DD241268A5 - Verfahren zur herstellung von gegen htnf resistenten maeuse-l(r)-zellen - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von gegen hTNF resistenten Maeuse-L(R)-Zellen, das zur Krebsbehandlung angewendet werden kann. Ziel der Erfindung ist eine neue diagnostische Moeglichkeit zur Krebserkennung zu finden. Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Herstellung von gegen hTNF resistenten Maeuse-L(R)-Zellen bereitzustellen. Die Erfindungsaufgabe wird dadurch geloest, dass Maeuse-L(S)-Zellen wiederholt durch ein Medium geleitet wird, das hTNF enthaelt.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von gegen hTNF resistenten Mäuse-L(R)-Zellen, das zur Krebsbehandlung angewendet werden kann.
Der Beginn der Geschichte des Tumor-Nekrose-Faktors (TNF) liegt mehr als ein Jahrhundert zurück. Es wurde damals festgestellt, daß während gewisser bakterieller Infektionen beim Menschen gleichzeitig ein Rückgang von Tumoren zu verzeichnen war. Über vierzig Jahre lang behandelten COLEY und Mitarbeiter bösartige Erkrankungen beim Menschen mit zellfreien Bakterien-Fi!traten oder gemischten Bakterien-Vakzinen, wobei oft positive Ergebnisse erzielt wurden. Es wurden ferner auch Untersuchungen an Meerschweinchen und Mäusen durchgeführt. Der Antitumor-Effekt bei den Versuchstieren besteht aus einer schweren hämorrhagischen Reaktion im Kern des Tumors während der Bakterienbehandlung des Versuchstieres binnen vier Stunden. Auf den Antitumor-Effekt folgt ein langsamerer, nekrotisierender Effekt, dessen Intensität in den nächsten 48 Stunden zunimmt. Das Tumorgewebe wird dabei zunehmend dunkler, wodurch Absterben und Blutung angezeigt wird, die in vielen Fällen zu einem vollständigen Rückgang des Tumors führen. Diese plötzliche hämorrhagische Nekrose, die bei gewissen Tumoren durch gramnegative Bakterien oder durch aus deren Zellwänden gewonnenes Endotoxin (Lipopolysaccharide) gelöst wird, wurde lange als die experimentelle Ergänzung zu den klinischen Beobachtungen angesehen, die oben beschrieben sind.
Arbeiten, die am Sloan-Kettering-Institut durchgeführt wurden, führten jedoch zu dem Ergebnis, daß aufgrund der Reizung mit Bakterien ein Faktor freigesetzt wird, möglicherweise von Makrophagen, der direkt oder indirekt verantwortlich ist für das Absterben der Tumorzellen. Dieses Ergebnis wird durch Untersuchungen gestützt, die zeigen, daß die Injizierung des Serums BCG-infizierter Mäuse zusammen mit Endotoxin eine hämorrhagische Nekrose eines transplantierten Sarkoms Meth A und anderer Tumore auslöst. Serum von mit BCG-injizierten Mäusen oder Serum von normalen Mäusen, denen Endotoxin gegeben wurde, ist inaktiv. Endotoxin allein besitzt keine Toxizität für die meisten in vitro gehaltenen Tumorzellen. Der aktive Serum-Bestandteil wird Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) genannt.
DieTNF-Aktivität kann nicht auf restliches Endotoxin zurückgeführt werden, wie das pyrogene Verhalten, der Limulus-Test und die chemische Analyse auf Endotoxin-Teile zeigt. TNF ist im Gegensatz zum Endotoxin direkt cytotoxisch für gewisse in vitro Tumor-Zellen. Normale Kultur-Zellen bleiben unverletzt (Lloyd J. Old, New Developments in Cancer Therapy, MSKCC Clinical Bulletin 6:118 [1976], E. A. Carswell et al Proc. Nat'l Acad. Sei. USA 72 3666-70 Sept 1975). Andere Nagetiere, z. B. Ratten oder Kaninchen, bilden ebenso TNF, wenn ihnen BCG und zusätzlich Endotoxin verabreicht wird. TNF wurde zuerst in einem Serum von Mäusen gefunden, das mit Bacillus Calmette-Guerin (BCG) versetzt und 2-3 Wochen später mit Endotoxin von E. CoIi überprüft wurde. Weder BCG oder seine Gegenstücke (siehe unten) noch Endotoxin erzeugen allein denTNF-Faktorim Mäuse-Serum; es müssen beide anwesend sein. Um TNF freizusetzen, können bei der Injizierung von Mäusen anstelle von BCG C. granulosum, C. Parvum, Malaria oder Zymosan (Schaum-Zellwände) eingesetzt werden, die wie BCG eine massive Hyperplasie der Makrophagen und anderer zellulärer Elemente des reticulo-endothelial Systems induzieren. Diese Faktoren sind die Gegenstücke von BCG. Das nach der BCG- und Endotoxin-Behandlung gewonnene Serum ist deswegen atypisch, da es nicht vollständig gerinnt. Eine Vorschrift für die optimale Produktion und die Prüfung von TNF in Mäusen beinhaltet:
a) BCG: eine Injektion von 2 χ 107 lebensfähigen BCG-Organismen zur maximalen Stimulation und Hyperplasie des reticuloendothelial (RES) Systems,
b) Endotoxin: 14-21 Tage später, auf der Höhe der RES-Stimulation durch BCG, eine 0,25-25 Mikrogramm Injektion von Endotoxin (Lipopolysaccharide w von E.CoIi. Die höchste Dosis gibt die besten TNF-Spiegel in den Mäusen,
c) Sammlung von TNF:
die optimale Zeit hierfür ist 2 Stunden nach Verabreichung des Endotoxins (längere Zeiten sind weniger geeignet wegen eines durch Schock verursachten Kreislaufkollaps), und
d) TNF-Untersuchungen: 1. In Vivo:
Der nektrotische Effekt von TNF-positivem Mäuseserum auf BALb/c Meth A ascites Sarkom transplantiertin einen (BALb/c x C 57 BL/6) FrHybrid wird wie folgt demonstriert. Nach sieben Tagen wird der Effekt desTNF-positiven Serums ,, auf subcutanes in vivo Tumortransplantat während 24 Stunden abgeschätzt. Eine erste Reaktion ist nach 3-4 Stunden sichtbar. Bei 7-Tage-Transplantaten korrespondiert die nekrotische Reaktion allgemein mit dem Volumen des TNF-positiven Serums, das in Dosen von ungefähr 0,1-0,5ml verabreicht wird, + ++-Reaktion zeigt, daß das Tumorgewebe vollkommen oder nahezu vollständig zerstört ist, wobei nur ein peripherer Rand von anscheinend lebensfähigem Tumor-Zellgewebe zurückbleibt. 6-Tage-Transplantate reagieren weniger leicht, 5-Tage-Transplantate reagieren überhaupt nicht. 2. In Vitro: .
TNF-empfindliche L-M Zellen wurden aus geklonten Mäusezellen gewonnen. Diese Zellen sind unter der Nummer L929 bei der Hinterlegungsstelle American Type Culture Collection (ATCC) hinterlegt. Durch wiederholten Durchfluß von TNF-empfindlichen L-Zellen durch Medien, die TNF enthielten, wurde eineTNF-resistente Linie von L-Zellen erhalten. TNF wirkt cytotoxisch gegen TNF-empfindliche L-Zellen (L[S]), aber nicht gegen TNF-resistente L-Zellen (L[R]). Zur Untersuchung nimmt man 0,5 ml eines Mediums, das fortlaufende Verdünnungen von TNF enthält, und gibt es in Behälter (24 well Costar plates), die 2-3 Stunden vorher mit 50000 typsinierten L-Zellen in 0,5ml von Eagle's minimal essential medium besetzt werden. Danach bestimmt man den Gehalt an Protein, der einen 50%igen Zelltod zur Folge hat, geschätzt nach 48 Stunden durch Phasen-Mikroskop oder Trypanblau-Anschluß. In einer Standardprobe entspricht z. B. einer Einheit eines in vitro partiell gereinigten Mäuse-TNF58ng oder einer spezifischen Aktivität von 20000 Einheiten/mg Protein. Dieses partiell gereinigte Mäuse-TNF enthält kein IFN. Vor der Reinigung enthält das Original-Serum noch Interferon (IFN). Neben BCG können als Impfmittel auch noch C.granulosum, C.Parvum, Malaria oderZymosan (Zellwand vom Schaum) eingesetzt werden. Green et al., J. Nat'l. Cancer Inst. 59: 1 519 (1977) berichten, daß Mäuse 6 Tage nach der Injektion von C. Parvum ein Maximum an Überempfindlichkeit gegen Endotoxin erreichen. Bei dieser Methode wird vier Tage, nachdem C.Parvum injiziert wurde, Endotoxin verabreicht. Die Endotoxin-Dosen betragen 0,25 Mikrogramm, aber 25 Mikrogramm werden gebraucht, um TNF freizusetzen. 90 Minuten nach der intravenösen Injektion von einem Mikrogramm Endotoxin ist die TNF-Freisetzung am größten. Die TNF-Produktion variiert mit unterschiedlicher Färbung der Mäuse.
