1-1)-2S,3S,4R)-2-amino-N-[(R)-2-hydroxytetracosanoyl]-1,3,4-octadecantriol (S1140B-9),
O-α-D-Galactofuranosyl-(1-3)-O-α-D-galactopyranosyl-(1-1)-2S,3S,4R)-2-amino-N-[(R)-2-hydroxytetracosanoyl]-1,3,4-octadecantriol (719-7), und
O-(N-Acetyl-2-amino-2-deoxy-α-D-glactopyranosyl-(1-3)-O-[α-D-glucopyrariosyl-(1-2)]-O-α-D-galactopyranosyl-(1-1)-(2S,3S,4R)-2-amino-N-[(R)-2-hydroxytetracosanoyl]-1,3,4-octadecantriol (STL-8).
Eine besonders bevorzugte Verbindung, die als wirksamer Inhaltsstoff in therapeutischen Mitteln gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist (2S,3S,4R)-1-(α-D-Galactopyranosyloxy)-2-hexacosanoylamino-3,4-octadecandiol (KRN7000).
Die Verbindungen der Formel (I) können in Form eines pharmazeutisch annehmbaren nicht-toxischen Salzes davon vorliegen. Salze der Verbindungen der Formel (I) schließen Säure-Additionssalze ein, wie beispielsweise Salze mit anorganischen Säuren (z. B. Salzsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure und Phosphorsäure), oder mit organischen Säuren (z. B. Essigsäure, Propionsäure, Äpfelsäure, Oleinsäure, Palmitinsäure, Zitronensäure, Bernsteinsäure, Tartarsäure, Fumarsäure, Glutaminsäure, Pantothensäure, Laurylsulfonsäure, Methansulfonsäure und Phthalinsäure). Die Verbindungen der Formel (I) können ebenfalls in Form von Solvaten davon vorliegen (z. B. als Hydrate).
Die Verbindungen der Formel (I) können durch irgendein zweckgerichtetes Verfahren hergestellt werden, um α-Glycosylceramide zu synthetisieren. Zuerst wird ein Ceramidrest unter Verwendung von D-Lyxose als Ausgangsmaterial synthetisiert, dann wird ein Zucker in dieses Ceramid eingeschleust, um Verbindungen der Formel (I) herzustellen. Ein allgemeines Verfahren, um derartige α-Glycosylceramide zu synthetisieren, kann beispielsweise in WO 93/5055 , WO 94/2168 , WO/9020 und WO 94/24142 gefunden werden. Die Verbindungen der Formel (I) können aus natürlichen Produkten (z. B. biologischen Organismen) isoliert werden, und mittels Säulenchromatographie oder ähnlichen gereinigt werden.
Das von den DC präsentierte Antigenfragment ist ein Antigenfragment, das T-Zellen in der ins Ziel genommenen T-Zell-abhängigen Immunreaktion präsentiert wird, welche für das Antigen spezifisch ist. Ein derartiges Antigenfragment kann durch Fachleute auf dem Gebiet in Übereinstimmung mit der gewünschten Immunreaktion entsprechend ausgewählt werden. Um beispielsweise eine Immunreaktion, die an einer Autoimmunerkrankung beteiligt ist, zu unterdrücken, kann das verwendete Antigenfragment ein Fragment eines Antigens sein, das in Geweben oder Organen vorhanden ist, die mit der Erkrankung in Verbindung stehen. Um die Immunreaktion, die an einer Transplantatabstoßung oder einer Transplantat-gegen-Wirt-Erkrankung beteiligt ist, zu unterdrücken, kann das verwendete Antigenfragment gegebenenfalls ein Fragment eines Antigens sein, das von einem Donor oder Empfänger stammt. Um die Immunantwort zu unterdrücken, die an allergischen Erkrankungen beteiligt ist, kann das verwendete Antigenfragment ein Fragment eines Antigens sein, das die Erkrankung verursacht, oder das Antigen, welches durch exogene Substanzen modifiziert worden ist, und dadurch eine neue Antigenizität gewonnen hat, sein.
Erfindungsgemäß verwendete DC sind vorzugsweise, aber nicht beschränkt auf, eine dendritische Zelle, die von einem Tier, das zu behandeln ist, stammt. Das Tier ist vorzugsweise ein Säuger, mehr bevorzugt ein Mensch. Die menschliche DC ist vorzugsweise eine aus einem Monocyten stammende DC (Beatrice Thurner, Gerold Schuler et al., J. Exp. Med. 1999, 190 (11): 1669–1678; Axel Heiser, Eli Gilboa et al. J. Clin. Invest. 2002, 109 (3) : 409–417), eine menschliche periphere Blut-DC (Small El., L. Clin. Oncol. 2000, 18 (23): 3894–3903), oder eine von einer menschlichen CD34 positiven Zelle abstammende DC (Caux C, Jacques Banchereau et al., Blood 1997, 90 (4): 1458–1470).
In den erfindungsgemäß verwendeten DC werden das Antigenfragment und das α-Glycosylceramidderivat vorzugsweise durch das MHC-Molekül bzw. das CD1d-Molekül präsentiert.
Die DC wird ex vivo hergestellt. Ein Verfahren zur Herstellung von DC ist beschrieben, und umfasst den Schritt des Kultivierens dendritischer Zellen in Gegenwart von α-Glycosylceramidderivat. In einem anderen Aspekt ist die Verwendung eines α-Glycosylceramidderivats zur Herstellung von DC beschrieben. Die Menge an α-Glycosylceramidderivat, die verwendet wird, kann von Fachleuten auf dem Gebiet entsprechend bestimmt werden, und beträgt vorzugsweise, aber nicht beschränkt auf, die Konzentration von 1–1.000 ng/ml, mehr bevorzugt 10–100 ng/ml. Die Kulturdauer kann von Fachleuten auf dem Gebiet entsprechend bestimmt werden, und beträgt bevorzugt 1–10 Tage einschließlich des letzten Tages der Kultur, ist aber nicht darauf beschränkt.
Um die Immunreaktion bei einer Transplantatabstoßung oder einer Transplantat-gegen-Wirt-Erkrankung zu unterdrücken, können die aus dem Donor oder Empfänger stammenden dendritischen Zellen, die bereits das benötigte Antigen präsentiert haben, verwendet werden, um die DC herzustellen, die an den Empfänger oder Donor zu verabreichen sind. Um gleichermaßen die Immunreaktion in anderen Erkrankungen zu unterdrücken, können die aus dem Patienten stammenden dendritischen Zellen, die bereits das benötigte Antigen präsentiert haben, verwendet werden, um die DCs für die Verabreichung an den Patienten herzustellen. In diesen Fällen braucht nur der Kulturschritt in Gegenwart von α-Glycosylceramidderivat in dem Herstellungsverfahren durchgeführt werden.
