DE60029762T2

DE60029762T2 - Sphingomyelin enthaltende zusammensetzung zur verbesserung der tumortherapie

Info

Publication number: DE60029762T2
Application number: DE60029762T
Authority: DE
Inventors: David Nutley MODRAK
Original assignee: Center for Molecular Medicine and Immunology
Current assignee: Center for Molecular Medicine and Immunology
Priority date: 1999-03-25
Filing date: 2000-03-24
Publication date: 2007-10-18
Anticipated expiration: 2020-03-25
Also published as: CA2707691C; US6541462B1; WO2000057916A1; CA2368676A1; EP1165137A1; CA2368676C; JP2002540172A; DE60029762D1; AU3740000A; ES2269121T3; EP1666045A1; CA2707691A1; ATE334686T1; ATE512664T1; EP1165137B1; US7288534B2; US20030228257A1; EP1666045B1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Traditionell wurde angenommen, daß die Wirksamkeit vieler Krebstherapien auf die Zytotoxizität zurückzuführen ist, die von durch Chemotherapie oder Bestrahlung ausgelöster DNA-Schädigung herrührt. Von solch einer DNA-Schädigung wurde angenommen, daß sie eine apoptotische Reaktion auslöst. Siehe Eastman et al., Cancer Invest., 10:229-240 (1992); Allan, D.J., Int. J. Radiat. Biol., 62:145-152 (1992). Apoptose wird begrifflich gefaßt als ein induzierbarer, vorprogrammierter Weg von aufeinanderfolgenden biochemischen Ereignissen, die zu einer Aktivierung von calcium- und magnesiumabhängigen Endonukleasen führt, welche das Kernchromatin an selektiven, internukleosomalen Verknüpfungsstellen spalten. Signale, die an der Membran der betroffenen Zelle erzeugt werden, aktivieren benachbarte Zellen und eindringende Makrophagen, um die sterbende Zelle und ihren zerfallenden Kern zu phagozytieren.
Eine frühe Hypothese über die Natur der durch ionisierende Strahlung erzeugten letalen Schädigung identifizierte heterologe Doppelstrangbrüche in der DNA als die häufigste Art von Läsionen, die zu Säugerzelltod führen. Siehe Radford, I.R., Int. J. Radiat. Biol., 49:611-620 (1986); Ward, J. F., Prog. Nucleic Acid Mol. Biol., 35:95-125 (1988). Solche Läsionen werden in der DNA durch direkte Wechselwirkung mit Röntgenstrahlen oder mit reaktiven Sauerstoffzwischenprodukten, die in der Zelle durch die Strahlung erzeugt werden, hervorgerufen. Siehe Steel et al., Int. J. Radiat. Biol., 56:525-537 (1989). Obwohl Säugerzellen es beherrschen, die meisten DNA-Doppelstrangbrüche zu reparieren, sind nicht alle solche Läsionen reparierbar. Siehe Ward, J. F., Prog. Nucleic Acid Mol. Biol., 35:95-125 (1988). Ein Rest von nicht reparierten DNA-Läsionen kann zu post-mitotischem Zelltod führen. Siehe Bedford, J. S., Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys., 21:1457-1469 (1991). Daher wurde bis vor kurzem angenommen, daß die Ineffizienz von DNA-Reparatur eine Schlüsselrolle bei der Strahlungsempfindlichkeit spielt.
In gleicher Weise wurde von einigen Chemotherapien, z.B. dem Anthrazyklin Daunorubizin (DNR), angenommen, daß sie Zytotoxizität als eine Folge von durch Arzneimittel induzierter Schädigung von DNA auslösen. Es wurde vorgeschlagen, daß eine Schädigung an genetischem Material von freien Radikalen, die von der durch Chinon erzeugten Redox-Aktivität stammen, von durch Interkalation induzierter Störung der Doppelhelix oder von einer Stabilisierung der zwischen DNA und Topoisomerase II gebildeten, spaltbaren Komplexe herrühren könnte. Siehe Chabner et al., Cancer: Principles and Practice of Oncology, J. B. Lippencorr Co., Philadelphia, PA., S. 349-395 (1989). Jedoch blieb der Mechanismus, durch welchen solch eine Schädigung den apoptotischen Weg induzierte, unklar.
