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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Die
Erfindung betrifft die Verwendung von natürlichen, biologischen Vesikeln,
die auf ihrer äußeren Membranoberfläche Phosphatidylserin
präsentieren.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Im
Körper
sind zwei Mechanismen des Zelltods festzustellen, nämlich die
Nekrose und die Apoptose. Unter Apoptose versteht man den Prozess
des programmierten Zelltods, wie er 1992 von Kerr et al beschrieben
wurde [Kerr, J. F. R., Wyllie A. H., Currie, A. R. (1992)], „Apoptosis:
a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in
tissue kinetics", „British
Journal of Cancer 26; 239–257", wonach die Fließgleichgewichtsniveaus
der verschiedenen Organsysteme und Gewebe im Körper aufrechterhalten werden,
da die kontinuierliche Zellteilung durch den Zelltod ausgeglichen
wird. Zellen, bei welchen eine Apoptose stattfindet, zeigen häufig charakteristische
morphologische Veränderungen
wie die ausgeprägte
Verringerung des Zellvolumens, die Modifikation der Zytoskelette,
die zu einer ausgeprägten Bläschenbildung
auf der Membran („membrane
blebbing") führt, die
Chromatin-Kondensation und der Abbau der DNS zu oligonukleosomalen
Fragmenten. Als Folge dieser morphologischen Veränderungen kann eine apoptotische
Zelle zu einer Anzahl von kleinen Fragmenten zerbrechen, die als
apoptotische Körper
bekannt sind und im Wesentlichen aus membrangebundenen Körpern bestehen,
welche intakte Organelle, Chromatin etc. enthalten. Apoptotische Zellen
und apoptotische Körper
werden normalerweise durch Phagozytose, hauptsächlich durch Makrophagen und
dendritische Zellen, schnell aus dem Körper entfernt, bevor sie lysiert
werden können
und ihren möglicherweise
entzündungsfördernden
intrazellulären
Inhalt freigeben können.
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Makrophagen,
die apoptotische Zellen und/oder apoptotische Körper aufgenommen haben, scheinen
eine entzündungsfördernde
Zytokinproduktion zu zeigen (Fadok et al., 1998) und können somit nach
einer Injektion apoptotischer Zellen oder Körper oder nach einer Injekti on
von Zellen, die für
eine beschleunigte Apoptose anfällig
sind, nach deren Phagozytose eine Th-1-Antwort im Immunsystem eines Patienten
herabregulieren.
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Während der
Apoptose wird Phosphatidylserin extern auf der Zellmembran exponiert
[Fadok V. A., Voelker D. R., Campbell P. A., Cohen, J. J., Bratton,
D. L., Henson, P. M. (1992) „Exposure
of phosphatidylserine on the surface of apoptotic lymphocytes triggers
specific recognition and removal of macrophages", Journal of Immunology 148: 2207–2216],
und dieses exponierte Phosphatidylserin bindet an bestimmte Rezeptoren,
um die Aufnahme und Beseitigung apoptotischer Zellen bei Säugetieren
zu vermitteln [Fadok V. A., Bratton, D. L., Rose, D. M., Pearson,
A., Exekewitz R. A. B., Henson, P. M. (2000), „A receptor for phosphatidylserine-specific clearance
of apoptotic cells",
Nature 405: 85–90].
Die Oberflächenexpression
von Phosphatidylserin an Zellen ist eine anerkannte Methode zur
Identifizierung von apoptotischen Zellen.
