DD209634A5

DD209634A5 - Verfahren zur herstellung neuer glykoproteine und deren verwendung in therapeutischen mitteln gegen tumore

Info

Publication number: DD209634A5
Application number: DD83248327A
Authority: DD
Inventors: Haruo Ohnishi; Kazuo Yamaguchi; Yasuo Suzuk; Ei Mochida; Nobuo Mochida
Original assignee: Mochida Pharm Co Ltd
Priority date: 1982-02-26
Filing date: 1983-02-28
Publication date: 1984-05-16
Also published as: US4481137A; DK93383A; PT76296B; GB2117385B; NO830669L; BR8300933A; GB8305330D0; PL240784A1; GB2117385A; RO85901B; SE8301073D0; NL8300727A; SE8301073L; DK93383D0; DE3306297A1; LU84662A1; GR78097B; BE896027A; FI830638A0; PT76296A

Abstract

VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG EINES GLYKOPROTEINS MIT ANTITUMORWIRKUNG DURCH DAS ZUECHTEN VON ZELLEN (URSPRUNGSZELLEN), WELCHE DIESES GLYKOPROTEIN ENTHALTEN UND VON WARMBLUETIGEN LEBEWESEN BZW. TIEREN STAMMEN, UND EXTRAKTION EINER IM WESENTLICHEN GEREIGNIGTEN FORM EINES GLYKOPROTEINS AUS DIESEN URSPRUNGSZELLEN ODER EINEM KULTIVIERTEN UEBERSTAND DERSELBEN, WOBEI DAS GLYKOPROTEIN DIE IN DER BESCHREIBUNG GENANNTEN EIGENSCHAFTEN AUFWEIST.

Description

7 Z 5 3 2 7 B Berlin, den 15.8.1983

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Verfahren zur Herstellung neuer Glykoproteine und. deren Verwendung in therapeutischen Mitteln gegen Tumore

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung neuer Glykoproteine und deren Verwendung in therapeutischen Mitteln gegen Tumore» Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Gewinnung neuer Glykoproteine aus einem iüxtrakt oder einem Überstand eines Kulturmediums von retikulo-endothelialen Zellen, Lymphoblasten, Leukämiezellen oder Pibroblasten warmblütiger Lebewesen bzw. Tiere und therapeutische Mittel gegen bösartige Tumore, wobei diese Mittel die genannten Glykoproteine einzeln oder in Kombination als einen Wirkstoff enthalten«

Charakteristik der bekannten technischen Lösung

Bisher kennt man keine perfekte Tumortherapie; Trotz der Tatsache, daß bis heute viele therapeutische Mittel gegen Tumore von einer Anzahl Forscher weltweit entwickelt worden sind, gibt es viele Versuche, neue therapeutische Mittel und Multi-Agens-Kombinationsbehandlungen auf dem klinischen Sektor anzuwenden.

Die therapeutischen Tumormittel können grob in awei Kategorien klassifiziert werden, den chemotherapeutischen Mitteln und den immunotherapeutischen Mitteln. Die chemotherapeutischen Mittel, die auch als cytotoxische Substanzen bekannt sird,

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führen die Wirkung durch eine nicht spezifische Unter- . drückung des Zellwachstums herbei und wirken daher nicht nur auf die Tumorzellen, sondern auch auf normale Zellen toxisch, und sie aeigen nachteilige Uebenreaktionen, wie leukocytenverminderung (Leukopenie), weibliche Sterilität, Alopezie, Missgeataltung, bösartige Ieoplasmen, etc·; aus diesem Grunde besteht eine atrikte Beschränkung im Hinblick auf die Dosierung. Andererseits führen die immunotherapeutischen Mittel den therapeutischen Effekt durch indirekte Inhibierung des Tumorwachstums herbei, indem sie auf die biophylaktischen Punktionen Einfluß haben, und nicht durch eine direkte Inhibierung des Wachstums der lumorzellen;aus diesem Grunde besteht hier eine weit geringere Gefahr für nachteilige Iebenreaktionen im Vergleich zu den chemotherapeutischen Mitteln. Tumorpatienten weisen jedoch häufig nicht in ausreichendem Maße biophylaktische funktionen auf; aus diesem Grunde ist der therapeutische Effekt immunotherapeutischer Mittel im Vergleich zu den . chemotherapeutischen Mitteln nicht immer befriedigend·

Die Erfinder gingen von der Erkenntnis aus, daß die retikuloendothelialen Zellen, die ijn Hinblick auf biöphylaktiache Punktionen eine wichtige Rolle spielen, eine Substanz produzieren, die bei der Behandlung von Tumoren wirksam ist; die .Erfinder haben nach dieser Substanz gesucht·

Mehrere Paktoren, die als vielversprechende therapeutische Mittel gegen Tumore angesehen werden, z. B. Lymphotoxin, Tumor-ftecroae-Paktor, Interferon, etc,_s wurden aus retikuloendothelialen Zellen erhalten; siehe z· B, Granger, G* A., et al, Cellular Immunology, Bd. 38, 338-402 (1978),

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Carswell, Ja. A. et al., Proc. BTatl. Acad. Sei. USA, Bd. 72, 3666-33670 (1975)» und Isaacs, A. et al., Proc· Hoy. Socu Ser. B., Bd. 147, 268 (1975). Im weiteren haben die Erfinder vor kurzem ein einfaches Verfahren zur Isolierung einer großen Menge an "Carcino-Breaking-Faktor" (im folgenden als CBF bezeichnet) gefunden, welcher ein Gemisch darstellt, das das vorstehend genannte Lymphotoxin, den Tumor-JSfecro.sefaktor etc. enthält. Die Isolierung erfolgte aus einer Kultur von Lymphoblasten, die in Hamster kultiviert wurden, deren Immunantwort unterdrückt worden war. Von den Erfindern wurde darüber berichtet, daß sich dieser CBP gegen experimentelle Rumore, die einem Tier transplantiert wurden, als wirksam erweist (The Yomiuri, morning issue, November 22, 1981).

Im Verlaufe der Forschungsarbeiten an GBP haben die Erfinder gefunden, daß Glykoproteine, die sich von den vorstehend genannten cytotoxischen Paktoren, wie Lymphotoxin, Tumor-Uecrosefaktor, CBP, etc., unterscheiden, in einem Extrakt oder einem Überstand eines Kulturmediums von retikulo-endothelialen Zellen, Lymphoblasten, Leukämiezellen oder PibrdöLasten warmblütiger Lebewesen bzw. Tiere vorliegen; diese Glykoproteine sind charakterisiert durch einen sehr starken und selektiven cytotoxischen Effekt gegen Tumorzellen. Außerdem wurden mehrere Verfahren zur Gewinnung derartiger,Glykoproteine auf einfache «Yeise erarbeitet.

Ziel der Erfindung

Aufgabe gemäß der Erfindung ist die Zurverfügungstellung von Verfahren zur Gewinnung von Anti-Tumor-Glykoproteinen aus einem Extrakt oder einem Überstand eines Kulturmediums

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von retikulo-endotheliaien Zellen, Lymphoblasten, Leukämiezelie oder Fibroblasten warmblütiger Lebewesen bzw. Tiere.

Im weiteren sollen durch die Erfindung therapeutische Mittel gegen Tumore zur Verfügung gestellt werden, wobei diese Mittel derartige Anti-Tumor-Glykoproteine einzeln oder in Kombination als einen aktiven Bestandteil enthalten.

Wesen der Erfindung

Die vorstehende Aufgabe wird durch ein Glykoprotein gelöst, das durch folgende Eigenschaften charakterisiert ist?

a) Molekulargewicht: im Bereich von 7*000 bis 90.000, bestimmt durch SDS-Gelelektrophorese oder Sephadex-Gelfiltration;

b) J?arbreaktionen: es bildet eine färbung bei der Lowry-Reaktion als Nachweis auf Proteine, es bildet eine Färbung bei der !Minhydrin-Reaktion nach Hydrolyse mit Salzsäure als Nachweis auf Peptidbindungen und -Aminosäuren, und es bildet eine Pärbung bei der Bhenolschwefelsäure-Reaktion, der Anthronschwefelsäure-Reaktion, der Indolschwefelsäure-Reaktion und der Tryptophansehwefelsäure-Reaktion als lachweis von Zuckern;

c) Aussehen und Löslichkeit: weißes Pulver, löslich in Wasser, wäßrigem natriumchlorid und Phosphatpuffer, und schwach löslich in Benzol, Hexan und Chloroform;

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d) Zuckergehalt: der Zuckergehalt beträgt 8 bis 45 %> wobei 6 bis 28 % des Gesamtzuckers Hexosen, 1 bis 11 % Hexosamiiie und 1 bis 6 % Sialinsäuren (sialic acids) darstellen;

e) stabil in wäßriger Lösung von pH 2,0, pH 7,0 oder pH 11,0 bei 4 ⁰C über 24 h oder länger und in einer wäßrigen Lösung von pH 7,0 bei 60 ⁰C über 3 h oder länger; und

f) Selektive Zerstörung von 2umorzellen ohne nennenswerte Schädigung normaler Zellen.

Da die Glykoproteine gemäß der üirf indung in vier Fraktionen mit verschiedenen Molekulargewichten und Zuckergehalten eingeteilt werden können, werden die Giykoproteine in der vorliegenden Beschreibung aufgrund ihres Unterschiedes im Molekulargewicht klassifiziert; eine Fraktion mit einem Molekulargewicht von 12.000 bis 17.000 wird als "Carcino-Breaker-X" bezeichnet (im folgenden als GB₇ bezeichnet\ dies trifft auch für die weiteren zu), eine Fraktion mit einem Molekulargewicht von 70.000 bis SO.000 wird als GB^. bezeichnet, eine Fraktion mit einem Molekulargewicht von 40.000 bis 50.000 als CB₂₂ und eine Fraktion mit einem Molekulargewicht von 7.000 bis 9.000 als CB₂-. In dem Falle, wo sämtliche Fraktionen, nämlich CB^, ^σΒχ-ι · ^GBX2 '""^ allgemein angesprochen sind, wird als Allgemeinausdruck "GB" verwendet.

Die physikalische^ chemischen und biologischen Eigenschaften der erfindungsgemäßen Glykoproteine werden nachfolgend im Detail beschrieben.

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a) Molekulargewichtι Bei Bestimmung mit Hilfe der Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex G 100 (Pharmacia Co·) und 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,2) als Lösungsmittel, beträgt das Molekulargewicht 12,000 bis 17.000.

b) Farbreaktionen: Die Ergebnisse der Versuche mit wäßriger

CB_V-Lösung auf Farbreaktionen sind in Tabelle 1-1 zu-.λ.

saramengestellt. Die Lowry-Reaktion und die Winhydrin-Reaktion wurden entsprechend den in Seikagaku «Jikken Koza, Bd· 1, Quantitative Proteinmethoden, 1971, beschriebenen Verfahren durchgeführt. Die Phenolschwefelsäure-Reaktion, die Anthronschwefelsäure-Reaktion, die Haphtholschwefelsäure-Reaktion, die Indolschwefelsäure-Reaktion und die Tryptophanschwefelsäure-Reaktion wurden entsprechend den Verfahren, wie sie in Seikagaku Jikken Koza, Band 4» Quantitative Methoden für Zucker, 1971, beschrieben sind, durchgeführt. Die Holff-Reaktion wurde entsprechend den Verfahren, wie sie in Seikagaku Jikken Koza, Bd. 3, Quantitative Methoden für Lipide, 1971, beschrieben sind, durchgeführt.

Tabelle 1-1

Farbreaktion Färbung Nachweis

Lowry blau Peptidbindungen

Ninhydrin purpurblau Aminosäuren

Phenolschwefelsäure braun Zucker

Anthronschwefelsäure grünlich blau Zucker

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Tabelle 1-1 (Fortsetzung)

Farbreaktion Färbung Nachweis

oC-Naphtholschwefelsäure purpurfarben Zucker

Indolschwefelsäure braun Zucker

Tryptophanschwefelsäure ptirpur-braun Zucker

HoIff farblos keine Lipide

aus vorstehender Tabelle hervorgeht, ergibt Farbreaktionen als Nachweis auf Proteine und Zucker; es ergibt keine Färbung zum Nachweis auf Lipide,

c) Aussehen und Löslichkeit: Weißes Pulver, löslich

in Wasser, wäßrigem Natriumchlorid und Phosphatρuffer, und schwach löslich in Benzol, Hexan und Chloroform·

d) Zuckergehalt: Gemäß der Methode von Spiro (Spiro H, Α., Methods in Enzymology, Bd. 8, 3-26 (1966)) "beträgt der Zuckergehalt von CB^- 27 bis 33 %\ die Zuckerzusammensetzung beträgt: 17 bis 20 % Hexosen, 5 bis 7 % Hexosamine und 5 bis 6 % Sialinsäuren.

e) Isoelektrischer Punkt: Bei Bestimmung mit Hilfe der isoelektrischen Fokussierung an Ampholin liegt der isoelektrische Punkt bei 4,2 bis 7,3.

f) Absorbierbar an Ulex-europeus-Agglutinin-konjugiertem Sephadex in 0,01 H Phosphatpuffer (pH 7,2).

g) Stabil im Hinblick auf das Molekulargewicht durch Gel-

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filtration und der cytotoxischen Aktivität gegen Tuniorzeilen in wäßriger Lösung von pH 2,0, pH 7,0 oder pH 11,0 bei 4 ⁰C 24 h oder langer und in wäßriger Lösung von pH 7,0 bei 60 ⁰C 3 η oder langer.

h) Das genannte Glykoprotein zerstört selektiv Tumorzellen, ohne daß es normale Zellen in nennenswertem .Maße schädigt·

Die Cytotoxiaität von CB^- wurde bestimmt durch Kultivieren von 10-Tumerzellen oder normalen Zellen in 0,2 ml eines Mediums in Gegenwart dieser Substanz bei 37 ⁰C für 48 h. in einer 5 % GO₂» 95 % Lüftatmosphäre, und Auszählen der Anzahl lebensfähiger Zellen, die nicht mit Trypan-blau gefärbt wurden, und ausgedrückt als Konzentration, bei welcher die zahlenmäßige Zunahme der Zellen zu 50 % inhibiert wurde. Eine'Einheit GB wird als die Substanzmenge definiert, bei welcher das Wa< Zelle zu 50 % inhibiert wird.

definiert, bei welcher das Wachstum von 10 -Zellen der KB-

i) Induktion einer Differenzierung von Tuniorzellen, d. h. nach einem Test gemäß dem Verfahren von Hozumi et al (Hozumi, et al, Cancer Research, Bd· 40, 2919-2924 (1980)),'werden die Tumorzellen, unter Anwendung von myelogenen Leukämiezellen M-1 zu normalen Zellen umgewandelt.

a) Molekulargewicht: Bei Bestimmung mit Hilfe der Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex G-1QO und 0,01 M

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Phosphatpuffer (pH 7,2) als Lösungsmittel beträgt das Molekulargewicht 70.000 bis 90.000.

b) Farbreaktionen: Die Ergebnisse der Versuche mit wäßriger CB₇...-Lo*sung auf Farbreaktionen sind in Tabelle 1-2 zusammengestellt.