Falls notwendig, kann das Herstellungsverfahren ferner den Schritt der Kultivierung der dendritischen Zellen in Gegenwart des Antigens oder den Antigenfragments umfassen. Wenn die DC unter Verwendung dendritischer Zellen hergestellt wird, welche nicht das benötigte Antigen präsentieren, ist dieser Schritt notwendig. Die Menge an Antigen oder Fragment, die verwendet wird, kann von Fachleuten auf dem Gebiet entsprechend bestimmt werden und liegt vorzugsweise in dem Bereich von 1 μg–10 mg/ml, mehr bevorzugt 10 μg–2 mg/ml, am meisten bevorzugt 10–100 μg/ml, ist jedoch nicht darauf beschränkt. Die Kulturdauer kann durch Fachleute auf dem Gebiet entsprechend bestimmt werden und beträgt vorzugsweise 1–10 Tage einschließlich des letzten Tages der Kultivierung, ist aber nicht darauf beschränkt. Das Antigenfragment kann auch auf dendritischen Zellen unter Verwendung von DNA oder RNA präsentiert werden, welche das Antigen oder Antigenfragmentoder modifizierte Derivate davon anstelle des Antigens oder Antigenfragments kodieren, und eine derartige Präsentierung kann durch ein Verfahren durchgeführt werden, das Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt ist.
Die anderen Kulturbedingungen in jedem der oben beschriebenen Schritte können solche sein, die für eine gewöhnliche Zellkultur verwendet werden. D. h., die Bedingungen einschließlich der Mengen der Zellen oder der Zellfraktion, die zum Kulturmedium gegeben wird, die Kulturtemperatur, die CO₂-Konzentration und die Kulturdauer kann durch Fachleute auf dem Gebiet entsprechend passend eingestellt werden. Die Kulturtemperatur beträgt vorzugsweise ungefähr 37°C. Die CO₂-Konzentration kann nach Wunsch reguliert werden, und kann vorzugsweise ungefähr 5% betragen. Des Weiteren können Cytokine, einschließlich GM-CSF (z. B. 10 ng/ml) oder FCS (z. B. 1%) zu dem Kulturmedium zugegeben werden, falls dies gewünscht ist. Wenn beide der zwei Schritte durchgeführt werden, kann jeder Schritt zuerst durchgeführt werden, oder die beiden Schritte können nacheinander durchgeführt werden.
Die spezifischen Antigen präsentierenden DC und die α-Glycosylceramidderivat präsentierenden DC, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können ebenfalls durch das gleiche Verfahren, das oben beschrieben wurde, hergestellt werden. D. h., dass die spezifischen Antigen präsentierenden DC beispielsweise durch Durchführung des oben beschriebenen Schrittes der Kultivierung der dendritischen Zelle in Gegenwart eines Antigens oder eines Antigenfragments hergestellt werden können. Die α-Glycosylceramidderivat präsentierende DC kann beispielsweise durch die Durchführung des oben beschriebenen Schrittes der Kultivierung der dendritischen Zelle in Gegenwart von α-Glycosylceramidderivat hergestellt werden.
Die DC kann in einer Zelltherapie zum Zwecke der Behandlung einer Erkrankung verwendet werden, die durch eine T-Zell-abhängige Immunreaktion verursacht wird. Auf diese Weise kann die Erfindung für ein Verfahren zur Behandlung einer Erkrankung nützlich sein, das durch eine T-Zell-abhängige Immunreaktion verursacht wird, umfassend den Schritt der Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge der DC an ein Individuum. Die Individuen sind vorzugsweise Säuger, einschließlich menschlicher oder nicht menschlicher Säuger. Die T-Zelle ist vorzugsweise eine CD4-positive Zelle oder eine CD8-positive T-Zelle.
Des Weiteren kann die Zellmischung und die Kombination in der Zelltherapie zum Zwecke der Behandlung von Erkrankungen verwendet werden, die durch eine T-Zell-abhängige Immunreaktion induziert wird. Auf diese Weise kann die vorliegende Erfindung in einem Behandlungsverfahren einer Krankheit verwendet werden, welche duch eine T-Zell-abhängige Immunreaktion induziert wird, einschließlich eines Schritts der Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge der Zellmischung an ein Individuum. Des Weiteren kann die vorliegende Erfindung in einem Behandlungsverfahren einer Erkrankung nützlich sein, die durch eine T-Zell-abhängige Immunreaktion verursacht wird, umfassend einen Schritt der Verabreichung dendritischer Zellen in einer therapeutisch wirksamen Menge, die mindestens ein Antigenfragment oder ein Antigen präsentieren, das den T-Zellen in dieser Immunreaktion präsentiert wird, und dendritischer Zellen, die mindestens α-Glycosylceramidderivat, getrennt oder gleichzeitig präsentieren, an ein Individuum. Das Individuum sind bevorzugt Säuger, einschließlich menschlicher oder nicht menschlicher Säuger. Die T-Zelle ist vorzugsweise eine CD4-positive T-Zelle oder CD8-positive T-Zelle. In einer Ausführungsform umfasst das therapeutische Verfahren einen Schritt der Verabreichung der spezifischen Antigen präsentierenden DC und der α-Glycosylceramidderivat präsentierenden DC getrennt voneinander oder gleichzeitig. In einer anderen Ausführungsform umfasst das therapeutische Verfahren den Schritt der Verabreichung der spezifischen Antigen präsentierenden DC und/oder der α-Glycosylceramidderivat präsentierenden DC, und der DC, die beides präsentieren, in getrennter oder gleichzeitiger Weise. In der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden diese DCs gleichzeitig verabreicht.