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Die
internationale Patentanmeldung PCT/EP99/03136, Veröffentlichungsnummer WO99/58645,
Erfinder: Gregoire, M. und Barthaleyns, J., offenbart apoptotische
Körper,
die aus menschlichen Tumorzellen gewonnen werden, welche durch die
Tumorbiopsie eines Patienten geborgen werden, und bei denen eine
Apoptose induziert wurde, und die wirksame Antigene liefern, die
vom Immunsystem erkannt werden. Es wird berichtet, dass sie bei
der Anti-Krebs-Immuntherapie Möglichkeiten
bieten, die bestimmten zellulären
und humoralen Antworten gegen Tumore zu verbessern.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung werden natürliche,
biologische Vesikel mit Membranen, die auf ihrer äußeren Membranoberfläche Phosphatidylserin
präsentieren,
zur Herstellung eines Arzneimittels zur Linderung der Symptome von
(i) entzündlichen
Erkrankungen sowie (ii) T-Zell-vermittelten Störungen, Störungen durch endotheliale Dysfunktion
oder Störungen
durch fehlangepasste Zytokin-Expression, bei denen entzündungsfördernde
oder antientzündliche
Zytokine beteiligt sind, verwendet. Derartige Vesikel werden nach
der Verabreichung bei einem zu den Säugetieren gehörigen Patienten
den Apoptoseprozess mit konsequenter Herabregulierung von entzündungsfördernden
Zytokinen und/oder Heraufregulie rung von antientzündlichen Zytokinen
nachahmen. Immunzellen können
die Einheiten in einem in vivo-Prozess verschlingen, der der Apoptose ähnelt, mit
konsequenter Herabregulierung von entzündungsfördernden Zytokinen und/oder
Heraufregulierung von antientzündlichen
Zytokinen. Folglich können
diese natürlichen,
biologischen Vesikel für
therapeutische Zwecke verwendet werden, zur Behandlung oder Prophylaxe
einer großen
Bandbreite von bei Säugetieren
auftretenden Störungen, bei
denen entzündungsfördernde
oder antientzündliche
Zytokine beteiligt sind.
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KURZE BEZUGNAHME
AUF DIE ZEICHNUNG
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Die
beiliegende Zeichnungsfigur ist eine graphische Darstellung der
Ergebnisse des nachfolgenden, speziellen, experimentellen Beispiels,
nämlich ein
Diagramm über
die Nettoohrschwellung bei einem Mausmodell aufgrund einer Entzündung (Kontakthypersensitivität), bei
Tieren, die gemäß der Erfindung
behandelt wurden, und bei Kontrolltieren.
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BESCHREIBUNG
DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
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Die
natürlichen
Vesikel mit Membranen, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet
werden, sind Vesikel, die Phosphatidylserin (PS) auf ihren äußeren Membranoberflächen präsentieren.
Nach geeigneter Einführung
in den Säugetierkörper, beispielsweise
durch intramuskuläre
Injektion, scheint es, als ob Antigen-präsentierende Zellen wie Makrophagen
und dentritische Zellen die injizierten Vesikel ausfinding machen,
und die PS-Gruppen auf deren Membranen wirken mit den PS-Rezeptoren
auf den Antigen-präsentierenden
Zellen zusammen, was zu einem apoptoseähnlichen Vorgang des Verschlingens
der Vesikel mit konsequenter Herabregulierung von entzündlichen
Zytokinen und/oder Heraufregulierung von antientzündlichen
Zytokinen führt.
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Zu
bestimmten, bevorzugten, natürlichen,
biologischen Vesikeln, die PS auf einer externen Membranoberfläche präsentieren
und bei der vorliegenden Erfindung von besonderem Interesse sind,
gehören
Folgende:
Exosome, d.h. Mikrovesikel, die aus Kulturzellen
entwickelt werden und auch in vivo produziert werden können, beispielsweise
während
der Reifung von Retikulozyten (siehe Trams et al., Biochimica et
Physica Acta, (1981) 645: 63–70;
und auch Johnstone, Biochem. Cell. Biol., (1982) 70: 179–190);
Prostasomen,
d.h. vesikuläre
extrazelluläre
Organelle, die in Samenplasma gefunden werden (siehe Rooney et al.,
J. Exp. Med., (Mai 1993) 177: 1409–1420);
spontan oder induziert
abgesonderte Membranvesikel, d.h. Membranvesikel, die von Zellen
als Folge einer Induzierung unter Verwendung von Detergentien wie
Lysophosphatidylcholin oder spontan abgesondert werden (siehe Ferber
et al., Biochimica at Biophysica Acta, (1980) 595: 244–256; und
auch Emerson et al., The Journal of Immunology, (August 1981) 127(2):
482–486);
ein
Prokoagulans, das an Plasmamembranvesikel gebunden ist, d.h. eine
thromboplastinähnliche
Aktivität,
die mit Membranvesikeln verbunden ist, bespielsweise in einer BAL-Flüssigkeit
[bronchoalveoläre
Lavage] gefunden und aus alveolären
Makrophagen gewonnen (siehe Lyberg et al., Eur. Respir. J., (1990)
3: 61–67);
Erythrozyten
mit Verlust der Phospholipidasymmetrie, d.h. Erythrozyten mit zufällig ausgewählter, symmetrischer
Transbilayer-Verteilung von Phospholipiden; diese können beispielsweise
produziert werden, indem intrazelluläre Ca++-Niveaus
angehoben werden (siehe Pradham et al. Molecular Membrane Biology
(1994) 11: 181–188);
aktivierte
Blutplättchen,
Blutplättchen
mit prokoagulanter Aktivität,
die mit einer Re-Orientierung
von PS vom inneren zum äußeren Blatt
der Blutplättchen-Membrandoppelschicht
verbunden sind (siehe Bevers et al., Biochimica et Biophysica Acta
(1983) 736: 57–66);
und
aus Blutplättchen
gewonnene Mikropartikel, d.h. Membranvesikel oder Mikropartikel,
die nach der Blutplättchenaktivierung
von Blutplättchen-Membranen
abgesondert werden (siehe Gilbert et al., The Journal of Biological
Chemistry, (16. September 1991) 266(26): 17261–17268).
