DE69825433T2

DE69825433T2 - Aktive substanz für inhibierung von tumoröse proliferation im geweben aus der ektoderm

Info

Publication number: DE69825433T2
Application number: DE69825433T
Authority: DE
Inventors: Gyula Magvasi
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1997-03-28
Filing date: 1998-03-24
Publication date: 2005-09-15
Anticipated expiration: 2018-03-25
Also published as: EP0975665B1; AU740247B2; CN1253566A; DK0975665T3; DE69825433D1; CA2284863A1; HUP9701165A2; CA2284863C; HU221407B1; JP2001518091A; HUP9701165A3; AU6848398A; EP0975665A1; IL132095A0; SI0975665T1; US6372263B1; IL132095A; WO1998043996A1; BR9808631A; ES2226119T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Wirkstoff und eine Zusammensetzung, welcher bzw. welche das Tumorwachstum bzw. die Tumorproliferation in ektoderm abgeleitetem Gewebe inhibiert, und Verfahren zur Herstellung derselben.
Eine der ernsthaftesten Erkrankungen im 20. Jahrhundert ist Krebs. Viele experimentelle Arbeiten haben das Ziel, die Ursachen der Bildung von tumorösen Gewebepoliferationen zu entdecken.
Die Bildung von Tumorzellen und die Eigenschaften dieser Zellen werden in den folgenden Veröffentlichungen diskutiert: Cancer Res. 47, S. 1473, 1987; European Journal of Cancer 15, S. 585, 1979; Science 197, S. 893, 1977; Int. Rev. Exp. Pathol. 16, S. 207, 1976.
Zahlreiche Wirkstoffe und Zusammensetzungen sind bekannt, welche die Tumorproliferation inhibieren. Der aktive Bestandteil der Zusammensetzung ist entweder natürlich oder synthetisch. So wird beispielsweise die tumorinhibierende Wirkung natürlicher Wirkstoffe, die aus Pflanzen isoliert werden, in den folgenden Artikeln diskutiert: Ukrain. J. Cell. Biochem., 1987, Suppl. 11A-53; J. Tumor Marker Oncol., 1988, 3, S. 463–465.
Im Verlaufe unserer Forschungsarbeit haben wir vorgeschlagen, dass die Ursache der Zellproliferation in ektodermal abgeleiteten, ausdifferenzierten Geweben darin bestehen könnte, dass auf Grund der Freisetzung oder Freigabe des zuvor supprimierten primordialen Reproduktionscodes die neue Zelle eine endlose Reproduktion beginnt. Die sich multiplizierenden neuen Zellen bilden ein Aggregat (Tumorgewebe), und mit Hilfe ihrer Metalloproteaseenzyme lysieren sie umgebendes Gewebe. Auf solch diffuse Weise wachsend, rücken sie in ihre Umgebung vor und treten nach Verursachung der Gefäßerosion in das lymphatische System und die Blutzirkulation ein. Die losgelösten Zellen können an weit vom Primärtumoren entfernten Stellen Neoplasmen induzieren. Diese Zellproliferationsschema ent spricht der Zellreproduktion gemäß dem endlosen Zellreproduktionscode im frühen Stadium der Phylogenese.
In Primodialzeiten war zur Bildung einer organischen Struktur anstelle eines Zellaggregats die Suppression des endlosen Zellreproduktionscodes erforderlich, wie auch der Einbau eines Codes in die Zelle, der die Bildung und Funktion der gegebenen Organisation sicherstellen würde.
Es ist bekannt, dass in Tieren (einschließlich des Menschen) die DNS das Codesystem für die Bildung und Funktion von Organisationen enthält.
Im Verlauf unserer Untersuchungen haben wir entdeckt, dass das grundlegende Ereignis, welches die maligne Transformation der Zelle, die zuvor differenziert funktionierte, auf dem Level der DNS abläuft.
Unser Ziel bestand darin, eine aktive Substanz bzw. einen Wirkstoff bereitzustellen, der diejenigen Codes enthält, die zum Inhibieren der endlosen und schnellen Zellreproduktion befähigt sind. Wir haben gefunden, dass die Substanz, die diesen genetischen Code, vermutlich verbunden mit RNS enthält, aus befruchtetem Ei isoliert werden kann.
Es ist aus der WO-A-96/39428, WO-A-91/07435 und der WO-A-89/09606 bekannt, dass es möglich ist, aus befruchteten Eiern von Rana pipiens Proteine zu erzeugen, die eine Antitumorwirkung aufweisen. Dieser Wirkstoff hat auf Grund des anderen Ausgangsmaterials eine andere Zusammensetzung, ein anderes Molekulargewicht (vorzugsweise 4.000–6.000 Dalton) und Wirkung als der beanspruchte Wirkstoff.
