DE3721562A1

DE3721562A1 - Verwendung exogener ganglioside als schutzfaktor bei tumorerkrankungen

Info

Publication number: DE3721562A1
Application number: DE19873721562
Authority: DE
Inventors: Valle Francesco Della
Original assignee: Fidia SpA
Current assignee: Fidia SpA
Priority date: 1986-06-30
Filing date: 1987-06-30
Publication date: 1988-03-03
Also published as: AU7490887A; ES2038621T3; DK333787D0; BE1000723A4; DE3774501D1; DK333787A; GR871005B; EP0251298B1; LU86930A1; ATE69381T1; US5229373A; FR2601248B1; IL82944A; DK165621C; JPS6327434A; AU601988B2; IT8648203A0; ZA874597B; EP0251298A2; CA1314219C

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung einer Gangliosidmischung und deren Einzelfraktionen, welche einen Schutzeffekt gegen die durch Antitumormittel verursachte Neurotoxizität aufweisen.

Die Ganglioside stellen eine Familie komplexer Glykolipidmoleküle dar und sind natürliche Komponenten zellulärer Membranen und insbesondere der neuronalen Membranen. Sie sind an der Entwicklung, Differenzierung und neuronalen Regeneration beteiligt.

Exogene Ganglioside werden in stabiler Weise in die neuronalen Membranen inkorporiert (Toffano G. et al [1980]: J. Neurochem. 35, [4], 861-866; Aporti F. et al. [1981]: Acta Oto-Laryingologica, 92, 433-437). Diese Inkorporierung steht mit der Aktivierung eines enzymatischen Membransystems (Na⁺, K⁺)ATPase, deren Aktivität für die Nervenimpulsleitung essentiell ist, im Zusammenhang. Die enzymatische Inkorporierung und Aktivierung wurden sowohl in vitro (Leon A. et al. [1981]: J. Neurochem. 37, [2], 350-357) und in vivo (Aporti F. et al. [1981]) gezeigt.

Ganglioside sind Säureglykolipide, die zu der als Glykosphingolipide bekannten Familie biologischer Verbindungen gehören. Diese weisen vier Grundstruktureinheiten auf: eine lange Aminoalkoholkette, eine Fettsäure, eine Oligosaccharidfraktion und einen oder mehrere Sialinsäurereste.

Die in cerebralen Gangliosiden vorhandene lange Aminoalkoholkette ist 4-Sphingenin. Das Analogon mit der längsten Kette ist 4-Eicosasphingenin. Diese Verbindungen sind allgemein als Shingosine bekannt.

Die entsprechenden gesättigten Verbindungen (Sphinganine) sind in geringen Mengen ebenfalls in den Gangliosiden vorhanden.

Eine Fettsäure ist mittels einer Amidbindung an die Sphingosin-Grundstruktur gebunden. Bei cerebralen Gangliosiden ist diese Fettsäure zu 95% Stearinsäure (18 : 0). Andere Fettsäuren finden sich in geringeren Mengen, beispielsweise Arachidinsäure (20 : 0), Palmitinsäure (16 : 0) oder Palmitoleinsäure (16 : 1⁹). Der Aminoalkohol und die Fettsäure bilden zusammen eine Ceramid genannte Einheit, die den hydrophoben Teil des Gangliosidmoleküls darstellt.

Die an das Ceramid gebundene Oligosaccharidkette charakterisiert die Glykosphingolipidfamilie, zu der das Gangliosid gehört. Sphingolipide werden auf der Basis der Kohlenhydrate, die unmittelbar an das Ceramid gebunden sind, in zwei Untergruppen eingeteilt. Die erste und kleinere Untergruppe leitet sich von Galaktosylceramid ab. Die meisten Glykosphingolipide und deshalb im wesentlichen alle Ganglioside gehören zu der Untergruppe, die sich von Glykosylceramid ableitet.

Sialinsäure ist in den cerebralen Gangliosiden hauptsächlich in der N-Acetylform vorhanden, die N-Glykolylform wurde jedoch auch bei einigen Gangliosidarten gefunden. Dieser Rest ist im allgemeinen als Neuraminsäure (NANA oder NGNA) bekannt.

N-Acetylneuraminsäure; offene Kette und Hemiketalring

Die Hydrophilie der Ganglioside hängt ab von der Oligosaccharidkette und der Zahl der an diese Kette gebundenen Sialinsäurereste.