Endotoxin von gram-negativen Bakterien, wie E. CoIi, hat sich bis heute als das wirksamste Mittel herausgestellt, um TNF in vivo freizusetzen (Carswell et al, Supra). Der Einfluß von TNF zeigt sich bei einer Vielfalt von Mäuse-Tumorsystemen, und zwar bei: Sarkomen S-180 (CD-1 Swiss), BP8 (C3H); Leukemien EL4 (C57BI/6), ASLI (AStrain), RADA-I (A Strain), RLoI (BALb/c), und MastozytomenP815(DBA/2). Meth A ist höchst empfindlich gegen TNF, wenn der Tumor intradermal injiziertwirdwiebeiderin vivo Untersuchung. Über weniger empfindliche Tumore wurde auch berichtet: Reticulum-Zellsarkom RCS 5 (SJL) war resistent, Brust-Tumoreder Art (C3H/An χ I) F1 waren nur geringfügig empfindlich und AKR spontane Leukämien zeigten mittelmäßige Empfindlichkeit. Hieraus ist ersichtlich, daß Mäuse-TNF einen therapeutischen Einfluß auf Mäuse-Tumore besitzt (Carswell et al. Supra).
In vitro zeigten sich transformierte Murin-Fibroblasten (L-Zellen) in Kultur wesentlich empfindlicher gegen TNF als Meth A Sarcom-Zellen oder Mäuseembryo-Fibroblasten (MEF). Lebensfähige Zellen wurden auch nach 48stündiger Behandlung mit TNF gefunden. Der Einfluß ist hier sowohl zytotoxisch als auch zytostatisch. Er tritt aber verzögert auf, da er in den ersten 16 Stunden nicht sichtbar ist. Der Einfluß zeigt sich bei dem Meth A in vivo Test in einem Nekrose-Prozeß, der in dem Zentrum des Meth Α-Tumors beginnt und sich nach außen fortsetzt, wobei ein Rand von scheinbar nicht angegriffenem Tumor-Zellgewebe zurückbleibt. Von diesem Rückstand aus kann der Tumor weiter wachsen. Bei einem hohen Prozentsatz der Versuchtiere konnte durch Behandlung mit einer optimalen Dosis von TNF der Tumor vollständig unterdrückt werden. Der L-Zellen-Effekt ist die Grundlage für die in vitro Untersuchung, Supra. Eine resistente Linie von L-Zellen wurde dadurch entwickelt, daß man wiederholt TNF-empfindliche Zellen durch Medien leitete, die TNF enthielten. TNF ist zytotoxisch gegen empfindliche L-Zellen (L[S]), aber nicht gegen resistente L-Zellen (L[R]). Diese Untersuchungen wurden ferner benutzt für die Untersuchung auf hTNF (siehe unten).
Indirekte Anzeichen deuten insofern auf Makrophagen als Ursprungsquelle fürTNF bei Mäusen und Kaninchen, da Leber- und Milz-Makrophagen eine massige Hyperplasie durchmachen unter dem Einfluß von BCG (oder seinen Gegenstücken) und Endotoxin
Zusammengefaßt kann man daher sagen:
1. Mittel, die für die Freisetzung von TNF verantwortlich sind, bewirken eine merkliche Makrophagen-Hyperplasie
2. eine selektive Lysis von Milz-Makrophagen kann kurz nach derEndotoxin-lnjektion bei BCG-behandelten Mäusen beobachtet werden
3. Serum, das TNF enthält, ist reich an Enzymen von Lysosomen und bezeichnenderweise enthalten aktivierte Makrophagen eine Menge solcher Lysosomen.
Geklonte Linien von Mäuse-Histozytomen (J 774 and PU5-1.8) produzieren TNF gemäß ihrer Veranlagung. Die Produktion kann noch gesteigert werden, wenn dieZellinien Endotoxin ausgesetzt werden (Mannel et al. [1980] Infect. Immun. 30, 523-530 und Williamson et al. [nicht veröffentlicht]).
Mäuse-TNF, das aus dem Serum isoliert wird, ist ein Glykoprotein und liegt in mindestens zwei Formen vor, eine mit einem Molekulargewicht von 40-60000 und eine mit einem Molekulargewicht von 150000 (Mannel et al. [1980] Infect. Immun. 28, 204-211; KuII et al. [1981] Jpn J. Exp. Med., 51,191-194; Green, S. et al. [1976] Proc. Nat'l Acad. Sei. USA 73, 381-385 und unveröffentlichte Arbeiten). TNF ist im gefrorenen Zustand, vorzugsweise unterhalb -700C stabil. Seine Aktivität wird zerstört, wenn es für 30 Minuten bei 70°C gehalten wird. Bei Kaninchen wirkt TNF pyrogen in einem Bereich von 5-500 Mikrogramm pro kg und nichtpyrogen bei 5 Mikrogramm pro kg. Es wird berichtet, daß TNF ein Molekulargewicht im Bereich von annähernd
-3- Ζ4Λ Zbö
39-68kDalton hat (Ruff, M. R. et al. [1980] J. Immunol. 125,1671-1677; Matthews, N. et al. [1980] Br. J. Cancer 42,416-422; Matthews, N. et al. [1978] Brit. J. Cancer 38,302-309; Ostrove, J. M. et al. [1979] Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 160,354-358).
Als Ergebnis einer zuvor erfolgten Virusinfektion wird im Organismus von Tieren proteinhaltiges Interferon produziert. Das gebildete Interferon schützt das Tier gegen eine nachfolgende Virusinfektion. Es konnte gezeigt werden, daß IFN eine wichtige Rollein der Regelung des Immunsystems spielt. Interferon beeinflußt folgende Zellfunktionen: Es unterdrückt die Zellteilung, das Tumorwachstum, die Antikörperbildung, erythroide Differenzierung und Adipozyten-Differenzierung, während es die Makrophagen-Phagozytose, Lymphozyten-Toxizität, NK-ZeIIaktivität, den Antigen-Ausdruck an der Zelloberfläche und die Antikörperproduktion steigert. Weiterhin wurde gefunden, daß Interferon (IFN) ein mögliches Mittel zur Krebsbekämpfungist. Es gibt drei wichtige Interferon-Typen, nämlich alphra, beta und gamma, die sich untereinander durch ihre antigenen und biochemischen Eigenschaften unterscheiden. Alpha-Interferon wird abgesondert durch Leukozyten, Beta-Interferon durch Fibroblasten, wobei beide auch durch Viren induziert werden können. Gamma-Interferon wird abgesondert durch Lymphoidzellen und ist bekannt als „lmmun"-lnterferon (Stewart, W.E. II, et al., Nature 286,110 [1980]). Größere Antigen-Unterschiede bilden die hauptsächliche Basis, um die drei Interferon-Arten zu unterscheiden. Die Interferone unterscheiden sich zusätzlich noch in einigen biologischen und physiko-chemischen Eigenschaften. Menschliches Alpha- und Beta-Interferon wurden rein dargestellt und ihre Aminosäuresequenzen wurden bestimmt, teilweise durch direkte Aminosäure-Sequenzierung (Knight, E. Jr., et al., Science 207, 527-528 [1980]) und noch vollständiger durch Analyse der geklonten komplementären DNA-Sequenzen (Mantei, N, et al. Gene 10,1-10 [1980];Taniguchi, T., et al., Gene 10,11-15 [1980]). Der Vergleich von geklonten Alpha- und Beta-Interferon DNA-Sequenzen zeigt, daß bei den beiden Interferonen nur 29% der Aminosäuren übereinstimmen (Taniguchie, T., Mantei, N., et al.. Nature 285, 547-549 [1980]). Bei jedem der drei Interferon-Haupttypen treten molekulare Untergruppen auf, die weniger heterogen sind. Einige der Untergruppen des menschlichen Alpha-Interferons ließen sich durch Vergleich der geklonten DNA-Sequenzen feststellen (Nagata, S., et al., Natura 287 401-408 [1980]).