In den letzten Jahren wurde eine Alternative zu der Hypothese, daß eine direkte DNA-Schädigung von Krebstherapien eine induzierte Apoptose vermittelt, etabliert. Der Sphingomylein-Signaltransduktionsweg für die Induktion von Apoptose hat sich als ein führender Mechanismus in vielen Krebstherapien, einschließlich ionisierender Strahlung, Tumornekrosefaktor α (TNF-α) und Daunorubizin, herausgestellt. Siehe Haimovitz-Friedman et al., J. Exp. Med., 180:525-535 (1994); Kolesnick et al., Cell, 77:325-328 (1994); Jaffrezou et al., Embo J., 15:2417-2424 (1996); Bose et al., Cell, 82:405-414 (1995).
Sphingomyelin ist eine Klasse von Sphingolipiden, welche eine Hauptlipidklasse in der Zelle, insbesondere der Plasmamembran, darstellen. Siehe Merrill et al., Toxicol. Appl. Pharmcol., 142:208-225 (1997). Sphingomyelin ist in der Plasmamembran in zwei getrennte Pools kompartimentiert. Siehe Linardic et al., J. Biol. Chem., 269:23530-23537 (1994). Es wurde vorgeschlagen, daß der Sphingomyelin-Pool, der an dem inneren Blättchen der Plasmamembran lokalisiert ist, ausschließlich für intrazelluläre Signalgebung dediziert ist. Die Beobachtung, daß es hinsichtlich der Sphingomyelin-Molekülspezies zwischen den zwei Pools von Sphingomyelin in der Plasmamembran keinen Unterschied gibt, legt die Bedeutung der Kompartimentierung für die Signaltransduktion nahe. Siehe Fitzgerald et al., Lipids, 30:805-809 (1995).
Viele Krebstherapien initiieren den Sphingomyelinweg, indem sie die schnelle Hydrolyse von Sphingomyelin zu Ceramid auslösen. Ceramid spielt eine Schlüsselrolle in einer Vielzahl von zellulären Prozessen, einschließlich der Regulierung des programmierten Zelltods. Siehe Merrill et al., Toxicol. Appl. Pharmcol., 142:208-225 (1997). Die Spezifität von Ceramid als ein Second-Messenger für die Apoptose wurde durch die Tatsache gezeigt, daß zelldurchlässige Ceramidanaloge, aber nicht Analoge von anderen Lipid-Second-Messengern in der Lage waren, die Wirkungen von TNF-α, Fas und ionisierender Strahlung zu wiederholen und Apoptose direkt auszulösen. Die Auslösung von Apoptose durch Ceramid ist auch stereospezifisch, da Dihydroceramid Apoptose nicht auslöst. Es wurde vorgeschlagen, daß Ceramid Apoptose durch Aktivierung des durch Streß aktivierten Proteinkinase-Weges auslöst. Siehe Verheij et al., Nature, 380:75-79 (1996).
Obwohl viele Therapien bei der Initiierung des Sphingomyelin-Transduktionsweges erfolgreich sind, kann die induzierte apoptotische Reaktion begrenzt oder kurzlebig sein. Aus unbekannten Gründen haben Tumorzellen eine abnormale Lipidzusammensetzung, welche Sphingomyelin einschließt. Tumorgewebe haben typischerweise höhere Konzentrationen an Sphingomyelin als normale Gewebe; jedoch ist es möglich, daß einige Tumorzellen verminderte Sphingomyelin-Synthesefähigkeiten besitzen. Siehe Koizumi et al., Biochim. Biophys. Acta., 649:393-403 (1991); Van Blitterswijk et al., Biochim. Biophys. Acta., 778:521-529 (1984). Darüber hinaus kann ein veränderter Lipidstoffwechsel in Tumorzellen zu Veränderungen in der intrazellulären Verteilung von Sphingomyelin führen. Solch eine Umverteilung innerhalb der Plasmamembran kann zu fehlgeleitetem Sphingomyelin führen, bei dem es nicht möglich ist, daß die Sphingomyelin-hydrolisierenden Enzyme, die als Reaktion auf eine zytotoxische Behandlung für die Erzeugung von Ceramid verantwortlich sind, auf dieses einwirken. Siehe Bettaieb et al., Blood, 88:1465-1472 (1996). Folglich kann eine Sphingomyelinumorganisation innerhalb der Plasmamembran die Fähigkeit einer Tumorzelle, durch Ceramid ausgelöste Apoptose zu erzeugen, beeinträchtigen und zu einer verminderten Sensitivität auf verschiedene Therapien führen. Modrak, D. E. et al., Proceedings of the American asso ciation for cancer research Annual meeting (15.03.1999), offenbart die Sphingomyelinpotentierung von 5-Fluorouracil-Chemotherapie in Lungentumor-tragenden HAT-29-Nacktmäusen.