Für die Herstellung des Wirkstoffs gemäß der Erfindung wird ein befruchtetes Ei von Cyprinus carpio als Ausgangsmaterial benutzt.
Die Befruchtung erfolgt vorzugsweise bei 12–14°C. Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit eine aktive Substanz bzw. ein Wirkstoff, die bzw. der die Tumorproliferation inhibiert, welche in ektoderm abgeleiteten Geweben auftritt, die bzw. der von befruchteten Eiern des Frischwasserkarpfens abgeleitet ist, wie auch eine Zusammensetzung, enthaltend eine solche Substanz.
Das Verfahren zur Erzeugung des Wirkstoffes umfasst die folgenden Schritte: befruchtete Eier des Frischwasserkarpfens werden maximal 24 Stunden, bevorzugt 14–16 Stunden nach Befruchtung einer Zellwandzerstörung mittels Rühren unterworfen; anschließend wird die Mischung ultrazentrifugiert, der Überstand abgetrennt, das Sediment homogenisiert und mehrmals ultrazentrifugiert, im Verlauf welcher Ultrazentrifugationen der Überstand und das Sediment getrennt werden, anschließend werden alle Überstände vereinigt und zentrifugiert, der erhaltene Überstand wird abgetrennt und mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnt, vorzugsweise in einem Gewichtsverhältnis von 1 : 2, die Mischung wird mindestens zweimal durch Gelfilter filtriert und die filtrierte Flüssigkeit anschließend lyophilisiert.
Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung besteht auch in dem Verfahren zur Erzeugung der Zusammensetzung, die den Wirkstoff enthält. Gemäß diesem Verfahren wird der Wirkstoff mit Additiven gemischt oder wahlweise mit einem Verdünner, vorzugsweise einer physiologischen Kochsalzlösung oder Dextroselösung oder sterilem destillierten Wasser, verdünnt, vorzugsweise in einem Gewichtsverhältnis von 1 : 2. Das befruchtete Ei, das der Zellwandzerstörung unterworfen wird, kann in einem Tiefkühlschrank vorzugsweise bei –70°C bis zur Endbearbeitung gelagert werden. Vor der Verwendung lässt man das gefrorene Material in einem Wasserbad von 20–25°C für 2–3 Stunden tauen. Das der Zellwandzerstörung unterworfene, befruchtete Ei wird ultrazentrifugiert. Anschließend wird der RNS enthaltende Überstand vom Sediment abgetrennt, das hauptsächlich aus hochmolekulargewichtigen Proteinen und Kohlenhydraten besteht.
Das Sediment wird nochmals ultrazentrifugiert, um den Überstand sorgfältiger von der Fraktion abzutrennen, die aus hochmolekulargewichtigen Proteinen und Kohlenhydraten besteht. Die vereinigten Überstände, enthaltend den Wirkstoff, werden wiederholt zentrifugiert, um eine ordnungsgemäße Trennung zu bewirken; anschließend wird der auf diesem Wege erhaltene Überstand mehrfach der Gelfiltration unterworfen, um Proteine und Bakterien zu entfernen.
Der hergestellte Wirkstoff kann lyophilisiert oder mit physiologischen Lösungen gemischt werden, um eine Zusammensetzung zu bilden. In der Zusammensetzung kann das Verhältnis von Wirkstoff und physiologischer Lösung frei gewählt werden, bevorzugt stellen wir jedoch Lösungen her, in denen das Verhältnis von Wirkstoff und Additiven 1 : 2 in Gewicht beträgt.
Der lyophilisierte Wirkstoff kann für unbegrenzte Zeit gelagert werden; die mittels Verdünnung mit physiologischer Kochsalzlösung oder Dextroselösung hergestellte Zusammensetzung kann bei –15°C für 4 Jahre gelagert werden.
Wir nehmen an, dass wir mit dem Überstand aus dem befruchteten Ei die RNS von den Kohlenhydraten und Proteinen mit hohem Molekulargewicht abtrennen.
Als tumorinhibierendes Mittel ist die Zusammensetzung intravenös in Form einer Behandlung zu verabreichen. Einem menschlichen Patienten von 70 kg Körpergewicht werden 1,5 ml Wirkstoff nach Verdünnung auf 10 ml Volumen, vorzugsweise mit physiologischer Kochsalzlösung verabreicht.
Die Behandlung erfolgt gemäß dem so genannten Besredka-Verfahren. Vor Beginn der Behandlung werden 0,1 ml Lösung, enthaltend den Wirkstoff, mit physiologischer Kochsalzlösung auf 10 ml verdünnt und dem Patienten verabreicht. Falls dieser empfänglich ist und sich ein so genannter anaphylaktischer Schock entwickelt, wird der Wirkstoffgehalt graduell auf ein Volumen von 1,5 ml gesteigert. In unseren Experimenten haben wir solche Empfindlichkeiten nicht beobachtet.
