DE69531546T2

DE69531546T2 - Synthetische gangliosid-derivate

Info

Publication number: DE69531546T2
Application number: DE69531546T
Authority: DE
Inventors: Stephan Ladisch; Akira Hasegawa
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1994-09-14
Filing date: 1995-09-14
Publication date: 2004-06-17
Anticipated expiration: 2015-09-15
Also published as: US5567684A; JP5165283B2; CA2199809C; EP0783311A4; JPH10508829A; JP4727767B2; EP0783311A1; DE69531546D1; JP2007262085A; CA2199809A1; ATE247475T1; AU3632395A; EP0783311B1; WO1996008257A1

Description

1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf synthetische Gangliosidderivate, die nicht in der Natur gefunden werden und die als immununterdrückende Mittel einsetzbar sind. Genauer bezieht sich die vorliegende Erfindung auf Glykosphingolipide, künstliche Ankerganglioside und vereinfachte Kohlenhydratanteilganglioside, die als pharmazeutische Mittel zum Verhindern einer Immunreaktion einsetzbar sind.
2. Beschreibung des Stands der Technik
Obwohl die Immunreaktion oft als nützlich angesehen wird, kann die Immunreaktion auf ein Antigen unter bestimmten Umständen tatsächlich gefährlich für das Tier sei, in dem die Immunreaktion auftritt. Ein Beispiel, bei dem die Immunreaktion einen Zustand erzeugt, in dem der Wirt einer ernsten pathologischen Folgeerscheinung unterliegt, tritt bei solchen Autoimmunerkrankungen auf, wie Lupus erythematosus, rheumatischer Arthritis, Diabetes und Morbus Crohn. Bei Autoimmunerkrankungen ist die Immunreaktion gegen Wirtsgewebe gerichtet und deshalb ist die Verwendung von immununterdrückenden Mitteln ein Behandlungsansatz.
Ein anderes Gebiet, das zu den wichtigsten gehört, die häufig eine erhebliche Immununterdrückung erfordern, ist die Gewebetransplantation, wo die Unterdrückung der Immunreaktion entscheidend ist, um die Transplantatabstoßung durch den Wirt (post versus draft reaction = HVG) und die Transplantatabstoßung des Wirts (draft versus hostal rejection = GVH) zu verhindern. Typischerweise ist das implantierte Gewebe allogen, wobei die Verhinderung von alloreaktiven T-Lymphozyten durch immununterdrückende Mittel für die Verhinderung der Allotransplantatabstoßung wesentlich ist. Abhängig von der Art des Allotransplantats (d. h. Leber, Niere oder Knochenmark) kann der Verlauf der immununterdrückenden Therapie relativ kurz sein (Monate) oder er kann unbegrenzt fortgeführt werden müssen (Jahre bis zur gesamten Lebensdauer). Alle bislang verwendete immununterdrückenden Mittel haben signifikante Nachteile, die sich entweder auf ihre direkte Toxizität auf andere Organsysteme oder auf das Nichterreichen des Bereitstellens einer "ausgeglichenen" Immununterdrückung beziehen. Das letztgenannte Problem hat zwei unterschiedliche Aspekte: Auf der einen Seite kann eine unzureichende Unterdrückung der Immunreaktion zur Abstoßung führen, während auf der anderen Seite eine übermäßige Immununterdrückung die Entwicklung von opportunistischen Infektionen und Tumorbildung ermöglichen kann. So besteht die Notwendigkeit fort, ein effektives nicht toxisches immununterdrückendes Mittel zu entwickeln, das keine der obigen ernsten Komplikationen verursacht.
Derzeit wird nach einer Organtransplantation eine Mehrdrogentherapie, die zytotoxische Mittel einschließt, angewendet. Diese umfasst typischerweise eine Kombinationstherapie, wie beispielsweise eine Behandlung mit Zyklosporin A, Azathioprin und Prednison, wobei die Ratio ist, dass jede Droge auf einer andere Stufe bei der Immunreaktion wirkt und dass die Kombinationstherapie geringere Dosen jeder einzelnen Droge erfordert, wodurch ihre dosierungsabhängigen Nebenwirkungen verringert werden. Die Nebeneffekte bleiben jedoch signifikant, während die Effizienz dieser Form von Therapie noch nicht zufriedenstellend ist. Die Abstoßung verursacht weiterhin nahezu 50% von Implantatverlusten bei der Nierentransplantation. Außerdem kann das Unterscheiden der Abstoßung von Zyklosporin-A-Nephrotoxixität schwierig sein.
Ein anderer Hauptgrund für Implantatverluste ist systemische Infektion, üblicherweise durch opportunistische Infektionen, die das Zurückführen oder Beenden der Immununterdrückung erfordern, was zu einem Transplantatverslust führt. Zudem gibt es bei solcher Kombinationstherapie bei der Transplantation einen signifikanten Anstieg bei den Vorfällen von Lymphknotenschwellungen (Wilkinson, et al., "Transplantation", 47: 293–296, 1989). Das chronische Versagen von immununterdrückender Therapie wird durch das Faktum aufgezeigt, das die Transplantatüberlebensrate bei Empfängern von Leichennieren transplantaten , die eine Dreifachtherapie erhalten, von 85% nach einem Jahr auf 67 nach fünf Jahren abfällt (Kahan, et al., "Am J. Kidney Dis", 5: 288–295, 1985). Es ist dann klar, dass die existierende Immununterdrückungstherapie unzureichend ist. Dies hat die Suche nach und die Entwicklung von neuen immununterdrückenden Drogen und insbesondere von Mitteln, die nicht sowohl bezüglich des Immunsystem als auch bezüglich anderer Organsysteme direkt toxisch sind, angeregt. Ein Ansatz, um die Probleme zu überwinden, die mit derzeitigen immununterdrückenden Drogen verbunden sind, ist die Verwendung von biologischen Mitteln, welche von dem Tier tatsächlich produziert werden. Ein Beispiel solcher biologischer Mittel sind die Ganglioside.