Sehr viel weniger Information liegt für das Gamma-Interferon vor. Dieses Interferon wird gewöhnlich in Überständen von Lymphozyten-Kulturen gefunden, die Mitogenen, z. B. verschiedenen Lektinen oder spezifischen Antigenen in Kulturen sensibilisierter Zellen, ausgesetzt sind. Die Definition von Gamma-IFN beruht auf zwei Hauptkriterien: (i) .im Gegensatz zu Alpha- und Beta-IFN ist die biologische Aktivität des Gamma-IFN bei einem pH-Wert von 2 weitgehend zerstört, und
(ii) eigens gegen Alpha- und Beta-IFN hergestellte Antisera zeigen keine Gegenreaktion mit Gamma-IFN. Zusätzlich lassen Experimente, die mit relativ unreinen Präparaten von Gamma-IFN durchgeführt wurden, auf eine Reihe von biologischen Unterschieden schließen. Zum Beispiel wurde gezeigt, daß Gamma-IFN den antiviralen Zustand viel langsamer induziert als Alpha- oder Beta-IFN (Dianzani, F.,etal., Natura 283,400-402 [1980]). Im Gegensatz dazu kann Gamma-IFN sehrviel aktiver sein als Zeilwachstumshemmer und Antitumor-Agens(Crane,J.L Jr., et al., J. Nat. Cancer lnsti- 61,871-874 [1973] Gupta et al., Proc. Nat'l. Acad. Sei. USA 76,4817 [1979] Blalock et al., Cellular Immunology 49,390-394, [1980]). Die klinische Erprobung von Interferon in der Krebstherapie wurde dadurch behindert, daß nicht genug Interferon hergestellt werden konnte. Durch entsprechende Entwicklungen in der Gen-Technologie wurde dieses Problem überwunden, und somit ist das National Cancer Institute in der Lage, in großem Umfang Versuche mit menschlichem Interferon (hlFN) durchzuführen. Es sind also sowohl natürliche als auch rekombinante menschliche Interferone bekannt, die beide auch klinisch benutzt werden.
Mit der Erfindung wird erreicht, daß eine neue diagnostische Möglichkeit zur Erkennung von Krebs zur Verfügung steht.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von gegen hTNF resistenten Mäuse-L(R)-Zellen bereitzustellen.
Das erfindungsgemäße Verfahren könnte für klinische Untersuchungen nützlich sein. Über 30 menschliche Zell-Linien in Zellkultur wurden daraufhin überprüft, ob sie sich für die Produktion von TNF eignen. Weiterhin wurde gefunden, daß Phorbol 12-myristat, 13-acetat (PMS) notwendig ist, um die hTNF-Produktion zu steigern. PMA ist bekannt als ein Stoff, der Krebs verursachen kann. Gegenwärtig sind B-Zell-Linien mit oder ohne PMA die Ausgangsstoffe für die hTNF-Produktion, von denen man sich am meisten verspricht.
Die oben beschriebenen Standard-TNF-Untersuchungen werden auch benutzt für die Untersuchung auf hTNF, z.B. bei der in vivo Untersuchung auf Tumor-Nekrose und der in vitro Untersuchung auf L-Zellen Zytostase/Zytotoxizität. T-Zellen, Monozyten- und Promyelozyten-Zell-Linien produzieren wenig oder kein TNF. Bei dieser Methode sind weder exogenes BCG, noch exogenes Endotoxin notwendig für die hTNF-Herstellung. Ein überraschender, synergistischer Anti-Tumor-Zelleffekt tritt dann auf, wenn hTNF und entweder rekombinantes oder natürliches hlFn zusammen verwendet werden, um menschliche Tumorzellen zu töten oder deren Wachstum zu unterdrücken. Jede der beiden Substanzen hlFN oder hTNF besitzt für sich eine Anti-Tumor-Wirkung, aber diese Wirkung ist größer, wenn hTNF zusammen mit hTFN eingesetzt wird, als die Summe der einzelnen Anti-Tumor-Wirkungen.
Als Quelle für hTNF können erfindungsgemäß menschliche Zell-Linien dienen. Die Methoden zur Produktion von Mäuse-TNF scheinen weitgehend abhängig zu sein von den Einflüssen des BCG und des Endotoxins. Nach der hier vorgestellten Methode zur Herstellung von menschlichen B-Zellen kann TNF produziert werden, ohne daß BCG oder Endotoxin zugesetzt wird. Daraus folgt, daß dieses TNF im wesentlichen frei ist von exogenem Endotoxin, und bakteriellen Verunreinigungen als auch Verun-
reinigungen aus dem Serum. Wie in Tabelle I an den getesteten hämatopoietischen Zellen gezeigt ist, läßt sich mit B-Zellen am besten hTNF herstellen. Überraschenderweise lassen sich hohe Gehalte an TNF erreichen, ohne daß exogenes BCG oder exogenes Endotoxin zugegen ist. Kleinere Gehalte oder Spuren von hTNF kann man in Überständen von Zell-Linien finden, die von T-Zellen oder Zellen monozytischen oder promyelozytischen Ursprungs abstammen. Nach der in vitro L-Zellen-Untersuchung (Carswell et al., Supra) ließen sich Gehalte an TNF bestimmen, das von Zellen menschlichen Ursprungs produziert wurde. In dieser Studie wurden also zum erstenmal Gehalte von TNF gefunden, die frei waren von irgendeiner exogenen Endotoxin-Verunreinigung, da, wie weiter unten noch beschrieben wird, kein Endotoxin der Kultur zugesetzt wurde. Neuere Studien durch andere an Mäusen ergaben, daß Endotoxin insofern problematisch ist, da in einem System vorhandenes Endotoxin nicht so leicht entfernt werden kann.
EBV-transformierte B-Zell-Linien stammen von Patienten mit einem Melanom. Andere Zell-Linien stammen von Zellsammlungen der Herren Dr. Lloyd Old, Dr. Jörgen E. Fogh oder Dr. Peter Ralph des Sloan-Kettering Institutes. Lukll-Zellen wurden von Dr. W. Steward erhalten (Pickering et al. [1980] Proc. Nat'l. Acad. Sei. USA 77, 5983-5942). EBV-transformierte B-Zell-Linien stammen von Patienten mit einem Melanom (Houghton et al., Proc. Nat'l Acad. Sei. USA, 77 4260 [1980]). Um menschliche Zellen hämatopoietischen Ursprungs auf ihre Eignung zur Herstellung von TNF hin zu überprüfen (siehe Tabelle I), werden 5 χ 106 Zellen pro ml in eine Kulturlösung RPM11640 gegeben, die 8%iges fetales Kälberserum (FCS) mit oder ohnePMA(10ng/ml [Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo]) enthält. Tabelle 2 zeigt die Zusammensetzung von RPM11640. Nach einer Inkubation von 48 Stunden bei 370C werden die Zellen durch Zentrifugation gesammelt, in einer Konzentration von
1 χ 106 Zellen pro ml in einer RPMI 1640-Lösung resuspendiert, die kein PMA enthält, und für weitere 48 Stunden stehen gelassen. Anschließend werden die zellfreien Überstände durch Zentrifugation der Zellkulturen gesammelt. Diese Überstände werden bei -2O0C tiefgefroren. Die TNF-Aktivität wird bestimmt durch L-Zellen-Überprüfung, bei der die Überstände auf die Hälfte ihrer Konzentration verdünnt werden. ·
Für die in vitro Untersuchung wurden L-M-Mäusezellen der NCTC clone 929 (L) Linie vom American Type Culture Collection (ATCC) verwendet und in Eagle's Minimum Essential Medium (MEM) (GIBCO, Grand Island, N. Y.) bei 37°C gezüchtet, das zusätzlich noch nicht essentielle Aminosäuren, Penicillin (100 Einheiten/ml), Streptomycin (100 g/ml) und 8% hitzeinaktiviertes, fetales Kälberserum enthielt. Eine Mäuse-TNF-resistente Zeil-Linie L(R) wurde dadurch gewonnen, daß man empfindliche L-Zellen L(S) wiederholt ein Medium passieren ließ, das Mäuse-TNF enthielt. Die Aktivität von hTNF wird bestimmt, indem man gleiche Volumina (z.B. 0,5 ml) eines Mediums, das fortlaufende Verdünnungen von TNF enthält, in Behälter gibt (24-well Costar plates), die drei Stunden zuvor mit 50000 trypsinierten L-Zellen in 0,5 ml des Mediums besetzt wurden. Danach wurde der Gehalt an Protein bestimmt, der einen 50%igen Zelltod zur Folge hat, geschätzt nach 48 Stunden durch Phasen-Mikroskopie oder Trypanblau-Ausschluß.