Es besteht daher nach wie vor ein Bedarf nach einem Verfahren zur Überwindung der Veränderung des Lipidstoffwechsels von Tumorzellen, um eine Tumortherapie, welche den Sphingomyelinweg zur Auslösung von Apoptose verwendet, zu maximieren.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Verbesserung von Tumortherapien, welche den Sphingomyelinweg zur Auslösung von Apoptose verwenden, bereitzustellen.
Erfindungsgemäß wird die Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge an Sphingomyelin gemäß Anspruch 1 bereitgestellt.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird natürlich vorkommendes Sphingomyelin (C16:0) zusammen mit einer Tumortherapie verabreicht. In einer weiteren Ausführungsform werden Sphingomyelinmoleküle mit kürzeren Seitenketten (C₂-C₁₅) verwendet.
In noch einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird Sphingomyelin einem Patienten oral verabreicht, während es in einer weiteren Ausführungsform parenteral verabreicht wird.
Weitere Aufgaben, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden anhand der folgenden, ausführlichen Beschreibung deutlich. Es sollte klar sein, daß Beispiele nur zu Erläuterungszwecken angegeben werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 zeigt graphisch, daß eine gemeinsame Verabreichung von 5-Fluorouracil und Sphingomyelin die Geschwindigkeit von GW39-Tumorwachstum in einem viel höheren Ausmaß und für eine längere Zeit reduziert als 5-Fluorouracil alleine.
2 zeigt graphisch, daß eine gemeinsame Verabreichung von Sphingomyelin eine 5-Fluorouracil-Behandlung von HT29-Tumoren verbessert. Die Testgruppen waren folgende: keine Behandlung (•), 0,45 mg 5FU/Tag für 5 Tage (
), 10 mg SM/Tag für 7 Tage (
) oder die Kombination von 5FU und SM, am gleichen Tag eingeleitet (♦).
3 zeigt, daß Sphingomyelin die 5FU-Chemosensitivität von Tumorzellinien in vitro verändert. Die IC₅₀-Werte sind mit Standardabweichungen graphisch dargestellt. Es werden die folgenden Symbole verwendet: m: Medium (kein Lipid); SM: Sphingomyelin; PC: Phosphatidylcholin. Es wurden drei bis sechs unabhängige Experimente zusammengestellt und mittels ANOVA verglichen: *, p < 0,1; **, p < 0,05; ***, p < 0,01; ****, p < 0,005.