Die Erkrankungen, die durch eine T-Zell-abhängige Immunreaktion verursacht werden, werden vorzugsweise aus der Gruppe ausgewählt, die aus Autoimmunerkrankungen, Transplantatabstoßung, Transplantat-gegen-Wirt-Erkrankung und allergischen Erkrankungen besteht. Die Autoimmunerkrankungen schließen beispielsweise ein: Multiple Sklerose, rheumatoide Arthritis, Typ I-Diabetes, Uveitis, autoimmune Myocarditis, Myasthenia gravis, Systemischen Lupus erythematosus, autoimmune hämolytische Anämie, systemische Sklerodermie, ulcerative Colitis, Morbus Crohn, Sjörgren's Syndrom, autoimmune Lebererkrankung (d. h. primäre biliäre Cirrhose), Psoriasis, idiopathische Thrombocytopenische purpurea, Goodpasture's Syndrom (z. B. Glomerulonephritis), perniciöse Anämie, Hashimoto's Erkrankung, Vitiligo vulgaris, Morbus Gehet, autoimmune Gastritis, Pemphigus, Guillain-Barré-Syndrom, HTLV-1 assoziierte Myelopathie und ähnliche. Die allergischen Erkrankungen schließen beispielsweise eine Kontakthypersensitivität, allergische Rhinitis, Lebensmittelallergie, Asthma und ähnliche ein. Die Hypersensitivitätsreaktion vom verzögerten Typ (DTH-Reaktion) ist typischerweise eine Th1-Antwort, welche als grundlegende Reaktion einer chronischen Entzündung in einer organspezifischen Autoimmunerkrankung angesehen wird. Die organspezifische Autoimmunerkrankung, in der eine Th1-Immunreaktion beteiligt ist, schließt hauptsächlich Multiple Sklerose, rheumatoide Arthritis, Typ I Diabetes, Uveitis, Autoimmun-Myocarditis, Morbus Crohn ein. Die allergischen Erkrankungen, in denen eine Th1-Immunantwort beteiligt ist, schließen die Kontakthypersensitivität und ähnliche ein. Die hierin beschriebenen DC können in einer therapeutisch wirksamen Menge auf einem Dosierungsweg verabreicht werden, der für gewöhnlich auf dem Fachgebiet der Zelltherapie verwendet wird. Der Dosierungsweg ist vorzugsweise, aber nicht beschränkt auf, die parenterale Verabreichung, mehr bevorzugt die intravenöse Verabreichung. Die therapeutisch wirksame Menge wird im Hinblick auf die Umstände des Individuums entsprechend bestimmt, wie beispielsweise des Alters, des Gewichts, des Geschlechts, der jeweiligen Erkrankung, der Ausmaße der Symptome und ähnlicher, und beträgt vorzugsweise, ist aber nicht beschränkt auf, 5 × 10⁵–10⁹, mehr bevorzugt 0,5–60 × 10⁶, mehr bevorzugt 2–20 × 10⁶, bezogen auf die DC-Fraktion. Zusätzlich kann die Terminierung der Verabreichung irgendeine sein, z. B. vor oder nach der Immunreaktion, und vor und nach der Entwicklung der Erkrankung, und vorzugsweise, aber nicht beschränkt auf, bei der Remission. Insbesondere bei der Behandlung der Transplantatabstoßung und der Transplantat-gegen-Wirt-Erkrankung, die an der Implantierung des Organs oder Gewebes beteiligt ist, ist eine Verabreichung vor dem Verfahren bevorzugt, von der diese Entwicklung erwartet wird.
Der Dosierungsweg und der Dosierungszeitraum der DC, die in der Zellmischung enthalten sind, oder in der Kombination, sind die gleichen, wie oben in Bezug auf die DC alleine beschrieben. Die therapeutisch wirksame Menge ist nicht besonders begrenzt, und wird im Hinblick auf die Umstände des zu behandelnden Individuums, wie beispielsweise des Alters, des Gewichts, des Geschlechts, der Art der Erkrankung, des Grades der Symptome und ähnlicher passend bestimmt. Die therapeutisch wirksame Menge wird vorzugsweise so festgelegt, dass die Gesamtlänge des Antigenfragments und des α-Glycosylceramidderivats, welche auf den DC präsentiert werden, die verabreicht werden sollen, bezüglich der oben erwähnten Menge bei DCs, die beide präsentieren, gleich ist. Beispielsweise ist die Dosierungsmenge jeder DC, wenn die Kombination spezifischer Antigen präsentierender DC und α-Glycosylceramidderivat präsentierender DC verabreicht wird, vorzugsweise 5 × 10⁵–10⁹, mehr bevorzugt 0,5–60 × 10⁶, am meisten bevorzugt 2–20 × 10⁶, bezogen auf die DC-Fraktion. Des Weiteren ist die Dosierungsmenge der spezifischen Antigen präsentierenden DC und der α-Glycosylceramidderivat präsentierenden DC, wenn die DC ebenfalls in Kombination verabreicht werden, vorzugsweise die Menge, die durch das Abziehen der DC, die beide präsentiert, aus jeder Dosierungsmenge, die oben beschrieben worden ist, gewonnen wird.
Zusätzlich stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung der oben beschriebenen DC zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung der oben beschriebenen Erkrankung bereit.
Des Weiteren stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung der Zellmischung, die oben beschrieben wurde, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung der oben beschriebenen Erkrankung bereit.
Außerdem stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung der Kombination, die oben beschrieben wurde, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung der oben beschriebenen Erkrankung bereit, d. h. eine Verwendung einer Kombination aus dendritischen Zellen zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Erkrankung, die durch eine T-Zell-abhängige Immunantwort verursacht wird, wobei diese Kombination aus dendritischen Zellen besteht, die mindestens ein Antigenfragment des Antigens, das T-Zellen in dieser Immunantwort präsentiert wird, besteht, und dendritischen Zellen, die mindestens α-Glycosylceramidderivat präsentieren.
Des Weiteren wird eine pharmazeutische Zusammensetzung für die Behandlung der Erkrankung, die oben beschrieben wurde, beschrieben, welche die oben beschriebenen DC umfasst.
Außerdem wird eine pharmazeutische Zusammensetzung beschrieben, die der Behandlung einer Erkrankung, die oben beschrieben wurde, dient, die die oben beschriebene Zellmischung umfasst.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können durch Fachleute auf dem Gebiet passend hergestellt werden, abhängig von dem Dosierungsweg und der Dosierungsmenge, die oben beschrieben wurde, oder nach den in der Zelltherapie gut bekannten Techniken.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird nun im Detail durch die folgenden Beispiele erklärt, aber die vorliegende Erfindung ist nicht auf diese Beispiele begrenzt.