Tabelle 1-2

Farbreaktion

Farbe

nachweis

Lowry

Hinhydrin

Phenolschwefelsäure Anthronachwefelsäure C6-&aphtholachwefelaäure Indolschwefelaäure

Trvptophanschwefelaäure Holff

blau

purpurblau

braun

grünlich blau

purpur

braun

purpur-braun

farblos

Peptidbindungen

.Aminosäuren

Zucker

keine Lipide

Wie die vorstehende Tabelle zeigt, ergibt CB^₁ F_arbreaktionen zum Nachweis auf Proteine und Zucker, jedoch keine farbreaktion zum Uachweis von Lipiden·

c) Aussehen und Löslichkeit: Weißes Pulver, löslich in Wasser, wäßrigem Natriumchlorid und Phoaphatpuffer und schwach löslich in 3enzol, Hexan und Chloroform.

d) Zuckergehalt: Gemäß der Methode von Spiro beträgt der Zuckergehalt von CB^₁ 35 bis 45 %\ die Zuckerzusammen-

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setzung ist folgende: 23 bis 28 % Eexosen, 8 bis 11 % Hexosamine und 4 bis 6 % Sialinsäuren.

e) Isoelektrischer Punkt: Bei Bestimmung durch isoelektrische fokussierung an AmphOlin liegt der isoelektrische Punkt bei 4,3 bis 6,2.

f) Absorbierbar an Ulex-europeus-Agglutinin-konjugiertem Sephadex in 0,01 m Phosphatρuffer (pH 7,2).

g) Stabil im Hinblick auf das Molekulargewicht mittels Gelfiltration und der cytotoxischen Aktivität gegen Tumorzellen in einer wäßrigen Lösung von pH 2,0, pH 7,0 oder pH 11,0 bei 4 ⁰G 24 h oder langer und in einer wäßrigen Lösung von pH 7,0 bei 60 ⁰G 3 h oder langer.

h) Selektive Zerstörung von Tumorzellen ohne wesentliche nachteilige Beeinflussung normaler Zellen. Die CytotoxLzität von CBy₁ wurde nach den gleichen '^erfahren, wie dies für GB₇. beschrieben ist, bestimmt.

a) Molekulargewicht; Bei Bestimmung mit Hilfe der Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex G-100 und 0,01 M Phospahtpuffer (pH 7,2) als Lösungsmittel wurde das Molekulargewicht zu 40,000 bis 50.000 ermittelt.

b) -F'arbreaktionen: Die Ergebnisse der Versuche mit wäßriger CB₂₂-Losung auf Farbreaktionen sind in Tabelle 1-3 zusammengefaßt:

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gabeile 1-3

Farbreaktion Farbe Nachweis

Lowry blau Peptidbindungen

Hinhydrin purpurblau Aminosäuren

Phenolschwefelsäure braun Zucker Anthronschwefelsäure grünlich, blau Zucker eC-ETaphtholschwefelsäure purpurfarben Zucker Indolschwefelsäure braun Zucker Tryptophanschwefelsäure purpur-braun Zucker HoIff farblos keine Lipide

Wie die vorstehende Tabelle zeigt, ergibt CB₇₀ Farbreaktionen

-o.e.

zum Nachweis von Proteinen und Zucker, jedoch keine Farbreaktion zum Nachweis von Lipiden·

c) Aussehen und Löslichkeit: weißes Pulver, löslich in Wasser, wäßriger Hatriumchloridlösung und Phosphatρuffer, schwach löslich in Benzol, Hexan und Chloroform.

d) Zuckergehalt: Fach der Methode von Spiro wurde der Zuckergehalt von CB^ zu 30 bis 37 % ermittelt, wobei sich dieser wie folgt zusammensetzt: 20 bis 23 % Hexosen, 6 bis 8 % Hexosamine und 4 bis 6 % Sialinsäuren,

e) Isoelektrischer Punkt: Bei Bestimmung durch Isoelektrofokussierung an impholin liegt der isoelektrische Punkt bei 4,2 bis 7,3.

f) Absorbierbar an Ulex-europeus-Agglutininkonjugiertem Sephadex in 0,01 m Phosphatpuffer (pH 7,2).

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g) Stabil im Hinblick auf das Molekulargewicht mittels Gelfiltration und der cytotoxischen Aktivität gegen iumorzellen in wäßriger Lösung von pH 2,0, pH 7,0 oder pH 11,0 bei 4 ⁰C über 24 h oder länger und in wäßriger Lösung von pH 7,0 bei 60 ⁰C über 3 h oder länger»

h) Es schädigt bzw. zerstört selektiv Tumorzellen ohne normale Zellen nennenswert zu schädigen. Die Cytotoxizitat von CB^₀ wurde nach den für CB_V beschriebenen Verfahren bestimmt.

a) Molekulargewicht: Bei Bestimmung durch SDS-Gel-Ü'lektrophorese beträgt das Molekulargewicht 7.000 bis 9·000.

b) Farbreaktionen: Die Ergebnisse der Versuche mit wäßriger CB^-Lösung auf J^arbreaktionen sind in Tabelle 1-4 zusammengestellt:

tabelle 1-4

farbreaktion

garbe

Eachweis

Lowry Hinhydrin Phenoischwefelsäure Anthronschwefelsäure

-Naphtholschwefelsäure Indolschwefelsäure Tryptophanschwefe!säure Holff

blau

purpur-blau

braun

grünlich blau

purpurfarben

braun

purpur-braun

farblos

Peptidbindungen .aminosäuren Zucker Zucker Zucker Zucker Zucker keine Lipide

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fie die vorstehende Tabelle zeigt, ergibt CIL·.- J?arbreaktionen zum nachweis von Proteinen und Zuckern, jedoch keine farbreaktion zum Nachweis von Lipiden.

c) Aussehen und Löslichkeit: weißes Pulver, löslich in Wasser, wäßrigem Natriumchlorid und Phosphatpuffer und schwach löslich in Benzol, Hexan und Chloroform.

d) Zuckergehalt: Nach der Methode von Spiro wurde der Zuckergehalt von CB^- mit 8 bis 15 % ermittelt, wobei sich dieser wie folgt zusammensetzt: 6 bis 10 % Hexosen, 1 bis 2 % Hexosamine und 1 bis 3 % Sialinsäuren.

e) Absorbierbar an Carboxymethylcellulose bei einer lonenaustauschshromatografie in 0,05 M Phosphatpuffer (pH 6,4) unter Verwendung von Carboxymethylcellulose.

f) Stabil im Hinblick auf das Molekulargewicht mittels Gelfiltration und der cytotoxischen Aktivität gegen Tumorzellen in einer wäßrigen Lösung von pH 2,0, pH 7,0 oder pH 11,0 bei 4 ⁰C über 24 h oder langer und in einer wäßrigen Lösung von pH 7,0 bei 60 ⁰C über 3 h oder langer,

g) Ss schädigt selektiv ^umorzellen ohne nennenswerte Beschädigung normaler Zellen. Die Cytotoxizität von CB^_ wurde nach den für GBy beschriebenen Verfahren bestimmt.

h) Die N-terminale Aminosäuresequenz des Proteinanteiles ist Alanin-Alanin-,

Die Glykoproteine gemäß der Erfindung besitzen gemeinsame

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Charakteristika in ihren Farbreaktionen, ihrem Aussehen, ihrer Löslichkeit, Stabilität, ihrer Wirkung auf Tumorzellen, etc., sie unterscheiden sich jedoch voneinander im Hinblick auf das Molekulargewicht und den Zuckergehalt; auf diese Weise können die jeweiligen Substanzen voneinander unterschieden werden»

Die Crlykoproteine gemäß der Erfindung unterscheiden sich deutlich von Lymphotoxin, dem Sumor-Necrose-Faktor, einem Gemisch derselben, nämlich OEF oder Interferon, wobei alle diese aus retikulo-endothelialen Zellen, Lymphoblasten, Leukämiezellen oder Fibroblasten erhalten werden, im Hinblick auf die folgenden Merkmale; die Glykoproteine gemäß der Erfindung stellen somit deutlich unterschiedliche Substanzen dar·

üs ist bekannt, daß Lymphotoxin in drei verschiedenen Typen vorliegt, die sich durch das Molekulargewicht unterscheiden, nämlich c&-Lymphotoxin mit einem Molekulargewicht von 70.000 bis 90.000, ß-Lymphotoxin jnit einem Molekulargewicht von 35.000 bis 50,000 und ff-Lymphotoxin mit einem Molekulargewicht von 10.000 bis 20.000 (Cohen et al., (Herausgeber) Biology of the Lymphokinase, Academic Press, 1979)· Im Hinblick auf das Molekulargewicht ähneln CB^. dem

y-Lymphotoxin, CB^₁ dem^-Lymphotoxin und CB^p dem ß-Lymphotoxin. Wie jedoch von Lucas et al. (Lucas, Z. J. et al., J. Immunology, Bd. 109, 1233 (1972)) berichtet wird, besitzt Lymphotoxin im Hinblick auf seine cytotoxische Wirkung wenig Selektivität; es führt zu einer Schädigung sowohl von normalen als auch von TumorzeIlen. Im Gegensatz dazu ist die- cytotoxische Wirkung der erfindungsgemäßen Glykoproteine gegenüber Tumorzellen selektiv und sie unter-

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scheiden sich darait deutlich von Lymphotoxin· Außerdem unterscheiden sich die erfindungsgemäßen Glykoproteine von Lymphotoxin in bezug auf Absorbierbarkeit und Stabilität· Genauer gesagt bedeutet dies folgendes: Während das nach dem Verfahren von Granger et al.(Granger, G. A· et al·, Cellular Immunology, Bd. 38, 388-402 (1978)) hergestellte Lymphotoxin nicht oder nur schwach an "Ulex-europeus-Agglutinkonjugiertem Sephadex in 0,01 M Phosphatpuffer absorbiert wird, werden die erfindungsgemäßen Glykoproteine an dasselbe absorbiert· Außerdem sind die Glykoproteine gemäß der Erfindung in wäßriger Lösung von pH 2,0, pH 7,0 und pH 11,0 bei 4 ⁰C über 24 h oder länger, und auch bei pH 7,0 bei 60 ⁰C über 3 h oder länger stabil· Im Gegensatz dazu verliert Lymphotoxin 60 % oder mehr seiner Aktivität, wenn man es.4 h lang auf 56 ⁰C hält·

Der Tumor-Necrose-Faktor zeigt eine selektive cytotoxische Wirkung auf Tumorzellen, er besitzt ein Molekulargewicht von 33.000 bis 36·ΟΟΟ und. einen Zuckergehalt von 0 % (Garswell, Ξ· A. et al., Proc. Matl. Acad. Sei· USA, Bd.72, 3666-3670 (1975)) und er weist ein Molekulargewicht von 39.000 und einen Zuckergehalt von 40 % (The Nippon Keizai Shimbun, Morgenausgabe, August 23» 1981) auf; beide unterscheiden sich von GB₂, CB^ und GBj_-y im Hinblick auf das Molekulargewicht und von CB^₀ im Hinblick auf den Zuckergehalt♦

GBi", welches diese cytotoxischen Paktoren in Kombination enthält, besitzt ein Molekulargewicht- von ca. 35.000 (The Nippon Keizai Shimbun, Morgenausgabe, November 22, 1981) und unterscheidet sich von den erfindungsgemäßen Glykoproteinen im Hinblick auf das Molekulargewicht,

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Schließlich unterscheiden sich die Glykoproteine gemäß der Erfindung auch von Interferon, indem eratere keine antivirale Aktivität besitzen.

Im folgenden werden die Zellen zur Herstellung bzw, Gewinnung der Glykoproteine gemäß der Erfindung erläutert.

Die Zellen zur Verwendung gemäß der Erfindung, die menschlichen Ursprungs sind oder von nicht-menschlichen warmblütigen Lebewesen stammen, können beliebig retikulo-endotheliale Zellen, Lymphoblasten, LeukämiezeIlen und -^ibroblasten darstellen, und sie können in einer Primärkultur oder in einer etablierten (established) Zellinie angewandt werden· Vorzugsweise werden "Zellen menschlichen Ursprungs eingesetzt; dieselben ergeben eine höhere Sicherheit _s da sie in geringerem Maße zu. antigen-induzierten Reaktionen und anderen nachteiligen Reaktionen im Hinblick auf die Verwendung von GB bei der Behandlung menschlicher Erkrankungen führen. Bs können hierfür beliebige Zellen ausgewählt werden, wie z. B. BALL-1-Zellen, TALL-1-Zellen und HALL-1-Zellen, wie äie von Miyoshi beschrieben werden (Miyoshi, I., Mature, Bd. 267, 843-844(1977)), Uamalwa-Zellen, wie sie in "Journal of Clinical Microbiology" beschleben werden (J. Glin. Microbiol. Bd. 1, 116-117 (1975)), M-7002-Zellen und B-7101-Zellen, wie sie in "Journal"of Immunology¹¹ beschrieben werden (Bd. 113, 1334-1345 (1974)), Plow-7000-Zellen (Plow Co.), JBL-Zellen, EBP-Sa-Zellen, äBV-Wa-Zellen und iiBV-HO-Zellen, wie sie in "The iissue Culture" (Bd. 6, 527-546 (1980)) beschrieben werden, eine etablierte Zellinie, wie z* B. BALM-2-Zellen, CCRP-SB-Zellen (AiCC CCL 120), etc., und menschliche Lymphocyten und Macrophagen, wie auch Zellen einer etablierten Zellinie von menschlichen

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Lym.-gb.ooyten. und Hacrophagen, die mit verschiedenen Viren, Arzneimitteln, Bestrahlungen, etc, behandelt worden sind·

Als Zellen, die von nicht-menschlichen, warmblütigen Lebewesen stammen, können beliebige Zellen gewählt werden, so z. B. Maus-BALB/G 313-Zellen (Plow Co.), Maus-Leukämie-Zellen, wie Li210-Zellen (J. Uatl. Cancer Inst., Bad. 13, 1328 (1953)) und P388-Zelien (Scientific Proceedings, Pathologists & Bacteriologists, Bad. 33» 603 (1957)), Maus-Melanom-Klon M-3 (Plow Co), Ratten-'Iumor LLC-WHC (Flow-Co.), Hamster-Melancm-RPMI-1846-Zellen (Plow Co.) und Lymphocyten, Hacrophagen, etc. Es versteht sich, daß die gemäß der Erfindung verwendeten Zellen nicht auf die vorstehend angegebenen Beispiele beschränkt sind·

Das "Verfahren zur Herstellung der Glycoproteine (CB) gemäß der Erfindung wird im folgenden näher erläutert.

Das Verfahren zur Herstellung von CB mit Hilfe von Zellen, die menschlichen Ursprungs sind oder von nicht-menschlichen, warmblütigen Lebewesen stammen, kann aus bekannten Verfahren zur Herstellung aktiver Substanzen mit Hilfe von Zellen ausgewählt werden; die Gewinnung bzw. das Ernten kann entweder direkt aus den Zellen erfolgen oder nachdem die Zellen kultiviert worden sind, oder - falls eine größere Menge an CB gewünscht wird - werden diese Zellen einem oder mehreren Induktoren ausgesetzt. Z. B. können die Zellen, die menschlichen Ursprungs sind oder von nicht-menschlichen, warmblütigen Lebewesen stammen, in einem geeigneten Medium suspendiert und direkt dem Induktor ausgesetzt werden um CB zu produzieren, welches dann aus dem Medium geerntet wird.

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Als Induktor für CB werden gewöhnlich ein oder mehrere Substanzen aus der folgenden Gruppe ausgewählt: Leotine, wie Phytohämagglutinin, Concanavalin A, Kermesbeere-Mitogen (pokeweed mitogen), Lypopolysaccharide, Polysaccharide, wie Phosphomannan, DexDranphosphat, Endotoxine, mikrobielle Zellkomponenten, Bakterien, Viren, nucleinsäuren, Polynucleotide etc. S¹Ur die antigen-aensibilisierten Zellen dient außerdem das korrespondierende Antigen auch als ein Induktor (inducer) für GB,

Das auf diese Weise produzierte, GB kann nach bekannten Reinigungsverfahren auf einfache Weise isoliert werden, wie 's. B. durch Aussalzen, Dialyse, filtration, Zentrifugation, Konzentrierung, Lyophilisierung, etc. Sofern eine bessere Reinigung gewünscht wird, kann diese durch Adsorption und Blution an einem Ionenaustauschharz durch Gelfiltration, .Elektrophorese oder Affinitätschromatografie unter Verwendung von z· B. Antikörper oder Ulexeuropeus-Agglatinin-konjagiertem Sephadex erzielt werden.

Wenn GB in einer großen Menge erhalten werden soll, können die Zellen der etablierten Zellinie im Körper warmblütiger Lebewesen bzw. liere gezüchtet werden, wie dies nach- "" folgend erläutert wird.