Ganglioside sind eine Klasse von Glykosphingolipiden. Wie schematisch in 1 gezeigt ist, haben Ganglioside eine Struktur, die einen Kohlenhydratanteil umfasst, welcher an ein Keramid gebunden ist. Der Kohlenhydratanteil umfasst einen Zuckeranteil, der mindestens ein Monosaccharid und ein. oder mehr Sialsäureanteile, d. h. Sialsäuregruppen (N-Acetyl- oder N-Glykolylneuraminsäure), aufweist. 2 stellt die Nomenklatur heraus, die verwendet wird, um den Keramidanteil zu beschreiben. Der Keramidanteil umfasst einen langkettigen Basenbereich (long chain base = LCB) und einen Fettsäurebereich (fatty acid = FA). Die Nummer links von dem Doppelpunkt gibt die Kohlenstoffkettenlänge der Fettsäure bzw. der langkettigen Base an, und die Nummer rechts gibt das Maß der Untersättigung an. Die langkettigen Hauptbasenstrukturen (links von dem Bindestrich) von normalen Gangliosiden aus dem menschlichen Gehirn sind d18:1 und d20:1, und diejenigen von extraneuralen Gangliosiden sind d18:1. Die Hauptfettsäurestrukturen (rechts von dem Bindestrich) sind 18 : 0 und 20 : 0.
Ganglioside werden auch gemäß der Anzahl von Monosacchariden in dem Kohlenhydratanteil und der Anzahl von Sialsäuregruppen klassifiziert, die in den Sialsäureanteil(en) enthalten sind. Eine weitere Klassifikation ist abhängig davon, wo und wie viele Sialsäuren an den Kohlenhydratanteil gebunden sind. Zum Beispiel bezeichnet das internationale Symbol G_M1a eines der üblicheren Ganglioside, das umfangreich untersucht worden ist. Der Index "M" zeigt bei dem Symbol an, dass das Gangliosid ein Monosialgangliosid ist, und "1" zeigt an, dass vier Saccharideinheiten in dem Kohlenhydratanteil vorliegen. Die Indizes "a", "b" bzw. "c" weisen auf Isomere des speziellen beschriebenen Gangliosids hin, die sich in der Position der Sialsäure(n) unterscheiden. Die Indizes "D", "T" und "Q", die als internationale Gangliosidsymbole verwendet werden, stehen für Ganglioside, Trisialganglioside bzw. Tetrasialganglioside. Die Indizes "2", "3" und "4" stehen für Trisaccharid-, Disaccharid- bzw. Monosaccharidganglioside. Das Endsaccharid ist das Saccharid, das am dem Ende des Kohlenhydratanteils angeordnet ist, welches demjenigen Ende gegenüberliegt, das an dem Keramidanteil befestigt ist.
Zehn übliche humane Hirnganglioside und ihre biosynthetischen Wege sind in 3 dargestellt. Die Struktur jedes Gangliosids ist unter Verwendung konventioneller Abkürzungen für die Keramid-, Saccharid- und Sialsäure-(sialic acid = SA)-Gruppen dargestellt. 3 zeichnet auch den biosynthetischen Weg der Ganglioside auf. Die Biosynthese der Ganglioside wird detailliert in S. Roseman, Chem. Phys. Lipids, 5: 270 bis 297, 1970 diskutiert.
Es ist gut bekannt, dass Ganglioside im Nervensystem funktional wichtig sind, und es ist behauptet worden, dass Ganglioside bei der Therapie von Störungen des peripheralen Nervensystems einsetzbar sind. Zahlreiche Ganglioside und Derivate davon sind verwendet worden, um sehr verschiedene Nervensystemstörungen zu behandeln, einschließlich ischämischer Hirnschläge. Siehe beispielsweise die US-Patente Nr. 4 940 694, 4 937 232 und 4 716 223. Ganglioside sind auch verwendet worden, um die Aktivität von Phagozyten zu beeinflussen (US-Patent Nr. 4 831 021) und um Magendarmerkrankungen erzeugende Organismen zu behandeln (US-Patent Nr. 4 762 822).
Die Verwendung von Gangliosiden und Gangliosidanalogen zum Unterdrücken oder anderweitigen Beeinflussen des Immunsystems ist bislang nicht so ausgiebig untersucht worden, wie Ihre Verwendung bei neurologischen Störungen.