Verteilung der Ganglioside

Die höchste Gangliosidkonzentration findet man in der grauen Substanz des Gehirns, die etwa 2,5 µm NANA pro g Naßsubstanz (ungefähr 0,4% des Trockengewichts, 0,6% der Gesamtlipide) (Ledeen R., Salsmar K., Cabrera M., J. Lipid Res.: 2, 129 [1968]) enthält. Ungefähr 90% des Gesamtgangliosidgehalts von Säugetiergehirnen wird durch vier Ganglioside mit identischer Oligosaccharidsequenz gebildet:

Gal( β 1→3)GalNAc( β 1→4)Gal( β 1→4)Glc( β 1→1)Cer

Der größte Teil der verbleibenden 10% des Gehalts an cerebralen Gangliosiden bei Säugetieren umfaßt die fehlenden Ganglioside der terminalen Galaktose- oder Galaktosyl-N-acetylgalaktosamineinheit (Svennerholm L., Mansson S., Li Y., J. Biol. Chem. 248, 740 [1973]).

Struktur und Nomenklatur der Ganglioside

Die cerebralen Ganglioside wurden chromatographisch isoliert und gereinigt. Zuerst wurde die Struktur des GM₁-Gangliosids bestimmt. Es wurde gezeigt, daß diese Struktur allen vier Hauptgangliosiden, die im Säugergehirn vorhanden sind, gemeinsam ist. Die nachfolgend angegebene Struktur bezieht sich auf die für GM₁ beschriebene Struktur und wird beispielhaft angegeben. Die Tabelle 1 enthält Angaben über die vier Hauptganglioside von Säugetiergehirnen.

Struktur des Monosialo-Gangliosids GM₁

Tabelle 1 - Strukturen der vier Hauptganglioside des Säugetiergehirns

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Behandlung und Heilung von Neurotoxizität, die durch Antitumormittel, insbesondere Vinca-Alkaloide, hervorgerufen wird, mit einer Zusammensetzung, die eine Gangliosidmischung ist aus GM₁, GD_1a, GD_1b und GT_1b in folgenden %-Verhältnissen:

GM₁- 21% GD_1a- 40% GD_1b- 16% GT_1b- 19%

Die Erfindung betrifft weiter ein pharmazeutisches Mittel, das eine Mischung von Gangliosiden und/oder der einzelnen Fraktionen davon enthält. Dieses Mittel besitzt Schutzwirkung gegen Neurotoxizität, hervorgerufen durch Antitumormittel, insbesondere Alkaloid-Antitumormittel der Vinca-Reihe. Die Gangliosidmischung ist insbesondere eine Mischung der Ganglioside GM₁, GD_1a, GD_1b und GT_1b der oben angegebenen prozentualen Zusammensetzung.

Dieses Mittel besitzt Schutzwirkung gegen die vom Antitumormittel verursachte Toxizität und ist zur Behandlung und Befreiung von den toxischen Nebenwirkungen einer Antitumor- Chemotherapie brauchbar.

Gegenstand der Erfindung ist weiter ein Arzneimittel für die Prophylaxe der allgemeinen toxischen Effekte oder chronischen neurotoxischen Effekte, die durch die Verabreichung antineoplastischer Mittel verursacht werden.

Schließlich ist Gegenstand der Erfindung die Verwendung einer Gangliosidmischung, insbesondere einer Mischung der Ganglioside GM₁, GD_1a, GD_1b und GT_1b zur Verhütung oder zur prophylaktischen Behandlung allgemeiner toxischer Effekte oder chronischer neurotoxischer Effekte, die durch eine anschließende Verabreichung antineoplastischer Mittel verursacht werden.

Wie oben erläutert, stellen die Ganglioside eine Familie komplexer Glykolipidmoleküle dar, die natürliche Komponenten von Zellmembranen sind. Aufgrund der Annahme, daß Ganglioside zur Hauptsache mit Neuronenmembranen assoziiert sind, wurde berichtet (Fishman and Coll. [1976]: Science, 194, 906-915), daß sie eine Rolle bei der Informationsübertragung durch diese Membranen spielen könnten. Diese Hypothese wird durch eine Reihe von Beobachtungen an Ereignissen gestützt, die durch die Zellmembranen vermittelt werden, bei denen diese Moleküle mit einbezogen sind. Dabei handelt es sich um: die neuronale Entwicklung (Dimpfel W. und Coll.: In "Gangliosides in Neurological and Neuromuscular Function, Development and Repair", Rapport and Gorio, Raven Press 119-134, 1981), Differenzierung (Leon A. und Coll.: In "Membranes in Growth & Development", Hoffmann und Coll., 311-320 [1981]) Regenerierung (Gorio A. u. Coll [1981a]: In "Gangliosides in Neurological and Neuromuscular Function, Development and Repair", Rapport and Gorio, Raven Press 177-195]).