Die etablierten Zellinien, die menschlichen Ursprungs sind oder von nicht-menschlichen, warmblütigen Lebewesen stammen, können beliebige retikulo-endotheliale Zellen, Lymphoblasten, Leukämiezellen und Pibroblaste darstellen, vorzugsweise v/erden Zellinien menschlichen Ursprungs eingesetzt, da diese weniger dazu neigen, durch Antigenizität induzierte Reaktionen oder andere nachteilige Reaktionen bei der Verwen-

248327 6

-19» 15.8.1983

62 128/11/37

dung von GB zur Behandlung menschlicher Erkrankungen hervorzurufen· Es können hierfür beliebige Zellinien verwendet werden, wie dies vorstehend beschrieben wird, z. B, BALL-1-Zellen, TALL-1-Zellen, UALL-1-Zellen, Namalwa-Zellen, M-7002-Zellen, B-7101-Zellen, Plow-7000-Zelien, BALB/C 323-Zellen, L1210-Zellen, P388-Zellen, Lymphocyten, Macrophagen, etc·

diese Zellen im Körper warmblütiger Tiere gezüchtet werden sollen, kann die Transplantation derartiger Zellen direkt durchgeführt werden oder - wie dies nachfolgend beschrieben wird - indirekt durch Inokulieren einer Kammer mit den genannten Zellen und Placieren der Kammer im Körper, Die warmblütigen Tiere, in welche derartige Zellen transplant iert werden, können der gleichen oder einer anderen Spezies angehören, sofern die etablierte Zellinie, die menschlichen Ursprungs ist oder von einem nicht-menschlichen, warmblütigen Lebewesen stammt, in derselben zu wachsen vermag· Z, B, können verwendet werden: Geflügel, wie Hühner, Tauben, und Säugetiere, wie Hunde, Katzen, Affen, Ziegen, Schweine, Pferde, Rinder, Kaninchen, Meerschweinchen, Ratten, Hamster, übliche Mäuse, Nacktmäuse (nude mouse).

Wenn in einem dieser Tiere eine Transplantation mit kultivierten Zellen, die von einem Tier einer anderen Spezies stammen, erfolgt, besteht die Möglichkeit des Auftretens unerwünschter immunologischer Reaktionen· Aus diesem Grunde werden Tiere in ihrem untersten Reifezustand bevorzugt verwendet, z. B« Eier, Poeten, Embryos, oder onatale oder infantile Tiere, so daß die Möglichkeit immunologischer

83 2/ Q -20« 15.8.1983

62 123/11/37

Reaktionen auf ein Minimum reduziert wird· Außerdem können die immunologischen Reaktionen durch Vorbehandlungen unterdrückt werden, z· B, indem diese 'liiere Röntgenstrahlen von 200 bis 600 RSM. ausgesetzt werden, oder indem man sie mit immunoauppressiven Mitteln injiziert·

Wenn das als Wirt zu verwendende !Bier eine Hacktmaus darstellt oder von der gleichen Spezies wie die zu transplantierenden Zellen ist, sind die immunologischen Reaktionen schwach; deshalb können derartige Zeilen in dieselben transplantiert und schnell ohne Vorbehandlung gezüchtet werden. Aus diesem Grunde ist die Verwendung derartiger Zellen besonders vorteilhaft·

In alternativer feise kann das konstante Zellwachstum sichergestellt und die Menge des von den Zellen produzierten CB erhöht werden, indem man Zellen von einem warmblütigen Tier in ein anderes warmblütiges Tier transplantiert, ζ. Β, durch Transplantation von Zellen, die menschlichen Ursprungs sind oder von nicht-menschlichen^ warmblütigen Lebewesen stammen, in Hamsier zum Wachstum, und anschließender Retransplantierung der genannten Zellen in Sacktmäuse, In solchen Fällen kann die Transplantation zwischen derselben Klasse oder Abteilung wie auch zwischen derselben Spezies oder Gattung durchgeführt werden.

Die Stelle, in welche die Zellen, die menschlichen Ursprungs sind oder von nicht-menschlichen, warmblütigen Lebewesen stammen, transplantiert werden, kann jede beliebige Stelle darstellen, an welcher die transplantierten Zellen wachsen; so können z. B, die allantoische Höhle, eine Vene, die Bauchhöhle, das subkutane Gewebe frei gewählt werden·

24832/ 6 -21- 15.8.1983

62 128/11/37

Anstelle der direkten Iransplantation und des Züchtens etablierter Zellinien, die menschlichen Ursprungs sind oder von nicht-menschlichen, warmblütigen Lebewesen stammen, im Körper warmblütiger Tiere, kann Jede beliebige der vorstehend, genannten etablierten Zellinien inokuliert und in einer üblichen Diffusionskammer verschiedener Gestalt und Größe gezüchtet werden, wobei letztere z, B. in der Peritonealhöhle des Körpers warmblütiger Tiere placiert wird; Die Diffusionskammer ist so konstruiert, daß sie das Wachstum der genannten Zellen ermöglicht, indem die Aufnahme von Körperflüssigkeit des Tieres als Nährstoffe leicht möglich wird; die Kammer ist außerdem mit porösen Filtermembranen ausgerüstet, z· B, einem Membranfilter mit einer Porengröße von ca· 10 ' bis 10 ^J m, einem ultrafilter oder einer Hohlfaser, welche das Herauswandern der Zellen aus der Kammer verhindern und den Eintritt der Körperflüssigkeit als Hährstoffquelle in die Kammer erlauben.

Sofern dies erforderlich ist, kann die Diffusionskammer ent— ,· sprechend konstruiert und z· B. auf der Oberfläche des ^ Tierkörpers placiert werden, so daß die Mhrstoffflüssigkeit in der Kammer mit der Körperflüssigkeit des Tieres in Verbindung steht und zirkuliert; auf diese Weise kann das Wachstum der in die genannte Kammer inokulierten Zellen durch ein Sichtfenster beobachtet werden. Die Diffusionskammer kann auch in der tfeise konstruiert werden, daß sie vom Tierkörper getrennt werden kann und es somit möglich ist, die Zellen über die gesamte Lebensspanne des Tieres zu züchten und auf diese Weise die Ausbeute an Zellen pro Tier zu erhöhen.

Das Verfahren unter Verwendung dieser Diffusionskammer weist

248327 6 -22- 15.8.1983

62 128/11/37

weitere Vorteile auf: da die Zellen der etablierten Zellinien, die menschlichen Ursprungs sind oder von nichtmenschlichen, warbblütigen Lebewesen stammen, nicht direkt in Kontakt mit den Tierzellen gebracht werden, können diese Zellen auf einfache Weise geerntet werden; aufgrund der geringen Wahrscheinlichkeit des Auftretens unerwünschter immunologischer Reaktionen kann man verschiedene warmblütige Tiere ohne Vorbehandlung derselben zur Immunosuppression verwenden.

Die Tiere, in welche die Zellen transplantiert worden sind, können in der für das Tier üblichen Weise gefüttert und gehalten werden; selbst nach der Transplantation sind keine besonderen Maßnahmen erforderlich; dies stellt einen besonderen Vorteil dar*

Der für das Wachstum der Zellen der etablierten Zellinien, die menschlichen Ursprungs sind oder von nicht-menschlichen, warmblütigen Tieren stammen, erforderliche Zeitraum beträgt im allgemeinen 1 bis 10 Wochen· Die Anzahl der auf

7 12 diese Weise erhaltenen Zellen wurde zu ca· 10 bis 10 Zellen und darüber pro Tier bestimmt.

Dies bedeutet, daß das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von CB extrem vorteilhaft ist, da die etablierten Zellinien, die von warmblütigen Tieren stammen, um ca· das

2 7 10 - bis 10'fache oder darüber in bezug auf die dem Tier direkt inokulierten Zellen vervielfacht werden, oder ca· 10- bis 10 fach oder darüber der Vervielfachung im Vergleich mit Zeilen, die in einem Uähratoffmedium kultiviert wurden·

Die Produktion von CB aus gezüchteten Zellen einer etablier-

248327 6 -23- 15.8.1983

62 128/11/37

ten Zellinie, die menschlichen Ursprungs ist oder von nicht-menschlichen, warmblütigen Lebewesen stammt, kann auf verschiedene Weise durchgeführt werden. Die Zellen können auch direkt aus dem Körper, in welchem aie gezüchtet wurden, geerntet werden« Z, B. kann CB direkt aus den Zellen, die durch Züchten transplantierter Zellen etablierter Zellinien, die von einem menschlichen oder nicht-menschlichen, ' warmblütigen Lebewesen stammen, in Aszites als Suspension geerntet werden oder indem man diese subkutan züchtet·

In alternativer Weise kann die Herstellung von GB unter Verwendung eines Induktors nach dem Züchten der etablierten Zellinien, die von menschlichen oder nicht-menschlichen, warmblütigen Lebewesen stammen, im Kerper eines Tieres erfolgen, indem man den Induktor entweder direkt in vivo oder in vitro, nachdem man die Zellen aus dem Körper genommen hat, anwendet, Z, B. können die Zellen einer etablierten Zellinie, die von einem menschlichen oder nicht-menschlichen, warmblütigen Lebewesen stammt, und die Aszites gezüchtet und daraus geerntet wurden, oder solche Zellen, die aus einem subkutanen lumor isoliert und dissoziiert worden sind, und die Zellen einer etablierten Zellinie, die von einem menschlichen oder nicht-menschlichen, warmblütigen Lebewesen stammt, umfassen, in einem Uährstoffmedium bei ca, 20 bis 40 ⁰G suspendiert werden, unter Bildung einer Zellkonzentration ron ca, 10^ bis 10 Zellen pro ml, und dann einem CB-Induktor ausgesetzt werden, wodurch die Produktion von GB, das dann geerntet wird, induziert wird,

tfenn außerdem die Zellen einer etablierten Zellinie, die von einem menschlichen oder nicht-menschlichen, warmblütigen

24 83 27 6 -²⁴- ΐ5.β.

62 128/11/37

Lebewesen stammt, in einer Diffusionakammer gezüchtet werden, so können die Zellen direkt aus der Kammer geerntet werden, oder sie können nach deren Entfernen aus der Kammer entweder direkt oder nach Einwirkung eines oder mehrerer Induktoren geerntet werden«

Im weiteren kann die Ausbeute an GB pro Tier noch weiter erhöht werden, indem man z· B. eine Methode anwendet, wonach die Zellen einer etablierten Zellinie, die von einem menschlichen oder nicht-menschlichen, warmblütigen Lebewesen stammt, die im Körper eines anderen Tieres gezüchtet worden sind, einem Induktor ausgesetzt werden, um die Produktion von CB in situ zu induzieren, und daraufhin die gezüchteten Zellen, die an einer bestimmten Stelle oder aus dem gesamten Tierkörper geerntet worden sind, einem Induktor zur Induzierung der Produktion von GB aussetzt, einem Verfahren, wonach die verwendeten Zellen wiederum einem Induktor zur Induzierung der CB-Produktion ausgesetzt werden, einem Verfahren, wonach eine Diffusionskammer, die in den oder in Verbindung mit dem tierkörper placiert wurde, durch eine neue ausgetauscht wird, um die Anzahl der erhaltenen Zellen zu erhöhen, etc·

Zar Induzierung der CB-Produktion kann jeder beliebige der vorstehend beschriebenen CB-Induktion eingesetzt werden, das auf diese Weise produzierte CB kann jeweils in CB₂-, CBy₁, CB_VO und'CB₇.-, die die spezifizierten Molekulargewichte

A.C. A.J

aufweisen, unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Trennungs- und Reinigungsverfahren fraktioniert werden«

Im folgenden wird die Wirksamkeit, Tozizität, das Anwendungsverfahren und die Dosierung auf das diese Weise erhaltene CB beschrieben«

248327 6 -25- 15.8.1983

62 128/11/37

Ausführungsbeiapiele

Hg. 1s das IR-Spektrum von CB^, bestimmt in Beispiel 10;

fig« 2: das IR-Spektrum von CB^₁, bestimmt in Beispiel 15;

B¹Ig* 3: das IR-Spektrum von 0Βγ_Ο, bestimmt in Beispiel 21;

Pig. 4: das IR-Spektrum von CBy-, bestimmt in Beispiel 29.

Experiment I

Selektivität des cytotoxischen Effektes

Proben von lO^Zellen einer jeden der Tumorzellinien, einschließlich KB-Zellen (Nasen-Rachenraum-Krebs), MX-1-Zellen (Brustkrebs, erhalten von Dr. Shigeru Tsukagoshi, Krebsinstitut), ϋώρ-2-Zellen (Rachenkrebs) und HEL-Zellen (Hepatom, Flow Go.) und normalen Zellinien, einschließlich Darm-407-Zellen, Girardi-Herzzellen, Ghang -Leber-Zellen, ^w Vero-Zellen (Affenniere) und MDGK-Zellen (Hundenieren) (Plow Co.), die sämtliche jeweils 24 h vofkultiviert worden waren, und ICrZellen von jeweils P388- und L1210-Zellen (Leukämie, erhalten von Dr. Shigeru Tsukagoshi, Krebsinstitut), die unmittelbar verwendet wurden, wurden jeweils in 1 ml iSagle-Medium, welches 10 % Kälberserum enthielt, mit jeder Testsubstanz bei 37 ⁰C 48 h lang in 5 % CO₂, 95 % Luftatmosphäre, kultiviert. Daraufhin wurde die Anzahl der lebensfähigen Zellen, die nicht mit Trypanblau angefärbt wurden, unter dem Lichtmikroskop ausgezählt und die Konzentration der Testsubstanz, bei welcher 50 % der Zellen ab-

248327 6 -²⁶- 15.8.1983

62 128/11/37

getötet wurden, In bezug auf die Kontrolle, die als 100 angenommen wurde, berechnet. Als Testsubstanzen wurden CIL. (erhalten in Beispiel 10), GB^₁ (erhalten in Beispiel 16), ^GBZ2 ^^erila^^en ^ⁿ Beispiel 20), CBy-, (erhalten in Beispiel 26 oder 29)» Gemisch von GBj und GB₅.., Gemisch von CBy, OBj₁, CB^₂ und CBg.* Gemisch von CB₃₂ und GB^·-, OL -, ß- und f'-Lymphotoxine, die nach einer bekannten Methode erhalten wurden (Granger, G. A. et al, Cellular Immunology, Bd. 38, 388-402 (1978)), GBI?, das von CB_x in Beispiel 1 abgetrennt wurde, und Mitomycin C verwendet. Sine Einheit der Lymphotoxine und CBP wird nach einem konventionellen Index ausgedrückt, der auf der Cytotoxizität auf Maus-L-Zellen (Bloom, B. R. Sc Grade, P. H. "In Vitro Methods in Cellmediated Immunity", Academic Press, 1979) basiert. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 2-1 bis 2-4 zusammengestellt,

	Zellen name	Spezies	Tabelle 2-1	16	—	18	34
	KB	human		5,6	-	24	17
	HEp-2	human		-	33 3,5	26 32
	Ηώ! ICX-1	human human	Konzentration für 50 % Inhibierung des Wachstums	80	-	43
	L1210	Maus	GB_x <er-Lymphotoxin GBF Mitomycin. Einheit/ml ^{in Ä;Lnhei}"^fc/^inl Einheit/ml /Ug/ml	-	-	36
Tumor- zellen	P 388	Maus	1,0	8,0	> 20.000	32
	Darm 407	human	1,6	—	} 20.000	45
	Girar- di-Herz Ghang-	human	1,1 1,9		> 20.000	19
	Leber	human	3,0	—	52
normale Zellen	Vero	Affe	3,3	-	41
	MDCK	Hund	7 1.000
			>1.000
		>1.000
	650
	520