Der erste Bericht einer Gangliosidunterdrückung von Immunreaktionen in vivo wurde vor zwanzig Jahren von Agarwal und Neter veröffentlicht, die die Inhibition der primären Antikörperreaktion auf bakterielle Antigene durch Ganglioside bei Mäusen entdeckten (Agarwal, et al., J. Immunol., 107: 1448–1456, 1971). Kürzliche Studien haben gezeigt, dass Tumorganglioside, die in vivo ausgebracht werden, die Tumorbildung bei Mäusen fördern (Ladisch, et al., J. Clin. Invest., 79: 1879–1882, 1987), eine Entdeckung, die durch andere Labore bestätigt wurde (Allessandri, et al., Cancer Res. 47: 4243–4347, 1987; Saha, et al., Int. J. Cancer, 41: 432–435, 1988); indirekte Hinweise (Ladisch, et al., J. Clint. Invest., 79: 1879–1882, 1987, deuten darauf hin, dass diese Förderung auf einem immunologischen Mechanismus basiert. Kürzlich wurde jedoch eine Untersuchung des in vivo Immununterdrückungseffekts von G_M1-Gangliosid bzw. gemischten bovinen Hirngangliosiden (im Wesentlichen G_M1), G_D1a, G_D1b und G_T1b) von Presti, D. et al., (Presti, D. et al. J. Neuroimmunology, 22: 233–239, 1989) durchgeführt. Die Studie folgert, dass es keinen Beweis für einen unterdrückenden Effekt auf humorale oder celluläre Immunität gibt, der in vivo durch das G_M1-Gangliosid oder die gemischten Hirnganglioside entwickelt wird. Jedoch hat eine Untersuchung von n-Acetyl, Neuramidyl-Galactosylkeramid (G_M3), einem natürlichen Gangliosid, das aus Hirn, Milz und Erythrozyten isoliert wird, gezeigt, dass dieses als immununterdrückendes Mittel wirkt (EP-A- 0 517 916).
Wie oben angemerkt wurde, setzten sich Ganglioside aus drei Elementen zusammen. Die Rolle jedoch, die diese Elemente bei der immununterdrückenden Aktivität von Gangliosiden spielen, ist unbekannt. Tatsächlich ist in der Vergangenheit die Identifikation von bevorzugten aktiven Gangliosidstrukturen auch im Wesentlichen auf natürlich vorkommende Ganglioside beschränkt worden. Obwohl natürlich vorkommende Ganglioside im gewissen Umfang bei der Struktur ihrer Elemente variieren, erlauben die verfügbaren Varianten keine vollständige Erkundung der Rolle, die die verschiedenen Elemente bei der Immununterdrückung spielen.
Synthetische Ganglioside, die kürzere Fettazylketten als die natürlich erzeugten Ganglioside aufweisen, sind synthetisiert worden, wie z. B. N-Acetyl-Lyso-GM₃ (Klein et al, 1987, Eur. J. Biochem. 167, 417–424) und GM₃ mit N-Acetylsphingosin (Nores et al, 1989, Methods in Enzymology, 179: 242 – 253); die Fähigkeit dieser synthetischen Ganglioside, als immununterdrückende Mittel zu wirken, ist jedoch nicht erforscht worden.
Es gibt deshalb ein fortbestehendes Bedürfnis, chemisch synthetisierte Ganglioside zu entwickeln, bei denen die verschiedenen Elemente von natürlich auftretenden Gangliosiden durch synthetische oder künstliche Anteile ersetzt sind.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Als erster Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung eines Glykosphingolipids bei der Herstellung eines Medikaments zur Unterdrückung einer Immunreaktion bei einem Tier bereitgestellt, wobei das Glykosphingolipid die Formel
hat, wobei x
ist, wobei Y
ist, wobei m 1 bis 20 ist und wobei n 1 bis 14 ist, und eines pharmazeutisch akzeptablen Trägers für das Glykosphingolipid.
Dieser Aspekt der vorliegenden Erfindung basiert auf der Entdeckung, dass Glykosphingolipide mit kürzeren synthetischen Fettacylketten potentere immununterdrückende Mittel sind als die Varianten mit längeren Fettacylketten. Entsprechend sind die oben beschriebenen Glykosphingolipide mit kürzerer Fettacylkette nützlich beim Unterdrücken einer Immunreaktion bei einem Tier.
So kann die Immunreaktion bei einem Tier über die Verabreichung einer Menge eines Glykosphingolipids gemäß der obigen Formel, die zur Unterdrückung einer Immunreaktion wirksam ist, unterdrückt werden.
Die oben diskutierten und viele andere Merkmale und resultierenden Vorteile der vorliegenden Erfindung werden deutlich werden, wenn die Erfindung durch Bezugnahme auf die folgende detaillierte Beschreibung besser verstanden werden wird.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die Struktur eines Gangliosids.
2 zeigt die Struktur und die Nomenklatur des Keramidanteils eines Gangliosids.
3 zeigt die Kohlenhydratstruktur und den biosynthetischen Weg von 10 natürlich auftretenden Gangliosiden.
4 ist eine grafische Wiedergabe der Inhibition der humanen lymphoproliferativen Reaktion (³H-Thymidinaufnahme) bei G_M3 N = 1 (•) und Lyso-G_M3 (∎).
3 ist ein Balkendiagramm, das die Inhibition der humanen lymphoproliferativen Reaktion durch G_M3 bei n = 1, n = 13, n = 17 und n = 23 zeigt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Stoffzusammensetzung, die ein Glykosphingolipid mit der Formel
aufweist, wobei X
ist, wobei Y
ist, wobei m 10 bis 20 ist und wobei n 1 bis 14 ist, und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger für das Glykosphingolipid. Eine wie oben definierte Stoffzusammensetzung kann in einem Verfahren zum Unterdrücken einer Immunreaktion bei einem Tier verwendet werden, indem eine Menge eines Glykosphingolipids mit der obigen Formel an das Tier verabreicht wird, die ausreichend ist, um eine Immunreaktion zu unterdrücken.