Eine zur parenteralen Verabreichung gereinigte Mischung der Ganglioside GM₁, GD_1a, GD_1b und GT_1b hat sich bei der Stimulierung der Reinnervation aufgrund verstärktem Neuronenwachstums (Gorio A. und Coll. [1980]: Brain Res. 197, 236-241) als wirksam erwiesen. Die das Neuronenwachstum fördernde Aktivität wurde sowohl in vitro an neuronalen Gewebekulturen-Modellen (Roisen F. J. and Coll. [1981]: Science, 214, 577-578; Hauw J. J. and Coll. [1981]: Neurophysiologie. C. R. Acad. Sc. Paris, 292, [8], 569-571]) als auch in vivo an Tier-Denervations-Modellen (Gorio und Coll., "Brain Res. 197, 236-241), Gorio A. und Coll. [1981]: In "Nervous system regeneration. Birth Defects; original article series", 19, [4], 157-174, [1983], Haber B und Coll.) bestätigt.

Die in vivo Tiermodelle (Denervation des rasch zuckenden Muskels bei der Ratte durch Zerquetschen des Ischial-Nervs, Teildenervation des Musculus soleus bei der Ratte durch Resektion und Dislokation der Nervenwurzel L 5) erbrachten sowohl elektrophysiologisch als auch morphologisch den Beweis für ein erhöhtes kollaterales Nervenwachstum nach Behandlung mit exogenen Gangliosiden (5-50 mg/kg pro Tag bei parenteraler Injektion), was zu einer rascheren Wiederherstellung der Funktionalität führte.

Elektrophysiologisch wurde die raschere Heilung des geschädigten Nervs aufgrund der Behandlung mit Gangliosiden an verschiedenen Tiermodellen gezeigt, dazu zählen die sensorische Nervenfunktion nach Durchtrennen des Nervs (Norido F. und Coll. [1981]: Experientia, 37, 301-302); Verringerung der Kochlear-Funktion nach Lärmeinwirkung (Aporti F. und Coll. [1977]: Nuovo Arch. Otol. Rinol. Laringol. 5, [1], 25-32); Diabetes-Neuropathie bei genetisch diabetischen Mäusen (Noride F. und Coll., Muscle & Nerve, 5, 107.110 [1982]); und Neurotoxinvergiftung (Aporti F. und coll. [1981]; Acta Otolaryngologica 92, 433-437, [1981], Maroni M. und Coll. Clinical Toxicology 18, [12] 1475-1484 [1981]).

Auf der Basis dieser experimentellen Daten ist ersichtlich, daß die Gangliosidmischung GM₁, GD_1a, GD_1b und GT_1b für viele Beschwerden brauchbar ist, die das periphere Nervensystem beeinflussen, wobei die Reinnervation stimuliert und beschleunigt werden kann.

Darüber hinaus hat sich die Gangliosidmischung aufgrund ihrer Schutzwirkung gegen die durch Antitumormittel im allgemeinen, insbesondere durch die von der Vinca-Reihe abgeleiteten Alkaloide, als brauchbar erwiesen.

Wie oben erwähnt, sind die Ganglioside als Membrankomponenten ubiquitär, wobei sich die meisten in dem äußeren Blättchen der Lipidschicht der Plasmamembranen finden (Ledeen R. [1984]: TINS 8, 169-174).

Es ist literaturbekannt, daß Ganglioside bei Regulationsphänomenen und bei der zellulären Erkennung beteiligt sind; es wurde daher verifiziert, daß sie bei der Entwicklung und der zellulären Differenzierung eine Rolle spielen. Es ist weiter bekannt, daß die Tumorbildung mit bedeutenden Veränderungen auf der Zelloberfläche von Glykosphingolipiden (und deshalb einschließlich Gangliosiden) im Zusammenhang steht. Auf dieser Basis wurde postuliert, daß Ganglioside eine (bisher noch nicht gut definierte) Rolle bei der Wachstumsregulierung, Differenzierung und Zellinteraktion spielen (Hakomori S. [1981]: Ann. Rev. Biochem. 50, 733-764).