Wie aus Tabelle I ersichtlich ist, ist hTNF, das durch menschliche B-Zellen abgegeben wird, zytotoxisch für Mäuse L(S)-Zellen aber nicht für Mäuse L(R)-Zellen gemäß der Standard-^Mäuse-TNF in vitro Untersuchung, die oben beschrieben ist. Zellen, die auf hTNF hin überprüft wurden, wurden mit und ohne einem, das Tumorwachstum fördernden Mittel gezüchtet. PMA z. B. ist in der Lage, den hTNF-Ausstoß der B-Zellen mehrfach zu steigern. Dies ist auch den L(S)-Spalten der Tabelle I, insbesondere der Spalte mit der Überschrift „kein PMA" ersichtlich. PMA ist auch unter dem Namen TPA bekannt.
In Kultur gehaltene L-M-Mäusezellen von L(929) (ATCC), die resistent gegen hTNF gemacht wurden durch wiederholten Durchtritt durch ein Medium, das hTNF (kontinuierliche Zugabe von 2-3 Mikrogramm pro Woche zu etwa 106 Zellen) enthielt, sind auch vollständig resistent gegen Mäuse-TNF. Dies ist ein interessanter Kreuzresistenz-Effekt.
UmdieÜberprüfungauf hTNFin vitro vorzunehmen, erhalten (BALB/c x C57BL/6F! 9Mäuse (Jackson Labs),denen sieben Tage zuvor 5 x 105Meth A Sarkom-Zellen intradermal injiziert wurden, eine einzelne intravenöse Dosis von hTNF. Eine nach 24 Stunden auftretende hämorrhagischeTumor-Nekrose wird dabei wie folgt gekennzeichnet: keine Reaktion (-), leicht ( + ), mittelmäßig (++), oder stark (+ + + ), wobei die letztere Kennzeichnung 90% der Tumor-Oberfläche umfaßt (siehe Carswell Supra). Demgemäß zeigt hTNF bei Standard-TNF-Untersuchungen in vivo und in vitro einen ähnlichen Effekt, obwohl im allgemeinen hTNF eine höhere spezifische Aktivität gegenmenschliche Zellen besitzt als vergleichsweise Mäuse-TNF. Endotoxin wird durch Lumulus-Amebocyte-Lysat-Test (Micro-biological Associstes) bestimmt.
5 x 105 Zellen/ml werden kultiviert in RPM11640, das 5% FCS und 10ng/ml PMA enthält, und 48 Stunden lang bei 370C inkubiert. Anschließend werden die Zellen durch Zentrifugation gesammelt und in einer Konzentration von 8-10 x 105/ml in serumfreien R-ITS PREMIX (Insulin [5 microgramm/ml], Selenum [5ng/ml] Serum substitute [Collaborative Research, Waltham Mass]) und
2 nM Ethanolamin resuspendiert. Danach werden die Zellen für weitere 48 Stunden inkubiert. Die Überstände sind frei von Zellen und werden bei -200C tiefgefroren. Lukll-Überstände werden konzentriert durch Amicon bewegte Zellen (PM 10 Membrane) und auf eine DEAE-SephadexA-50 Säule (40 x 2.6) aufgegeben, die mit Tris 0,05 M, NaCI 0,15 M Puffer auf einen pH-Wert von 7,3 bei 50C eingestellt wurde. Mit der gleichen Puffer-Lösung werden danach 5-ml-Fraktionen aus der Säule ausgewaschen. Die TNF-Aktivität wird in den Durchfluß-Fraktionen bestimmt und die Fraktionen werden anschließend zusammengefaßt. Nach diesem Verfahren wird ein 25facher Anstieg der spezifischen Aktivität erzielt (2-5 x 104 Einheiten/mg Protein). hTNF-aktive Fraktionen, die nach dem L-Zellen-in vitro-Verfahren bestimmt wurden, werden zusammengefaßt und in Amicon-Zellen konzentriert.
Die spezifische Aktivität von den zusammengefaßten Fraktionen des hTNF liegt ungefähr im Bereich von 1 χ 103- 1 χ 104.Dies gilt für Zellen, die in Kulturlösungen gezüchtet wurden, die zusätzlich fetales Kälberserum (FCS) enthielten. Bei Zellen, die in serum-freien Medien gezüchtet wurden, liegt die spezifische Aktivität der zusammengefaßten Fraktionen des hTNF ungefähr im Bereich von 2-5 χ 104microgramm.
Intravenöse Injektionen von DEAE-fraktionierter hTNF verursachte eine hämorrhagische Nekrose von Meth ATumoren in dem in vivo Test, Supra. 300 micrqgramm erzeugten + + + Nekrose bei Vs der Mäuse und bei den restlichen 4/s ++ Nekrose. 150 microgramm des hTNF riefen bei sh der Mäuse ++ Nekrose hervor und bei 2h der Mäuse + Nekrose. 75 microgramm hTNF erzeugten bei Vs der Mäuse ++ Nekrose und + Nekrose bei den restlichen 4A. Keine Nekrose wurde bei allen dreien der drei Kontroll-Mäuse beobachtet, denen vergleichbare DEAE-Fraktionen der Kulturlösung (RPM11640) injiziert wurde. Darausfolgt, daß hTNF voll aktiv ist bei in vivo und in vitro Standard-Tests, die bei der Bestimmung der TNF-Aktivität verwendet werden.
Unabhängig davon, ob mit oder ohne FCS gezüchtet wurde, liegt das Molekulargewicht von hTNF ungefähr bei 70.000 Dalton. Dies wurde durch Chromatographie an einer Sephacryl S-200 Säule bestimmt. Hohe oder niedrige pH-Werte, die z. B. 12 Stunden lang eingestellt werden, zerstören die Aktivität des hTNF. Zum Beispiel beträgt der Aktivitätsverlust bei einem pH-Wert von 2,0 etwa 90%, bei einem pH-Wert von 4,0 55% und bei einem pH-Wert von 10 etwa 45%. Die Aktivität von hTNF ist stabil in einem pH-Bereich von etwa 6-8. Die Untersuchung der Hitzestabilität ergab, daß die hTNF-Aktivität zerstört wird, wenn hTNF 60 Minuten lang einer Temperatur von 700C ausgesetzt wird. hTNF ist aber 60 Minuten lang bei 56 0C stabil. Seine Aktivität bleibt auch über längere Zeiträume erhalten, wenn es bei — 78°C oder -20°C aufbewahrt wird.
Eine lFN-Aktivität von 100 Einheiten/ml wird bei dem nicht fraktionierten Überstand von PMA-stimulierten LUKII-Zellen gefunden. Keine Interferon-Aktivität kann in den zusammengefaßten Fraktionen des durch DEAE-Chromatographie gereinigten hTNF festgestellt werden, noch ist sie in dem verwendeten gereinigten Mäuse-TNF feststellbar. Die menschliche Interferon-Aktivität wird bestimmt durch Hemmung deszytopatischen Effektes eines vesikulären Stomatis Virus vom WISH oder GM 2767 cells (Stewart W.E. Il [1979]) The Interferon System (Springer, Vienna) und verglichen gegen einen internationalen Standard im Fall von rekombinaten menschlichen Alpha-IFN (Hoffmann-La Roche) und gegen einen Laborstandard im Falle von natürlichem menschlichem Gamma-IFN. Rekombinantes Alpha-hlFN (2-4 χ 108 Einheiten/mg Protein) wurde von der Firma Hoffmann-La Roche erhalten, natürliches Alpha-hlFN von Leukozyten (0,64 x 106/mg Protein) wurde für das Sloan-Kettering Institut Auswertungsprogramm von Kocher-Laboratorium, Bern (Schweiz) hergestellt, natürliches Beta-hlFN [(1 χ 107 Einheiten/mg Protein) lieferte das Roswell Park Memorial Institut (RPMI) und natürliches Gamma-hIFN] von Leukozyten (1 x107 Einheiten/mg Protein) stammt von Dr. Berish Rubin, Sloan-Kettering-Institut. Im partiell gereinigten Zustand zeigen weder Mäuse-TNF noch menschliches TNF nachweisbare IFN-Aktivität. Die verschiedenen menschlichen interferone besitzen keine nachweisbare hTN F-Aktivität, wie durch fehlende Zytotoxizität oder Zytostase an L(S)-Zellen bei der in vitro Untersuchung, Supra gezeigt werden kann.