Diese Aspekte der vorliegenden Erfindung basieren auf der Entdeckung gemäß der vorliegenden Erfindung, dass Glykosphingolipide mit kürzeren synthetischen Fettacylketten potentere Immununterdrücker als Glykosphingolipide mit identischer Kohlenhydratstruktur sind, die längere Fettacylketten enthalten. Zum Beispiel wurde bei einem Glykosphingolipid gemäß der obigen Formel, wobei n = 1 ist, der vorliegenden Erfindung gemäß herausgefunden, dass es eine größere immununterdrückende Aktivität als Glykosphingolipide hat, bei denen n 17 oder 23 ist. Von anderen Spezies von Glykosphingolipiden, wobei n 1 bis 14 ist und wobei m 10 bis 20 ist, wird auch erwartet, dass sie eine höhere immununterdrückende Aktivität als ihre längere Fettacylketten enthaltenden Mitspieler aufweisen. So können Keramidanteile mit kürzeren Fettacylketten, wie sie oben definiert sind, mit einem Kohlenhydrat-Anteil verbunden werden, wie er demjenigen jedes natürlich auftretenden Gangliosids entspricht.
Vorzugsweise ist bei einem Glykosphingolipid, das bei einer Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird, m = 13 und n von 1 bis 5. Am meisten bevorzugt ist m 13 und n ist 1. Dies ist auch bezüglich der Stoffzusammensetzungen und der Verfahren der Fall, die ein wie oben definiertes Glykosphingolipid einsetzen.
Bei einem bevorzugten beispielhaften Glykosphingolipid ist X vorzugsweise
und Y ist vorzugsweise N. Weiterhin ist m, wenn X und Y so wie in diesem Paragraph beschrieben sind, vorzugsweise 13, und n ist vorzugsweise von 1 bis 5. Am meisten bevorzugt sind X und Y so wie in diesem Paragraph beschrieben, m ist 13, und n ist 1. Ganglioside, die eine synthetische Fettacylstruktur gemäß der vorliegenden Erfindung enthalten, werden gemäß Verfahren synthetisiert, die dem Fachmann wohl bekannt sind. Siehe beispielsweise Murase et al. (1989) Carbohydr. Res. 188, 71–80; KDN-Analoge werden gemäß Terada, et al. (1993) J. Carbohydr. Chem. 12, 425–440 synthetisiert.
Wie in den Beispielen unten demonstriert ist, sind die oben definierten Glykosphingolipide potente immununterdrückende Mittel, und sie sind für die Behandlung von Tieren, einschließlich Menschen, einsetzbar, wenn es wünschenswert ist, eine Immunreaktion zu reduzieren. Es ist beispielsweise wünschenswert, eine Immunreaktion zu reduzieren, um die Abstoßung eines Gewebetransplantats zu verhindern.
Bei der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Begriff "unterdrückend" eine Reduzierung des nachteiligen Effekts der unerwünschten Immunreaktion bei dem Tier, das die Therapie erhält. Der Begriff "Menge, die zum Unterdrücken einer Immunreaktion wirksam ist" bedeutet, dass die Menge des verwendeten Mittels von ausreichender Quantität ist, um die Ursache der Krankheit oder des Symptoms aufgrund der unerwünschten Immunreaktion zu unterdrücken. Der Begriff "Tier" bezeichnet auch Menschen.
Die Dosierungsbereiche für die oben definierten Glykosphingolipide ("immununterdrückenden Mittel"), die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind jene, die groß genug sind, um den gewünschten Effekt zu erzeugen: die Immunreaktion zeigt irgendeinen Grad von Unterdrückung. Die Dosierung sollte nicht so groß sein, dass sie entgegengerichtete Nebenwirkungen zeigt. Grundsätzlich wird die Dosierung mit dem Alter, dem Zustand, dem Geschlecht und dem Ausmaß der Krankheit bei dem Tier variieren, und sie kann vom Fachmann festgelegt werden. Die Dosierung kann von dem einzelnen Mediziner im Fall von jeglichen Gegenanzeigen abgestimmt werden. Die Dosierung kann von weniger als 1 mg/kg/Dosis bis etwa 100 mg/kg/Dosis, vorzugsweise von etwa 5 mg/kg/Dosis bis 10 mg/kg/Dosis, bei einer oder mehreren täglich verabreichten Dosen variieren.
Die bei der vorliegenden Erfindung verwendeten immununterdrückenden Mittel können parenteral durch einzelne Injektionen oder durch graduelle Infusion über die Zeit verabreicht werden. Die immununterdrückenden Mittel können auch intravenös, intraperitoneal, intramuskulär, subkutan, intracaviträr oder transdermal verabreicht werden.