Beispiel 1: Wirkung der immunregulierenden DC auf ein Autoimmun-Erkrankungsmodell
1-1: Induktion und Abtrennung von DC aus Knochenmarkzellen
Hüftknochen wurden aus C57BL/6 Mäusen im Alter von 6–8 Wochen ausgeschnitten und Hank's Lösung (Gibco BRL) wurde in die Hüftknochen durch eine Spritze injiziert, die mit einer 25G Nadel ausgestattet ist, um die Knochenmarkszellen auszuwaschen. Die Zellen wurden hämolysiert mit Ammoniumchloridpuffer (Sigma), um Erythrocyten zu entfernen, und dann auf eine Platte inokuliert, die mit menschlichem γ-Globulin beschichtet ist (Sigma). Die ausplattierten Zellen wurden unter gewöhnlichen Kulturbedingungen inkubiert, um Fc rezeptor-exprimierende Zellen zu entfernen und Voräuferzellen von DC aufzukonzentrieren. Die Zellen wurden in einem RPMI1640 Kulturmedium suspendiert, das mit GM-CSF (Kirin) (10 ng/ml), FCS (Hydone) (10%), HEPES-Puffer (Sigma) (10 mM) und 2-Mercaptoethanol (Gibco BRL) (50 μM) ergänzt ist und in einer 24-Well-Platte in Bedingungen bei 5% CO₂ bei 37°C kultiviert. Nach 2 und 4 Tagen des Beginns der Kultivierung wurde das folgende Verfahren zum Mediumwechsel und der Zellkonzentrierung durchgeführt. Der Mediumaustausch wurde durch vorsichtiges Suspendieren der Zellen mit einer Pasteur-Pipette, durch Entfernen von 3/4 des Überstands nach dem Absinken des Zellaggregats, und dem Zugeben des frischen Mediums, das oben beschrieben worden ist, welches Cytokine enthält, durchgeführt. 6 Tage nach dem Beginn der Kultivierung wurde das Verfahren bis zur Entfernung des Überstands in gleicher Weise durchgeführt, und alle verbliebenen Zellen wurden eingesammelt und als DC-Fraktion verwendet. Danach wurden magnetische Kügelchen, die mit einem anti-CD11c-Antikörper markiert sind (Miltenyi Biotec GmbH) zu der CD-Fraktion zugegeben, und DC wurden durch das Magnetzell-Abtrennungssystem (Miltenyi Biotec GmbH) abgetrennt.
1-2: Herstellung modifizierter DC
DC, die in Abschnitt 1-1 getrennt wurden, wurden in RPMI1640-Medium (enthaltend 10 ng/ml GM-CSF) kultiviert, welches ein oder zwei der Peptide enthält, die in Resten 35–55 des Myelinoligodendrocytenglycoprotein (MOG; Aminosäuresequenz: MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK) (10 μM) und KRN7000 (100 ng/ml) entspricht, für 2 Tage unter den Bedingungen von 5% CO₂ bei 37°C kultiviert (der Schritt, der MOG und/oder KRN7000 bereitstellt), um modifizierte DC zu gewinnen. In diesem Zusammenhang ist zu erwähnen, dass MOG ein Antigen ist, das später in der Immunisierung verwendet wird, welche eine experimentelle allergische Encephalitis (EAE) induziert.
1-3: Analyse der Merkmale der erhaltenen DC
Zellen, die in den Abschnitten 1-1 und 1-2 gewonnen wurden, wurden durch Färben mit den folgenden Antikörpern und Durchflusscytometrie dahingehend bestätigt, dass es DC sind. Genauer gesagt, ist CD11c, welche ein Marker ist, der für Maus-DC spezifisch ist, zur Analyse durch das folgende Verfahren gefärbt. anti-CD11c-Antikörper (BD Pharmigen) oder eine Isotypenkontrolle dafür, d. h. Hamster-IgG (BD Pharmigen) wurde zu den in Waschpuffer suspendierten Zellen (PBS, enthaltend 2% FCS/0,02% Natriumazid) suspendiert in einer Konzentration von 5 μg/ml für eine Reaktion bei 4°C für 30 Minuten, gewaschen und mittels Fluoreszenz-aktiviertem Cell-Sorter (FACS) analysiert. Es wurde für jede der oben beschriebenen Zellen bestätigt, dass CD11c-positive Zellen in einem Anteil von 97% oder mehr vorliegen, und dass die meisten DC sind. Der Anteil wurde selbst durch Zugabe von MOG oder KRN7000 nicht geändert. Zusätzlich ist mit Hilfe des Fluoreszenz-aktivierten Cell-Sorters (FACS) (BD Biosciences) unter Verwendung von anti-MHC Klasse II (I-A)-Antikörpern und anti-CD86-Antikörpern gezeigt worden, dass die meisten dieser Zellen MHC Klasse II (I-A) positiv und CD86 positiv sind.
1-4: Auswirkung auf die EAE
Die in den Abschnitten 1-1 und 1-2 gewonnenen DC wurden vor der Immunisierung mit Antigen zur Induktion von EAE verabreicht (drei Mal an den Tagen 7, 5 und 3 vor der Immunisierung; 1A), oder an einem Tag nach der Immunisierung (1B). Eine Gruppe, die mit Phosphatgepufferter Salzlösung behandelt wurde, eine Gruppe, die mit unbehandelten DC behandelt wurde, eine Gruppe, die mit DC behandelt wurde, welche mit KRN7000 beladen wurden, eine Gruppe, die mit DC behandelt wurden, welche mit MOG beladen wurden, und eine Gruppe, die mit DC behandelt wurden, welche sowohl mit KRN7000 als auch mit MOG beladen wurden, wurden als experimentelle Gruppen bereitgestellt. Jede der Gruppen, die mit den verschiedenen DCs behandelt wurden, wurden in zwei Untergruppen zur Verabreichung in den oben beschriebenen zwei Zeiträumen unterteilt. An Mäuse, die in der Gruppe waren, welche mit PBS behandelt wurde, wurde PBS anstelle von DC an beiden Tagen der DC-Verabreichung vor und nach der Immunisierung mit Antigen, verabreicht.
Die EAE wurde durch Verabreichung von 200 μl einer Antigen(MOG)-Emulsion auf intradermalem Wege in einem proximalen Teil des Schwanzes der C57BL/6-Mäuse im Alter von 9 Wochen und das intraperitoneale Verabreichen von 400 ng Pertussis-Toxin (Pertussis Toxin: Seikagaku Corporation) am nächsten Tag, induziert. Jede der Gruppen bestand aus 9–10 Mäusen. Zur Herstellung der Antigenemulsion wurde physiologische Salzlösung, die 100 μg/100 μl MOG und 600 μg/100 μl Mycobacterium tuberculosis H37RA (Difco) enthält, in einem gleichen Volumen Freund's kompletten Adjuvanz emulgiert.
Das Körpergewicht und die EAE-Symptome wurden für drei Wochen ausgehend vom Tag der Antigen-Immunisierung als Tag 0 beobachtet. Die EAE-Symptome wurden durch Skalierung in sechs Stufen beurteilt, die aus 0 = keine Symptome, 1 = Absenkung der Autokinese des Schwanzes, 2 = fehlen des Aufrichtungsreflexes, 3 = mittlere Paralyse der Hintergliedmaßen, 4 = vollständige Paralyse der Hintergliedmaßen, 5 = Quadriplegie, und 6 = Tod, beurteilt.
Das Ergebnis ist in 1 und 2 sowie Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1 zeigt die Werte verschiedener Parameter (gemittelter kumulativer EAE-Grad (AUC), gemittelter Entwicklungstag, gemittelter maximaler Grad, und Prozentsatz der Entwicklung), welche mit dem Symptom der EAE zusammenhängt.