4 zeigt, daß Sphingomyelin die DOX-Chemosensitivität von Tumorzellinien in vitro verändert. Die IC₅₀-Werte sind mit Standardabweichungen graphisch dargestellt. Es werden die folgenden Symbole verwendet: m: Medium (kein Lipid); SM: Sphingomyelin; PC: Phosphatidylcholin. Es wurden drei bis sechs unabhängige Experimente zusammengestellt und mittels ANOVA verglichen: *, p < 0,1 ; **, p < 0,05; ***, p < 0,01; ****, p < 0,005.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
Die vorliegende Erfindung verbessert die Tumortherapie. Es wird angenommen, daß die Erfindung die Fähigkeit einer Tumorzellinie, durch Ceramid ausgelöste Apoptose durchzuführen, verbessert, indem die Mengen an Sphingomyelin in allen zellulären Kompartimenten erhöht werden, wobei ausreichend Substrat für aktivierte Sphingomyelinase bereitgestellt wird. Tumorzellen haben typischerweise einen veränderten Lipidstoffwechsel, einschließlich einer abnormalen Sphingomyelin-Zusammensetzung und -Kompartimentierung. Die meisten Studien legen nahe, daß Tumorgewebe erhöhte Konzentrationen an Sphingomyelin haben. Obwohl die meisten Tumorzellen abnormal hohe Mengen an Sphingomyelin aufweisen können, kann dieses für sein hydrolisierendes Enzym, Sphingomyelinase, aufgrund von abnormaler, subzellulärer Kompartimentierung von Sphingomyelin nicht verfügbar sein. Die Veränderung des Sphingomyelin-Stoffwechsels kann die Fähigkeit einer Tumorzelle, Ceramid zu erzeugen, beeinträchtigen und zu verminderter Sensitivität auf bestimmte Therapien führen. Überraschenderweise und unerwartet zeigt die vorliegende Erfindung, daß eine Verabreichung von zusätzlichem Sphingomyelin die tumorizide Aktivität von Tumortherapie erhöht.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die tumorizide Aktivität einer Tumortherapie durch Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge an Sphingomyelin zusammen mit der Therapie an den Patienten erhöht. Obwohl die Erfindung nicht auf den vorgeschlagenen Mechanismus beschränkt ist, verbessert die Verabreichung von Sphingomyelin wahrscheinlich jede Therapie, die den Sphingomyelin-Signaltransduktionsweg für eine Auslösung von Apoptose verwendet. Dies umfaßt, ist aber nicht beschränkt auf Therapien, die ein schnelles, abnormales Wachstum kontrollieren oder hemmen wollen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine therapeutisch wirksame Menge an Sphingomyelin an einen Patienten verabreicht, der einer Tumortherapie mit Anthrazyklinen (z.B. Doxorubicin/Adriamycin, Daunorubicin, Idarubicin) unterzogen wird.
In einer weiteren Ausführungsform kann die Chemotherapie unter Verwendung eines Antikörpers oder eines Antikörperfragmentes auf die Tumorzellen gerichtet werden. Die Verwendung von Antikörpern, Antikörperfragmenten oder Rezeptorbindungspeptiden zum spezifischen Ansteuern von Tumorzellen erhöht die Auslieferung von tumoriziden Arzneimittelmengen der Chemotherapie, während eine signifikante Verminderung der Toxizität gegenüber normalen Geweben bewirkt wird.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird natürlich vorkommendes Sphingomyelin an einen Patienten verabreicht, um die tumorizide Aktivität einer Tumortherapie zu verstär ken. Natürlich vorkommendes Sphingomyelin enthält typischerweise lange Seitenkettenderivate (C₁₆-C₃₀ N-Acylgruppen). Solches Sphingomyelin kann von kommerziellen Quellen bezogen werden und wird normalerweise aus Eigelb erhalten und enthält in erster Linie Palmitoylketten. Siehe Sigma Chemicals (St. Louis, MO), Katalog Nr. S0756.
Die de novo Biosynthese von Sphingomyelin wird eingeleitet durch die Kondensation von Serin und Palmitoyl-CoA, was zur Bildung von 3-Ketosphinganin (3-Ketodihydrosphingosin) führt, welches anschließend zu Dihydrosphingosin reduziert wird. Siehe Hannun, Y. A., J. Biol. Chem., 269:3125-3218 (1994). Dihydroceramid wird durch die Amidverknüpfung von Fettsäure-Acyl-Gruppen an Dihydrosphingosin gebildet. Ceramid wird aus Dihydroceramid durch die Einführung der trans-4,5-Doppelbindung gebildet und dient als ein Vorläufer für alle anderen komplexen Sphingolipide. Sphingomyelin wird durch die Hinzufügung einer Phosphorylcholin-Kopfgruppe an Ceramid in erster Linie durch die Übertragung von Cholinphosphat aus Phosphatidylcholin durch die Wirkung von Phosphatidylcholin:Ceramid-Cholinphosphotransferase gebildet.