Anmerkung: "-" bedeutet, das Experiment wurde nicht durchgeführt·

OO CaJ

ro ui όο

VD CD UJ

	Zellen name	Spezies	Tabelle 2-2	1,0	des Wachstums	> 20,	18	-	34	CO Cü hO
	KB	human		1,4	Ot-Lymphotoxin ß-Lympho- CBi¹ Mito- Einheit/ml toxin Einheit/ my ein Einheit/ml ml ,ug/ml	^20, >20,	24	-	17
	HEp-2	human	Konzentration für 50 % Inhibierung	1,5	19 21		22	,000	26
	HKL	human	^CBX1 ^Gßx2 Einheit/ml Einheit/ml	1,6	4,8 7,2		3,5	.000 ,000	32
Tumor	MX-1	human	1,0	3,4			-	43
zel	L1210	Maus	1,5	3,2	-	—	36	I
len	P 388	Maus	1,3	>1.000			32	00
	Darm 407	human	1,8	) 1.000 >1.000	- —	19 19
	Girar- di-Herz Chang- Leber	human human	3,2	640	76,0 92,0	52
	Vero	Affe	3,2	530	9,6 8,8	41	er. -* ro vn _i CD
normale Zelle	Ml)CK	Hund	> 1,000	das Experiment wurde			i.1983 28/11
	Anmerkung: "-¹¹	bedeutet,	) 1.000 y 1.000		·"-."
			630		nicht durchgeführt»
			550

Turnorzellen

normale Zelle

Tabelle 2-3 Konzentration für $0 % Inhibierung des V/aohstums

Zellen- Spezies ^GBX3 ^CBX3 Mitomycin C ^naItie Einheit/ml Einheit/ml

KB

HEp-2 HEL

ivix-1

L1210 P 388

human human human human

Maus Maus

1,0 1,5 1,3 1,8 3,1 3,4

1,0 1,7 1,4 1,7 2,9 3,5

Darm 401

Girardi-Herz

Chang-Leber

Vero

MUCK

Primär-Kultür

human human

human Affe Hund Ratte

> 1.000 >1.000

) 1.000 620 510 870

1.000 )1.000

) 1.000 580 540 910

ttatten-Leber

35 18

25 30 44 37

35 44

21 50 44 61 OO GJ ISJ

ro

tO VJI -» 00

ro ·

(D

Anmerkung:

ΟΒ

_χ3 (erhalten in Beispiel 26) *)f2) 0Β_χ3 (erhalten in Beispiel 29)

u>

iumorsellen

normale Zellen

l'abelle 2-4 Konzentration für 50 % Inhibierung des Wachst tuna

Zellen- Spezies name

Einheit/ml Einheit/ml ^inheit/ml

KB HEp-2

IVlX-1 L1210 P 388

human human, human human

Maus Maus

1,0

1.5

1,6

1.8.

3,0

3,1

1.0 1.4 1,7 1.7

3,2

3,4

1,0 1,6 1,9 1,6 3,0 3,2

Darm 407

Girardi-Herz

Chang-Leber

Vero

MDGK

human human

human

Affe

Hund

1,000

1.000

>1.000 610 580

>1.000 V 1.000

>1.000 590 610

1.000

1,000

^1.000 580 600

Anmerkung:

1) Gemisch von

2) Gemisch von

3) Gemisch von

und

und GB

CB_X2 und

GB

Ca.

er. ro u

ro

24 83 27 6 -^- «.β.

62 128/11/37

Wie die vorstehenden Ergebnisse deutlich zeigen, schädigt GB ähnlich dem CBP die Tumorzellen selektiv ohne irgendeine nennenswerte Schädigung der Normalzellen· Die Intensität der cytotoxischen Wirkung auf die jeweiligen Tumore war zwischen CB und CBP verschieden« Im Gegensatz dazu zeigten sowohl öL- und ß-Lymphotoxin und Mitomycin C eine nicht selektive Cytotoxizität gegenüber JHormalzellen und Tumor zellen,

Experiment 2

Einfluß auf Mäuse, in welche Sarcoma 18G or Bhrlich-Tuinor transplantiert wurde.

Männliche Mäuse (ddY-Stamm) mit einem Gewicht von 25 bis 30 g wurden intraperitoneal einer Transplantation mit 3 χ 10 Zellen Sarcoma 180 oder Ehrlich-Aszites-Tumor pro Tier unterzogen und die Überlebenstage beobachtet,

(erhalten in Beispiel 6), CB^. (erhalten in Beispiel 15), ^₂ (erhalten in Beispiel 20) und ^CBx-i (erhalten in Beispiel 26 oder 29) wurden intravenös an zwei Gruppen von 5 Mäusen täglich, einen Tag nach der Transplantation ab bis zum Tode, verabreicht. Die Ergebnisse sind ausgedrückt in % der durchschnittlichen Überlebenstage im Vergleich zur Kontrollgruppe und werden in den Tabellen 3-1 bis 3-3 wiedergegeben.

4 83 27 6 -32-

15.8.1983 62 123/11/37

Tabelle 3-1

!Tumor	^estsubstanz	1,2	tägliche Dosis	durchschnittl·
		4		überlebens-
		12		tage {%)
Maus-	^0BX	0,5	iäinh./kg	111
Sarcoma		20	Sinn,/kg	131
180		1,2	Einfcu/kg	164
	Mitomycin C	4	mg/kg	140
	Gyclophosphamid	12	mg/kg	172
iiihrlich-		0,5	Jiinh./kg	141
Aszites-		20	Binli./kg	159
iumor		Binh./kg	187
	Mitomycin G	mg/kg	168
	Gyclophosphamid	mg/kg	212

	OC/ Q	^CBX2	-33-	15	.8.1983
				62	128/11/37
	Tabelle
Tumor	^eatsubstanz	Mitomycin C	3-2	tägliche Dosia	durchachnittl·
	•	Cyclophoaphamid			Überlebenstage
		^CBX1			(St)
Maiis-				Jinh./kg	113
Sarcoma			1	Sinn./kg	133
180		^GBX2	3	Einfcu/kg	160
		10	ü-inh./kg	110
		1	ü'inii./kg	135
	Mitomycin C	3	Sinh«/kg	159
	Gyclophoaphamid	10	5 mg/kg	138
	o,	mg/kg	170
Shrlich-	20	üintu/kg	139
Aszites-	1	iäinh./kg	164
Tumor	3	Einh./kg	. 187
	10	Einh,/kg	135
	1	iiinh./kg	161
	3	Einh./kg	189
	10	5 mg/kg	164
	o,	mg/kg	206
20

Lk ο J L / e	^GBX3^2)	1983	labeile 3-3	durchschnittl.	26)
		62 128/11/37	tägliche Dosis	Überle benstage
			110
iumor ΐβstsubstanz	Mitomycin G	1 Binn,/kg	129
	Anmerkungen: Jf"\) GB_V	3 Einh./kg	157
Maus- ^-^T^ '	j -34- 15.3.	10 Einh./kg	108
Sarcoma	1 Einh·/kg	131
¹⁸⁰ J*o	3 Einh./kg	150
^CBX3	10 Einh./kg	142
	0,5 mg/kg	139
	1 Einh./kg	155
Mitomycin C	3 Einh»/kg	181
Ehrlich- CB_x-^rI)	10 Einh./kg	132
Ässsites-	1 Einh./kg	157
Tumor	3 Einh./kg	179
10 Einh./kg	166
0,5 mg/kg
ο (erhalten in Beispiel

GB_x- (erhalten in Beispiel 29)

Wie die vorstehenden Ergebnisse deutlich zeigen, besitzt GB eine signifikante Ariti-Tuinorwirkung sowohl auf Mäuse, denen jeweils Sarcoma 180 und ehrlich-Tumor transplantiert wurde.

24 83 27 6 -35- 15.S.1983

62 128/11/37

Experiment 3

Einfluß auf die Überlebenstage von leukämischen Mäusen

Männlichen Mäusen von BDP -Stamm mit einem Gewicht von 20 bis 25 g wurden ΙΟ-⁷ Maus-Leukämie-L1210-Zellen oder 10 Maus-Leukämie-.P388-Zellen pro Tier transplantiert und daraufhin die Überlehenstage ermittelt. CB^. (erhalten in Beispiel 10), CB₂-.. (erhalten in Beispiel 16), GB^₂ (erhalten in Beispiel 20) und ^^ C^{erilalten in} Beispiel 26 oder 29) wurden intraperitoneal an Gruppen von 5 Mäusen verabreicht und zwar täglich, beginnend einen Tag nach der •Transplantation bis zum Tode (für GB^, CB^.. und ^GBj2^ oder einmal an dem auf die Transplantation folgenden Tag (für GBy-), Die Ergebnisse werden ausgedrückt in % der durchschnittlichen Lebenstage in bezug auf die Kontrollgruppe ; die erhaltenen Daten sind in den Tabellen 4-3 zusammengestellt.

Tabelle 4-1

Turmor	Testsubstanz	tägliche Dosis	durchschnittl·
			Überlebenstage
			(*)
Maus-	/TD T	0,4 Einh./kg	105
Leukämie-		1,2 Einlu/kg	123
L1210		4 Einh./kg	151
	Mitomycin G	0ι5 mg/kg	128
	Cyolophosphamid	20 mg/kg	172

48327 β

-36-

Tabelle 4-1 (Fortsetzung)

15.3.1983 62 128/11/37

Tumor Testsubstanz	Mitomycin G	tägliche Dosis	Testsubstanz	4 BiaWkg	*inh_e/kg	durchschnittl«
	Gyclophosphamid			2 SjLuJa./kg	Einh*/kg	Überlebenstage
			S'inh,/kg	±Jinh./kg	(36)
Maus-	o,		5 mg/kg	üinh,/kg	113
Leukämie-	1.		mg/kg	Einh./kg	128
P 388	4	^0BZ2	4-2	Sinh./kg	144
	o,		tägliche Dosis	mg/kg	133
	20			mg/kg	147
	Tabelle	Mitomycin G	3
Tumor	Gyclophosphamid	10	durchschnittl.
		30	Überlebenstage
Maus-		1	108
Leukämie-	3	122
L1210	10	149
	0,5	110
	20	121
		151
	136
	149

248327

Tabelle 4-2 (Port se ta ting)

Tumor Testsubstanz tägliche Dosis

15.3.1983 62 128/11/37

durchschnittl· Überlebenstage

U)

Maus-	GB₇₁ 1 ^inh./kg	110
Leukämie	3 Einh./kg	126
P 388	10 Einh./kg	147
	CB₁₂ 0,3 Einh./kg	109
	1 Einh./kg	125
	3 Einh./kg	151
	Mitomycin C 0,5 mg/kg	130
	Gyelophoaphamid
	20 mg/kg	145
	Tabelle 4-3
Tumor	Testsubstanz tägliche Dosis	durchschnitt!.
		Überlebenstage
•		U)
Maus-	CB₂₃^h) 10 Einh./kg	109
Leukämie-	30 Einh./kg	120
L1210	100 Einh./kg	149
	CB₂₃^) 10 Einh./kg	111
	30 Einh./kg	121
	100 Einh./kg	146
	Mitomycin C 5,0 mg/kg	132

24 83 27

15.8.1983 61 128/11/37

'fabeile 4-3 (Fortsetzung)

lumor Testsubstanz tägliche Dosis

durchschnittl· Überlebenstage

Maua-	CB #1)	10	Sinn»/kg	122
Leukä-		30	Einh./kg	145
mie-		100	Sintu/kg	176
P 388	OB_x *2)	10	Einh_#/kg	120
		30	Sinn./kg	148
		100	Einh./kg	171
	Mitomycin G	5,0	mg/kg	141

Anmerkung:

1) GB^- (erhalten in Beispiel 26)

2) GB₁ (erhalten in Beispiel 29)

Wie die vorstehenden Ergebnisse deutlich zeigen, besitzt GB eine signifikante Anti-Iumorwirkung auf die mit ^umor befallenen Mäuse, nämlich sowohl auf Maus-Leukämie-L1210 als auch -P388.

Experiment 4

Einfluß auf die Überlebenstage von mit Lungencarcinom befallenen Mäusen:

Männlichen Mäusen vom BDF.-Stamm mit einem Gewicht von 20 bis 25 g wurden intramuskulär in die rechte Hüfte 2 χ 10° Zellen des Lewis-Lungencarcinoms transplantiert und die Überlebenstage ermittelt. GB^ (erhalten in Beispiel 7),

24 83 27 6

15.S.1983 62 128/11/37

(erhalten In Beispiel 17), GB^₂ (erhalten in Beispiel 22) and CB,,, (erhalten in Beispiel 26 oder 29) wurden intravenös an Gruppen von 6 Mäusen verabreicht und zwar täglich, beginnend einen Tag nach der Transplantation bis zum Tode. Die Ergebnisse werden ausgedrückt in % der durchschnittlichen Überlebenstage in bezug auf die Eontrollgruppe; die erhaltenen Daten werden in Tabelle 5-1 bis 5-2 wiedergegeben.

	Tabelle 5-1	durchschnittl.
Testsubstanz	tägliche Dosis	Überlebenstage (56)
		104
CB_x	1,2 Äinh./kg	112
	4 Sinn./kg	146
	12 Blah./kg	121
Mitomycin C	0,5 mg/kg	163
Gyclophosphamid	20 mg/kg
	Tabelle 5-2	durchschnittl.
Teatsubstanz	tägliche Dosis	Überlebenstage
		107
^0BX1	1 iäinh./kg	113
	3 üinh./kg	145
	10 ^inh./kg

248327

15.8.1983 62 128/11/37

Tabelle 5-2 (PortSetzung)

Testsubstanz

tägliche Dosis

durchschnittl» Überlebenstage {%)

^GBZ2	1	äinh./kg	109
	3	Sinti./kg	121
	10	Einh./kg	143
CB^	1	üiinlu/kg	115
	3	Einh./kg	143
ν-	10	Sinh./kg	157
^G%3^}	1	iiinh./kg	111
	3	Einh./kg	136
	10	Einh./kg	159
Mitomycin C	o,	5 mg/kg	120
Cyclophosphamid	20	mg/kg	164

0Β_χ, (erhalten in Beispiel 26} ^ (erhalten in Beispiel 29)

Anmerkung:

Sxperiment 5

Einfluß auf die Überlebenstage von mit Melanom befallenen Mäusen:

In männliche Mäuse von BDP.-Stamm mit' einem Gewicht von bis 25 g wurden pro Tier subkutan in den Rücken 10 Zellen Maus-Melanom B 16 transplant!ert, und die Überlebenstage ermittelt. CB_T (erhalten in Beispiel 10) und CB₇-- (erhalten in -^eispie^. 26 oder 29) wurden intravenös an Gruppen von 7 Mäusen verabreicht, und zwar täglich, beginnend einen Tag nach der Transplantation bis zum Tode· Die Ergebnisse werden

2483 27 6 -^-

15.8.1983 62 128/11/37

ausgedrückt in % der durchschnittlichen Überlebenstage in bezug auf die Kontrollgruppe; die Daten sind in den Tabellen 6-1 bis 6-2 zusammengestellt·

	Tabelle 6-1	durchschnittl.
Testsubstanz	tägliche Dosis	Überlebenstage
		(*)
		122
	1,2 Einh./kg	135
	4 Einh./kg	180
	12 Einh./kg	138
Mitomycin C	0,5 mg/kg	158
	20 mg/kg
	Tabelle 6-2	durchschnittl.
Testsubstanz	tägliche Dosis	Überlebenstage (%)
		110
^GI?3°	1 Einh./kg	131
	3 Einh./kg	178
	10 Einh./kg	116
	1 Einh./kg	129
	3 Einh./kg	176
	10 Einh./kg	140
Mitomycin G	0,5 mg/kg

8 3 2 7 Ό -42- 15.8.1983

62 128/11/37

Anmerkung *f 1) GB.^ (erhalten in Beispiel 26) 3 (erhalten in Beispiel 29)

Wie die vorstehenden Ergebnisse deutlich zeigen, besitzt CB einen deutlichen Anti-Tumoreffekt auf die mit Maus-Melanom B 16 befallenen Mäuse.