In der Gruppe, die mit DC behandelt wurde, welche sowohl mit KRN7000 als auch MOG beladen wurde, wurde die Unterdrückung der Entwicklung der Symptome der EAE beobachtet, wenn die DC zu irgendeinem Zeitpunkt verabreicht wurden, und die unterdrückende Wirkung war in der Gruppe, die drei Male mit DC vor der Induktion von EAE behandelt wurde, ausgeprägter (1 und Tabelle 1). Zusätzlich war die EAE-unterdrückende Wirkung in der Gruppe, die mit DC behandelt wurde, welche sowohl mit KRN7000 als auch MOG beladen wurden, an der Unterdrückung der Körpergewichtsabnahme, die mit EAE verbunden ist (2) beteiligt, und nicht nur der gemittelte kumulative EAE-Grad (AUC: Bereich unter der Kurve), sondern auch an dem gemittelten maximalen Grad, und der Häufigkeit der Entwicklung (nur die Gruppe, die mit den DC drei Male vor der Induktion von EAE behandelt wurde) war signifikant verschieden von der Gruppe, die mit PBS behandelt wurde (Tabelle 1). In diesem Zusammenhang zeigte die Gruppe, die mit DC behandelt wurde, welche mit MOG beladen wurden, die drei Mal vor der EAE-Induktion stattfand, eine signifikante Unterdrückung des gemittelten kumulativen EAE-Grads, aber der Grad der Unterdrückung war geringer als bei der Gruppe, die mit DC behandelt wurden, welche mit KRN7000 und gleichzeitig MOG beladen wurden (Tabelle 1).
Beispiel 2: Unterdrückende Wirkung der immunregulatorischen DC auf die Induzierung zytotoxischer CD8-positiver T-Zellen (CTL)
2-1: Herstellung von DC, die mit OVA-Peptid als Antigen behandelt wurden
DC, die im Abschnitt 1-1 gewonnen wurden, wurden weiter in RPMI1640-Medium, enthaltend GM-CSF (10 ng/ml) bei 37°C unter der Bedingung von 5% CO₂ für zwei Tage kultiviert. Während der Kultivierung für zwei Tage wurden die DCs in zwei Gruppen unterteilt: behandelt oder nicht mit KRN7000 behandelt. Nach dem Austausch des Mediums durch RPMI1640-Medium enthaltend 1% FCS und der Zugabe des synthetischen OVA-Peptids (SIINFEKEL) (Quiagen), wurden die reifen DC unter gleichen Bedingungen für vier Stunden kultiviert. Die reifen DC, die nach vier Stunden eingesammelt wurden, wurden mit PBS gewaschen und die Konzentration wurde auf 5 × 10⁵ Zellen/ml eingestellt.
2-2: Auswirkungen von KRN7000 auf die therapeutische Wirkung bei Krebs durch DC, die mit OVA-Peptid als Antigen behandelt wurden
DC, die im Abschnitt 2-1 gewonnen wurden, wurden in PBS suspendiert, um die Konzentration von 1 × 10⁵ Zellen/200 μl pro Maus zu gewinnen, und intravenös in die Mäuse injiziert. Des Weiteren wurden 7 Tage später E.G7-Zellen (EL-4-Zellen, die mit dem OVA-Gen transfiziert sind) oder EL-4-Zellen als Kontrolle subkutan in die rechte Flanke der Maus injiziert, und das Volumen des Tumors wurde über den Verlauf der Zeit gemessen. Das Tumor-Volumen wurde als Länge × Breite × Höhe des Tumors/2 gerechnet.
Im Ergebnis war die Proliferation des Tumors in der Gruppe der Mäuse, die mit DC behandelt wurden, die nur mit dem OVA-Peptid beladen waren, beträchtlich inhibiert, während in der Gruppe, die mit DC behandelt wurden, die mit dem KRN7000 und dem OVA-Peptid beladen wurden, eine Proliferation beobachtet wurde, die über dem Tumor war, der in der unbehandelten Gruppe war, und so wurde eine merkliche Inhibierung der die Tumorproliferation unterdrückenden Wirkung beobachtet (3).
2-3: Auswirkung auf die Induktion der Peptid-spezifischen IFNγ-Produktion mit OVA-Peptid als Antigen
Milz-Lymphozyten wurden über die Zeit aus Mäusen, die mit DC behandelt wurden, welche in Schritt 2-1 gewonnen wurden, gesammelt (3, 5, 7 und 9 Tage später). Die Milz wurde in RMPI1640-Medium aufgequollen, und wurde mit einem Glas-Objektträger zerdrückt. Die gewonnenen Zellen wurden mit Puffer, der NH₄Cl enthält, hämolysiert, um Milz-Lymphozyten zu ergeben, welche in Click's Medium (Irvine Science) suspendiert wurden und unter den Bedingungen der Zugabe oder Nicht-Zugabe des OVA-Peptids für drei Tage kultiviert wurden, um die Produktion von IFNγ im Überstand mittels ELISA zu messen.
Im Ergebnis war die OVA-Peptid-spezifische IFNγ-Produktion mit einem Gipfel nach fünf Tagen nach Verabreichung in Mäusen beobachtet, die mit DCs behandelt wurden, auf die nur das OVA-Peptid geladen wurde, während eine OVA-Peptid-spezifische IFNγ-Produktion in Mäusen, die mit DC mit KRN7000 und OVA-Peptid gleichzeitig beladen, inhibiert war (4).
Beispiel 3: Auswirkungen auf die Typ II Collagen-induzierte Arthritis in Mäusen
Induktion und Abtrennung von Maus-DC wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1-1 durchgeführt.
Die abgetrennten DC wurden in RPMI1640-Medium (enthaltend 10 ng/ml GM-CSF) kultiviert, welches entweder eines oder beide des Rindertyp II Collagens (K-41, Collagen Gijutsu Kenshukai) (1 mg/ml) enthält, welches zuvor für 10 Minuten bei 95–100°C gekocht wurde und KRN7000 (100 ng/ml) für 2 Tage unter den Bedingungen von 5% CO₂ bei 37°C (ein Schritt, der K-41 und/oder KRN7000 ergibt), um modifizierte DC zu gewinnen. In diesem Zusammenhang sei erwähnt, dass Rinder Typ II Collagen ein Antigen ist, das später in der Immunisierung verwendet wird, die eine Typ II Collagen-induzierte Arthritis (CIA) induziert.