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Die
am meisten bevorzugten Vesikel dieser Art zur Verwendung bei der
vorliegenden Erfindung sind Erythrozytenghosts mit nach außen gestülpter Innenseite,
die PS auf der Außenfläche ausdrücken können, und
Sichelzellerythrozyten, die als Teil der Pathologie PS auf der Oberfläche ausdrücken (siehe Schroit
et al., Biol. Cell (1984) 51: 227–238).
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Natürliche,
biologische Vesikel, die PS auf einer externen Membranoberfläche präsentieren
und die Eigenschaft haben, apoptotische Zellen und/oder apoptotische
Körper
dadurch nachzuahmen, dass sie von Leukozyten des Immunsystems des
Patienten phagozytiert werden, mit nützlichen Begleiterscheinungen
wie die Hemmung der Freigabe von entzündungsfördernden Zytokinen und/oder
die Förderung
der Freigabe von antientzündlichen
Zytokinen, werden geschaffen und Patienten verabreicht. Diese natürlichen
Vesikel sind dreidimensionale Körper,
die Formen und Abmessungen haben, welche von solchen, die Säugetierzellen ähneln, bis
zu Formen und Abmessungen reichen, die sich an apoptotische Körper annähern, welche
durch die Apoptose von Säugetierzellen
produziert werden, und sie haben PS-Gruppen auf den externen Membranoberflächen.
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Wie
vorstehend bemerkt, weiß man,
dass exponiertes PS auf der externen Membran einer Zelle eine Schlüsselrolle
bei der Beseitigung apoptotischer Lymphozyten durch Makrophagen
spielt. Auf Makrophagen ist ein Rezeptor für PS vorhanden. Ein „Phosphatidylserin-Rezeptor" oder „PS-Rezeptor" ist ein Rezeptor
oder eine Antigen-präsentierende
Zelle (APC), wie z.B. ein Makrophage, dessen Aktivität durch
lösliches
Phosphatidylserin blockiert ist, entweder monomer oder oligomer.
Es wird in Betracht gezogen, dass der PS-Rezeptor auch auf anderen APCs, wie
dendritischen Zellen und B-Zellen, vorhanden ist.
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Bei
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
sind die natürlichen,
biologischen Vesikel, die PS auf einer externen Membranoberfläche präsentieren,
Erythrozytenghosts. Erythrozyten (rote Blutkörperchen) in ihrem natürlichen
Zustand weisen PS auf den Innenflächen der Zellmembran auf. Wenn Hämoglobin
und andere Zellbestandteile aus ihnen entfernt werden, sind sie
als „Erythrozytenghosts" bekannt und weisen
effektiv einen leeren Vesikel aus einer Erythrozytenmembran auf.
Diese Ghosts können
durch physikalische/chemische Mittel von innen nach außen gedreht
werden, beispielsweise indem sie durch auf diesem Gebiet bekannte
Prozesse oxidativem Stress, Schallenergie und Ähnlichem unterzogen werden,
um PS auf der Außenfläche der
Membran zu präsentieren,
während
die vesikuläre
Form und die Einheit der Membran beibehalten werden. Prozesse zur
Vorbereitung von von innen nach außen gedrehten Erythrozytenghosts
werden beschrieben von Steck, T. L., 1974 „Preparation of impermeable
inside-out and right-side out vesicles from erythrocyte membranes", in: Method in Membrane
Biology, Korn, E. D., ed., Plenum Press, New York 2, 245–281.