Sphingomyelin mit modifizierten Seitenketten kann einem Patienten zur Verstärkung der tumoriziden Aktivität einer Tumortherapie verabreicht werden. Zum Beispiel können Sphingomyelinanaloge mit kürzeren als den normalen Seitenketten, einschließlich C₂-C₁₅-Seitenketten, verwendet werden. Apoptosestudien haben gezeigt, daß Ceramidanaloge mit kurzen Seitenketten (C₂, C₈) wirksam Apoptose auslösen und schneller wirken können als Moleküle normaler Länge. Siehe Bose et al. Cell, 82:405-414 (1995) ; Haimovitz-Friedman et al., J. Exp. Med., 180:525-535 (1994). In ähnlicher Weise bieten Sphingomyelinanaloge mit kürzeren als den normalen Seitenketten eine weitere Verbesserung der tumoriziden Aktivität von Tumortherapiemitteln. Alternativ können auch die Seitenketten, die länger als normal sind, einschließlich C₂₄, wirksam sein.
Auf dem Gebiet sind zahlreiche Strategien zur Veränderung der Aktivität von biologischen Molekülen durch Veränderung ihrer Struktur gut bekannt. Im allgemeinen können Modifikationen an einer natürlich vorkommenden Verbindung ihre biologische Aktivität erhöhen oder ihre Aufnahme durch die geeignete Zellmaschinerie erleichtern. Neben dem Variieren der Länge von Seitenketten eines Moleküls kann auch die Aufnahme zusätzlicher Elemente oder funktionaler Gruppen die Leistung einer natürlich vorkommenden Verbindung verbessern. Beispiele für solche Substituenten umfassen, sind aber nicht beschränkt auf aliphatische Gruppen, z.B. C₁-C₆-Alkyl- oder -Cycloalkyl-Gruppen mit gerader oder verzweigter Kette, aromatische Gruppen, funktionale Gruppen, z.B. Cyano-, Nitro-, Azido-, Halogen- und Epoxygruppen und andere Elemente, zum Beispiel Schwefel, Selen, Bor und Metalle, sowie eine Einfügung von z.B. Sauerstoff- oder Stickstoffatomen in die Seitenketten. Sphingomyelinaktivität kann auch durch Hinzufügung von Doppel- oder Dreifachbindungen zu dem Molekül erhöht werden. Siehe Kishida et al., J. Lipid Mediat. Cell Signal, 16:127-137 (1997).
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird Sphingomyelin einem Patienten oral verabreicht. In einer weiteren Ausführungsform wird es parenteral verabreicht. Parenterale Verabreichung bezieht sich auf eine Vielzahl von Methoden der Verabreichung einer Verbindung an einen Patienten, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf intravenöse/intraarterielle, intrathekale und subkutane Verabreichung und Verabreichung über ein Transdermalpflaster.
Gentherapie kann dazu verwendet werden, die Sphingomyelinkonzentration in Zielzellen eines Patienten, der zytotoxischer Tumortherapie unterzogen wird, zu erhöhen. Gentherapie erfordert ein System zum Einbringen eines Vektors, der ein an der Synthese von Sphingomyelin beteiligtes Enzym enthält, in Zielzellen. Jedes Enzym, einschließlich solche mit Säuger-, Bakterien- oder Pilzursprung, welches die Konzentration von Sphingomyelin in einer Zelle erhöht, kann verwendet werden. Beispiele umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Serinpalmitoyltransferase, Ceramidsynthase und Sphingomyelinase.