In den Experimenten wurden zehn männliche DBA/1JNCrj-Mäuse (11 Wochen alt) (Charles River Japan, Inc.) pro Gruppe verwendet. Zuerst wurde eine Emulsion aus einer gemischten Lösung aus 0,3% Rinder-Collagen Typ II-haltiger Lösung (5 ml) (K-41, Collagen Gijutsu Kenshukai), Mycobacterium tuberculosis H37Ra (15 mg) (Difco), physiologische Salzlösung (2,5 ml) (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) und unvollständigen Freund's Adjuvans (7,5 ml) (Difco) hergestellt. Das erhaltene Gemisch wurde als Antigen-Emulsion verwendet. Im nächsten Schritt wurde eine durch Collagen Typ II induzierte Arthritis (CIA) durch Injizieren von zwei Mal 0,1 ml der Antigen-Emulsion auf intradermalem Wege in den proximalen Teil des Schwanzes der Mäuse innerhalb eines Intervalls von drei Wochen induziert. Die Verabreichung von DC (1 × 10⁶ Zellen/Maus) in die Caudalvene der Mäuse wurde einen Tag nach der ersten Injektion des Antigens durchgeführt.
Das Körpergewicht und die arthritischen Symptome der Mäuse wurden ausgehend vom Tag der zweiten Antigen-Verabreichung als Tag 0 beobachtet. Die klinische Einteilung jeder Pfote wurde unter Bezugnahme auf die folgende Skala ermittelt: 0 = normal, 1 = Schwellung und/oder Erythem eines Zehs, 2 = Schwellung und/oder Erythem von zwei oder mehr Zehen, 3 = Schwellung und Erythem der gesamten Pfote, 4 = vollständige Schwellung und Erythem der gesamten Pfote und Unfähigkeit, das Gelenk zu beugen. CIA-Grade wurde als kumulativer Wert für alle Pfoten mit einem Maximum von 16 ausgedrückt.
Das Ergebnis ist in 5 und 6 gezeigt. Eine signifikante Unterdrückung der Arthritis-Symptome (gemittelter kumulativer CIA-Grad (AUC)) wurde in der Gruppe beobachtet, die mit DC behandelt wurden, welche sowohl mit KRN7000 und Collagen Typ II behandelt wurden (5). Des Weiteren schloss die Arthritis-unterdrückende Wirkung in der Gruppe, die mit DC behandelt wurden, welche mit sowohl KRN7000 als auch Collagen Typ II beladen wurden, die Unterdrückung der Körpergewichts-Abnahme ein, welche mit einer Arthritis verbunden ist (6).
Beispiel 4: Wirkung der Unterdrückung der Entwicklung von experimenteller Autoimmunencephalomyelitis (EAE) durch die gemischte Verabreichung von DC, die mit KRN7000 beladen wurden, und DC, die mit MOG-Peptid beladen wurden
DC, die wie in Beispiel 1-2 beschrieben, hergestellt wurden, wurden zwei Tage nach der Immunisierung mit Antigen zur Induktion von EAE verabreicht. Als experimentelle Gruppen wurde eine Gruppe mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) behandelt, zwei Gruppen wurden mit DC behandelt, welche mit sowohl KRN7000 und MOG beladen wurden, in Dosen von 5 × 10⁵ Zellen/Maus bzw. 1 × 10⁶ Zellen/Maus behandelt, und eine Gruppe wurde mit der Mischung aus DC behandelt, welche mit KRN7000 beladen waren (5 × 10⁵ Zellen/Maus) und DC, die mit MOG beladen sind (5 × 10⁵ Zellen/Maus) bereitgestellt und eine intravenöse Injektion bei allen der Gruppen wurde durchgeführt.
Die EAE wurde durch die Verabreichung von 200 μl einer Antigen(MOG)-Emulsion auf intradermalem Wege in den proximalen Teil des Schwanzes der C57BL/6-Mäuse im Alter von 9 Wochen induziert, und in dem intraperitoneal 400 ng Pertussis-Toxin (Pertussis Toxin: Seikagaku Corporation) am nächsten Tag verabreicht wurde. Jede der Gruppen besteht aus 9–10 Mäusen. Zur Herstellung der Antigen-Emulsion wurde physiologische Salzlösung, die 200 μg/100 μl MOG enthält und 600 μg/100 μl Mycobacterium tuberculosis H37RA (Difco) in einem gleichen Volumen von Freund's kompletten Adjuvans (Difco) emulgiert.
Das Körpergewicht und die EAE-Symptome wurden über vier Wochen ausgehend vom Tag der Antigen-Immunisierung als Tag 0 beobachtet. Die EAE-Symptome wurden durch Einteilen in sechs Grade beurteilt, von 0 = kein Symptom, 1 = verminderte Autokinese des Schwanzes, 2 = Fehlen des Aufrichtungsreflexes, 3 = mittlere Paralyse der Hintergliedmaßen, 4 = vollständige Paralyse der Hintergliedmaßen, 5 = Quadriplegie und 6 = Tod.

Das Ergebnis ist in 7 und 8 gezeigt, sowie in Tabelle 2. Tabelle 2 zeigt die Werte verschiedener Parameter (gemittelter kumulativer EAE-Grad (AUC), gemittelter Entwicklungstag, gemittelter maximaler Grad und Prozentsatz der Entwicklung), welche mit dem Symptom der EAE zusammenhängen. Tabelle 2: EAE-supprimierende Wirkung in den jeweiligen experimentellen Gruppen nach Induktion der EAE

Experimentelle Gruppe (verabreichtes Mittel)	n	Gemittelter kumulativer Grad (AUC)	Gemittelter Tag der Entwicklung	Gemittelter maximaler Grad	Prozentsatz) der Entwicklung (%)
PBS	10	41,6 ± 7,1	11,6 ± 3,9	2,1 ± 0,3	100
DC beladen mit KRN7000 + MOG (5 × 10⁵, i. v.)	10	24,5 ± 17,4*	15,7 ± 1,6*	1,4 ± 1,1	70
DC beladen mit KRN7000 + MOG (1 × 10⁶, i. v.)	10	13,0 ± 16,8**	21,5 ± 4,7**	0,7 ± 0,9**	40#
Die Mischung aus DC beladen mit MOG (5 × 10⁵) und DC beladen mit KRN7000 (5 × 10⁵)	10	15,5 ± 20,2**	17,5 ± 4,0*	0,8 ± 1,0**	40#

*p < 0,05 gegenüber der Gruppe der PBS-Verabreichung (Student'scher t-Test)
**p < 0,01 gegenüber der Gruppe der PBS-Verabreichung (Student'scher t-Test)
#p < 0,05 gegenüber der Gruppe der PBS-Verabreichung (χ²-Teilungstest)

In der Gruppe, die mit DC behandelt wurden, welche sowohl mit KRN7000 und MOG beladen wurden, war eine signifikante Unterdrückung der Entwicklung der EAE, abhängig von der Anzahl der verabreichten Zellen, zu beobachten, und in der Gruppe, die mit der Mischung aus DC behandelt wurden, welche mit KRN7000 beladen waren, und DC, die mit MOG beladen waren, wurde ebenfalls eine signifikante unterdrückende Wirkung der Entwicklung und Symptome der EAE beobachtet (7). Diese EAE-unterdrückenden Wirkungen wurden in signifikanter Form nicht nur einem gemittelten kumulativen EAE-Grad (AUC: Bereich unter der Kurve), sondern auch beim gemittelten Tag der Entwicklung, dem gemittelten maximalen Grad und dem Prozentsatz der Entwicklung im Vergleich mit der PBS-Gruppe beobachtet (Tabelle 2). Des Weiteren schließt die EAE-unterdrückende Wirkung die Unterdrückung der Körpergewichtsabnahme ein, die mit der EAE verbunden ist (8).