Pharmazeutisch akzeptable Träger umfassen sterile wässrige oder nichtwässrige Lösungen, Suspensionen und Emulsionen. Beispiele für nichtwässrige Lösungsmittel sind Propylenglykol, Polyethylenglykol, Pflanzenöl, so wie Olivenöl, und injizierbare organische Ester, so wie Ethyloleat. Wässrige Träger umfassen Wasser, Alkohol-/Wasserlösungen, -emulsionen und -suspensionen, einschließlich Salzlösungen und gepufferten Medien. Parenterale Vehikel umfassen Natriumchloridlösungen, Ringer-Dextrose, Dextrose und Natriumchlorid, laktathaltige Ringer-Lösung und feste Öle; intravenöse Vehikel umfassen Fluide und nahrhafte Füllstoffe, elektrolyte Füllstoffe (so wie solche basierend auf Ringer-Dextrose) und dergleichen. Konservierungsstoffe und andere Zusätze können auch vorliegen, so wie beispielsweise antimikrobielle Mittel, Antioxidative, Geliermittel und inerte Gase und dergleichen.
Zusätzliche pharmazeutische Verfahren können angewendet werden, um die Dauer der Wirkung zu steuern. Präparationen mit gesteuerter Freisetzung können durch die Verwendung von Polymeren erreicht werden, um die immununterdrückenden Mittel, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden, zu komplexieren und zu absorbieren. Der gesteuerte Austrag kann durch Auswahl geeigneter Makromoleküle (zum Beispiel Polyester, Polyamincarboxymethylcellulose und Protaminsulfat) und der Konzentration der Makromoleküle sowie der Verfahren des Einbaus ausgeübt werden, um die Freigabe zu steuern. Ein anderes mögliches Verfahren, um die Dauer der Wirkung durch Zubereitungen mit kontrollierter Freisetzung zu steuern, ist es, die immununterdrückenden Mittel, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden, in Teilchen aus einem polymeren Material, wie beispielsweise Polyester, Polyaminsäuren, Hydrogele, Polymilchsäure- oder Ethylenvinylacetatcopolymere einzubauen.
Um die immununterdrückenden Mittel davor zu schützen, an Plasmaproteine anzubinden, ist es bevorzugt, dass die Ganglioside in Mikrokapseln eingeschlossen sind, die zum Beispiel durch Coazervierungstechniken oder durch Grenzflächenpolymerisation hergestellt werden, beispielsweise Hydroxymethylcellulose- oder Gelatinemikrokapseln und Poly-(Methylmethacrylat)-Mikrokapseln, oder in colloidalen Drogenaustragssystemen, zum Beispiel Liposomen; Albuminmikrokügelchen, Mikroemulsionen, Nanopartikeln und Nanokapseln oder in Makroemulsionen. Solche Lehren sind offenbart in Remington's Pharmaceutical Sciences (16. Auflage, A. Oslo, Herausgeber, Mack, Easton, PA, 1980).
Die bei der vorliegenden Erfindung verwendeten immununterdrückenden Mittel sind gut geeignet zur Verwendung in zielgerichtet einsetzbaren Drogenaustragssystemen, wie beispielsweise synthetischen oder natürlichen Polymeren in der Form von makromolekularen Komplexen, Nanokapseln, Mikrokügelchen oder -perlen, und lipidbasierten Systemen, einschließlich Öl-Wasser-Emulsionen, Liposomen und wieder geschlossene Erythrozyten. Mizellen und gemischte Mizellen sind für das Austragen der bei der vorliegenden Erfindung verwendeten immununterdrückenden Mittel besonders bevorzugt. Diese Systeme sind kollektiv als colloidale Drogenaustragssysteme bekannt. Typischerweise beträgt der Durchmesser solcher colloidalen Partikel, die die dispergierten Ganglioside enthalten, etwa 50 nm bis 2 um. Die Größe der colloidalen Partikel erlaubt es ihnen, intravenös, wie beispielsweise durch Injektion, oder als Aerosol verabreicht zu werden. Materialien, die bei der Präparation von colloidalen Systemen verwendet werden, sind typischerweise durch Filtersterilisation sterilisierbar, nichttoxisch und bioabbaubar, zum Beispiel Albumin, Ethylcellulose, Casein, Gelatine, Lecithin, Phospholipide und Sojaöl. Polymere colloidale Systeme werden durch einen Prozess präpariert, der der Coazervierung von Mikroumkapselungen ähnlich ist.
Am meisten bevorzugt als zielgerichtetes Austragssystem für die bei der vorliegenden Erfindung verwendeten immununterdrückenden Mittel sind Liposome. Wenn Phospholipide behutsam in wässrigen Medien dispergiert werden, schwellen sie, hydratisieren sie und bilden sie spontan multilamellare konzentrische Doppelschichtvesikel mit Schichten aus wässrigen Medien, die die Lipiddoppelschicht trennen. Solche Systeme werden üblicherweise als multilamellare Liposome oder multilamellare Vesikel (MLV) bezeichnet und haben Durchmesser im Bereich von etwa 100 nm bis etwa 4 um. Wenn MLV mit Schall behandelt werden, werden kleine unilamellare Vesikel (small unilamellar vesicles = SUV) mit Durchmessern in dem Bereich von etwa 20 bis etwa 50 nm gebildet, die eine wässrige Lösung im Kern der SUV enthalten.
Die Zusammensetzung der Liposome ist üblicherweise eine Kombination von Phospholipiden, insbesondere Phospholipiden mit hoher Phasenübergangstemperatur, üblicherweise in Kombination mit Steroiden, insbesondere Cholesterol. Andere Phospholipide oder andere Lipide können ebenfalls verwendet werden.