Bei der embryonalen und histogenen Entwicklung und Differenzierung werden die zellulären Interaktionen durch kontinuierliche Veränderung von Zelloberflächenmolekülen, die für ein genetisches Programm kodieren, mediiert. Während dieses Prozesses erfolgen bemerkenswerte phasenabhängige Veränderungen im Gehalt und der Komplexität der Zelloberflächen-Ganglioside.

Einige Beispiele für dieses Phänomen sind:

a) Expression von Tetanustoxin (Koulakoff A. et al. [1983]: Develop. Biol. 100, 350-357) und Choleratoxin- Bindungsstellen (Willinger M. und Schachner M. [1980]: Develop. biol. 74, 101-117) im ZNS erfolgt nur an postmitotischen Neuronen);
b) Beim Intestinalepithelium sind die undifferenzierten Zellen durch die Anwesenheit von Lac-Cer, Glu-Cer und die Abwesenheit von GM₃ charakterisiert, wohingegen die differenzierten Zellen durch hohe GM₃-Spiegel charakterisiert sind (Ledeen R. [1984] TINS 8, 169-174);
c) Es erfolgt eine beträchtliche Erhöhung an GM_1b, wenn die Amyloidzellen dazu induziert werden, in Makrophagen zu differenzieren (Ledeen R. [1984] TINS 8, 169-174).

Diese und andere hier nicht genannte Beispiele, wie die Modifizierung von Gangliosiden während eines Zell- Zell-Kontaktes, zeigen, daß die Expression spezifischer Ganglioside an der Zelloberfläche mit dem Umschalten des Zellprogramms vom proliferativen zum nicht-proliferativen Zustand korreliert (Koulakoff A. et al [1983]: Develop. Biol. 100, 350-357). Darüber hinaus kann ihre Expression die Zell-Zell-Interaktion, Zellmigration und Zelldifferenzierung definieren.

Letzteres läßt sich von in vitro Experimenten ableiten, die durch Zugabe exogener Ganglioside zu proliferierenden (z. B. 3T3, Neuroblastom, Glioma etc.) oder nicht- proliferierenden Zellen (z. B. Primärneuronen) in eine Kultur durchgeführt wurden. In allen Fällen erhöhen die exogen zugegebenen Ganglioside die Zelldifferenzierung. Bei proliferierenden Zellen steht dieser Effekt mit abnehmender Proliferation (siehe unten) im Zusammenhang (Haber B. und Gorio A., Hrsg. [1984]: J. Neurosci. Res.).

Aufgrund der nachfolgenden Beobachtungen wurde vorgeschlagen, daß die Ganglioside möglicherweise bei der Regulierung des Zellwachstums eine Rolle spielen:

a) die Synthese spezifischer Ganglioside ist in Assoziation mit der "Kontaktinhibierung" des Zellwachstums stark erhöht (Ledeen R. [1984] TINS 8, 169-174);
b) die Gangliosidsynthese erhöht sich, wenn das Zellwachstum in transformierten Zellen durch Differenzierungsmittel gehemmt oder induziert wird (Ledeen R. [1984] TINS 8, 169-174);
c) die exogene Zugabe von Gangliosiden, einschließlich GM₁, die in Plasmamembranen inkorporiert sind, inhibiert das Zellwachstum und induziert Kontaktinhibitierung. Dieser Effekt wurde bei mehreren Zellinien beobachtet (d. h. 3T3, Neuroblastoma, Gliom) (Haber B. und Gorio A., Hrsg. [1984]: J. Neurosci. Res.; Ledeen R. et al., Hrsg. [1984]: Adv. Exper. Med. and Biol. 174).

Demzufolge erhöht sich die Gangliosidsynthese, wenn die Proliferation gestoppt wird. Darüber hinaus führt der exogene Zusatz von Gangliosiden zu einem Anhalten oder Verzögern der Zellproliferation. Es ist zu bemerken, daß dieser letztere Effekt in keiner Weise mit Cytotoxizität im Zusammenhang steht.

Veränderungen im Gangliosidmuster der Zelloberfläche wurden bei verschiedenen Typen von Tumorzellen und als spezifische Antwort auf unterschiedliche transformierende, karzinogene Mittel beobachtet. Diese Veränderungen können deshalb als allgemeines Phänomen betrachtet werden, das gewöhnlich mit der Transformation assoziiert ist (Hakomori S. [1975]: Biochim. Biophys. Acta 417, 55-89).