Die Konstruktion eines geeigneten Vektors kann durch jede der auf dem Gebiet gut bekannten Methoden für das Einbringen von exogener DNA in einen Vektor erreicht werden. Siehe Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, NY. Darüber hinaus lehrt der Stand der Technik verschiedene Methoden zum Einbringen exogener Gene in Zellen in vivo. Siehe Rosenberg et al., Science 242:1575-1578 (1988); Wolff of al., PNAS 86:9011-9014 (1989). Die Verabreichungswege umfassen systemische Verabreichung und Verabreichung in situ. Gut bekannte Techniken umfassen systemische Verabreichung mit kationischen Liposomen und Verabreichung in situ mit viralen Vektoren. Siehe Caplen et al., Nature Med., 1:39-46 (1995); Zhu et al., Science, 261:209-211 (1993); Berkner et al., Biotechniques, 6:616-629 (1988); Trapnell et al., Advanced Drug Delivery Rev., 12:185-199 (1993); Hodgson et al., BioTechnology 13:222 (1995). Vektoren und Genauslieferungssysteme, welche die exogenen Gene spezifisch auf Zielzellen richten, sind am bevorzugtesten. Es wird angenommen, daß zukünftige Entwicklungen in der zielgerichteten Genauslieferung die Bedeutung dieser Ausführungsform erhöhen werden.
Eine „therapeutisch wirksame" Menge an Sphingomyelin kann durch Verhinderung oder Verbesserung von nachteiligen Zuständen oder Symptomen von zu behandelnden Krankheiten, Verletzungen oder Störungen bestimmt werden. Eine Optimierung der Zeitplanung und Dosierung von Sphingomyelin, das einem Patienten in Verbindung mit einer Tumortherapie gemäß Konvention verabreicht wird, wird neben anderen Dingen an die jeweiligen Eigenschaften des Patienten und das Ausmaß der Tumorgenese angepaßt. Solche Anpassungen sind Routine und erfordern kein übermäßiges Experimentieren oder Fachkönnen auf dem Gebiet. In ähnlicher Weise wird eine Optimierung der Zeitplanung und Dosierung von Sphingomyelin, das einem Patienten als eine Therapie für rheumatoide Arthritis verabreicht wird, ebenfalls, neben anderen Dingen, an die jeweiligen Eigenschaften des Patienten angepaßt. Die Methoden und pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung können zur Behandlung einer Vielzahl von Säugern verwendet werden und werden besonders bevorzugt zur Behandlung von Menschen und domestizierten Tieren, wie beispielsweise Vieh und Haustieren, verwendet.
1. HERSTELLUNG VON REAGENZ
Herstellung von Sphingomyelin
Verschiedene Formen von Sphingomyelin können in Pulverform von Sigma Chemicals (St. Louis, MO) bezogen werden. Man mische 1 g Sphingomyelinpulver mit 9,5 ml steriler Salzlösung oder phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und QS auf 10 ml. Man behandle die resultierende Suspension in einem Wasserbad bei 80 bis 90°C für eine Stunde mit Ultraschall. Die Suspension sollte innerhalb einer Stunde nach Ultraschallbehandlung verabreicht werden und sollte etwa Raumtemperatur (25–30°C) haben. Die Suspension kann bei 4°C gelagert werden, jedoch sollte sie vor der Verabreichung für 30 Minuten in einem Wasserbad bei 80–90°C erneut mit Ultraschall behandelt werden.
II. METHODE ZUR VERBESSERUNG VON TUMORTHERAPIE
Beispiel 1 In vivo-Bewertung von Sphingomyelin-Therapie an GW39-Dickdarmtumoren
Die Sphingomyelin-Verbesserung von Chemotherapie wurde durch Messung ihrer Wirkung bei 5-Fluorouracil (5FU)-Behandlung von GW39-Dickdarmtumoren in Mäusen bewertet. Nacktmäusen wurden subkutan GW39-Tumore implantiert. Nachdem die Tumore etwa 0,5 cm³ erreicht hatten, wurden die Mäuse in Gruppen von jeweils zehn aufgeteilt und erhielten eine der folgenden Therapien verabreicht: keine Behandlung (•), 0,45 mg/Tag 5-Fluorouracil für fünf Tage (
), 10 mg/Tag Sphingomyelin (SM) für sieben Tage (
) oder 0,45 mg/Tag 5-Fluorouracil für fünf Tage und 10 mg/Tag Sphingomyelin für sieben Tage (♦). Sowohl das 5-Fluorouracil als auch das Sphingomyelin wurden durch intravenöse Injektion verabreicht. Der Gruppe, die sowohl 5-Fluorouracil als auch Sphingomyelin erhielt, wurden beide Therapien für fünf Tage verabreicht, und anschließend wurde damit fortgefahren, daß sie für zwei Tage Injektionen von Sphingomyelin erhielt. Das Tumorvolumen in jedem Tier wurde in wöchentlichen Intervallen für drei Wochen nach der Behandlung untersucht.