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Es
gibt im Allgemeinen zwei Arten von Erythrozytenghosts, nämlich weiße Ghosts,
bei welchen das Hämoglobin
ohne merkliches Reißen
der Membran aus dem roten Blutkörperchen
entfernt wird, und wieder verschlossene Ghosts, bei welchen die
Membran geöffnet
wird, der Inhalt der Zelle extrahiert wird, und dann die Membran
wieder zusammengesetzt und verschlossen wird. Bei dem Verfahren
der vorliegenden Erfindung kann eine der beiden Arten oder eine
Mischung aus beiden verwendet werden. Die Herstellung weißer Ghosts
wird beschrieben von Schow, G. und Passow, H., Molecular and Cellular
Biochemistry Bd. 2, Nr. 2, 15. Dezember 1973, Seiten 197–217. Die
Herstellung von wieder verschlossenen Ghosts wird beschrieben von
Bodemann, H. und Passow, H., J. Membrane. Biol., 8.1 – 26 (1972)
und von Rohling, O. und Neidhart, B., Anal. Chem. 1999, 71, 1077–1082. Die
Erythrozytenghosts für
die vorliegende Erfindung sollten vom Patienten selbst oder von
einem kompatiblen Spender stammen. Es können auch kompatible rote Blutkörperchen
von Kulturzelllinien verwendet werden.
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Auch
die Verwendung von aktivierten Blutplättchen stellt eine bevorzugte
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung dar. Es ist bekannt, dass Phospholipide
wie PS in der Plasmamembran von menschlichen Blutplättchen nicht
homogen zwischen den beiden Hälften
der Membran-Doppelschicht verteilt sind. Bei nicht aktivierten Blutplättchen ist
PS fast ausschließlich
in dem inneren Blatt der Doppelschicht vorhanden. Die Aktivierung
der Blutplättchen, beispielsweise
durch die gleichzeitige Wirkung von Thrombin und Collagen, bewirkt,
dass PS auf der Membranaußenfläche exponiert
wird. Derartig aktivierte Blutplättchen
sind für
die Prozesse der vorliegenden Erfindung nützlich.
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Die
natürlichen,
biologischen Vesikel, die PS auf einer externen Membranoberfläche präsentieren, können dem
Patienten durch jedes geeignete Mittel verabreicht werden, das sie
mit aktiven Komponenten des Immunsystems des Patienten in wirksamen Kontakt
bringt. Die Vesikel werden vorzugsweise in eine flüssige Suspension
in einer biokompatiblen Flüssigkeit,
wie z.B. eine physiologische Saline, eingesetzt, und dem Patienten
intraarteriell, intravenös oder,
was am meisten zu bevorzugen ist, intramuskulär oder subkutan verabreicht.
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Die
zu verabreichende Dosierung natürlicher,
biologischer Vesikel, die PS auf einer externen Membranoberfläche präsentieren,
variiert abhängig von
der Art der bei einem Säugetier
auftretenden Störung,
die behandelt werden soll, und abhängig von der Individualität und den
charakteristischen Eigenschaften des Patienten. Es ist wichtig,
dass die wirksame Menge von Vesikeln für den Patienten nicht schädlich ist.
Die erforderlichen Dosen und Behandlungsvorschriften liegen im Fachwissen
des entsprechenden behandelnden Klinikers. Bei der intraarteriellen,
intravenösen,
subkutanen oder intramuskulären
Verabreichung einer flüssigen
Suspension von Vesikeln wird bevorzugt, für jede Dosis ab etwa 0,1–50 ml Flüssigkeit,
die eine Menge von natürlichen,
PS-tragenden Membranvesikeln nach der Erfindung enthält, welche
im Allgemeinen 1%–1000% der
Anzahl der Zellen entspricht, die normalerweise in einem äquivalenten
Volumen von Vollblut zu finden sind, oder der Anzahl der apoptotischen
Körper,
die aus ihnen erzeugt werden können,
zu verabreichen. Im Allgemeinen liegt die Anzahl derartiger Körper pro Injektion
im Bereich von etwa 500 bis etwa 20.000.000. Die Anzahl kann jedoch
auch irgendwo zwischen 500 und etwa 2 ×109,
vorzugsweise zwischen 10.000 und etwa 2 × 109,
liegen.