Beispiele für Lipide, die bei der Liposomproduktion verwendbar sind, umfassen Phosphatidylverbindungen, so wie Phosphatidylglycerol, Phosphatidylcholin, Phosphatidylserin und Phosphatidylethanolamin. Besonders nützlich sind Diacylphosphatidylglycerole, bei denen der Lipidanteil von 14 bis 18 Kohlenstoffatome, insbesondere von 16 bis 18 Kohlenstoffatome enthält, und die gesättigt sind. Illustrative Phospholipide umfassen Eiphosphatidylcholin, Dipalmitoylphosphatidylcholin und Distearoylphosphatidylcholin.
Bei der Herstellung von Liposomen, die die bei der vorliegenden Erfindung verwendeten immununterdrückenden Mittel enthalten, sollten solche Variablen wie die Effizienz der Gangliosideinkapselung, die Labilität der Ganglioside, die Homogenität und die Größe der resultierenden Population von Liposomen, das Verhältnis des immununterdrückenden Mittels zum Lipid, die Permeabilitätinstabilität der Zubereitung und die pharmazeutische Akzeptierbarkeit der Formulierung berücksichtigt werden. Szoka, et al., Annual Review of Biophysics and Bioengineering, 9: 467, 1980; Deamer, et al., in Liposomes, Marcel Dekker, New York, 1983, 27: Hope, et al., Chem. Phys. Lipids, 40: 89, 1986).
Die Ausrichtung der Liposome ist klassifiziert worden basierend auf anatomischen und mechanistischen Faktoren. Die anatomische Klassifizierung basiert auf dem Niveau der Selektivität, beispielsweise organspezifisch, zellspezifisch und organellenspezifisch. Die mechanistische Ausrichtung kann weiter unterschieden werden basierend darauf, ob sie passiv oder aktiv ist. Passives Ausrichten verwendet die natürliche Tendenz von Liposomen, sich über Zellen des retikuloendothelialen Systems (RES) in Organen zu verteilen, die sinusoidale Kapillaren enthalten. Auf der anderen Seite umfasst aktives Ausrichten die Veränderung der Liposome durch Koppeln der Liposome an einen spezifischen Liganden, wie beispielsweise einen monoclonalen Antikörper, ein Zucker, ein Glykolipid oder Protein, oder durch Ändern der Zusammensetzung oder der Größe der Liposome selbst, um das Ausrichten auf andere Organe- und Zelltypen als die natürlich auftretenden Lokalisationsorte zu erreichen. Alternativ können Liposome physikalisch in Kapillarbetten, so wie der Lunge, lokalisiert werden, oder sie können durch ortsspezifische Injektion verabreicht werden.
Ein anderes zielgerichtetes Austragssystem, das mit den bei der vorliegenden Erfindung verwendeten immununterdrückenden Mittel verwendet werden kann, sind wieder abgedichtete Erythrozyten. Wenn Erythrozyten in einem hypotonischen Medium suspendiert werden, tritt ein Schwellen auf, und die Zellmembran reißt. Als Konsequenz werden Poren mit Durchmessern von ungefähr 200–500 A geformt, die einen Ausgleich zwischen der intrazellulären und der extrazellulären Umgebung erlauben. Wenn die ionische Stärke dieses umgebenden Mediums dann auf isotonische Bedingungen eingestellt wird und die Zellen bei 37°C inkubiert werden, werden sich die Poren schließen, so dass die Erythrozyten wieder abdichten. Diese Technik kann mit den bei der vorliegenden Erfindung verwendeten immununterdrückenden Mitteln angewendet werden, um das immununterdrückende Mittel innerhalb des wieder abgedichteten Erythrozyts einzufangen. Das wieder abgedichtete Erythrozyt, das das immununterdrückende Mittel enthält, kann dann zum zielgerichteten Austrag verwendet werden.
Das die bei der vorliegenden Erfindung verwendeten immununterdrückenden Mittel enthaltende zielgerichtete Austragssystem kann auf verschiedenen Wegen an einen Wirt verabreicht werden, insbesondere an einen Säugetierwirt, wie beispielsweise intravenös, intramuskulär, subcutan, intraperitoneal, intravasculär, topical, intracavitär, transdermal, intranasal und durch Inhalation. Die Konzentration der Ganglioside wird von der speziellen Anwendung, der Natur der Krankheit, der Wiederholungshäufigkeit der Verabreichung und dergleichen abhängen. Das eingekapselte Gangliosid des zielgerichteten Austragssystems kann in einer Formulierung bereitgestellt werden, die in geeigneter Weise andere Bestandteile und ein wässriges physikalisch akzeptiertes Medium aufweist, beispielsweise eine Salzlösung, eine mit Phosphat gepufferte Salzlösung oder dergleichen.
Die obige Offenbarung beschreibt die vorliegende Erfindung im Allgemeinen. Ein weitergehendes Verständnis kann unter Bezugnahme auf die folgenden spezifischen Beispiele erreicht werden, die zum Zwecke der Erläuterung gegeben werden und nicht als beschränkend vorgesehen sind:
BEISPIELE
GLYKOSPHINGOLIPIDE MIT REDUZIERTER FETTACYLKETTE
LÄNGE DIE VERBESSERTE IMMUNUNTERDRÜCKENDE AKTIVITÄT ENTWICKELT
In diesem Beispiel wurde die immununterdrückende Aktivität von Glykosphingolipiden mit reduzierter Fettacylkettenlänge mit derjenigen Ihrer Mitspieler verglichen, die eine längere Fettacylkette enthalten.