Experiment 6

Einfluß auf die Metastase von Lungenkrebs:

Männlichen Mäusen vom BDI?..-Stamm mit einem Gewicht von 20 bis 30 g (jeweils 6 Tiere in jeder Gruppe) wurden subkutan in deren Rücken 2 mm große quadratische Segmente Lewis-Lungenkrebs transplantiert. CB^ (erhalten in Beispiel 6), GB^₁ (erhalten in Beispiel 15), ^²Tp ^^erilal^^en ^¹¹ Seispiel 20) und CBP wurden intravenös einmal täglich, 12 Tage lang, beginnend am 9· Tag nach der Transplantation verabreicht. Am 21» Tag nach der Transplantation wurde die Masse des Primärtumors isoliert and ausgewogen, und die Anzahl der metastatisierten Knoten in der Lunge nach der Methode von Wexler, H. (J. Hatl. Cancer Institute, Bd. 36, 641 (1966)) ermittelt. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 7-1 und 7-2 zusammengestellt.

Tabelle 7-1 -Experiment Teatsubstanz tägl« Dosis

'i-'umor-Gewicht (g)

Kontrolle

GB,

Cyolophosphamid

Einheit/kg

40

Einheit/kg

20 mg/kg

9,6 + 1,9 5,1 ± 1,6*

3,0+ 0,3

3,4 ± 0,7**

Kontrolle CB_V

CBF

Einheit/kg

40 Einheit/kg

4 Einheit/kg

40 Einheit/kg

7,3 ± 0,3

4,1 + 1,2*

2,3 + 0,2***

6,6 + 0,6

4,2+ 0,4 *

Anzahl der metastatisierten Knoten in der Lunge

?,2 + 7,3

6,8 + 3,2^

0,4 + 0,4* ^

0,4 + 0,2**·

29,2+ 1,4

6,7 + 2,1

0,5 + 0,2

22,0 + 5,0

21,4 ± 4,5*

OO

CX) U)

	tägl. Dosis Einheit/kg	• Tabelle 7^2	Anzahl der metasta- tisierten Knoten in der Lunge	1
Testaubstanz		Tumor-Gewicht (g)	29,6 +	2,0 <f
Kontrolle	3	7,8 + 0,5	7,3 ±	0,3**
^GBX1	30	4,3 ± 1,3*	0,5 +	1,9#
	3	2,4 ± 0,3**·	7,1 +
^GBX2	30	4,9 + 1,3*	0,7 ±	5,2
	3	2,1 + 0,5**	23,0 +	4,4
GBI¹	30	6,8 + 0,6	22,4 +	0,3**
	20	4,3 ± 0,55*	0,6 +
Gyclophosphamid	3,5 + 0,6)

CJO OJ

ro vjt όο

248327 6 -45- i5.s.

62 128/11/37

Anmerkung: Die Ergebnisse in den Tabellen aind ausgedrückt als (durchschnittlicher Wert) + (Standardfehler) ^f Statistisch verschieden von der Kontrollgruppe bei einem "ignifikanzwert von 5 % oder darunter, $& Statistisch Verschieden von der IContrcllgruppe bei einem

Signifikanzwert von 1 % oder darunter·

Die vorstehenden Ergebnisse zeigen deutlich, daß CB^- sehr erfolgreich primären Lungenkrebs und dessen Metastasen unterdrückt, wohingegen CBP nahezu keine Wirkung auf Lungenmetastasen zeigte

!Experiment 7

Wirkung auf die Induzierung der Differenzierung von Tumorzellen:

Nach der Methode von Hozumi, M. et al (Cancer Research, Bd. 40, 2919-2924 (i960)) wurden 5 x 10^ akute myelogene Leukämie-Zellen M-1 (erhalten von Dr· Motoo Hozumi, Saitama Krebszentrum) in 1 ml Sagle-Medium, welches 10 % Kälberserum und außerdem Aminosäuren und Vitamine in der doppelten Menge als üblich enthielt, suspendiert; dazu wurde jeweils die Testsubstanz gegeben, und bei 37 ⁰C 48 h in einer 5 % CO₂, 95 % Luftatmosphäre kultiviert» Daraufhin wurden die Zellen in einem Medium, welches 0,2 % Polystyrol-Latexteilchen (Dow Chemical Co.) enthielt, resuspendiert, bei 37 ⁰C 4 h lang inkubiert und dann die Anzahl der Zellen, welche die Partikel phagozytosierten, und die Anzahl der Gesamtsellen unter dem Lichtmikroskop bestimmt und die Differenzierungsrate aus dem Verhältnis dieser Zellen berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 zusammengestellt.

4 8 3 2 7 6 -46-

15.8.1983 62 128/11/37

Tabelle 8

Testsubatanz Konzentration

Differensierungsrate

Kontrolle	0,004	Sinn,	/ml	1
CB_x	0,04	Sinn ♦	/ml	8
	0,4	Sinn.	/ml	11
	20,0	mg/ml		18
Dexamethason			25

zeigte eine Wirkung zur Induzierung der Differenzierung,

Experiment 8

Pyrogenteat:

Nach der in "Japanese Pharmacopeia" beschriebenen Methode wurde GB₂- (erhalten in Beispiel 3) intravenös an weiße Kaninchen in einer Dosis von 100 Einheiten pro Tier verabreicht. Die Ergebnisse der Messungen der Rektaltemperatur bis zu 3 h danach unter Verwendung eines Thermometers vom Typ eines Thermoelementes, sind in Tabelle 9 zusammengestellt:

Tabelle 9

Kanin- Gew. Rektal-Temperatur vor und nach GB^-Injektipn chen (kg) (⁰C) *

vor Inj. i h später 2 h später 3 h später

A	2	,0	38	,90
B	2	,0	38	,90
C	2	,0	39	,25

38,70 38,90 39,25

38,80

38,97 39,22

38,80 38,97 39,30

4 83 27 6 -47-

15.3.1983 62 123/11/37

Experiment 9

Einfluß auf an Brustkrebs erkrankten Mäusen:

Sackmäusen von BALC/C-Stamm mit einem Gewicht von 20 bis 25 g (6 Tiere in jeder Gruppe) wurden in den Rücken 2 mm große"quadratische Segemente an menschlichem Bruystkrebs MX-1 subkutan transplantiert. 0Β_χ~ (erhalten in Beispiel oder 29) wurde intravenös 14 Tage läng, beginnend am 14. Tag nach der Transplantation, an die Mäuse verabreicht· im 15· Tag nach der ersten Verabreichung wurde das Volumen des Primärtumors gemessen· Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 zusammengestellt:

Tabelle 10

Testsubstanz tägliche Dosis

Tumorvolumen (cm3)

Kontrolle

Mitomycin G

1 ^inh./kg

3 -Sinn./kg

10 Einh./kg

1 ü'inh,/kg

3 Sinn./kg

10 Einh./kg

0,5 mg/kg

9,7 + 2,2 7,6 + 1,3 4,3 ± 1,3*

2.2 + 0,9**

7.3 ± 1,2 4,6 + 1 2,0 + 1

4.4 + 1

Anmerkung:

if 1) (Durchschnittlicher Wert) + (Standardfehler) ^XV ^eriia^^ea i-ⁿ Beispiel 26, CB_x,, erhalten in Beispiel 29,

24 83 27 6

15.8.1983 62 128/11/37

if Statistisch verschieden von der Kontrollgruppe bei einem Signifikanzwert von 5 % oder drunter,

Statistisch verschieden von der Kontrollgruppe bei einem 3xgxil£j.karLZwert von 1 % oder darunter.

Experiment 10

iSinflüß auf Methylcholanthren-induzierten Tumor:

3-Methylcholanthren, aufgelöst in Olivenöl, wurde subkutan in den seitlichen Abdomen von Mäusen (ddY-Stamm) mit einem Gewicht von 20 bis 25 g (8 Tiere in jeder Gruppe) in einer Dosis von 0,5 mg pro Maus injiziert· ^CBjo (erhalten in Beispiel 26 oder 29) wurde den Mäusen einmal täglich, 21 Tage lang, beginnend ca· am 60· Tag nach der 3-Methylcholanthren-Injektion verabreicht· Am 21. Tag nach der ersten ΟΒ^-ν-Verabreichung wurde das Volumen des Tumors gemessen. Die Ergebnisse sind, in Tabelle 11 zusammengestellt.

Tabelle 11 Testsubstanz Tägliche Dosis Tumorvolumen

(cnr)

Kontrolle

^BX3*³⁾

. /kg 3 Einh./kg 10 Sinh,/kg 1 Einh«/kg 3 Sinh./kg 10 Binh./kg

Mitomycin C 0,5 mg/kg

10,5 ± 2,3 3,5 ± 1,4

5.4 _± 1,4

2.5 ± 0 3,9 + 1,5

5.1 ± 1

2.2 ± 0,8

6.6 + 1,3*

24 83 27 6 -^- 15.8.1933

62 128/11/37 Anmerkung:

# 1) (Durchschnittlicher ffert) + (Standardfehler) Jf 2) CB₂-, erhalten in Beispiel 26, erhalten in Beispiel 29,

# Statistisch verschieden von der Kontrollgruppe bei einem Signifikanzwert von 5 % oder darunter,

Statistisch verschieden von der Kontrollgruppe bei einem Signifikanzwert von 1 % oder darunter·

Die vorstehenden Ergebnisse zeigen duetlich, daß eine Antitumorwirkung auf spontanen Tumor besitzt.

Experiment 11

Toxizitätstest (Einzelverabreichung)

Männlichen Mäusen von BDI^-Stamm mit einem Gewicht von 20 bis 25 g (10 Tiere in jeder Gruppe) wurde intravenös CB verabreicht und die Anzahl der toten Tiere im Verlaufe von 7 Tagen ermittelt· äs zeigte sich, daß sämtliche der 10 Tiere überlebten, ohne daß 3ie irgendwelche Veränderung im Körpergewicht und im Allgemeinzustand zeigten, selbst wenn 10#000 üinheiten/kg an GBy, GB^₁ oder CB^₂ oder 100.000 Einheiten/kg an CB_x- verabreicht wurden.

Experiment 12

'üoxizitätstest (kontinuierliche Verabreichung über 30 Tage)

243327- 5 -se- 15.8.1983

62 128/11/37

Männlichen Mausen vom BDP.-Stamm mit einem Gewicht von 20 bis 25 g (10 Tiere· in ;Jeder Gruppe) wurde intravenös CB verabreicht und die Anzahl der toten Tiere im Verlaufe von 7 'Tagen ermittelt· Es zeigte sich, daß sämtliche der 10 Tiere überlebten, ohne daß sie irgendwelche Veränderung im Körpergewicht und im Allgemeinzustand zeigten, selbst wenn 10.000 Einheiten/kg an CB₇, CB^, oder CB₇₀, oder

Jv. Al A.c.

100.000 Einheiten/kg an GB^₃ verabreicht wurden.

Experiment 12

Toxizitätstest (kontinuierliche Verabreichung über 30 Tage)

Männlichen Mäusen vom BDP.-Stamm mit einem Gewicht von 20 bis 25.g (10 Tiere in jeder Gruppe) wurde intravenös GB über 30 Tage verabreicht; die Anzahl der toten Tiere, die Veränderung des Körpergewichts und des Allgemeinzustandes wurden beobachtet. Das Körpergewicht wurde zwischen 9.00 Uhr und 10.00 Uhr vormittags bestimmt, die Beobachtung des Allgemeinzustandes (general conditions) wurde sun 10·, 20. und 30· Tag nach der Methode von Arvien (Science, Band 36» 123 (1962)) vorgenommen. Es zeigte sich, daß in diesen 30 Tagen bei Verabreichung von 1.000 Einheiten/kg/Tag an GB_x, CB₂₁ oder OBj₂» ^{oder 10}·⁰⁰⁰ Einheiten/kg/Tag an CB₇.., kein totes Tier vorgefunden wurde, und die Kurve der Gewichtszunahme mehr oder weniger die gleiche war, wie für die Kontrollgruppe. Außerdem wurde der Allgemeinzustand als normal, ebenso wie in der Kontrollgruppe, festgestellt.

Die vorstehenden Experimente zeigen, daß CB selektiv das Wachstum der ^umorzellen unterdrückt, und daß es nicht nur duetlich die Krebsmetastase unterdruckt, sondern sich

248327 6 -51-· 15.8.1933

62 128/11/37

auch gegen mehrere lamore· als extrem wirksam und in der Anwendung als sehr sicher erweist, selbst bei Dosen, die über der Dosis liegen, bei der die pharmazeutische Wirkung manifest würde. Somit ist CB außerordentlich nützlich zur Therapie verschiedener lumore, wie Magenkrebs, Lungenkrebs, Hepatom, Colonkrebs, Brustkrebs, Uteruskrebs, Leukämie etc·

GB kann in Porm üblicher Präparationen verabreicht werden, wie z. B. als Injektionen, Augentropfen, Nasentropfen, Inhallierungsmittel, topischen Präparationen, oralen Präparationen, rektalen Präparationen, vaginalen Präparationen etc. Die tägliche therapeutische Dosis an CB für einen erwachsenen ist aufgrund der hohen Sicherheit nicht besonders beschränkt, liegt jedoch im allgemeinen bei 0,5 bis 500.000 Einheiten, vorzugsweise 0,5 bis 5.000 Einheiten für topische Applikation, 20 bis 100.000 Einheiten für systemische Verabreichung, wie intravenöse Injektion, intramuskuläre Injektion etc., und 50 bis 500.000 Einheiten für die orale Verabreichung; die jeweilige Dosis kann in Abhängigkeit der Anwendungsmethode oder der Ernsthaftigkeit der Erkrankung in geeigneter Weise angepaßt werden· Die Präparation kann jeweils CBy, CB₂₁, CBy₂ ¹^d CBy- allein oder in Kombination miteinander in jedem beliebigen gewünschten Verhältnis enthalten«

CB kann nach üblichen Methoden zu pharmazeutischen Präparationen formuliert werden, wobei pharmazeutisch annehmbare Träger, Basen, Exzipienten etc. verwendet werden. Vorzur ziehen ist eine Verwendung als orale Präparation, wie z. B, als enterische Präparationen, z. B. Kapseln, Tabletten, Pulver etc., rektale Präparationen, wie ixektalsuppositorien, Injektionen, wie z. B. wäßrige Injektionen, rekonstituierbare Präparationen von lyophilisiertem Pulver zur Auflösung in destilliertem

24 8 3 27 S -52- 15.3.1983

"* 62 128/11/37

Wasser unmittelbar vor der Verwendung zur Injektion und topische Präparationen, wie Salben, Lotionen etc· Außerdem kann eine Formulierung als Augentropfen, Hasentropfen oder Inhallationsmittel vorgenommen werden.

Beispiele fester Träger und äxzipienten, die sich besonders eignen, umfassen übliche üixzipienten, wie Laktose, Mannit, Maisstärke und Kartoffelstärke, Bindemittel, wie kristalline Cellulose, Cellulosederivate, Gummiarabikum, Maisstärke und Gelatine; Desintegratoren, wie Maisstärke, Kartoffelstärke und Caleiumcarbohydroxymethylcellulose; und Schmiermittel, wie Talk und Magnesiumstearat· Beispiele flüssiger Träger, die besonders geeignet sind, umfassen destilliertes Wasser zur Injektion, physiologische Kochsalzlösung, pflanzliche Öle zur Injektion und Glykole, wie Propylenglykol und Polyethylenglykol·

Im folgenden werden hierzu Beispiele gegeben, die jedoch die Erfindung nicht beschränken sollen.

Beispiel 1

Humanlymphozyten"(2 χ 10 Zellen) wurden in 4.000 ml Eagle-Medium, welches 10 % Kälberserum enthielt, suspendiert und 48 h bei 37 ⁰C in einer 5 % CO^, 95 % Luftatmosphäre kultiviert. -Daraufhin wurde der Überstand des Kulturmediums gegen 0,01 M Phospähtρuffer (pH 7,2) dialysiert, und eine Fraktion, die mit 40 bis 80 % immoniumsulfat ausgesalzt wurde, von diesem Dialysat erhalten. Diese .Fraktion wurde erneut gegen den genannten Phosphatρuffer dialysiert und dann einer Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex G-100 (Pharmacia

248327 δ -⁵> i5.s.