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Obwohl
nicht beabsichtigt ist, dass der Umfang der vorliegenden Erfindung
durch irgendwelche bestimmte Theorien über ihre Arbeitsweise beschränkt wird,
werden die folgenden Ausführungen versuchsweise
als Erläuterung
angeboten, um die Wege und Mittel besser verständlich zu machen, durch die
die Erfindung in die Praxis umgesetzt werden kann. Es wird als gegeben
vorausgesetzt, dass Antigen-präsentierende
Zellen des Immunsystems des Patienten, besonders professionelle
Antigen-präsentierende
Zellen (APCs), zu welchen Makrophagen und dendritische Zellen gehören, die
natürlichen,
biologischen Vesikel, die PS auf einer externen Membranoberfläche präsentieren,
in ähnlicher Weise
aufnehmen, wie sie apoptotische Zellen und apoptotische Körper aufnehmen
würden.
Nachdem sie die Vesikel aufgenommen haben, induzieren die APCs eine
antientzündliche
Antwort, die eine Änderung
der Th-Zellpopulation fördert,
mit einem Anstieg des Anteils von Th2-Zellen und/oder anderen regulierenden/antientzündlichen
Zellpopulationen (beispielsweise Tr1-Zellen), sowie eine Abnahme
der Th1-Zellen. Th2-Zellen und andere regulierende Zellen sekretieren
antientzündliche
Zytokine, wie z.B. Interleukin-10, was zu einer verringerten Entzündung führt.
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Die
vorliegende Erfindung ist zur Verwendung bei der Prophylaxe und
bei der Behandlung einer großen
Vielzahl von bei Säugetieren
auftretenden Störungen
angezeigt, bei welchen die T-Zellenfunktion, Entzündungen,
endotheliale Dysfunktion und fehlangepasste Cytokin-Expression beteiligt sind.
Ein Patient, der eine derartige Störung hat oder im Verdacht steht,
diese zu haben, oder besonders anfällig ist, sich eine derartige
Störung
zuzuziehen, kann zur Behandlung ausgewählt werden. „Behandlung" bedeutet hierbei
eine Verringerung der Symptome, beispielsweise – aber nicht beschränkt auf – eine Verringerung
der Stärke
oder der Anzahl der Symptome der bestimmten Störung, oder eine Einschränkung des
weiteren Fortschreitens der Symptome der Störung.
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Was
T-Zellenfunktionsstörungen
(T-Zell-vermittelte Störungen)
betrifft, so sind diese Autoimmunstörungen, zu welchen Diabetes,
Sklerodermie, Psoriasis und rheumatoide Arthritis zählen. Die
Erfindung ist zur Verwendung bei entzündlichen allergischen Reaktionen,
Reaktionsstörungen
im Zuge der Organ- und Zelltransplantation und bei mikrobiellen
Infektionen, die entzündliche
Reaktionen verursachen, angezeigt. Sie ist auch zur Verwendung als
Vorbehandlung gegen die Aufnahme von Giften angezeigt, oder wenn
man toxischen Chemikalien ausgesetzt ist, gegen Strahlungsschäden, und
wenn man über
Luft oder Wasser transportierten Reizstoffen ausgesetzt ist, etc,
wodurch eine schädliche
Entzündung
ausgelöst
wird. Darüber
hinaus ist sie für
entzündliche,
allergische und T-Zell-vermittelte Störungen der inneren Organe wie
Nieren, Leber, Herz, etc. angezeigt.
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Was
Störungen
betrifft, bei welchen eine fehlangepasste Zytokin-Expression beteiligt
ist, für die
die vorliegende Erfindung angezeigt ist, so zählen hierzu neurodegenerative
Erkrankungen. Neurodegenerative Erkrankungen, zu welchen das Down-Syndrom,
die Alzheimer- Krankheit
und das Parkinson-Syndrom zählen,
sind mit erhöhten
Werten bestimmter Zytokine verbunden, zu welchen Interleukin-1β (IL-1β) zählt [siehe
Griffin WST, Stanley, L. C., Ling, C., White, L., Macleod, V. Perrot
L. HJ., White, C. L., Araoz, C. (1989)]. Interleukin 1 im Gehirn
und die S-100-Immunreaktivität
sind beim Down-Syndrom und bei der Alzheimer-Krankheit erhöht (Proceedings
of the National Academy of Sciences USA 86: 7611–7615; Mogi M., Harada, M.,
Narabayashi, H., Inagaki, H., Minami, M., Nagatsu T. (1996)). Die
Werte für
Interleukin (IL)-1 beta, IL-1, IL-4, IL-6 und den transformierenden
Wachstumsfaktor alpha sind bei juvenilem Parkinsonismus und beim
Parkinson-Syndrom in der ventrikulären cerebrospinalen Flüssigkeit
erhöht
(Neuroscience Letters 211: 13–16).