Eine Behandlung dauert 14 Tage, und jeden Tag werden 1,5 ml Wirkstoff, verdünnt auf 10 ml mit physiologischer Kochsalzlösung (gezählt für 70 kg Körpergewicht), intravenös verabreicht. Danach wird für weitere 14 Tage dieselbe Zusammensetzung jeden zweiten Tag verabreicht.
Nach einem halben Jahr erfolgt eine Kontrolle, und wird dann, wenn die tumorinhibierende Wirkung nicht befriedigend ist, eine weitere 14-tägige Behandlung mit täglicher intravenöser Verabreichung angewandt.
Der Wirkstoff und die Zusammensetzung gemäß der Erfindung wie auch das Verfahren für deren Herstellung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht.
Beispiel 1
Weibliche und männliche Frischwasserkarpfen, Cyprinus carpio, werden getrennt.
Von den weiblichen Karpfen wird Rogen und von den männlichen Karpfen Milch abzogen. Der Rogen und die Milch werden in einer Flasche gemischt, um eine künstliche Befruchtung durchzuführen.
Das befruchtete Ei lässt man für 14 Stunden bei 14°C stehen. Anschließend wird es mit einer Natriumcitrat-Pufferlösung homogenisiert und die Mischung für 10 Minuten zur Zerstörung der Zellwand gerührt. Das erhaltene Material wird tiefgefroren und bis zur Aufarbeitung bei –70°C gehalten. Vor der Verwendung wird das Material in einem Wasserbad bei 27°C für zwei Stunden getaut und für 4 Stunden bei 30.000 UpM ultrazentrifugiert.
Der Überstand wird abgetrennt, und das RNS enthaltende Endprodukt findet sich in dieser Fraktion. Das Sediment wird nochmals für 2 Stunden bei 35.000 UpM ultrazentrifugiert.
Der Überstand wird abgetrennt, und alle Überstandsfraktionen werden vereinigt, bei 10.000 UpM 1 Stunde lang zentrifugiert, anschließend wird der Überstand abgetrennt und ein Gewichtsteil des Überstandes mit 2 Gewichtsteilen an physiologischer Kochsalzlösung gemischt.
Das Produkt wird in mehreren Stufen durch Gelfilter verschiedener Porengröße filtriert. Der. Porendurchmesser der Gelfilter beträgt 8 μ, 0,8 μ, 0,45 μ bzw. 0,22 μ. Anschließend wird die obige Serie an Filtrationen wiederholt, das filtrierte Material mit sterilem Wasser auf das Dreifache seines ursprünglichen Volumens verdünnt und der Bakterienlevel bestimmt.
Eine Probe des hergestellten Produktes wird auf Blutagar als Kulturmedium ausgestrichen und für 24 Stunden inkubiert. Nach 24 Stunden waren keine Bakterienkulturen vorhanden; daher haben wir das Produkt als bakterienfrei bezeichnet.
Die Zusammensetzung wurde einem Endotoxintest unterworfen. Der bestimmte Endotoxinwert betrug 3 U/ml. Der Endotoxinlevel der Zusammensetzung ist geeignet.
Die Zusammensetzung wird in Ampullen gefüllt. Die formulierte Zusammensetzung kann bei –18°C zwei Jahre lang gelagert werden.
Beispiel 2
Der unverdünnte Wirkstoff aus Beispiel 1 wird der HPLC-Untersuchung unterworfen. Das Ergebnis zeigt, dass die Peaks, welche den Wirkstoff charakterisieren, sich zwischen 4.000 und 10.000 Dalton befinden. Der Wirkstoff kann über diese Peaks identifiziert werden.
Beispiel 3
Das Verfahren gemäß Beispiel 1 wird wiederholt, jedoch unter Verwendung von Aristichtys nobilis als Ausgangssubjekt. Anschließend folgt man dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren mit der Ausnahme, dass nach den Gelfiltrationen das erhaltene Material lyophilisiert wird. Die lyophilisierte Substanz wird in Ampullen gelagert.
Beispiel 4
Pharmakologischer Test
Die Wirkung des aktiven Materials gemäß Beispiel 1 wurde in vitro unter Verwendung von menschlichem MCF-7-Lungenkarzinomgewebe getestet. Das MCF-7-Karzinomgewebe wurde vom Institut of Oncology, Budapest, erhalten.