Beispiel 5: Auswirkung auf die Unterdrückung der Entwicklung der verzögerten Hypersensitivität (DTH-Reaktion), welche durch OVA als Antigen verursacht wird, durch Verabreichung von DC, welche sowohl mit KRN7000 und OVA-Antigen beladen wurden
DC, die in Abschnitt 1-1 abgetrennt wurden, wurden in RPMI1640-Medium kultiviert (enthaltend 10 ng/ml GM-CSF), welches entweder sowohl OVA (2 mg/ml) und KRN7000 (100 ng/ml) enthält für 2 Tage unter den Bedingungen von 5% CO₂ bei 37°C (ein Schritt, der OVA-Antigen und/oder KRN7000 bereitstellt), um modifizierte DC zu erhalten. In diesem Zusammenhang sei erwähnt, dass OVA ein Antigen ist, das später in der Immunisierung verwendet wird, welche die Hypersensitivität vom verzögerten Typ induziert (DTH-Reaktion).
DC, welche mit KRN7000 beladen war oder DC, welche mit sowohl KRN7000 als auch OVA-Antigen beladen wurden (1,5 × 10⁶ Zellen/Maus) wurden intravenös in C57BL/6-Mäuse an drei Zeitpunkten nach 7,5 und 3 Tagen vor der Immunisierung mit OVA injiziert. PBS (PBS-Gruppe) oder DC, welche mit nichts beladen wurden (nicht behandelte DC-Gruppe) wurden der Kontrollgruppe in gleicher Weise verabreicht. In diesem Experiment wurde eine Gruppe, die mit OVA nicht sensibilisiert worden war, zusätzlich zu der oben genannten Kontrollgruppe bereitgestellt. Des Weiteren wurde eine Gruppe, die mit Prednisolon behandelt wurde (0,2 mg/Maus an Prednisolon-Acetat (Shionogi & Co., Ltd.) an den Tagen 9, 10 und 11 nach der Immunisierung intraperitoneal injiziert) als positive Kontrollgruppe herangezogen. Fünf beziehungsweise zehn Mäuse wurden in der nicht mit OVA sensibilisierten Gruppe und den anderen Gruppen verwendet.
Die DTH-Reaktion mit OVA als Antigen wurde durch die Sensibilisierung durch intradermale Injektion einer Emulsion, die durch Zugeben von 100 μg Ovalbumin (OVA) zu vollständigen Freund'schen Adjuvans (CFA) (Sigma) in den Rücken der Mäuse zur Immunisierung am Tag 0 hergestellt wurde, und die Verabreichung der Lösung aus 10 μg OVA in 20 μl PBS in die Ohrmuschel nach 10 Tagen. Am nächsten Tag wurden die Ohrmuschel von Mäusen mit einem Durchmesser von 5 mm mit einem Zentrum des Teils, in das OVA injiziert worden war, durch Ausstanzen mit einem Stanzer für eine Hautbiopsie eingesammelt, das Gewicht hiervon wurde auf einer elektronischen Waage gemessen, und die Messung, die erhalten wurde, wurde als Index verwendet, die den Grad der DTH darstellt.
Im Ergebnis des oben beschriebenen Experimentes wurde eine signifikante unterdrückende Wirkung in der Gruppe, die mit DC, welche sowohl mit KRN7000 als auch dem OVA-Antigen beladen worden waren, auf die Schwellung der Ohrmuschel beobachtet, und die Wirkung war gleich oder höher als die unterdrückende Wirkung von Prednisolon als positive Kontrolle (9).

Claims

Verwendung einer dendritischen Zelle zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Erkrankung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Autoimmunerkrankung, Transplantatabstoßung, Transplantat-versus-Wirt-Erkrankung und allergischer Erkrankung, worin die dendritische Zelle ein Antigenfragment eines Antigens präsentiert, welches einer T-Zelle in einer T-Zell-abhängigen Immunantwort, die diese Erkrankung auslöst, präsentiert wird, und alpha-Glycosylceramidderivat.
Verwendung wie in Anspruch 1 beansprucht, worin das alpha-Glycosylceramidderivat eine Verbindung der Formel (I) ist:
worin R¹ H oder OH darstellt, X eine ganze Zahl zwischen 7 und 27 darstellt, R² einen Substituenten ausgewählt aus der Gruppe, die aus den folgenden (a) bis (e) besteht (worin Y eine ganze Zahl zwischen 5 und 17 ist), darstellt: (a) -CH₂(CH₂)_YCH₃ (b) -CH(OH)(CH₂)_YCH₃ (c) -CH(OH)(CH₂)_YCH(CH₃)₂ (d) -CH=CH(CH₂)_YCH₃ (e) -CH(OH)(CH₂)_YCH(CH₃)CH₂CH₃, und R³ bis R⁹ Substituenten darstellen, die in den folgenden i) oder ii) definiert sind: i) wenn R³, R⁶ und R⁸ H darstellen, stellt R⁴ H, OH, NH₂, NHCOCH₃ oder einen Substituenten dar, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den folgenden Gruppen (A) bis (D) besteht:
R⁵ OH oder einen Substituenten darstellt, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den folgenden Gruppen (E) und (F) besteht:
R⁷ OH oder einen Substituenten darstellt, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den folgenden Gruppen (A) bis (D) besteht:
R⁹ H, CH₃, CH₂OH oder einen Substituenten darstellt, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den folgenden Gruppen (A') bis (D') besteht:
ii) wenn R³, R⁶ und R⁷ H darstellen, stellt R⁴ H, OH, NH₂, NHCOCH₃ oder einen Substituenten dar, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den folgenden Gruppen (A) bis (D) besteht:
R⁵ OH oder einen Substituenten darstellt, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den folgenden Gruppen (E) und (F) besteht:
R⁸ OH oder einen Substituenten darstellt, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den folgenden Gruppen (A) bis (D) besteht:
R⁹ H, CH₃, CH₂OH oder einen Substituenten darstellt, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den folgenden Gruppen (A') bis (D') besteht:
oder ein Salz oder ein Solvat davon.