Während der onkogenen Transformation sind im wesentlichen drei Kategorien an Veränderungen der Glykolipidzelloberfläche, einschließlich der Ganglioside, zu beobachten:
Unvollständige Synthese, Neusynthese und organisatorische Membran-Neuordnungen der Glykolipidmoleküle (Hakomori S. [1984]: TIBS 10, 453-458). Sowohl der Prekursor, der sich aufgrund unvollständiger Synthese akkumuliert als auch das durch Neosynthese gebildete Neoglykolipid (üblicherweise kleinere [minor] Glykolipide oder Ganglioside) werden für eine "tumor-assoziierte" antigene Expression gehalten, wenn sie auf der Progenitor-Zelloberfläche nicht nachweisbar sind. Darüber hinaus sind diese tumor-assoziierten Antigene manchmal dadurch charakterisiert, daß sie eine ungewöhnliche Ceramid-Zusammensetzung besitzen.

Information über die Gangliosid-Vincristin (VCR)- Assoziation zur Behandlung von Tumorerkrankungen

Vincristin ist ein häufig verwendetes antineoplastisches Mittel und kommt erfolgreich bei der Behandlung von Leukämie, Lymphom und im allgemeinen bei fortgeschrittenen Krebsformen zur Anwendung (Holland J. F. et al [1983]: Cancer Res., 33, 1258-1264). Der Hauptnachteil der extensiven Anwendung von Vincristin bei verschiedenen Tumorerkrankungen ist dessen große Toxizität. Insbesondere besteht eine der Hauptnebenwirkungen darin, daß Anzeichen von peripherer und autonomer Neurotoxizität auftreten.

Die Neuropathie zeigt sich typischerweise im Verlust der Sehnenreflexe, in Parästhesie, Muskelschmerz und -schwäche, Konstipation und Bauchschmerz. Die Neurotoxizität setzt der Dosierung und der Zahl der Verabreichungen, die zur Heilung tumoraler Pathologien erforderlich ist, enge Grenzen und erfordert häufig das Absetzen des Arzneimittels (Arnold A. M. et al [1985]: The Lancet, 9. Februar).

Der anti-mitotische Wirkungsmechanismus der Vinca-Alkaloide besteht in einer Interferenz mit der Mikrotubuli-Anordnung in der mitotischen Spindel. Man nimmt an, daß der die Mikrotubli störende Effekt auch für morphologische Änderungen der Axone und Neurone in Tierversuchen verantwortlich ist, wobei fokale, axonale Schwellungen, disorganisierte Akkumulierungen von Neurofilamenten (Cho E. S. et al. (1983): Arch. Toxicol. 52, 83-90) und mikrotubulare, kristalloide Inklusionen in Neuronen (Sato M., Miyoshi K. [1984]: Acta Neuropathol. 63, 150-159) zu beobachten sind. Vom elektrophysiologischen Standpunkt aus gesehen, zeigen die Untersuchungen von McLeod und Penny (J. Neurol. Neurosurg. Psychiat. 32, 297-304, 1969) und Guiheneuc et al. (J. Neurol. Sci. 45, 355-366, 1980) am Menschen, daß die VRC-induzierte Neuropathie vom Dying-Back-Typ unter Miteinbeziehung distaler, retrograder axonaler Degeneration war. Dieser distale Degenerationsprozeß verursacht eine teilweise Denervation des entsprechenden Muskels. In dieser Situation scheinen Reparatursequenzen in Form kollateraler Sprouting-Phänomene durch lebensfähige Axone den Versuch des Organismus darzustellen, die betreffenden Muskeln mit verschwindenden Axonen zu reinnervieren (Brown M. C. et al [1981]: Ann. Rev. Neurosci. 4, 17-42).

McLeod und Penny (1969) haben gefunden, daß diese physiologischen Repair-Prozesse nach Unterbrechung der VCR-Therapie erneut wirksam werden und die rasche Regenierung der Nervenfasern ermöglichen.