Die Zellzahl des Karzinomgewebes beträgt 7 × 10^–4 Zellen/ml. Die Kultivierung erfolgt auf Greiner-Platten in RPMI-Kulturmedium, supplementiert mit 2 Gew.-% Rinderserum. In Experiment 1 wurden 300 ml Wirkstoff gemäß Beispiel 1 zu 200 ml Medium zugesetzt; in Beispiel 2 wurden 150 ml Wirkstoff zu 850 ml Medium zugesetzt und in Beispiel 3 wurden 30 ml Wirkstoff zu 970 ml Medium zugesetzt. Im Kontrollexperiment wurde destilliertes Wasser anstelle von Wirkstoff zum Kulturmedium zugesetzt. Die Experimente wurden in drei parallelen Wiederholungen durchgeführt.
Beobachtungen erfolgten nach 24, 48 und 72 Stunden. Die Zellzahlen wie auch der Prozentsatz lebensfähiger Zellen werden mit Hilfe des Methylen-Blau-Färbeverfahrens bestimmt.
Die Ergebnisse des Tests sind in der folgenden Tabelle gezeigt.
Aus den Ergebnissen ist ersichtlich, dass die Zusammensetzung gemäß der Erfindung die Proliferation von MCF-7-Tumorgewebe bereits in der niedrigsten untersuchten Konzentration stark inhibiert. Gemäß der Untersuchung wird der Maximalwert der inhibierenden Aktivität nach 72 Stunden erreicht. Die Kultur wird einer morphologischen Untersuchung unterworfen, das heißt eine Kontroll- und eine behandelte Kultur werden untersucht. In dem Kontroll-Experiment wird dem Kulturmedium destilliertes Wasser anstelle des Wirkstoffes zugesetzt. Sowohl die Kontroll- als auch die behandelte Kultur zeigen mitotische und apoptische Aktivität. Gemäß unserer Erfahrung in den Experimenten 1–3 übersteigt in der Zeitspanne von 48–72 Stunden nach der Behandlung mit Wirkstoff das Maß der Apoptose dasjenige der Mitose.

Claims

Wirkstoff, enthaltend RNA einer Molmasse zwischen 4000 und 10 000 Dalton, welcher das Tumorwachstum in ektodermalen Geweben inhibiert, erhältlich durch folgende Schritte: (a) befruchtete Eier von Cyprinus carpio werden zwecks Erhalten einer Substanz innerhalb von 24 Stunden nach der Befruchtung einer Zellwandzerstörung unterworfen; (b) das gemäß Schritt (a) hergestellte Material wird zur Herstellung eines Proteine und Kohlehydrate enthaltenden Niederschlages und eines RNA enthaltenden Überstandes ultrazentrifugiert, und der RNA enthaltende Überstand wird abgetrennt; (c) der Niederschlag wird homogenisiert und der homogenisierte Niederschlag zur Gewinnung zusätzlicher Überstände einer zusätzlichen Zentrifugierung unterworfen; (d) die gemäß den Schritten (b) und (c) erhaltenen Überstände werden vereinigt und die vereinigten Überstände zur Gewinnung eines endgültigen RNA-haltigen Überstandes zentrifugiert; (e) der endgültige RNA-haltige Überstand wird abgetrennt und zur Erzeugung des RNA-haltigen, das Tumorwachstum hemmenden Wirkstoffes mit phisiologischer Lösung verdünnt; (f) der RNA-haltige; das Tumorwachstum hemmende Wirkstoff wird von Verunreinigungen abgetrennt; (g) der gemäß Schritt (f) von Verunreinigungen abgetrennte RNA-haltige Wirkstoff wird zwecks Gewinnung eines filtrierten RNA-haltigen Wirkstoffes wenigstens zweimal einer Gelfiltration unterzogen; und (h) der filtrierte RNA-haltige Wirkstoff wird lyophilisiert.
Wirkstoff nach Anspruch 1, wobei gemäß Schritt (a) die Zellwandzerstörung 14–16 Stunden nach der Befruchtung erfolgt.
Wirkstoff nach Anspruch 1, wobei gemäß Schritt (e) das Gewichtsverhältnis des erhaltenen Überstandes und der zum Verdünnen des endgültigen Überstandes verwendeten physiologischen Lösung 1 : 2 beträgt.
Präparat zur Hemmung von Tumorwachstum in ektodermalen Geweben, enthaltend eine therapeutisch wirksame Menge des Wirkstoffes nach Anspruch 1 in Kombination mit pharmazeutisch annehmbaren Zusätzen.
Das Präparat gemäß Anspruch 4, worin der pharmazeutisch annehmbare Zusatz ein Verdünnungsmittel ist.
Verwendung des Wirkstoffes gemäß Anspruch 1 zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparates, welches das Tumorwachstum in ektodermalen Geweben hemmt.