Die Ergebnisse sind graphisch in 1 wiedergegeben. Sphingomyelin alleine hatte keinen Effekt auf das Tumorwachstum. Eine Behandlung mit 5-Fluorouracil verlangsamte anfänglich die Geschwindigkeit des Tumorwachstums, aber nach der zweiten Woche erhöhte sich die Geschwindigkeit des Wachstums. Jedoch verminderte eine gemeinsame Verabreichung von sowohl 5-Fluorouracil als auch Sphingomyelin die Geschwindigkeit des Tumorwachstums in einem viel höheren Ausmaß und für einen längeren Zeitraum als 5-Fluorouracil alleine. Dies ist nicht Teil der vorliegenden Erfindung.
Beispiel 2 in vivo-Bewertung von Sphingomyelin-Therapie an HT29-Dickdarmtumoren
Die Sphingomyelin-Verbesserung von Chemotherapie wurde durch Messung ihrer Wirkung auf 5-Fluorouracil-Behandlung von HT29-Dickdarmtumoren in Mäusen bewertet. Nacktmäusen wurden subkutan HT29-Tumore implantiert. Nachdem die Tumore etwa 0,5 cm³ erreicht hatten, wurden die Mäuse in zwei Gruppen von jeweils zehn aufgeteilt und ihnen eine der folgenden Therapien verabreicht: keine Behandlung (•), 0,45 mg/Tag 5-Fluorouracil für fünf Tage (
), 10 mg/Tag Sphingomyelin für sieben Tage (
) oder 0,45 mg/Tag 5-Fluorouracil für fünf Tage und 10 mg/Tag Sphingomyelin für sieben Tage (♦). Sowohl das 5-Fluorouracil als auch das Sphingomyelin wurden durch intravenöse Injektion verabreicht. Der Gruppe, die sowohl 5-Fluorouracil als auch Sphingomyelin erhielt, wurden beide Therapien für fünf Tage verabreicht, und anschließend wurde damit fortgefahren, daß sie für zwei Tage Injektionen von Sphingomyelin erhielt. Das Tumorvolumen in jedem Tier wurde in wöchentlichen Intervallen für fünf Wochen nach der Behandlung untersucht, ausgenommen der nur Sphingomyelin erhaltenden Gruppe, welche für vier Wochen bewertet wurde. Die Mittelwerte der Daten von jeder Gruppe wurden an eine exponentielle Wachstumskurve unter Anwendung von nicht-linearer Regression angepaßt. Die Kurven wurden unter Verwendung von ANOVA verglichen.
Die Ergebnisse sind graphisch in 2 dargestellt. Weder alleine verabreichtes Sphingomyelin noch 5-Fluorouracil hatten eine Wirkung auf das Tumorwachstum (p > 0,1 für jede Verbindung im Vergleich zur unbehandelten Gruppe). Jedoch reduzierte eine gemeinsame Verabreichung von sowohl 5-Fluorouracil als auch Sphingomyelin die Geschwindigkeit des Tumorwachstums um ungefähr 250 % (p < 0,0002). Dies ist nicht Teil der vorliegenden Erfindung.