62 128/11/37

Company) unterzogen, ^ine Fraktion mit einem Molekulargewicht von 12,000 bis- 17.000 "wurde aufgefangen, die als rohe CB_V—fraktion bezeichnet wird, während die vorher eluierte Praktion als rohe CBP-iraktion bezeichnet wird· Die rohe GBy-Praktion wurde an Ulex-europeus-Agglutinin (Maruzen Oil Co*)-kon:jugiertem Sephadex adsorbiert, mit 0,01 M Phosphatpuffer, der 0,5 M Pucose enthielt, eluiert. Hach Entfernen der Pucose durch Dialyse wurde CBy erneut an Ulex europeus-Agglütinin-konjugiertem Sephadex adsorbiert, worauf sich eine Blution mittels der Gradientenmethode unter Verwendung von Phosphatpuffer (pH 7,2) anschloß. Dabei wurde gereinigtes CB₂- eluiert. Im Gesamten wurden 0,02 mg CB_x erhalten. Die Gesamtaktivität des erhaltenen CBy betrug 150 .Einheiten, bestimmt durch die vorstehend angegebene Methode. Somit betrug die spezifische Aktivität des gereinigten CB₇. 7.500 Einheiten/mg.

Beispiel 2

Rinder-Lymphozyten (2 χ iO°Zellen) wurden in 1.000 ml Jiagle-Medium, welches· 10 % Kälberserum enthielt, suspendiert und 48 h bei 37 ⁰C in einer 5 % CO₂, 95 % Luftatmosphäre kultiviert. Daraufhin wurde der Überstand des Kulturmediums den Verfahren gemäß Beispiel 1 zur Reinigung von CB₃. unterworfen, wobei 0_P01 mg CIL. erhalten wurden. Die Gesamtaktivitat des erhaltenen CB^. betrug 20 Einheiten, somit betrug die spezifische Aktivität des gereinigten CB^ 2.000 Einheiten/mg.

Beispiel β

Maus-Lamphozyten (5 x 10 Zellen) wurden in 5.000 ml Eagle-

24 8 3 27 6 "⁵⁴~ 15.8.1983

62 123/11/37

Medium, welches 10 % Kälberserum enthielt, suspendiert und 48 h bei 37 ⁰G in einer 5 % CQ₂, 95 % Luftatmoaphäre kultiviert· Daraufhin wurde der überstand des Kulturmediums den Verfahren gemäß -Beispiel 1 zur Reinigung von CB^. unterworfen, und 0,12 mg GB_x erhalten. Die Gesamtaktivität des erhaltenen GE₇. betrug 400 Einheiten; somit betrug die spezifische Aktivität des gereinigten CB^ 3»333 Einheiten/mg.

Beispiel 4

BALL-1-Zeilen (menschliche Zellinie, 1 χ 10 Zellen), die vorkamtiviert werden, wurden in 2.000 ml Eagle-Biedium, welches 10 % Kälberserum enthielt, suspendiert und 48 h bei 37 ⁰G in einer 5 % GO₂, 95 % Luftatmosphäre kultiviert. Daraufhin wurde der Überstand des Kulturmediums den Verfahren von Beispiel 1 zur Reinigung von CBy unterworfen, wobei 0,7 mg GB^. erhalten wurden· Die Gesamtaktivität des erhaltenen CBg betrug 4.000 Einheiten; somit betrug die spezifische Aktivität des gereinigten CE^ 5»714 Einheiten/mg·

Beispiel 5

Flow-7e000-Zellen (menschliche Fibroblastenlinie, 3 χ 10^ Zellen), die durch Zellkultur gezüchtet worden waren, wurden in 600 ml Eagle-Medium, welches 10 % Kälberserum enthielt, suspendiert und 48 h bei 37 ⁰G in einer 5 % GO₂, 95 % Luftatmosphäre kultiviert. Daraufhin der überstand des Kulturmediums den Verfahren von Beispiel 1 zur Reinigung von CB^. unterv/orfen, wobei 0,005 mg CB^. erhalten wurden. Die Gesamtaktivität des erhaltenenCB„ war 10 Einheiten; somit

24 83 2 7 6 -55- 15.S.19S3

62 128/11/37

betrug die spezifische Aktivität des gereinigten CB^ 2.000 Einheiten/mg.

Beispiel 6

Menschliche Lymphozyten (2 χ 10' Zellen) wurden in 4.000 ml -Eagle-Medium, welches 10 % Kälberserum enthielt, suspendiert, und nach Zugabe von Phytohämagglutinin (Difco Go·) bis zu einer 4tidkonzentration von 50/Ug/ml, 48 h bei 37 ⁰C in einer 5 % COp, 95 % Luftatmosphäre kultiviert· Daraufhin wurde der Überstand des Kulturmediums den Verfahren von Beispiel 1 zur Reinigung von GBy unterzogen, wobei 1,0 mg CBy erhalten wurden· Die Gesamtaktivität des erhaltenen GBy war 10.000 Einheiten; somit betrug die spezifische Aktivität des gereinigten GB_x 10.000 Sinheiten/mg·

Beispiel 7

3?low-7.000-Zellen (menschliche IPibroblastenlinie, 3 χ 10 .Zellen) wurden in 600 'ml Eagle-Medium, welches 10 % Kälberserum enthielt, suspendiert, und nach Zugabe von Phytohämagglutinin bis zu eier ^ndkonzentration von 50/Ug/ml 48 h bei 37 ⁰C in einer 5 % GO₂, 95 % Luftatmosphäre kultiviert. Daraufhin wurde der überstand des Kulturmediums den Verfahren von Beispiel 1 zur Reinigung von GBy unterzogen, wobei 60_/(ug CB^. erhalten wurden. Die Gesamtaktivität des erhaltenen GBy war 480 üinheiten; somit betrug die spezifische Aktivität des gereinigten GBy 8.000 Sinheiten/mg.

Beispiel 8

TALL-1-Zellen (menschliche Zellinie, 9 x 10 Zellen), welche

2*4 8 3 2 7 6 -56- 15.8.1983

62 128/11/37

durch Zellkultur gezüchtet worden waren, wurden in 800 ml Eagle-Medium, welches 10 % Kälberserum enthielt, suspendiert; nach Zugabe von Phytohämagglutinin bis zu einer Endkcnzentration von 50/Ug/ml wurden diese 48 h bei 37 ⁰G in einer 5 % CO₂, 95 % Luftatmosphäre kultiviert. Daraufhin wurde der Überstand des Kulturmediums den Verfahren von Beispiel 1 zur Reinigung von CB₇ unterzogen, wobei 0,3 mg

A.

CB^ erhalten wurden· Die Gesamtaktivität des erhaltenen CB^ war 7·5ΟΟ Einheiten; somit betrug die spezifische Aktivität dea gereinigten CB₂- 9,375 ^inheiten/mg·

Beispiel 9

Ausgewachsene Mäuse wurden durch Bestrahlung mit Röntgenstrahlen von ca· 400 R.SM vorbehandelt, um deren Immunantwort zu. unterdrücken, und dann dieselben subkutan IALL-1-Zellen (menschlichen Ursprungs) transplantiert· Daraufhin wurden die Mäuse 3 lochen lang gefüttert. Die Masse des subkutan gebildeten (Cumors, der ca· 10 g wog, wurde isoliert, fein vermhalen und in physiologischer Kochsalzlösung, welche trypsin enthielt, dissoziiert; daraufhin wurden die dispergierten Zellen gesammelt. Diese Zellen wurden entsprechend dem Verfahren von Beispiel 1 behandelt, um CB_x zu erhalten. Die Ausbeute an OBy betrug ca. 190 Einheiten pro Maus,

Beispiel 10

BALL-1~Zellen (menschliche Zellinie, 9 χ 1θ" Zellen) wurden in 1.800 ml -äagle-Medium» welches 10 % Kälberserum enthielt, suspendiert j und nach Zugabe von 9 x 10° pfu (Plaque-bildende Einheiten) von Sendai-Virus (HVJ) 48 h bei 37 ⁰C in einer 5 % CO^, 95 % Luftatmosphäre kultiviert. Daraufhin wur-

24 8 3 27 δ -⁵⁷- 15.3.1933

62 128/11/37

de der überstand des Kulturmediums den Verfahren von Beispiel 1 zur Reinigung von CBy unterzogen, wobei 720/Ug erhalten wurden· Die Gesamtaktivität des erhaltenen war 7.920 Einheiten; somit betrug die spezifische Aktivität des gereinigten CBy. 11.000 Einheiten/mg.

Das vorstehend erhaltene CBy wurde in physiologischer Kochsalzlösung bei einer Konzentration von 1 mg/ml aufgelöst, und die optische Rotation der Lösung bei 598 nm (Ha-D-Linie) bei 26,5 bis 28,5 ⁰C mit Hilfe eines Polarmimetefs (Nihon Bunko DJP-181) unter Verwendung einer Mikrozelle mit 10 mm Lichtweg bestimmt. Die optische Rotation von physiologischer Kochsalzlösung als Kontrolle wurde dabei mit 0 angenommen.

zeigte Levo-Rotation.

(10/Ug), welches wie vorstehend erhalten wurde, wurde zu einer Mikrotablette mit Kaliumbromidpulver verarbeitet, um das IR-^pektrum von CBy aufzunehmen. Die integrierte ,- Messung (60mal) wurde mittels Pourier-Transform-Infrarotspektrometer (fx-6201 (Analect Instruments Co.) ausgeführt. Das Ergebnis wird in Pig. 1 wiedergegeben.

Beispiel 11

In ausgewachsene lacktmäuse wurden subkutan BALL-1-Zellen (menschlichen Ursprungs) transplantiert, und die Mäuse 3 Wochen lang gefüttert. Die sich subkutan bildende Tumormasse (Gewicht jeweils 10 g) wurde isoliert, fein vermählen und dann in physiologischer Kochsalzlösung, welche Trypsin enthielt, dissoziiert; daraufhin wurden die dispergierten Zellen gesammelt. Diese Zellen wurden mit iagle-Medium,

248327 δ -^5s- 15.8.1983

62 128/11/37

welches 5 % Humanserum enthielt, gewaschen; im folgenden q

wurden 2 χ 10⁷ Zellen davon in 2,000 ml desselben Mediums suspendiert and 48 h bei 37 ⁰C in einer 5' % GO₂, 95 % Luftatmosphäre kultiviert· Daraufhin wurde der überstand des. Kulturmediums den Verfahren von Beispiel 1 unterzogen, um CBy zu erhalten· Die Ausbeute an GB^. betrug ca· 200 Einheiten pro lacktmaus,

Beispiel 12

JBL-Zeilen (menschliche Zellinie) wurden in physiologischer Kochsalzlösung suspendiert; die Suspension wurde daraufhin in einer zylindrischen Diffusionskammer aus Plastik mit einem fassungsvermögen von ca· 10 ml und ausgestattet mit einem Membranfilter mit einer Porengröße von ca« 0,5 Mikron, plaziert, ^iese Kammer wurde in die Peritonealhöhle einer ausgewachsenen Ratte eingesetzt* Die Ratte wurde 4 Wochen lang gefüttert, dann wurde die Kammer aus derselben entfernt.

Die Zellkonzentration der auf diese Weise erhaltenen Human-

Zellen wurde zu ca. 5 x 10 Zellen pro ml ermittelt; dies stellt ca· die 10^fache Menge oder mehr dar, wie sie durch Kultivierung in vitro in einem Hährstoffmedium in einer 5 % GOp, 95 % Luftatmosphäre erhalten wird.

Insgesamt wurden 1 χ 10 JBL-Zellen, die nach der vorstehenden Methode erhalten wurden, in 4.000 ml Eagle-Medium, welches 10 % Kälberserum enthielt, suspendiert und 48 h bei 37 ⁰G in einer 5 % GO₂, 95 % Luftatmosphäre kultiviert. Daraufhin wurde der überstand des Kulturmediums den Verfahren von Beispiel 1 unterzogen, um CB^- zu erhalten. Die Ausbeute an CB₂- betrug ca. 350 Einheiten pro Ratte.

24 83 27 6 -⁵⁹- -15.8.1983

62 128/11/37 Beispiel 13

In ausgewachsene Nacktmäuse wurden subkutan BALL-1-Zellen (menschlichen Ursprungs) transplantiert; die Mäuse wurden daraufhin 5 lochen lang gefüttert. Im folgenden wurde jede Maus intraperitoneal mit 1 ing Phytohämagglotinin injiziert, und 24 h nach der Injektion getötet; der Aszitea wurde gesammelt· Der Aszites wurde bei 4 ⁰G und 1.000 g zentrifugiert ; der erhaltene überstand wurde gegen physiologische Kochsalzlösung, welche 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,2) enthielt, 15 h lang dialysiert· Die Lösung wurde im weiteren einer ünltrafiltration mit einem Membranfilter unterzogen und das J\iltrat konzentriert, wobei eineCB^hsltige Lösung er-

JL

halten wurde· Die CB^-Menge betrug ca· 8000 Einheiten pro Nackmaus·

Beispiel 14

HALL-1-Zellen (menschliche Zellinie) wurden in physiologischer Kochsalzlösung suspendiert und in eine zylindrische Plastik-Diffusions-Kammer mit einem Fassungsvermögen von ca· 10 ml, ausgestattet mit einem ßfembranfilter einer Porengröße von ca. 0,5 Mikron, gegossen; diese Kammer wurde in die Peritonealhöhle einer ausgewaschsenen Ratte eingesetzt· Diese Ratte wurde 4 Wochen lang gefüttert; dann wurde die Kammer entfernt· Die auf diese Weise gezüchteten Zellen wurden mit üiagle-Medium, welches 5 % Human-Serum enthielt, gewaschen und in dem gleichen Medium bei einer Zellkonzentration von ca. 5 x 10 Zellen pro ml resuspendiert. Der Suspension wurden ca. 200 /ug/ml Phytohämagglutinin zugegeben; das Gemisch wurde 2 Tage lang bei 37 ⁰C inkubiert, um die Produktion von CB^ zu induzieren. Das auf diese Weise pro-

248327 8 -⁶°- 15.8.1983

62 128/11/37

duzierte GB~ wurde - wie im Beispiel 1 beschrieben - gereinigt und konzentriert, und im weiteren lycphilisiert, um ein CB^-Pulver au erhalten. Die Ausbeute an CB_V betrug

-Λ. A.

oa. 15.000 Einheiten pro Ratte. Beispiel 15

lach den in -Beispiel 6 beschriebenen ^erfahren wurden menschliche Lymphoayten kultiviert' und der Überstand des Kulturmediums einer Reinigung unterworfen, um eine gereinigte Fraktion mit einem Molekulargewicht von 70.000 bis 90.000 zu erhalten. Diese fraktion wurde als GB^... bezeichnet. Die Gesamtaktivität der "0,1 mg an gereinigtem CB^.. betrug 5.000 Einheiten; somit betrug die spezifische Aktivität des gereinigten CB_T/j 50.000 ^innelten/mg.

Die optische Rotation des vorstehend erhaltenen CB^.. wurde bestimmt, wie dies in Beispiel 10 beschrieben ist. GBy₁ zeigte dextro-Rotation.

Außerdem wurde eine IR-Messung des erhaltenen GB-.. durchgeführt, wie dies im Beispiel 10 beschrieben ist. Das Ergebnis ist in Fig. 2 wiedergegeben.

Beispiel 16

lach den in Beispiel 10 beschriebenen Verfahren wurden BALL-1-ZeIlen kultiviert und der Überstand des Kulturmediums einer Reinigung unterworfen, um gereinigte GB_Vi zu erhalten. Die Gasamtaktivität der 100/Ug an gereinigtem GB^.. betrug 4.200 Einheiten; somit betrug die spezifische Aktivität des gereinigten CB^. 42.000 Einheiten/mg.