Es ist andererseits bekannt, daß die parenterale Verabreichung einer Gangliosidmischung (mit dem Warenzeichen CRONASSIAL bezeichnet) an Tiere Repair-Prozesse an peripheren Nerven durch einen Mechanismus stimuliert, der auf einer Erleichterung des Nerven-Sproutings basiert (Gorio A. et al. [1980]: Brain Res. 197, 236-241). Umfangreiche klinische Forschung hat erbracht, daß das Arzneimittel CRONASSIAL bei einer großen Zahl von Störungen des peripheren Nervensystems angebracht ist, wobei die Stimulierung der reparativen Innervierung einen klinischen Vorteil bedeutet. Zu derartigen peripheren Neuropathien zählen auch einige toxische Formen, wie iatrogene Neuropathien, die durch Vinca-Alkaloide verursacht werden, welche zur Behandlung von Neoplasien angewandt wurden.

Bei Vincristin-induzierter Neuropathie haben Dantona et al (1978): Rivista Scientifica ed Educazione Permanente (Suppl. 9, 155-158) von 40 Patienten mit akuten neurotoxischen Syndromen, die durch Vincristin verursacht wurden, berichtet. Diese Patienten erhielten 20 mg Cronassial täglich während 20 Tagen und anschließend 10 mg täglich für mehr als 10 Tage. Die Patienten wurden regelmäßig befragt, wobei besonderes Augenmerk auf ihre Symptome gelegt wurde. 57,5% der Patienten berichteten über eine signifikante subjektive Verbesserung. Insbesondere hat sich gezeigt, daß die Parästhesiesymptome bereits am vierten Tag nach Beginn der Therapie nachlassen. Diesen Vorversuchen folgte ein kontrollierter Versuch an einer geringeren Patientenzahl.

Azzoni (II Policlinico, Sez. Medica, 85 [4], 255-262 [1978]) untersuchte sieben mit Cronassial behandelte Patienten und parallel dazu im Vergleich sieben unbehandelte vergleichbare Patienten. Die behandelten Patienten erhielten 20 mg Cronassial i.m. täglich 4 bis 6 Wochen lang gleichzeitig mit Vincristin, um neoplastische Störungen zu unterdrücken. Der Effekt der Behandlung wurde anhand der Symptome für vier wichtige neurologische Veränderungen verfolgt: Parästhesie, Achillessehnen-Areflexie, Fußdorsiflexionskraft und Darmfunktionsstörung. Die Bewertung der Symptome nach dem Behandlungszyklus erfolgte im Hinblick auf die geringe Patientenzahl mit Hilfe der Armitage-Sequenzanalyse. Diese Analyse zeigte, daß die Cronassial-Therapie bei der angewandten Dosierung das Auftreten mäßig neurotoxischer Anzeichen (Paresthesie und den Verlust des Achillessehnenreflexes) wirksam verhütete.

Experimentelle Untersuchungen

Um die Möglichkeit einer physikalisch-chemischen oder biologischen Wechselwirkung zwischen den in Cronassial enthaltenen Gangliosiden und Vincristin auszuschließen und um die Möglichkeit der Beeinträchtigung der antitumoralen Aktivität von Vincristin durch die begleitende Verabreichung von Cronassial zu untersuchen, wurden verschiedene Tierversuche unter gleichzeitiger Verabreichung von Vincristin und Gangliosiden durchgeführt. Insbesondere wurden untersucht:

1. Die akute und chronische Toxizität und
2. der antitumorale Effekt.

1. Wirkung der Ganglioside auf die akute, durch Vincristin verursachte Toxizität Materialien und Methoden

Tiere: Die Mäuse wurden in Gruppen von nicht mehr als 8 Tieren unterteilt und in Standardkäfigen gehalten. Futter und Wasser stand ad libitum zur Verfügung. Die Tiere wurden in Räumen unter genau kontrollierten Bedingungen untergebracht.

Arzneimittel

- 1 mg Vincristin wurde auf die Konzentration verdünnt, die erforderlich ist, um 0,1 ml/10 g Körpergewicht zu injizieren.
- eine Lösung von Gangliosiden wurde hergestellt durch Zugabe von sterilem destilliertem Wasser in einer Menge, die ausreicht, um eine Endkonzentration von 200 mg/kg in einem Volumen von 0,2 ml zu erhalten. Diese Dosis wurde Mäusen mit einem Gewicht von ungefähr 20 g verabreicht.

Ergebnisse

Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengestellt. Es ist ersichtlich, daß die Gangliosidmischung keine Schutzwirkung gegen die von einer einzelnen i.v. Vincristindosis herrührende Toxizität besitzt.