Beispiel 3 In vitro-Bewertung von Sphinaomyelin-Therapie an Dickdarmtumoren
Die Sphingomyelin-Verbesserung von Chemotherapie wurde durch Messen ihrer Wirkung auf 5-Fluorouracil- oder Doxorubicin (DOX) -Behandlung von in Kultur gezüchteten Dickdarmtumoren bewertet. Die Zellüberlebensfähigkeit wurde unter Verwendung des Farbstoffs MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid) in einem 24-Well-Kammerformat gemessen. Siehe Mosmann, T., J. Immunol. Methods, 65:55-63 (1983). Menschliche Dickdarmtumorzellen HCT15, HT29, LoVo, LS174T, MOSER, SW480 und WiDr wurden in RPMI-Medium, das mit 10 fötalem Kälberserum versetzt war, gehalten. Menschliche Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HU-VEC) von gepoolten Spendern (Clonetics/BioWhittaker, San Diego, CA) wurden als Kontrollen verwendet. Zellen (10⁴/Well) wurden in der Gegenwart variierender Konzentrationen an Arzneimittel und Sphingomyelin ausplatiert und in einem befeuchteten Inkubator gezüchtet. Als eine zusätzliche Kontrolle wurde Eigelb-Phosphatidylcholin (PC) (Sigma, St. Louis, MO) anstelle von Sphingomyelin zu den Zellen hinzugegeben. Arzneimittel und Lipide wurden zu HUVEC-Zellen 24 Stunden nach dem Ausplatieren hinzugefügt, aber ansonsten wurden sie auf die gleiche Weise behandelt. Nach fünf Tagen wurden die Medien durch Medien, die 0,5 mg/ml MTT enthielten, ausgetauscht und für zwei bis vier Stunden bei 37°C inkubiert. Es wurde ein gleiches Volumen an 0,04 N HCl in Isopropanol hinzugefügt und die Absorption bei 570 nm gemessen. Die IC₅₀-Werte, die als die zur Reduzierung der Zellüberlebensfähigkeit um 50 % erforderliche Konzentration an Arzneimittel definiert sind, von drei bis sieben unabhängigen Experimenten wurden gemittelt und unter Verwendung von ANOVA verglichen.
Die Ergebnisse sind graphisch in den 3 und 4 dargestellt. In der Gegenwart von 1 mg/ml SM zeigten HT29-Zellen nahezu den gleichen IC₅₀ für 5FU (0,52 ± 0,21 μg/ml Medium; 0,38 ± 0,15 μg/ml SM; 0,39 ± 0,24 μg/ml PC) und DOX (92 ± 64 ng/ml Medium; 67 ± 23 ng/ml SM; 139 ± 63 ng/ml PC). Sphingomyelin sensibilisierte die anderen sechs Zellinien sowohl für 5FU als auch DOX in variierenden Ausmaßen (siehe 3 und 4). Sphingomyelin erhöhte die 5FU- und DOX-Sensitivität in HCT15- (140 % bzw. 340 %), LS174T- (70 % bzw. 70 %), MOSER- (90 % bzw. 100 %) und SW480-Zellen (260 % bzw. 180 %). Die Zellinien HT29, LoVo und WiDr wurden durch Sphingomyelin in vitro nicht chemosensibilisiert. In gleicher Weise sensibilisierte Sphingomyelin HUVEC-Zellen nicht für 5FU- oder DOX-Therapie (Daten nicht gezeigt). Die Erhöhung von Chemosensitivität scheint eine Funktion des Ceramidanteils von Sphingomyelin zu sein, da PC keinen ähnlichen Effekt wie Sphingomyelin hervorruft. Die Unterschiede zwischen den Ergebnissen in vivo und in vitro können auf die Umgebung zurückzuführen sein, in der Tumorzellen wachsen.

Claims

Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge von Sphingomyelin bei der Herstellung eines Medikaments zur Verbesserung der zytotoxischen Tumortherapie unter Verwendung von Chemotherapie, wobei das Sphingomyelin zusammen mit einem Anthracyclin an den Patienten verabreicht wird.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Anthracyclin Doxorubicin ist.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die Sphingomyelinzusammensetzung zusammen mit der zytotoxischen Tumortherapie verabreicht wird.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Sphingomyelin vor der Anwendung der Tumortherapie verabreicht wird.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei der Patient ein menschlicher Patient ist.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei Doxorubicin unter Verwendung eines Antikörpers oder eines Antikörperfragments auf Tumorzellen ausgerichtet wird.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei die Therapie unter Verwendung eines Antikörpers oder eines Antikörperfragments, der ein monoklonaler Antikörper oder das ein Fragment eines monoklonalen Antikörpers ist, auf Tumorzellen ausgerichtet wird.