24 8 3 27 6 ^-

62 128/11/37 Beispiel 17

Nach den in Beispiel 7 beschriebenen Verfahren wurden Plow 700-Zellen kultiviert, und der Überstand des Kulturmediums einer Reinigung unterworfen, um 10/Ug an gereinigtem zu erhalten, Die Gesamtaktivität des erhaltenen war 250 Einheiten; somit betrug die spezifische Aktivität des gereinigten OB^₁ 25.000 Einheiten/mg.

Beispiel 18

lach den in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren wurden Rinderlymphozyten kultiviert, und der Überstand des Kulturmediums einer Reinigung unterworfen, wobei 0,002 mg an gereinigtem erhalten wurden» Die Gesamtaktivität des erhaltenen war 14 Einheiten; somit betrug die spezifische Aktivität des gereinigten CJi₇.,, 7.000 Einheiten/mg·

Beispiel 19

Nach den in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren wurden BALL-1-Zellen kultiviert und der Überstand des Kulturmediums einer Reinigung unterworfen, wobei 0,2 mg gereinigtes GB^₁ erhalten wurden» Die G_eaamtaktivität des erhaltenen CB₇.,, war 2,300 Einheiten; somit betrug die spezifische Aktivität des gereinigten CB₇₁ 11.500 Einheiten/mg.

Beispiel 20

Nach den in Beispiel 6 beschriebenen Verfahren wurden menschliche Lymphozyten kultiviert und der Überstand des Kulturmediums einer Reinigung unterworfen, um eine gereinigte !Fraktion mit einem Molekulargewicht von 40.000 - 50.000 zu

248327 6 -^- i5_os

62 128/11/37

erhalten. Diese Fraktion wurde als CB_YO bezeichnet. Die Geaamtaktivität der 0,25 mg an gereinigtem CB^₂ war 5·2ΟΟ Einheiten; somit betrug die spezifische Aktivität des gereinigten GBy₂ 20,800 Einheiten/mg»

Beispiel 21

lach den in Beispiel 10 beschriebenen Verfahren wurden BÄLL-1-Zellen kultiviert und der Überstand des Kulturmediums einer Reinigung unterworfen, wobei 75/Ug gereinigtes erhalten wurden. Die Gesamtaktivität des erhaltenen war 10,000 Einheiten; somit betrug die spezifische Aktivität des gereinigten GBy₂ 133.333 Sinneiten/mg.

y₂

Die optische Rotation des erhaltenen GBy₉ wurde bestimmt, wie dies im Beispiel 10 beschrieben ist. CB_TC> zeigte deztro-Rotation.

Die IR-BeStimmung des erhaltenen CBy₀ wurde, wie im Beispiel 10 beschrieben, ausgeführt. Das Ergebnis ist in Pig. 3 wiedergegeben.

Beispiel 22

Uach den in Beispiel 7 beschriebenen Verfahren wurde Plow 7000-Zellen kultiviert und der überstand des Kulturmediums einer Reinigung unterworfen, wobei 2Oyug an gereinigtem CB-^₂ erhalten wurden. Die Gesamtaktivität des erhaltenen ^GS22 ^war 5°° Einheiten; somit betrug die spezifische Aktivität des gereinigten CBy₂ 25.000 Einheiten/mg.

^48327 β -⁶> 15.8.1983

62 128/11/37

Beispiel 23

Bach den in -Beispiel 2 beschriebenen Verfahren wurden Rinder-Lymphozyten kultiviert und der überstand des Kulturmediums einer Reinigung unterworfen, wobei 0,001 mg an gereinigtem erhalten wurden· Die Gesamtaktivität des erhaltenen ^war 40 Einheiten? somit betrug die spezifische Aktivität des gereinigten CB^₂ 40.000 Einheiten/mg·

Beispiel 24

Hach den in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren wurden BALL-1-Zellen kultiviert und der Überstand des Kulturmediums einer Reinigung unterworfen, wobei 0,25 mg an gereinigtem erhalten wurden, -Die Gesamtaktivität des erhaltenen war 2·900 Einheiten; somit betrug die spezifische Aktivität des gereinigten GB^₂ 11.600 Einheiten/mg·

Beispiel 25

Menschliche Lymphozyten (2 χ 1O¹ Zellen), wurden, in 4000 ml üagle-Medium, welches 10'% Kälberserum enthielt, suspendiert, und nach Zugabe von Phythämagglutinin in einer Konzentration von 50yUg/ml wurde die Suspension 48 h bei 37 ⁰C in einer 5 % GO₂, 95 % Luftatmosphäre kultiviert» Daraufhin wurde der Überstand des Kulturmediums gegen Q,01 M Phosphatpuffer (pH 7,2) dialysiert, und eine durch -^ussalzung mit 40 bis 80 fa Ammoniumsulfat erhaltene Fraktion aus diesem ^ialysat erhalten. Diese Fraktion wurde gegen den genannten Phosphatpuffer dialysiert und dann einer Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex G-100 unterworfen, wobei eine Fraktion mit einem Molekulargewicht von 7.000 bis 9.000 erhalten wurde; diese Fraktion wurde als Rohfraktion GB^-_ bezeichnet.

248327 6 -^- 15.8.1933

62 128/11/37

Die Rollfraktion CB₃.., wurde an Phythämagglutin-kon;jagierter Sephalose adsorbiert, mit 0,01 M Phosphatρuffer (pH 7,2), welcher 0,5 M IT-Acetyl-D-galactosamin enthielt, eluiert. Hach Entfernen des H-Acetyl-D-galactosamins durch Dialyse wurde die erhaltene Lesung auf Carboxymethylcellulose, weiche mit 0,05 M Phoephatpuffer (pH 6,4) equilibiert war, aufgebracht, im folgenden mit 0,05 M Phosphatpuffer (pH 6,4), welcher 0,5 M Natriumchlorid enthielt, eluiert»'Auf diese Weise wurden 0,1 mg GBy, erhalten· Die Gesamtaktivität des erhaltenen GB„_ betrug 5·000 Einheiten«

Beispiel 26

leugeborene Hamster wurden einer Vorbehandlung durch Injektion Ton Antiserum, welches aus Kaninchen nach einem üblichen Verfahren gewonnen wurde, unterzogen, um deren Immunantwort so weit wie möglich zu reduzieren. Daraufhin wurden in dieselben BALL-1-Zellen subkutan transplantiert; die Hamser wurden dann 3 kochen lang gefüttert· Die subkutan gebildete Tumormasse, die ca· 15 g wog, wurde isoliert, feinvermahlen und in physiologischer Kochsalzlösung dissoziiert, ^ach dem Waschen dieser Zellen mit serumfreiem Eagle-Medium wurden 1 χ 10 Zellen in 150 1 Eagle-Medium, welches 10 % Kälberserum enthielt, suspendiert, und nach Zugabe von 9 χ 10° pfu Sendai-Virus (HVJ) 48 h bei 37 ⁰C in einer 5 % CO₂, 95 % Luftatmosphäre kultiviert. Der überstand des Kulturmediums wurde gegen 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7j2) dialysiert und eine bei 40 bis 80 % Ammoniumsulfat ausgesalzte fraktion aus diesem Dialysat erhalten. Diese Fraktion wurde wiederum gegen den genannten Puffer dialysiert und dann einer Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex G-100 unterzogen, wobei eine Fraktion mit einem

24 83 27 6 -⁶⁵- 15.8.1983

62 128/11/37

Molekulargewicht von 7000 bis 9000 erhalten wurde, die als CB_V,-Rohfraktion bezeichnet wird· Diese Rohfraktion GBy-, wurde an Concanavalin Α-konjugierter Sephalose adsorbiert, dann mit 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,2), welcher 0,5 M cu-Methyl-D-mannosid enthielt, eluiert· Nach Endfernen des OC-Methyl-D-manncaids durch Dialyse wurde die Lösung auf Carboxymethylcellulose, welche mit 0,05 M Phosphat puffer (pH 6,0) equilibriert war, aufgebracht; daran schloß sich eine Blution mit 0,05 M Phosphatpuffer (pH 7,8) an. Die Gesamtaktivität der erhaltenen 0,2 mg CB_x, war 12,000 Einheiten; der isoelektrische Punkt lag bei 6,3 bis 7*8,

Beispiel 27

Plow 7000-Zellen (3 χ 10¹⁰ Zellen) wurden in 1,0 1 i-'agle-Medium, welches 10 % Kälberserum enthielt, suspendiert, und nach Zugabe von Phythämagglutinin bis zu einer Endkonzentration von 50/Ug/ml 48 h bei 37 ⁰C in einer 5 % GO₂, 95 % Luftatmosphäre kultiviert· Der Überstand des Kulturmediums wurde CBy- unterworfen, wobei 0,1 mg des gereinigten ^CBj3 erhalten wurden· Die Gesamtaktivität des erhaltenen betrug 3.100 Einheiten·

Beispiel 28

Rinder-Lymphozyten (5 χ 10 Zellen) wurden in 10 1 Eagle-Medium, welches 10 % Kälberserum enthielt, suspendiert, und 48 h bei 37 ⁰C in einer 5 % CO₂, 95 % Luftatmosphäre kultiviert· Daraufhin wurde der Überstand des Kulturmediums den Verfahren von Beispiel 26 zur Reinigung von CB^- unterworfen, wobei 0,1 mg des gereinigten CBy- erhalten wurden. Die

24 8 3 27 6 -⁶⁶- .15.8.1983

^ 62 128/11/37

Gesamtaktivität des erhaltenen 0Β_χ~ betrug 1.700 Einheiten· Beispiel 29

BALL-1-Zellen (5 χ 10¹¹ Zellen), die durch Zellkultur gezüchtet worden'waren, wurden in 100 1 Eagle-Medium, welches 10 % Kälberserum enthielt, suspendiert und 48 h bei 37 ⁰O in einer 5 % CO₂, 95 % Luftatmosphäre kultiviert, I&aufhin wurde der Überstand des Kulturmediums gegen 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,2) dialysiert und eine bei 40 bis 80 % itamoniumaulfat äufgesalzte fraktion erhalten. Diese Fraktion wurde wiederum gegen den genannten Phosphatpuffer dialysiert und dann einer Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex G-100 unterworfen, wobei eine fraktion mit einem Molekulargewicht von 7000 bis 9000 erhalten wurde. Diese Fraktion wurde an Phytohämagglutinin-konjugierter Sephalose adsorbiert, dann mit 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,2), welcher 0,5 M 1-Acetyl-D-galactosamin enthielt, eluiert. lach Entfernen des N-Acetyl-D-galactosamins durch Dialyse wurde die dialysierte Lösung, auf Carboxymethylcellulose, welche mit 0,05 M iris-Puffer (pH 8,0) equilibriert war, aufgetragen; daran schloß sich eine dilution mit 0,05 M iris-Puffer (pH 8,0), welcher 0,5 H liatriumchlorid enthielt, an. Auf diese Weise wurden 0,1 mg an gereinigtem GB₇- erhalten« Die Gesamtaktivität an CB^., betrug 8.200 Einheiten, Der isoelektrische Punkt war 8,0 bis 9*2.

Die optische Rotation des erhaltenen GB_x- wurde, wie im Beispiel 10 beschrieben, bestimmt. CB,,.- zeigte keine optische Rotation.

Die IR~Messung des erhaltenen 0Β_χ« wurde, wie im Beispiel beschriebe^ ausgeführt. Das Ergebnis ist in Pig.· 4 wiederge-

248327 6 -⁶?- 15.8.1983

62 128/11/37 geben, Beispiel 30 (wäßrige Injektionen)

CB_x 100.000 Einheiten

natriumchlorid 9 g

destilliertes Wasser zur Injektion bis auf 1000 ml

CBy und Natriumchlorid wurden ausgewogen und miteinander vermischt, dann in 500 ml destilliertem Wasser zur Injektion aufgelöst, das Gesamtvolumen auf 1000 ml mit destilliertem Wasser zur Injektion aufgefüllt. Diese wäßrige Lösung wurde unter Sterilbedingungen mit Hilfe eines ^embranfilters filtriert, und jeweils 2 ml des Piltrats in sterilisierte Glasbehälter gefüllt und unter Herstellung wäßriger Injektionen versiegelt.

Beispiele 31 bis 33

[ Ähnliche Verfahren, wie dies für Beispiel 30 beschrieben wird, wurden für CB^..., ^GBj2 ^un^^L ^CBZ3 J^{eweila zur} Herstellung wäßriger Injektionen durchgeführt.

Beispiel 34 (lyophilisierte Injektionen)

_x 100.000 Einheiten

20 % Human-Serum-.Albumin 10 ml Natriumchlorid 9 g

destilliertes Wasser zur Injektion bis auf 1000 ml

248327 8 -^6s- 15.8.1933

62 128/11/37

CB,- und Natriumchlorid wurden ausgewogen und miteinander vermischt, dann in einer Lösung aufgelöst, die erhalten wurde durch Zugabe einer bestimmten Menge an Humanalbumin zu 500 ml destilliertem Wasser ^Z)XC Injektion; das Gesamtvolumen wurde mit destilliertem Wasser sur Injektion auf 1000 ml aufgefüllt, ^iese Lösung wurde unter Sterilbedingungen mit einem Membranfilter filtriert, und jeweils 2 ml des Piltrats in sterilisierte Glasbehälter gegeben, lyophilisiert und unter Herstellung eines lyophilisierten Pulvers zur Injektion versiegelt,

Beispiele 35 bis 37

Ähnliche Verfahren, wie dies für Beispiel 34 beschrieben wird, wurden jeweils für OB^-, _t CB^₂ und GBy 3 zur Herstellung lyophilisierter Pulver zur Injektion durchgeführt.

Beispiel 38 (Augentropfen)

100.000 Einheiten natriumchlorid 5g

Chlorobutanol 5 g

destilliertes Wasser zur Injektion bis auf 1000 ml

Die vorstehenden Bestandteile wurden ausgewogen und in 950 ml destilliertem Wasser zur Injektion aufgelöst. Das Gesamtvolumen wurde auf 1000 ml aufgefüllt, und die Lösung unter Sterilbedingungen mit Hilfe eines Membranfilters zur Herstellung einer Augentropfen-Präparation filtriert.

248327 6 -⁶^- i5.s.

62 128/11/37 Beispiele 39 bis 41

Ähnliche Verfahren, wie dies in Beispiel 38 beschrieben wird, warden jeweils für CB,,.., 03^₂ und CB₂-- zur Herstellung von ^Augentropfen-?räparationen durchgeführt.

Beispiel 42 (Suppositorien)

CB₃. 100.000 Einheiten

Polyethylenglykol 1500 250 g

Polyethylenglykol 4000 ca. 750 g

1000 g

Die vorstehenden Bestandteile wurden ausgewogen und die ganzen Mengen an CB^. und Polyethylenglykol 1500 und 500 g Polyethylenglykol 400 gründlich miteinander vermischt; daraufhin wurde das restliche Polyethylenglykol 4000 bis zu einem Gesamtgewicht von 1000 g, im weiteren gründlich vermischt und zu 5000 mg Sektalsuppositorien nach der ( Schmelzmethode aufgearbeitet.

Beispiele 43 bis 45

Ähnliche Verfahren_s wie 3ie in Beispiel 42 beschrieben sind, wurden jeweils für CB₃.-j, ^0Βχ2 ¹^ ^CBZ3 ^{zur 201}^^6111111S ^von Rektalsuppositorien durcligeführt.

Beispiel 46 (Nasentropfen)

100.000 Einheiten liatriumchlorid 5 g

Chlorobutanol 5 g

destilliertes Wasser bis auf 1000 ml

/4 8 6 2 7 D -70- 15.8.1983

62 128/11/37

Die vorstehenden Bestandteile wurden ausgewogen und in 950 ml destilliertem Wasser aufgelöst. Die erhaltene Lösung wurde auf ein Gesamtvolumen von 1000 nil mit destilliertem Wasser unter Herstellung einer Lösung für Hasentropfen aufgefüllt.