Es wurde auch gezeigt, dass Il-1β die Langzeit-Potenzierung
im Hippocampus hemmt [Murray, C. A., Lynch, M. A. (1998). Evidence
that increase hippocampal expression of the cytokine interleukin-1β is a common
trigger for age and tress-induced impairments in long-term potentiation.
Journal of Neuroscience 18: 2974–2981]. Die Langzeit-Potenzierung
im Hippocampus ist eine Form der synaptischen Plastizität und gilt
im Allgemeinen als angemessenes Modell für Gedächtnis und Lernen [Bliss, T.
V. P., Collinridge, G. L., (1993). A synaptic model of memory: long-term
potentiation in the hippocampus, Nature 361: 31–39]. Daher geht man derzeit
davon aus, dass die fehlangepasste Zytokin-Expression im Gehirn
an der Entwicklung und dem Fortschreiten von neurodegenerativen
Erkrankungen beteiligt ist.
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Folglich
ist die Erfindung für
die Behandlung und Prophylaxe einer großen Bandbreite von bei Säugetieren
auftretenden neurodegenerativen und anderen neurologischen Störungen angezeigt,
zu welchen das Down-Syndrom, die Alzheimer-Krankheit, das Parkinson-Syndrom, senile Demenz,
Depressionen, Multiple Sklerose, die Huntingtonsche Krankheit, periphere
Neuropathien, Rückenmarkserkrankungen,
neuropathische Gelenkerkrankungen, die chronisch-entzündliche
Entmarkungskrankheit, Neuropathien einschließlich Mononeuropathie, Polyneuropathie,
symmetrische distale sensible Neuropathie, Störungen der neuromuskulären Verbindung, Myasthenien
und amyotrophische Lateralsklerose zählen.
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Was
Störungen
betrifft, an welchen eine endotheliale Dysfunktion beteiligt ist,
so ist die vorliegende Erfindung für die Behandlung und Prophylaxe einer
großen
Bandbreite von derartigen, bei Säugetieren
auftretenden Störungen
angezeigt, zu welchen kardiovaskuläre Erkrankungen, wie z.B. Atherosklerose,
periphere vaskuläre
Erkrankungen, kongestive Herzinsuffizienz, Schlaganfall, Myokardinfarkt,
Angina, Hochdruck, etc., vasospastische Störungen, wie z.B. das Raynaud-Syndrom,
das kardiale Syndrom X, Migräne,
etc., und der Schaden, der sich durch Ischämie ergibt (ischämischer
Schaden oder Ischämie-Reperfusionsschaden)
zählen,
obwohl keine Einschränkung
hierauf besteht. Zusammenfassend kann es im Wesentlichen jede Störung sein,
die sich aus einem unangemessen funktionierenden Endothelium ergibt.
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Die
Erfindung wird in dem folgenden speziellen Beispiel zum Zweck der
Veranschaulichung weiter beschrieben.
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BEISPIEL
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Dieses
Beispiel zeigt die Wirkung der Injektion von nach außen gedrehten
Erythrozytenghosts auf eine Ohrschwellung beim Kontakthypersensitivitäts-Mausmodell
(CHS). Dies ist ein bekanntes und allgemein akzeptiertes präklinisches
Modell einer Entzündung
nach Herabregulierung der Th-1-Zellen oder Wechsel auf den Th-2-Phänotyp.