Das hergestellte hTNF hat unterschiedlichen Einfluß auf verschiedene Zell-Linien, wie in Tabelle 3 gezeigt ist. Zytotoxisches Verhalten wird notiert, wenn die Lebensfähigkeit der Zellen nach 7 Tagen um 35% oder mehr zu rückgegangen ist, dagegen eine Zytostase, wenn die Anzahl der Zellen nach 7 Tagen um 35% oder mehr zurückgegangen ist. Für diese Untersuchung und für alle weiteren Untersuchungen, die in der Beschreibung angeführt sind, wurde ein hTNF eingesetzt, das wie oben beschrieben durch die LUKli-Zell-Linie hergestellt wurde. Dieser spezielle Satz von Beispielen soll die Erfindung nur erläutern, die Erfindung wird dadurch aber nicht begrenzt. hTNF von einer anderen B-Zell-Linie und TNF von anderen Zellquellen beim Menschen können offensichtlich bei einer Vielzahl von menschlichen Zellen in vivo und in vitro eingesetzt werden. Für den Fachmann ist der Einfluß von BCG-und seinen Gegenstücken und ferner Endotoxin auf die TNF-Herstellung in menschlichen Zellen in vitro und in vivo klar ersichtlich.
Der Einfluß von hTNFauf Zell-Linien der menschlichen Brust (Tabellen 3 und 4) ist mit dem des Mäuse-TNF vergleichbar, da beide auf die Mehrzahl der Zell-Linien zytotoxisch wirken, die von Brustkrebs stammen. Lungen- und Melanom-Zellen werden ebenso durch hTNF angegriffen, aber hier ist der vorherrschende Einfluß zytostatischer Natur. Von den vier normalen Zell-Linien, Lunge, Nieren, fetale Lunge und fetale Haut, die mit hTNF getestet wurden, ist keine gegen hTNF empfindlich. Es scheint daher, daß der zytotoxische,zytostatische oder hämorrhagischeNekrose Einfluß von hTNFauf menschliche Zellen sich auf menschliche Tumorzellen beschränkt. Im Vergleich zu Mäuse-TNF hat hTNF eine höhere spezifische Aktivität bei menschlichen Zellen. Menschliches Interferon, ob rekombinant oder natürlich, oder in der Alpha-, Beta- oder Gamma-Form, besitzt einen wohlbekannten, hemmenden Einfluß auf das Tumor-Zellwachstum, wie dies am Beispiel von vierTumor-Zell-Linien in den Tabellen 5,6 und 9 gezeigt ist. Im allgemeinen ist die Anzahl der antiviralen Einheiten an IFN, die benötigt werden, um einen 35%igen oder größeren zytotoxischen oder zytostatischen Effekt auszulösen, beim Alpha-hlFN größer als beim Beta- oder Gamma-hlFN. Keines der IFN-Präparate zeigte Zytotoxizität oder Zytostase bei L(S)-Mäusezellen in vitro, wodurch angezeigt wird, daß keine hTN F-Aktivität vorhanden ist. Außerdem zeigen diese beiden zellulären Produkte, wenn sie in reiner Form vorliegen und zusammen verwendet werden, einen Einfluß, der größer ist als die Summe ihrer separaten Einflüsse, wie an den Beispielen in den Tabellen 7 und 8 verdeutlicht ist. Der kombinierte zytotoxische Effekt von IFN und hTNF kann auch synergistisch, z. B. pharmakologisch synergistisch, sein nach der Methode, vorgeschlagen durch CLARK (Clark, D. A. [1958] Ann. N. Y. Acad. Sei. 76 915-921). Dies ist aus den Tabellen 10,11 und 12 ersichtlich. Dieses unerwartete Resultat kann von enormem Wert bei der Behandlung von menschlichen Tumoren sein.
Imfolgenden soll am Beispiel einer Methode dargelegt werden, welchen Einfluß hTNF, hIFN oder eine Kombination der beiden Substanzen hat. Trypsinierte Zellen werden zweimal gewaschen, jeweils 4-5 x 104 Zeilen werden in einen Behälter (24 well Costar plates) in MEM eingebracht, das 8% FCS enthält, und bei 370C inkubiert. Nach 16-24 Stunden wird das Medium abgesaugt und eine 1 ml Verdünnung entweder von DEAE-fraktionierter hTNF oder IFN oder hTNF und IFN wird dann dem Medium zugesetzt. Die gesamte Anzahl der Zellen (lebensfähige und nicht lebensfähige) wird nach 3, 5 und 7 Tagen durch Phasenmikroskopie bestimmt. Die Kulturen werden am 5.Tag mit frischem Medium versorgt, das gleiche Konzentrationen an hTNF und/oder hIFN enthält. Diese Methode wurde bei den Ergebnissen verwendet, die in den Tabellen 3 bis 9 aufgeführt sind. Das Protokoll gemäß CLARK, Supra zur Überprüfung auf Drogen-Synergismus oder Potentiation soll zwei Faktoren χ und y testen, in diesem Falle hIFN (x) und hTNF (y) allein und in Kombination. Verstärkte Tumor-Hemmung oder Zell-Toxizität führt zu Versuchen mit 1A χ + 1A y, oder in diesem Fall 1A hIFN + 1A hTNF, um zu sehen, ob diese Kombination einer viertel Dosis vergleichbar ist mit der vollen Dosis einer jeden Substanz, und um den Synergetismus der beiden Fajctoren χ und y, hier hIFN und hTNF, zu demonstrieren. Dies ist aus den Tabellen 10,11 und 12 ersichtlich, bei denen die gleiche Methode verwendet wird wie bei den Beispielen der Tabellen 4 bis 8, aber nur an den Tagen 3 und 5. Ein klarer Synergismus-Effekt ist bei 1AhIFN + 1AhTNF vorhanden, der größer ist als der Effekt von TNF oder hIFN allein für die drei Zell-Linien in den Tabellen 10,11 und 12. Die beiden Substanzen, hTNF und hIFN, können folglich in vielfältigen Kombinationen verwendet werden, um menschliche Tumore und Krebs zu behandeln, da sie zusammen eine viel größere zytotoxische Aktivität gegen Krebs entwickeln als jede Substanz für sich allein. Es ist in der Tat offensichtlich, daß zur Erzielung eines maximalen therapeutischen Effektes Krebspatienten stimuliert werden sollten, um TNF und/oder IFN zu bilden, oder mit wechselnden Kombinationen der beiden oben genannten therapeutischen Substanzen (TNF und IFN) behandelt werden sollten, wobei man die beiden Substanzen auch sich abwechseln lassen könnte, um einen maximalen Nutzen zu erzielen oder ferner auch die zeitliche Abfolge variieren könnte. Wenn andere Faktoren, wie TNF, notwendig sind für die maximale Wirkung von IFN, kann die Lieferung dieser Mangel-Faktoren zu einer verstärkten IFN-Aktivität gegen Krebs führen. Die verstärkte IFN-Wirkung kann auch daran liegen, daß hTNF als ein Wandler der biologischen Antwort des Immun-Systems wirkt. Es liegt daher für den Fachmann nahe, in weiteren Versuchen die
Wirkung von hIFN gegen menschliche Krebszellen in Verbindung mit anderen, die biologische Antwort modifizierenden Substanzen (allein oder in Kombination), z. B. Hormonen, oder hormonartigen Molekülen, wie IL-2, oder anderen Zytokinen, Lymphokinen oderLymphtoxin zu untersuchen. Es werden in der Tat Versuche durchgeführt, um das Verhalten wechselnder Kombinationen der verschiedenen Interferone und derartiger Moleküle gegen Krebs zu untersuchen. Hinzu kommen noch Versuche, bei denen hTNF oder hIFN von verschiedenen Zellquellen gegen Krebs eingesetzt wird.