Beispiele 47 bis 49

Ähnliche Verfahren, wie dies in Beispiel 46 beschrieben wird, wurden jeweils für GE₇.., CB₇₀ und CB_YO zur Herstellung einer Lösung für Nasentropfen durchgeführt.

Beispiel. 50 (enterische, beschichtete Tabletten)

1.000.	000	β	üinheiten
	64	S
ca·	30	S
	3	σ

Lactose

Kartoffelstärke Polyvinylalkohol Magnesiumstearat

100 g

Die vorstehenden Bestandteile wurden jeweils ausgewogen, die Gesamtmengen an CB^. und Lactose und ca. die halbe Menge an Kartoffelstärke vermischt, dann die restliche Kartoffelstärke zu dem Gemisch zugegeben bis zu einem Gesamtgewicht von 94 g, und das Gemisch bis zur Homogenität vermischt. Zu dem erhaltenen Gemisch wurde eine wäßrige Polyvinylalkohollösung zugegeben und Granalien mit Hilfe der Haß-Pelletisierungs-Methode hergestellt. Die Granalien wurden getrocknet, mit Magnesiumstearat vermischt und zu 200- mg 'Tabletten komprimiert» Die -Tabletten-wurden mit Methylcellulosephthalat unter Herstellung eines enterischen Dragees beschichtet.

24 83 2 7 6 -⁷¹- 15.8.1983

62 128/11/37 Beispiele 51 bis 53

Ähnliche Verfahren, wie dies in Beispiel 50 beschrieben wird, wurden Jeweils für 0Β_ΎΛ, 0By₀ und CB,,- unter Her-

Js. \ !i.e. A. j

stellung enterischer beschichtetet Tabletten durchgeführt· Beispiel 54 (Salbe)

GB_x 100.000 Einheiten

flüssiges Paraffin 10 g

Vaseline ca. 1.000 g

1.000 g

Die vorstehenden Bestandteile wurden jeweils ausgewogen, dann wurde GB^. mit dem flüssigen Paraffin gründlich durchgeknetet, 500 g Vaseline zugegeben und wiederum gründlich vermischt. Zu dem Gemisch wurde allmählich die restliche Vaseline bis zu einem Gesamtgewicht von 1000 g zugegeben, und das Gemisch unter Herstellung einer Salbe gründlich vermischt·

Beispiele 55 bis 57

Ähnliche Verfahren, wie dies in Beispiel 54 beschrieben wird, wurden jeweils für CB₂₁, CB^₂ und CB₂₃ unter Herstellung einer Salbe durchgeführt.

Claims

62 128/11/37 Erfind ungsanspruch

1. Verfahren zur Herstellung bzw. Gewinnung eines Glycoproteins (CB), welches eine Antitumorwirkung besitzt, gekennzeichnet durch das Züchten von Zellen (Ursprüngszellen) , welche dieses Glykoprotein enthalten und von warmblütigen Lebewesen bzw· Tieren stammen, und Extraktion einer im wesentlichen gereinigten Form eines Glykoproteins aus diesen Ursprungszellen oder einem kultivierten Überstand derselben, wobei das Glykoprotein folgende Eigenschaften aufweist:

a) Molekulargewichte Im Bereich von 7.000 bis 90,000, bestimmt durch Sephadex-Gel-Filtration oder SDS-GeI-Blektrophorese;

b) Farbreaktionen: ils ergibt eine Färbung bei der Lowry-Reaktion als Nachweis auf Proteine, eine Färbung bei der Hinhydrin-Reaktion nach Hydrolyse mit Salzsäure als lachweis auf Peptidbindungen und Aminosäuren und eine Färbung bei der Phenolschwefelsäure-Reaktion, der Anthronschwefelsäure-Reaktion, der Indolschwefelsäure-Reaktion und der Iryptophanschwefelsäure-Reaktion als Nachweis auf Zucker;

c) Aussehen und Löslichkeitt Weißes Pulver, löslich in Wasser, wäßrigem Natriumchlorid und Phosphatρuffer und achwach löslich in Benzol, Hexan und Chloroform;

d) Zuckergehalt: Der Zuckergehalt beträgt 8 bis 45 %, wobei 6 bis 28 % des Gesamtzuckers Hexosen, 1 bis 11 % Hexosamine und 1 bis β % Sialinsäuren darstellen;

248327 6 -?> 15.3.1933

62 128/11/37

e) Stabilität: Stabil in wäßriger Lösung von pH 2,0,

pH 7,0 oder pH 11,0 bei 4 ⁰G über 24 h oder langer und in einer wäßrigen Lösung von pH 7,0 bei 60 ⁰G über 3 h oder langer; und

f) Cytotoxizität: ISs zerstört selektiv Tumorzellen ohne nennenswerte Schädigung normaler Zeilen·

2 % als Hexosamine und 1 bis 3 % als Sialinsäuren vorliegen;

e) Absorbierbarkeit: Absorbierbar an Carboxymethylcellulose bei Ionenaustausch-Ghromatografie in 0,05 M Phosphatpuffer (pH 6,4) unter Verwendung von Carboxymethylcellulose ;

f) Stabilität: Stabil in einer wäßrigen Lösung von pH 2,0, pH 7,0 oder pH 11,0 bei 4 ⁰C über 24 h oder langer und in einer wäßrigen Lösung von pH 7,0 bei 60 ⁰C über 3 h oder langer;

g) Cytotoxizität: Es zerstört selektiv Tumorzellen ohne wesentliche Schädigung normaler Zellen; und

h) die iiminosäuresequenz des Sf-terminalen ^ndes des Proteinanteils ist Alanin-Alanin-,

24-83 27 S ~?⁸- Τ5.8.1983

62 123/11/37

2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß das Glykoprotein (CBy) die folgenden eigenschaften aufweist:

a) Molekulargewicht: 12,000 bis 17.000;

b) Farbreaktionen: Ea ergibt eine Färbung bei der Lowry-Reaktion als Nachweis auf Proteine, eine Färbung bei der Ninnydrin-Reaktion nach Hydrolyse mit Salzsäure als ITachweia auf Peptidbindungen und .Aminosäuren und eine Färbung bei der Phenolschwefelsäure-Reaktion, der Anthronschwefelsäure-Reaktion, der Indolschwefelsäure-Reaktion und der Tryptophanschwefelsäure—Reaktion als lachweis auf Zucker;

c) Aussehen und Löslichkeit: Weißes Pulver, löslich in Wasser, wäßrigem natriumchlorid und Phosphatρuffer und schwach löslich in Benzol, Hexan und Chloroform;

d) Zuckergehalt: Der Zuckergehalt beträgt 27 bis 33 %_f wobei 17 bis 20 % des Gesamtzuckers Hezosen, 5 bis 7 % Hexosamine und 5 bis 6 % Sialinsäuren darstellen;

e) Isoelektrischer Punkt: 4,2 bis 7,3;

24 8 3 27 6 -74- 15.8.1983

62 128/11/37

f) Absorbierbarkeit: Absorbierbär an Ulex-europeus-Agglutinin-konjugiertem Sephadex in 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,2);

g) Stabilität: Stabil in einer wäßrigen Lösung von pH 2,0, pH 7,0 oder pH 11,0 bei 4 ⁰G über 24 h oder langer und in einer wäßrigen Lösung von pH 7,0 bei 60·⁰G über -3h oder langer;

h) Cytotoxizitäts Ss zerstört selektiv Juniorzellen ohne nennenswerte Schädigung normaler Zellen; und

i) Differenzierung: jüs induziert eine Differenzierung von ^umorzellen.

3. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß das Glykoprotein (GBy₁) die folgenden Eigenschaften aufweist:

a) Molekulargewicht: 70_β000 bis 90.000;

b) 3?arbreaktionen: Es ergibt eine Färbung bei der Lowry-Reaktion als lachweis auf Proteine, eine Färbung bei der Hinhydrin-Reaktion nach Hydrolyse mit Salzsäure als lachweis auf Peptidbindungen und Aminosäuren und eine Färbung bei der Fhenolschwefelsäure-Reaktion, der Anthronschwefelsäure-Reaktion, der Indolschwefelsäure-Reaktion und der Tryptophanschwefelsäure-Reaktion als Nachweis auf Zucker;

c) Aussehen und Löslichkeit: weißes Pulver, löslich in Wasser, wäßrigem Natriumchlorid und Phosphatpuffer und schwach löslich in Benzol, Hexan und Chloroform;

248327 6

-75- 15.8.1983

62 128/11/37

d) Zuckergehalt: Der Zackergehalt beträgt 35 bis 45 %, wobei 23 bis 28 % des Gesamtzuckers als Hexosen, 8 bis 11 % als Hexosamine und 4 bis 6 % als Sialinsäuren vorliegen,

e) Isoelektrischer Punkt: 4,3 bis 6,2;

f) Absorbierbarkeit; Absorbierbar an Ulex-europeus-Agglutinin-konjagiertem Sephadex in 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,2);

g) Stabilität: Stabil in einer wäßrigen Lösung von pH 2,0, pH 7,0 und pH 11,0 bei 4 ⁰G über 24 h oder länger und in einer.wäßrigen Lösung von pH 7,0 bei 60 ⁰C über 3 h oder länger; und

h) Cytotoxizität: Ss zerstört selektiv ^umorzellen ohne nennenswerte Schädigung normaler Zellen.

4. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß das Glykoprotein (GB₂₂) die folgenden Eigenschaften aufweist:

a) Molekulargewicht: 40.000 bis 50.000;

b) Farbreaktionen: Ea ergibt eine Färbung bei der Lowryüeaktion als Hachweis auf Proteine, eine !Färbung bei der Ninhydrin-Reaktion nach Hydrolyse mit Salzsäure als Nachweis auf Peptidbindungen und .aminosäuren und eine Färbung bei der Phenolschwefelsäure-Reaktion, der Anthronschwefelsäure-Reaktion, der Indolschwefelsäure-Heaktion und der Tryptophanschwefelsäure-Reaktion als iJachweis auf Zucker;

248327 b -76- 15.8,1933

62 128/11/37

c) Aussehen and Löslichkeit: Weißes Pulver, löslich in Wasser, wäßrigem Natriumchlorid und Phosphatpuffer und achwach löslich in Benzol, Hexan und Chloroform;

d) Zuckergehalt; Der Zuckergehalt beträgt 30 bis 37 %, wobei 20 bis 23 % des Gesamtauckers als Hexosen, 6 bis 8 % als Hexosamini und 4 bis 6 % als Sialinsäuren vorliegen;

e) Isoelektrischer Punkt: 4,2 bis 7,3;

f) Absorbierbarkeit: Absorbierbar an Ulex-europeus-Agglutinin-konjugiertem Sephadex in 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,2);

g) Stabilität: Stabil in wäßriger Lösung von pH 2,0, pH 7,0 und pH 11,0 bei 4 ⁰G über 24 h oder langer und in einer wäßrigen Lösung von pH 7,0 bei 60 ⁰G über 3 h oder langer; und

h) Cytotoxizität: Es zerstört selektiv Tumorzellen ohne wesentliche Beschädigung normaler Zellen.

5. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß das Glykoprotein (GB_T_) die folgenden Eigenschaften aufweist:

a) Molekulargewicht: 7,000 bis 9,000;

b) Parbreaktionen: 3s ergibt eine Färbung bei der Lowry Reaktion als Nachweis auf Proteine, eine Färbung bei

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der Hinhydrin-Reaktion nach Hydrolyse mit Salzsäure als Nachweis auf Peptidbindungen und .Aminosäuren und eine Färbung bei der Phenolschwefelaäure-Reaktion, der Anthronachwefelsäure-Reaktion, der Indolachwefelsäure-Reaktion und der Tryptcphanschwefelsäure-Reaktion als Nachweis auf Zucker;

f"v c) Aussehen und Löslichkeit: Weißes Pulver, löslich in

Wasser, wäßrigem natriumchlorid und Phosphatρuffer und schwach löslich in Benzol, Hexan und Chloroform;

d) Zuckergehalt: Der Zuckergehalt beträgt 8 bis 15 %, wobei 6 bis 10 % des Gesamtzuckers als Hexosen, 1 bis

6. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß

die Ursprungszellen aus der Gruppe der reticule—endothelialen Zellen, Lymphoblasten, Leukämie-Zellen und i'ibroblasten ausgewählt werden, wobei die üraprungszellen nicht-etablierte (non-estabalished) Zellen oder Zellen etablierter (established) Zellinien darstellen·

7. Verfahren nach Punkt 6, gekennzeichnet dadurch, daß die etablierten Zellinien aus der Gruppe bestehend aus BALL-1, TALL-1, NALL-1, lamalwa, M-7002, B-7101, Plow 7000, JBL, ^BV-Sa, ^BV-Wa, JiBV-HO, BALM2 und GGRF-SB, die sämtliche menschlichen Ursprungs sind, ausgewählt werden·

8. Verfahren nach Punkt 6, gekennzeichnet dadurch, daß die etablierten Zellinien aus der Gruppe, bestehend aus Maus-BALB/C 313, Maus-Leukämie-Zellen L1210, P388, Maus-Melanom-Klom M-3, Ratten-Tumor LLC-vVRC 56 und Harnster-Melanom RPMI 1846, die sämtliche nicht-menschlichen Ursprungs sind und von einem warmblütigen 'Her stammen, ausgewählt werden«

9. Verfahren nach Punkt 6, gekennzeichnet dadurch, daß die

nicht-etablierten Zellen aus der Gruppe, bestehend aus

I
human-Macrophagen und human-Lymphocyten, ausgewählt werden.

10. Verfahren nach Punkt 6, gekennzeichnet dadurch, daß die nicht etablierten Zellen aus der Gruppe der Lymphocyten und Macrophagen, die nicht menschlichen Ursprungs sind und von einem warmblütigen 'Tier stammen, ausgewählt werden.

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11. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet durch direkte Transplantation von Zellen einer etablierten Zelllaie, die menschlichen Ursprungs ist oder von einem nichtmenschlichen warmblütigen Lebewesen stammt, in den Körper warmblütiger Tiere derselben oder einer unterschiedlichen Species und Extraktion des genannten Glykoproteins aus den durch die transplantierten Zellen gebildeten Tumoren entweder auf direktem Weg oder nachdem der Tumor kultiviert (cultured) und in vitro weiter gezüchtet (grown) worden ist·

12« Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet durch Placieren von Diffus ionskainmern, die mit Ursprungszellen einer etablierten Zellinie, die menschlichen Ursprungs ist, oder von einem nicht-menschlichen warmblütigen Lebewesen stammt, inokuliert worden sind, in warmblütigen Tieren, so daß diese einen Zustrom einer Körperflüssigkeit des genannten Tieres erhalten, Züchten der genannten Ursprungszellen und ^strahieren des genannten Glykoproteins aus den gezüchteten Ursprungszellen, entweder auf direktem Weg oder nachdem diese kultiviert und im weiteren in vitro gezüchtet worden sind·

13. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Ursprungszellen der -Einwirkung einer oder mehrerer Induktoren ausgesetzt werden.

14. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß

die Glykoproteine GB^-, GB-^₁, GB^-p und GB-~ aus den Zellen bzw, einem überstand durch an 3ich bekannte fteinigungsmethoden, wie Aussalzen, Dialyse, filtration, Zentrifugation, Konzentrierung und Lyophilisation isoliert werden.

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15· Verfahren nach Punkt 1 und 14» gekennzeichnet dadurch, daß die weitere Isolierung durch Adsorption und dilution mittels Ionenaustauschchromatografie, Gelfiltration, Elektrophorese oder Äffinitätschromatografie weiter isoliert werden.

16, Verfahren nach Punkt 15, gekennzeichnet dadurch, daß die Isolierung der genannten Glykoproteine mit Hilfe von Antikörper oder Ulex-europeus-Agglutinin-konjugiertem Sephadex erfolgt.

- Hierzu 4 Blatt Zeichnungen —