Glikosphingolipide gemaß der Struktur
wobei x
ist, wobei Y N ist, wobei m 13 ist, und wobei n entweder –1 (ein Lyso-Glykosphingolipid ohne Fettacylanteil), 1, 13, 17 oder 23 ist, wurden auf ihre immununterdrückende Aktivität getestet. Die Kohlenhydratbereiche der studierten Glykosphingolipide entsprachen denjenigen von G_M3, und so werden die untersuchten Glykosphingolipide auch als G_M3 n = eine Zahl von –1 bis 23 bezeichnet.
Materialien und Verfahren
Lymphozytenprofilerationstest: Ein Test der humanen zellulären Immunreaktion, Lymphoprofiliration stimuliert durch ein spezifisches Antigen, Tetanustoxoid (Ladisch et al., Brochim Briphys. Aota, 1125, 180–88 (1992), ist angewendet worden, um die immununterdrückenden Effekte des synthetischen Gangliosidderivats der vorliegenden Erfindung zu messen. Kurz gesagt wurden normale humane mononukleare Leukozyten aus dem peripheralen Blut durch Ficoll-Hypaque Dichtegradientzentrifugation (Boyum, Scand. J. Clin. Lab. Invest 21, 77–89 (1968) aus Vollblut in konservierungsmittelfreiem Heparin (50 U/ml) gesammelt. Die Zellen würden dreimal gewaschen und in komplettem HB104-Medium resuspendiert. Autologes humanes Plasma wurde auf eine Endkonzentration von 0,5% zugegeben. Normale humane mononukleare Leukozyten aus dem periferalen Blut wurden in 96-Loch (A/2) Gewebekulturclustern (Costar No. 3696) kultiviert.
Synthetische Gangliosidderivate wurden vor der Zugabe zu den Zellkulturen durch kurze Beschallung in Medium suspendiert. 10 μl synthetische Gangliosidderivatlösung wurde pro Loch zugegeben, gefolgt von der Zugabe der mononuklearen Leukycozyten aus dem peripheralen Blut (PBMC, 25 μl, 2 × 10⁶ Zellen/ml Komplettmedium). Nach 3 Stunden Vorinkubation bei 37°C wurden 10 μl der zuvor bestimmten optimalen Konzentration des Stimulans der Lymphoproliferation, Tetanustoxoid (3,5 Lf/ml, Mass. Dept. of Health, Boston, MA), zugesetzt. Den unstimulierten Kontrollkulturen wurden nur 10 μl Basalmedium zugesetzt. Die vollständigen Kulturen wurden bei 37°C in 95% Luft/5% CO₂ für 6 Tage inkubiert (Biochem. Biophys. Aota 1125, 180–88 (1992)). Wie zuvor unter diesen Bedingungen dokumentiert worden ist (Biochem. Biophys. Aota 1125, 180–88 (1992)) sind Ganglioside für die Zellen nicht toxisch. Am Ende der Kulturperiode, wurden 0,5 μCi [³H]-Thymidin in 5 μl Medium in jedes Loch gegeben. Die Kulturen wurden für zusätzliche 4,5 h inkubiert und auf Glasfaserfilterpapier geerntet. Die zelluläre [3H]-Thymidinaufnahme wurde durch β-Szintillationsszählung quantifiziert. Die mittlere Netto-[3H]-Thymidineaufnahme bei stimulierten Kulturen wurde durch Subtrahieren der mittleren Zählrate von unstimulierten Kulturen bestimmt. Die prozentuale Inhibition wurde durch Vergleichen der mittleren Netto[³H]-Thymidinaufnahme von Kulturen, die Ganglioside enthielt, mit der von Kulturen ohne synthetische Gangliosidderivate berechnet.
In vivo Test der immununterdrückenden Aktivität: Einer Fußsohleninjektion der untersuchten synthetischen Gangliosidderivate und des Stimulans der zellulären Immunreaktion (allogenische Zellen) folgt eine Ernte der Poplitealknoten und die Beurteilung der Knotengröße, der Zellanzahl, der spezifischen Proliferationsantwort und der Erzeugung von spezifischer Zytotoxizität.
Mäuse: C3H (H-2^K) und BALB/c (H-2^d)-Mäuse wurden im Alter von 6 Wochen erhalten und bei diesen Experimenten im. Alter von 7 bis 12 Wochen verwendet. Die Tiere sind mausvirusfreie Stämme, die von Charles River, Wilmington, Massachusetts, erworben wurden.