L-Zellen Lebensfähigkeit (in %) in Vitro Zeil-Linie L(S)
B-Zeile
ARH-77
DAUDI
LuKII
RPMII788
RPMI8226
RPMI8866
SK-LY-16
SK-LY-18
ARA-10
BALL-1
T-ZeIIe
CCRF-CEM
MOLT-4
HPB-ALL
TALL-1
Monozyten
J111 THP U-937
HL-60
kein PMA
47%
57%
95%
28%
45%
18%
88%
27%
70%
15%
47%
19%
44%
80%
68%
97%
20%
78%
96%
32%
98%
99%
77% 100%
100%
95%
100%
100%
100%
96%
100%
96%
100%
+ PMA 20% 43% 37% 8% 18% 11% 38% 16% 16% 11% 22% 8% '16% 30% 12% " 97% 13% 35% 84% 10%
100%
100% 39%
100%
100c
94 =
100c
100c
97c.
94 =
100c
80c
100c
kein PMA
+ PMA
96% 97%
+EBV- transformierte Zell-Linien gewonnen aus peripherem Blut
L(R)
kein PMA 100%
ioo%
100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 97% 100% 100% N.T. 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100%
100%
99%
99%
100%
100%
96%
99% 99% 99%
99%
+ PMA
100 %
98 /o
97%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
97%
100%
NT.
100%
100%
86%
98%
100%
98%
97%
100%
100<
98c
96'
100c
100c
96c
98% 99% 99%
98%
RPM11640 flüssig (IX)
Anorganische Salze
Ca(NO3)2-4H2O
MgSO4-7H2O
NaHCO3
Na2HPO4-7H2O
mg/l
100,00
400,00
100,00
6000,00
2 000,00
1512,00
Tabelle 2 Fortsetzung RPM11640 flüssig (IX)
| Bestandteil | (reduziert) | L-Arginin (freie Base) | (Astrozytom) | mg/L |
| L-Asparagin | (Brust Ca) | |||
| Andere Bestandteile: | L-Asparticacid | (Brust Ca) | 2000,00 1,00 | |
| D-Glucose Glutathion | L-Cy sti η | (Brust Ca) | ||
| Aminosäuren: | L-Glutaminsäure | (HaIsCa) | 200,00 | |
| L-Glutamin | (Colon Ca) | 50,00 | ||
| Glycin | (Melanom) | 20,00 | ||
| 50,00 | ||||
| (Lungen Ca) | 20,00 | |||
| (Melanom) | 300,00 | |||
| (Melanom) | 10,00 | |||
| (Melanom) | 15,00 | |||
| (Eierstock Ca) | 20,00 | |||
| L-Histidin (freie Base) | 50,00 | |||
| L-Hydroxypyrolin | (Gallenblasen Ca) | 50,00 | ||
| L-Isoleucin | (Gallenblasen Ca) | 40,00 | ||
| (Brust Ca) | 15,00 | |||
| (Colon Ca) | 15,00 | |||
| L-Leucin (Methionin frei) | (Lungen Ca) | 20,00 | ||
| L-Lysin HCI | (Lungen Ca) | 30,00 | ||
| L-Methionin | (Lunaen Ca) | |||
| L-Phenylalanin | 20,00 | |||
| 5,00 | ||||
| 20,00 | ||||
| 20,00 | ||||
| L-Prolin (Hydroxy L-Prolin frei) | ||||
| L-Serin | 0,20 | |||
| Aminosäuren: | 0,25 | |||
| L-Threonin | 3,00 | |||
| L-Tryptophen | 1,00 | |||
| L-Ty rosin | 35,00 | |||
| L-Valin | 1,00 | |||
| Vitamine: | 1,00 | |||
| Biotin | 1,00 | |||
| D-Ca-pantothenat | 0,20 | |||
| Cholin chlorid | 1,00 | |||
| Folsäure | 0,005 | |||
| i-lnositol | ||||
| Nikotinamid | ||||
| Para-aminobenzoesäure | ||||
| Pyridoxin HCI | ||||
| Riboflavin | ||||
| ThiaminHCI | ||||
| Vitamin B12 | ||||
| Tabelle 3 | ||||
| Einfluß von hTNF auf menschliche Zell-Linien | ||||
| Zytotoxisch | ||||
| SK-MG-4 | ||||
| MCF-7 | ||||
| BT-20 | ||||
| SK-BR-3 | ||||
| ME-180 | ||||
| SK-CO-1 | ||||
| RPMI7931 | ||||
| Zytostatisch | ||||
| SK-LU-1 | ||||
| RPMI4445 | ||||
| SK-MEL-29 | ||||
| SK-MEL-10 | ||||
| SK-OV-3 | ||||
| Kein Effekt | ||||
| T-24 | ||||
| 5637 | ||||
| MDA-MB-361 | ||||
| S-48 | ||||
| SK-LC-4 | ||||
| SK-LC-6 | ||||
| <=LKT-t C.-ΛΟ | ||||
Tabelle 3 (Fortsetzung)
SK-UT-1 (Uterus Ca)
SAOS-2 (OestrogenischesSarcom)
U2OS (OestrogenischesSarcom)
WI-38 (Normale Fetale Lunge)
MY (Normales Nieren-Epitheliom)
F-136-35-56 (Normale Fetale Lunge)
F-136-35-56 (Normale Fetale Haut)
Der Einfluß von hTNF auf vier menschliche Tumor-Zell-Linien (Tag 0-5 x 104Zellen überzogen mit hTNF)
| Zeil-Linie | hTNFmicrogramm | 1263 | S.Tag | Zell | 5. Tag | Zell | 7. Tag | Zell |
| Protein/Kultur | 505 | wachs | wachs | wachs | ||||
| 253 | % lebens | tum | % lebens | tum | % lebens | tum | ||
| 126 | fähige | x105 | fähige | x106 | fähige | x105 | ||
| 32 | Zellen | 1,03 ' | Zellen | 1,55 | Zellen | 1,45 | ||
| 0 | 1,08 | 1,43 | 1,38 | |||||
| 645 | 24 | 1,05 | 16 | 1,53 | 5 | 1,3 | ||
| BT-20 | 258 | 30 | 1,03 | 19 | 1,6 | 7 | 1,23 | |
| (Brust) | TNF Einheiten | 129 | 45 | 1,05 | 21 | 1,8 | 10 | 2,43 |
| (cyto- | 48 | 63 | 49 | 0,99 | 30 | 2,23 | 18 | 3,39 |
| toxic) | 19,2 | 0 | 50 | 1,78 | 53 | 2,7 | 61 | 6,33 |
| 9,6 | 645 | 93 | 1,73 | 94 | 2,83 | 96 | 7,38 | |
| 4,8 | 258 | 83 | 1,75 | 52 | 3,48 | 49 | 8,03 | |
| ME-180 | 1,2 | 129 | 83 | 1,73 | 57 | 4 | 49 | 8,23 |
| (Hals) | Control | 63 | 80 | 1,62 | 70 | 4,48 | 58 | 1,01 |
| (cyto- | 24,5 | 0 - | 81 | 0,8 | 76 | 1,63 | 63 | 1,68 |
| toxic) | 9,8 | 1263 | 98 | 1,15 | 97 | 1,93 | 97 | 2,68 |
| 4,9 | 505 | 91 | 1,35 | 86 | 2,13 | 72 | 2,93 | |
| SK-MEL-109 | 2,45 | 253 | 96 | 1,25 | 90 | 2,1 | 91 | 3,13 |
| (Melanom) | Control | 126 | 94 | 2,19 | 93 | 3,89 | 90 | 9,78 |
| (cyto- | 24,5 | 0 | 94 | 2,38 | 93 | 4,6 | 92 | 7,75 |
| static | 9,8 | 98 | 2,83 | 98 | 4,55 | 99 | 8,58 | |
| 4,9 | 95 | 2,78 | 98 | 4,65 | 99 | 8,33 | ||
| T-24 | 2,45 | 96 | 3,25 | 97 | 4,55 | 98 | 8,33 | |
| (Gallenblase) | Control | 97 | 3,23 | 98 | 4,53 | 98 | 8,38 | |
| kein Effekt | 48 | 98 | 99 | 98 | ||||
| 19,2 | 100 | 98 | 99 | |||||
| 9,6 | ||||||||
| 4,8 | ||||||||
| Control |
Der Einfluß von rekombinantem menschlichen α-Interferon auf vier menschliche Zell-Linien (O.Tag 5 x 104 Zellen überzogen mit IFN)