Verwendung wie in Anspruch 2 beansprucht, worin R³ und R⁶ H darstellen, R⁴ OH oder einen Substituenten irgendeiner der Gruppen (A) bis (D) darstellt, R⁵ OH oder einen Substituenten der Gruppen (E) oder (F) darstellt, R⁷ und R⁸ jeweils H oder OH darstellen, wobei sowohl R⁷ als auch R⁸ nicht den gleichen Substituenten darstellen, und R⁹ CH₂OH, CH₃, H oder einen Substituenten irgendeiner der Gruppen (A') bis (D') darstellt.
Verwendung wie in Anspruch 2 beansprucht, worin X eine ganze Zahl zwischen 21 und 25 darstellt und R² den Substituenten (b) darstellt, worin Y eine ganze Zahl zwischen 11 und 15 darstellt.
Verwendung wie in Anspruch 2 beansprucht, worin X eine ganze Zahl zwischen 9 und 13 darstellt und R² den Substituenten (a) darstellt, worin Y eine ganze Zahl zwischen 11 und 15 darstellt.
Verwendung wie in Anspruch 2 beansprucht, wobei eine Verbindung der Formel (I) (2S,3S,4R)-1-(α-D-Galactopyranosyloxy)-2-hexacosanoylamino-3,4-octadecandiol ist.
Verwendung einer Zellmischung zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Erkrankung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Autoimmunerkrankung, Transplantatabstoßung, Transplantat-versus-Wirt-Erkrankung und allergischer Erkrankung, worin diese Zellmischung dendritische Zellen umfasst, die mindestens ein Antigenfragment eines Antigens präsentieren, welches einer T-Zelle in einer T-Zell-abhängigen Immunantwort, die diese Erkrankung auslöst, präsentiert wird, und dendritischen Zellen, die mindestens alpha-Glycosylceramidderivat präsentieren.
Verwendung wie in Anspruch 7 beansprucht, wobei die Zellmischung dendritische Zellen umfasst, die dieses Antigenfragment präsentieren, und dendritische Zellen, die alpha-Glycosylceramidderivat präsentieren.
Verwendung wie in Anspruch 7 beansprucht, wobei die Zellmischung dendritische Zellen, die dieses Antigenfragment präsentieren, und/oder dendritische Zellen, die alpha-Glycosylceramidderivat präsentieren, und dendritische Zellen, die das Antigenfragment und alpha-Glycosylceramidderivat präsentieren, umfasst.
Verwendung wie in Anspruch 7 beansprucht, wobei das alpha-Glycosylceramidderivat eine Verbindung der Formel (I) oder ein Salz oder ein Solvat davon ist:
wobei R¹ bis R⁹ und X wie in Anspruch 2 definiert sind.
Verwendung wie in Anspruch 10 beansprucht, worin R³ und R⁶ H darstellen, R⁴ OH oder einen Substituenten irgendeiner der Gruppen (A) bis (D) darstellt, R⁵ OH oder einen Substituenten der Gruppen (E) oder (F) darstellt, R⁷ und R⁸ jeweils H oder OH darstellen, wobei sowohl R⁷ als auch R⁸ nicht den gleichen Substituenten darstellen, und R⁹ CH₂OH, CH₃, H oder einen Substituenten irgendeiner der Gruppen (A') bis (D') darstellt.
Verwendung wie in Anspruch 10 beansprucht, worin X eine ganze Zahl zwischen 21 und 25 darstellt und R² den Substituenten (b) darstellt, worin Y eine ganze Zahl zwischen 11 und 15 darstellt.
Verwendung wie in Anspruch 10 beansprucht, worin X eine ganze Zahl zwischen 9 und 13 darstellt und R² den Substituenten (a) darstellt, worin Y eine ganze Zahl zwischen 11 und 15 darstellt.
Verwendung wie in Anspruch 10 beansprucht, wobei eine Verbindung der Formel (I) (2S,3S,4R)-1-(α-D-Galactopyranosyloxy)-2-hexacosanoylamino-3,4-octadecandiol ist.
Verwendung einer Kombination aus dendritischen Zellen zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Erkrankungen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Autoimmunerkrankung, Transplantatabstoßung, Transplantat-versus-Wirt-Erkrankung und allergischer Erkrankung, worin diese Kombination aus dendritischen Zellen besteht, die mindestens ein Antigenfragment eines Antigens präsentiert, welches einer T-Zelle in einer T-Zell-abhängigen Immunantwort, die diese Erkrankung auslöst, präsentiert wird, und dendritischen Zellen, die mindestens alpha-Glycosylceramidderivat präsentieren.
Verwendung wie in Anspruch 15 beansprucht, worin die Kombination aus dendritischen Zellen, die dieses Antigenfragment präsentieren, und dendritischen Zellen, die das alpha-Glycosylceramidderivat präsentieren, besteht.
Verwendung wie in Anspruch 15 beansprucht, worin die Kombination aus dendritischen Zellen, die dieses Antigenfragment präsentieren, und/oder dendritischen Zellen, die das alpha-Glycosylceramidderivat präsentieren, besteht, und die dendritischen Zellen dieses Antigenfragment und alpha-Glycosylceramidderivat präsentieren.
Verwendung wie in Anspruch 15 beansprucht, worin das alpha-Glycosylceramidderivat eine Verbindung der Formel (I) oder ein Salz oder Solvat davon ist:
worin R¹ bis R⁹ und X wie in Anspruch 2 definiert sind.
Verwendung wie in Anspruch 18 beansprucht, worin R³ und R⁶ H darstellen, R⁴ OH oder einen Substituenten irgendeiner der Gruppen (A) bis (D) darstellt, R⁵ OH oder einen Substituenten der Gruppen (E) oder (F) darstellt, R⁷ und R⁸ jeweils H oder OH darstellen, wobei R⁷ und R⁸ nicht den gleichen Substituenten darstellen, und R⁹ CH₂OH, CH₃, H oder einen Substituenten irgendeiner der Gruppen (A') bis (D') darstellt.
Verwendung wie in Anspruch 18 beansprucht, worin X eine ganze Zahl zwischen 21 und 25 darstellt und R² den Substituenten (b) darstellt, worin Y eine ganze Zahl zwischen 11 und 15 darstellt.
Verwendung wie in Anspruch 18 beansprucht, worin X eine ganze Zahl zwischen 9 und 13 darstellt und R² den Substituenten (a) darstellt, worin Y eine ganze Zahl zwischen 11 und 15 darstellt.
Verwendung wie in Anspruch 18 beansprucht, worin eine Verbindung der Formel (I) (2S,3S,4R)-1-(α-D-Galactopyranosyloxy)-2-hexacosanoylamino-3,4-octadecandiol ist.