Präparation von Stimulatorzellen: Milzen wurden aseptisch entfernt und sofort in Mauskomplettmedium gegeben [RPMI 1640 w/o L-Glutamin (Whittaker Bioproducts, Walkersville, Md), dem 10% FCS, 1% MEM nicht-essentielle Aminosäuren (Cellgro), Natriumpyruvat, L-Glutamin, Penicillin 50 U/ml/Streptomycin 50 μg/ml und 10 mM Hepes-Puffer (Whittaker Bioproducts) zugesetzt waren], und wurden dann auf eine 60 × 10 mm Petrischale überführt. Eine sterile Einzelzellensuspension wird durch sanftes Pressen der Milz auf ein Zelldissozüerungssieb (Sigma) präpariert. Mononukleare Zellen werden durch Ficoll-Hypaque-Dichtegradientseparation isoliert, gefolgt von einer Lysis der Erythrozyten (ACK Lysierpuffer pH 7,4). Die Zellen werden gewaschen, und ihre Lebensfähigkeit wird durch Trypanblauexklusion bestimmt. Allogenische (BALB/c) Splenozyte werden in Salzlösung auf die geeignete Konzentration verdünnt und zusammen mit den zu testenden synthetischen Gangliosidderivaten in die Fußsohlen von C3H Mäusen injiziert.
Präparation von synthetischen Gangliosidderivaten: Synthetische Gangliosidderivate werden in HPLC-Chloroform:Methanol (1 : 1) aliquotiert und in Glasmikroviolen getrocknet. Die synthetischen Gangliosidderivate werden dann zur Injektion in 0,9% NaCl resuspendiert und für 2 Minuten in einem Branson-Wasserbadsonikator beschallt.
Injektionen: Milzzellen oder Tumorzellen und die untersuchten synthetischen Gangliosidderivate werden in einem Gesamtvolumen von 30 μl in die linke hintere Fußsohle injiziert. Zyklosporin A wird i.p. verabreicht.
Isolierung der Popliteallymphknoten: Die entzündeten Tiere werden am Tag 4 durch Genickbruch getötet, die Popliteallymphknoten, der die linken und rechten Fußsohlen drainieren, werden aseptisch entfernt, von überschüssigem Fett befreit, gewogen und in Gewebekulturmedium enthaltenden Röhrchen auf Eis gegeben. Die Knoten werden dann mit dem flachen Ende einer 3 ml Spritze gedrückt, um eine Einzelzellensuspension zu erhalten, die in Mauskomplettmedium gewaschen wird, das 0,1% 2-Mercaptolethanol (Gibco, NY) enthält. Die Zellen werden dann quantifiziert und ihre Lebensfähigkeit wird durch Trypanblauexklusion bestimmt. Die Zellkonzentration wird auf 2 × 10⁶ Zellen/ml eingestellt.
Zellkulturen: 2 × 10⁵ Lymphknotenzellen in 100 μl werden für 18 Stunden in Komplettmedium mit 0,5 uC ³H-Thymidineinbau quantifiziert durch β-Szintillationszählung als Maß der in vivo Lymphozytenaktivierung (50) kultiviert.
ERGEBNISSE
Rolle der Keramidstruktur beim Bestimmen der immununterdrückenden Aktivität von Glykosphingolipiden: Die Aktivität von zwei synthetischen Glykosphingolipiden, G_M3 n = 1 und GM3 n = –1 (Lyso-G_M3) wurden bei verschiedenen Konzentrationen bezüglich ihrer Inhibition der humanen lymphoproliferativen Reaktion (4) verglichen. Jeder Punkt in 4 gibt den Mittelwert ± SEM von dreifachen Kulturen wieder, die Kontrollstimulation war 1,5 ± 3,0 × 10³ min^–1. Die Wichtigkeit der Fettacylstruktur wurde deutlich durch das höhere Maß an immununterdrückender Aktivität des Glykosphingolipids mit n = 1 (ID₅₀ = 0,2 nm), verglichen mit derjenigen des Glykoshpingolipids mit n = –1 (Lyso-G_M3) (4).
Als nächstes wurden die relativen immununterdrückenden Aktivitäten einer Anzahl von Glykosphingolipiden verglichen: G_M3 (n = 1, n = 13, n = 17 und n = 23) (5). Jeder Balken entspricht dem Mittelwert ± SEM der [3H]-Thymidinaufnahme von Kulturen, die 5 μM der angegebenen G_M3-Spezies ausgesetzt waren. Die Kontrollstimulation war 11,5 ± 3,0 × 103 min^–1. Die getesteten Glykosphingolipide entwickelten einen immununterdrückenden Effekt, der mit der Abnahme der Länge des Fettacylanteils zunahm, wobei n = 1 die höchste immunsupressive Aktivität hatte.
G_M3 n = 1 wurde auch auf die immununterdrückende Aktivität in vivo getestet. Eine einzelne Dosis von G_M3 n = 1 wurde als nahezu genauso immununterdrückend herausgefunden wie systematisch verabreichtes Zyklosporin A, ein bekanntes Immununterdrückungsmittel (Tabelle 1). Die in vivo Immununterdrückungsaktivität von G_M3 n = 1 wurde auch mit derjenigen von gemischten humanen Hirngangleosiden verglichen; G_M3 n = 1 wurde als viel aktiver herausgefunden als die gemischten Hirnganglioside.
TABELLE 1

Claims

Verwendung eines Glykosphingolipids bei der Herstellung eines Medikaments zum Unterdrücken einer Immunreaktion bei einem Tier, wobei das Glykosphingolipid die Formel
hat, wobei X
wobei Y
wobei m eine Zahl von 10 bis 20 ist und wobei m eine Zahl von 1 bis 14 ist, und eines pharmazeutisch akzeptabeln Trägers für das Glykosphingolipid.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei X
und Y N ist.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei n eine Zahl von 1 bis 5 und m gleich 13 ist.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei n gleich 1 ist.