| Zeil-Linie | hTNF microgramm | 3. Tag | Zell | 5. Tag | Zell | 7. Tag | Zell |
| Protein/Kultur | wachs | wachs | wachs | ||||
| % lebens | tum | % lebens | tum | % lebens | turn | ||
| fähige | x105 | fähige | x105 | fähige | x105 | ||
| Zellen | Zellen | Zellen | |||||
| IFN-Einheiten/ | 0,6 | 0,65 | 0,9 | ||||
| Kultur | 0,65 | 0,95 | 0,925 | ||||
| BT-20 | 50,000 | 83 | 0,72 | 31 | 1,15 | 28 | .1,37 |
| 12,500 | 85 | 0,75 | 47 | 1,32 | 38 | 1,4 | |
| 3,125 | 83 | 1,04 | 74 | 2,3 | 65 | 5,4 | |
| 781 | 83 | 1,02 | 75 | 1,67 | 70 | 2 | |
| Kontrolle | 95 | 1,18 | 93 | 1,92 | 97 | 3,4 | |
| 50,000 | 85 | 1,3 | 78 | 2,02 | 62 | 4,2 | |
| ME-180 | 12,500 | 91 | 1,42 | 86 | 2,7 | 79 | 4,9 |
| 3,125 | 90 | 1,87 | 91 | 5,91 | 87 | 7,8 | |
| 781 | 95 | 93 | 90 | ||||
| Kontrolle | 98 | 98 | 98 | ||||
-9- 241 2β8
Tabelle 5 (Fortsetzung) Zeil-Linie hTNFmicrogramm
Protein/Kultur
3. Tag
5. Tag
7. Tag
| IFIM-Einheiten/ | % lebens | Zell | % lebens | Zell | % lebens | Zell | |
| Kultur | fähige | wachs | fähige | wachs | fähige | wachs | |
| 50,000 | Zellen | tum | Zellen | tum | Zellen | turn | |
| 12,500 | XiO5 | x105 | x105 | ||||
| 3,125 | |||||||
| 781 | 62 | 0,6 | 15 | 1,35 | 10 | 1,25 | |
| Kontrolle | 58 | 0,65 | 34 | 1,77 | 37 | 2,1 | |
| SK-MEL-109 | 50,000 | 67 | 1,12 | 52 | 1,8 | 54 | 2,4 |
| 12,500 | 79 | 1,42 | 69 | 2,37 | 74 | 2,5 | |
| 3,125 | 97 | 2,2 | 98 | 3,6 | 98 | 6,8 | |
| 781 | 95 | 1,6 | 94 | 4,1 | 83 | 4,8 | |
| Kontrolle | 94 | 1,7 | 96 | 4,7 | 89 | 5,3 | |
| 94 | 1,98 | 95 | 4,8 | 90 | 5,9 | ||
| T-24 | 97 | 2,72 | 94 | 4,97 | 90 | 7,4 | |
| 98 | 3,43 | 96 | 6,05 | 93 | 7,97 | ||
Der Einfluß von natürlichem menschlichen Gamma-lnterferon auf vier menschliche Zell-Linien (TagO — 5 x 104 Zellen überzogen mit IFN)
| Zeil- | -hlFN- | 3. Tag | Zell | 5. Tag | Zell | 7. Tag | Zell |
| Linie | Einheiten/Kultur | wachs | wachs | wachs | |||
| % lebens | tum | % lebens | tum | % lebens | tum | ||
| fähige | x105 | fähige | x105 | fähige | x10s | ||
| Zellen | 1,33 | Zellen | 2,2 | Zellen | 2,83 | ||
| 250 units | 1,43 | 2,43 | 3,15 | ||||
| 125 units | 73 | 1,78 | 79 | 2,7 | 58 | 4,03 | |
| BT-20 | 31,25 units | 81 | 1,93 | 81 | 2,78 | 66 | 3,83 |
| 7,8 units | 84 | 1,64 | 86 | 3,61 | 79 | 5,44 | |
| Kontrolle | 86 | 1,15 | 93 | 1,23 | 87 | 1,95 | |
| 250 units | 95 | 1,2 | 97 | 1,3 | 97 | 1,9 | |
| 125 units | 67 | 1,32 | 49 | 1,3 | 22 | 1,78 | |
| 31,25 units | 69 | 1,55 | 56 | 1,38 | 26 | 2,65 | |
| ME-180 | 7,8 units | 72 | 2,45 | 61 | 5 | 34 | 7,75 |
| Kontrolle | 79 | 1 | 67 | 1,73 | 50 | 2,3 | |
| 250 units | 98 | 1 | 98 | 2 | 96 | 2,78 | |
| 125 units | 55 | 1,18 | 51 | 3,02 | 23 | 3,35 | |
| 31,25 units | 67 | 1,15 | 61 | 3,28 | 38 | 5,45 | |
| 7,8 units | 74 | 2,05 | 82 | 3,53 | 61 | 5,43 | |
| SK-MEL-109 | Kontrolle | 85 | 1,75 | 90 | 2,58 | 77 | 2,48 |
| 2000 units | 98 | 2,08 | 98 | 2,52 | 96 | 3,1 | |
| 500 units | 100 | 2,4 | 95 | 2,9 | 93 | 3,52 | |
| 125 units | 100 | 3,03 | 95 | 4,95 | 94 | 6,45 | |
| 31,25 units | 99 | 3,35 | 95 | 7 | 96 | 9,45 | |
| 7,8 units | 99 | 4 | 98 | 7,35 | 98 | 10,4 | |
| T-24 | Kontrolle | 99 | 98 | 98 | |||
| 99 | 98 | 99 | |||||
Der Einfluß von hTNFund rekombinanten menschlichen Alpha-Interferon auf vier menschliche Zell-Linien (Tag 0 — 5 x 304 Zellen plus hTNF und IFN)
BT-20
| % lebensfähige Zellen | 5. Tag | |
| 3. Tag | 6 | |
| hTNF+ IFN+ | 26 | 64 |
| hTNF+ U | 74 | 74 |
| IFN3125U | 83 | 93 |
| Kontrolle | 95 | |
7. Tag
62 65 97
Tabelle 7 (Fortsetzung)
ME-180
SK-MEL-109
hTNF+IFN+ hTNF16U
IFN 3125 U Kontrolle
hTNF+ IFN+ hTNF33U IFN 781 U
Kontrolle
hTNF+ IFN+ hTNF33U IFN 781 U Kontrolle
| 5. Tag | -10- | 7. Tag | |
| % lebensfähige Zellen | 25 | 20 | |
| 3. Tag | 82 | 70 | |
| 53 | 91 | 87 | |
| 85 | 98 | 98 | |
| 90 | 19 | 25 | |
| 98 | 96 | 96 | |
| 33 | 69 | 74 | |
| 96 | 98 | 98 | |
| 79 | 93 | 85 | |
| 97 | 95 | 88 | |
| 97 | 95 | 90 | |
| 98 | 96 | 93 | |
| 94 | |||
| 98 | |||
+ Bei der Kombination wurden gleiche Mengen an hTNF und hlFN verwendet wie bei der Einzelanwendung bei jeder der Zell-Linien U = Einheiten
Der Einfluß von hTNF und natürlichem Gamma-lnterferon auf vier menschliche Tumor-Zell-Linien (Tag 0 — 5 χ 104 Zellen plus hTNF und hlFN)
% lebensfähige Zellen
BT-20
ME-180
SK-MEL-109
| 3.Taf | 5. Tag | |
| hTNF+ IFN+ | 11 | 10 |
| hTNF4U | 56 | 46 |
| IFN 3125 U | 84 | 86 |
| Kontrolle | 95 | 97 |
| hTNF+IFN+ | 2 | 4 |
| hTNF16U | 77 | 72 |
| IFN3125U | 69 | 56 |
| Kontrolle | 98 | 98 |
| hTNF + IFN+ | 9 | 6 |
| hTNF33U | 95 | 93 |
| IFN 781 U | 67 | 61 |
| Kontrolle | 98 | 98 |
| hTNF + IFN+ | 99 | 94 |
| hTNF33U | 97 | 97 |
| IFN 781 U | 99 | 97 |
| Kontrolle | 99 | 98 |
7. Tag
6 31 79 97
5 60 26 96
92 38 96
94 96 93 93
+ Bei der Kombination wurden gleiche Mengen an hTNF und hlFN verwendet wie bei der Einzelanwendung bei jeder der Zell-Linien U = Einheiten
Der zytotoxische und zytostatische Einfluß von menschlichen Interferonen auf fünf menschliche Zell-Linien Anzahl der antiviralen Einheiten, die 35 % Zytotoxizität oder Zytostase verursachen