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Die
Ghosts wurden aus mit Natriumcitrat versetztem Blut hergestellt,
das syngenen Mäusen
entnommen wurde. Das Blut wurde mit einem gleichen Volumen eiskalter,
isotonischer, phosphatgepufferter Saline (PBS) verdünnt (300
mOsm). Nach fünfminütigem Zentrifugieren
mit 2000 U/min bei Raumtemperatur wurden das Plasma und das Leukozyten-
und Thrombozytenzentrifugat (Buffy Coat) entfernt und noch drei
Mal mit kalter isotonischer PBS gewaschen. In dem Phosphatpuffer
wurde eine 50%ige Zellsuspension (v/v) bereitet. Eine Hämolyse wurde durchgeführt, indem
ein 1:15 Phosphatpuffer zugefügt
wurde (20 mOsm). Diese Lösung
wurde 10 Minuten lang auf Eis gelegt. Die Ghosts wurden wieder verschlossen,
indem die Zellen 40 Minuten lang bei 37°C inkubiert wurden. Dann wurden
die Zellen 5 Minuten lang mit 2000 U/min bei Raumtemperatur zentrifugiert
und wieder in isotonischer PBS suspendiert.
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Weibliche
BALB/c-Mäuse
im Alter von 6–8 Wochen
mit einem Gewicht von 22–25
g wurden von den Jackson Laboratories erhalten. Erythrozytenghosts
wie oben erwähnt
hergestellt.
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Einige
Mäuse wurden
der Gruppe A – Kontrollgruppe – zugeordnet
und erhielten keine Injektionen. Andere Mäuse wurden der Gruppe B zugeordnet
und erhielten Injektionen mit Suspensionen von Erythrozytenghosts.
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Die
Experimente wurden 7 Tage lang dürchgeführt. Am
Tag 1 erfolgte eine Sensibilisierung. Zum Zweck der Sensibilisierung
erhielten Mäuse
der Gruppe B ihre Injektionen mit Erythrozytenghosts für den Tag
1 und wurden unter Verwendung einer 0,2 ml-Intraperitonealinjektion
(IP-Injektion) von 5 mg/ml Pentobarbital-Natrium anästhesiert.
Die Bauchhaut der Maus wurde mit 70% ETOH besprüht. Eine Klinge wurde verwendet,
um am Bauch einen Bereich mit einem Durchmesser von etwa 1 Inch
zu enthaaren. Der nackte Bereich wurde unter Verwendung einer Pipettenspitze
mit 25 μl
von 0,5% 2,4-Dinitrofluorbenzol (DNFB) in 4:1 Aceton:Olivenöl bestrichen.
Die Kontrollmäuse
der Gruppe A wurden am gleichen Tag in ähnlicher Weise sensibilisiert.
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An
jedem der Tage 1, 2, 3, 4, 5, 6 und 7 wurden den Versuchsmäusen die
in physiologischer Saline suspendierten Erythrozytenghosts, wobei
ein 50 μl-Volumen
etwa 600.000 Körper
enthält,
durch intramuskuläre
Injektion (IM-Injektion) injiziert. Am Tag 6, nach der Injektion
für diesen
Tag, wurden die Mäuse folgendermaßen einem
Immunitätstest
(Challenge) mit DNFB unterzogen: 10 μl von 0,2% DNFB wurden mit einer
Pipettenspitze auf die dorsale Fläche des rechten Ohrs aufgebracht,
und 10 μl
des Vehikels wurden mit einer Pipettenspitze auf das linke Ohr aufgebracht.
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Am
Tag 7, 24 Stunden nach dem Immunitätstest, wurde die Dicke der
Ohren unter Verwendung eines federbeaufschlagten Peacock-Mikrometers
gemessen, wobei die Tiere mit Halothan lokal anästhesiert wurden. Eine Zunahme
der Ohrschwellung wurde als Maß für die CHS-Antwort
verwendet. Die Daten sind ausgedrückt als Differenz zwischen
der Dicke des behandelten rechten Ohrs und der Dicke des mit dem
Vehikel behandelten linken Ohrs in Mikrometer. Die Ergebnisse sind
in der anliegenden Figur dargestellt, einem Balkendiagramm, das
die Nettoohrschwellung zeigt (Mittel der Tiere in jeder Gruppe). Der
Balken A zeigt die Ergebnisse der Kontrollgruppe, der Balken B die
der Tiere, die mit den Ghost-Zusammensetzungen
behandelt wurden. Die Signifikanz des Unterschieds zwischen den
beiden Versuchsgruppen wurde durch den zweiseitigen Student t-Test
bestimmt. Ein Wert von p < 0,05
wurde als signifikant betrachtet. Die Versuchsgruppe B zeigt eine statistisch
signifikante Verbesserung (18%) gegenüber der Kontrollgruppe, die
keine Injektionen erhielt.