Zell-Linien
| Menschliches | CT | BT-20 | ME-180 | CT | CS | SK-MEL-109 | CS | T-24 | CT | CS | WI-38 | CT | CS |
| Interferon | 270 | 6500 | 110 | 26 | > 50,000 | 1,900 | > 50,000 | 230 | |||||
| CS | CT | ||||||||||||
| Natürliches | 3125 | 25 | 44,000 | <781 | 1250 | <781 | > 50,000 | 16,000 | > 50,000 | >50,000 | |||
| Alpha-IFN | |||||||||||||
| Rekombinantes | <49 | <781 | 260 | <49 | 1400 | <49 | > 12,500 | <49 | > 25,000 | 160 | |||
| Alpha-IFN | |||||||||||||
| Natürliches | 130 | <49 | <7,8 | <7,8 | <49 | 27 | >2000 | 25 | >2000 | >2000 | |||
| Beta-IFN | |||||||||||||
| Natürliches | 72 | 22 | |||||||||||
| Gamma-IFN | |||||||||||||
CT- zytotoxisch CS- zytostatisch
BT-20 Synergismus Experiment mit natürlichem Gamma-hlFN und hTNF
Zellen
| X | 250 | 1,08 | 1,15 | 0,8 |
| V2X | 125 | 1,03 | 1,1 | 0,75 |
| 1/4 X | 62,5 | 0,95 | 0,98 | |
| hTNF (Einheiten/Kultur) | hTNF (50 Einheiten) | 0,67 | ||
| +Y+ | 50 | 0,75 | Control 1,02 | |
| 1/2 X | 25 | 0,75 | ||
| 1/4 Y | 12,5 | 0,7 | ||
| IFN + | hTNF (25 Einheiten) | |||
| X-V2Y | 250 | 0,85 | ||
| V2X + V2Y | 125 | 0,73 | ||
| 1/4X+Y | 62,5 | 0,75 | ||
| IFN + | IFN+ hTNF (12,5 Einheiten | |||
| X-1/2 Y | 250 | 250 | ||
| V2 X+ 1/2 Y | 125 | 125 | ||
| 1/4 X+ 1/2 Y | 62,5 | |||
| 62,5 | ||||
| X+1/4 Y | ||||
| 1/2 X+ 1/2 Y | ||||
| +Synergismus+ | ||||
| +1Ai: + V4Y+ | ||||
3. Tag
5. Tag
| lebens | Zellen | lebens |
| fähig" | x105 | fähig |
| 1,4 | ||
| +74+ | 1,83 | +64+ |
| 76 | 1,73 | 79 |
| 84 | 1,75 | 83 |
| +48+ | 1,98 | +37+ |
| 52 | 2,28 | 47 |
| 59 | 1,05 | 54 |
| 3 | 1,05 | 5 |
| 10 | 1,05 | 5 |
| 7 | 1,05 | 9 |
| 12 | 1 | 5 |
| 14 | 0,8 | 7 |
| 13 | 1,13 | 12 |
| 22 | 1,15 | 11 |
| 17 | 1,15 | 11 |
| +22+ | 1,97 | + 11 + |
| 96 | 94 | |
3. Tag
5. Tag
+Synergismus+
| Zellen | 0,8 | 0,825 | lebens | Zellen | lebens | |
| x105 | 0,8 | 0,8 | fähig | x105 | fähig | |
| 1,15 | 0,825 | |||||
| 250 | 1,2 | hTNF (2 000 Einheiten) | hTNF (50 Einheiten) | 1,08 | ||
| 125 | 1,25 | 0,875 | 0,8 | +58+ | 1,15 | +32+ |
| 62,5 | 1,2 | 0,8 | 1 | 70 | 1,5 | 43 |
| hTNF (Einheiten/Kultur) | 0,775 | 0,875 | 72 | 63 | ||
| 50 | IFN+ hTNF (100 Einheiten) | Control 1,44 | ||||
| 25 | 250 | 1,38 | ||||
| 12,5 | 125 | +87+ | 1,63 | +87+ | ||
| 62,5 | 91 | 1,73 | 92 | |||
| IFN + | IFN + | 91 | 96 | |||
| 250 | 250 | 0,9 | ||||
| 125 | 125 | 8 | 0,85 | 3 | ||
| 62,5 | 62,5 | 12 | 0,83 | 6 | ||
| 16 | 6 | |||||
| 0,83 | ||||||
| 12 | 0,925 | 3 | ||||
| 16 | 0,95 | 8 | ||||
| 18 | 16 | |||||
| 0,85 | ||||||
| 19 | 0,9 | 6 | ||||
| 32 | 0,9 | 11 | ||||
| +31 + | 4,12 | +14+ | ||||
| 96 | 99 | |||||
Zellen x105
"•"Synergismus4
1,15 1,3 1,33
hTNF (Einheiten/Kultur) 50
25 2,48
12,5 2,38
2,4
IFN+ hTNF (200 Einheiten) 250 0,775
125 0,775
62,5 0,775
JFN+_hTNF (1OO..Einheiten)... 250 0,83
125 0,8
62,5 0,8
IFN+ hTNF (50 Einheiten) 250 0,875
125 0,85
62,5 Control
0,8 2,69
3. Tag
lebensfähig
71 75
86 89
3 12
6 12
98
Zellen x10s
1,15
1,35
4,2 4,4 4,4
1,25 1,15 1,25
1,2
1,23
1,15
1,23
1,05
1,08 5,61
5. Tag
lebensfähig
+56+ 64 67
+55+ 59 63
4 2 4
2 2 2
0 2
98
Claims (8)
1. Verfahren zur Herstellung von gegen hTNF resistenten Mäuse-L(R)-Zellen, gekennzeichnet dadurch, daß Mäuse-L(S)-Zellen wiederholt durch ein Medium geleitet werden, das hTNF enthält.
2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß hTNF eingesetzt wird, das hergestellt wird, indem in einem ersten Inkubationsschritt menschliche hämatopoietische Zellen in Kulturlösung inkubiert werden, anschließend die Zellen von den Lösungs-Überständen abgetrennt, gesammelt und in einem zweiten Inkubationsschritt erneut in einer Kulturlösung inkubiert werden, und daß die Überstände gesammelt und tiefgefroren werden.
3. Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß bei dem ersten Inkubationsschritt eine RPMI 1640-Kulturlösung verwendet wird, die FCS im Bereich von 0-8% enthält.
4. Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß bei einem zweiten Inkubationsschritt die Zellen in RPMI 1640-Kulturlösung inkubiert werden.
5. Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß die hämatopoietischen Zellen menschliche B-Zellen sind.
6. Verfahren nach Punkt 5, gekennzeichnet durch menschliche B-Zellen der Gruppe BE, BJ, CL, CW, DE, DM, EY, EL, EQ, ER, FC, FD, FG, ARH-77, DAUDJ, LuKII, RPMJ 1788, RPMJ 8226, RPMJ 8866 und ARA-10.
7. Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß die Zellen bei dem ersten Inkubationsschritt in Gegenwart vom PMA inkubiert werden.
8. Verfahren nach Punkt 7, gekennzeichnet dadurch, daß im Anschluß an den ersten Inkubationsschritt die Zellen in serumfreien R-ITS PREMIX und 2nM Ethanolamin resuspendiert werden, diezelifreien Überstände gesammelt und konzentriert werden, daß das Konzentrat der Überstände einer Trennsäule aufgegeben wird, die zuvor mit einer Pufferlösung auf einen pH-Wert von 7,3 eingestellt wird, und daß die von der Säule abgezogenen, hTNF-aktiven Fraktionen zusammengefaßt und konzentriert werden.
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