Tabelle 2

Akute Lethalität durch Vincristin und Vincristin + Gangliosiden bei Mäusen

Ziel: Reduktion der Toxizität antitumoraler Arzneimittel

2. Wirkung einer Gangliosidbehandlung bei chronischer Vincristintoxizität Materialien und Methoden

Männliche Mäuse CD-1 (ICR) BR (Charles River, Italien) mit einem Gewicht von 25-30 g wurden für das gesamte Experiment verwendet. Es wurde Gruppen von 10 Tieren pro Käfig gehalten. Die Tiere wurden mit Standard-Laborfutter gefüttert, Leitungswasser stand ihnen ad libitum zur Verfügung. Die Tiere wurden bei konstanter Raumtemperatur (21±1°) und relativer Feuchtigkeit (60%) und regelmäßigen Hell/Dunkelzyklen (Licht von 8.00 morgens bis 8.00 abends) gehalten.

Vincristinsulfat (Lilly) wurde in Kochsalzlösung gelöst und i.v. in einem Dosisvolumen von 10 ml/kg injiziert. Die Ganglioside wurden in einem Phosphatpuffer (0,01 M; pH 7,5) der 0,8% NaCl enthielt, solubilisiert und i.m. in einem Dosisvolumen von 5 ml/kg verabreicht.

Vorbehandlung mit Gangliosiden

Die Gangliosidmischung (oder der Träger) wurde i.m. täglich an fünf aufeinanderfolgenden Tagen in unterschiedlichen Dosierungen (50, 100 und 200 mg/kg) verabreicht. Vincristin wurde i.v. 5 h nach der letzten Behandlung mit Gangliosiden (oder dem Träger) in Dosierungen von 2,4 und 2,6 mg/kg injiziert.

Nachbehandlung mit Gangliosiden

Die Gangliosidmischung (oder der Träger) wurde i.m. in Dosierungen von 200 mg/kg 5 h vor einer i.v. Behandlung mit Vincristin an fünf aufeinanderfolgenden Tagen verabreicht.

Die Vincristindosierung war 2,2, 2,4 und 2,6 mg/kg.

Die Mortalitätsrate wurde anhand der Zahl der Tiere bewertet, die innerhalb der ersten 14 Tage der Vincristin-Behandlung starben.

Die statistische Signifikanz der Mortalitätsraten wurde mit Hilfe des Wahrscheinlichkeitstests von Fisher bewertet.

Ergebnisse

Die Ergebnisse der Versuche sind in den Tabellen 3 und 4 zusammengestellt und in Fig. 1 graphisch aufgetragen. Fig. 1 zeigt:
Den Effekt der Vor- und Nachbehandlung mit Gangliosiden auf die Toxizität, die durch unterschiedliche Vincristin-(VCR)-Dosen induziert wurde. Es wurden 10 Mäuse in jeder Gruppe verwendet. Auf Basis der Kurve für die Mortalitätsrate nach einer Vincristinverabreichung wurden Dosierungen zwischen 2 und 3 mg/kg für die Untersuchungen mit Gangliosiden ausgewählt. Im ersten Experiment wurde die Wirkung der Gangliosidbehandlung vor und nach der Vincristininjektion verglichen.

Im Falle der Nachbehandlung wurde eine einzelne Gangliosidverabreichung gegeben, um die Möglichkeit auszuschließen, daß die größere Wirksamkeit der Vorbehandlung mit Gangliosiden bei der Reduktion der Vincristintoxizität nur von der letzten Gangliosidinjektion herrührt.

Wie in Fig. 1 gezeigt, wurde eine Reduktion der Vincristintoxizität beobachtet, wenn die Gangliosidmischung subchronisch vor, aber nicht nach der Vincristininjektion verabreicht wurde. Dieser Effekt wurde mit der maximalen Gangliosiddosis (200 mg/kg) erhalten. Wenn eine geringere Dosis der Gangliosidmischung verabreicht wurde, war ein dosisabhängiger Effekt der Gangliosid-Schutzwirkung (Tabelle 3) zu beobachten, ausgenommen die abnormale Mortalitätsrate der Gruppe, die mit 100 mg/kg Gangliosiden und 2,6 mg/kg Vincristin behandelt wurde.

Weitere Versuche wurden mit einer Gangliosiddosis von 200 mg/kg durchgeführt. Die relativen Daten sind aus Tabelle 4 ersichtlich.
BehandlungMortalitätsrate

Träger + VCR 2,4 mg/kg i.v.7/10 Ganglioside 50 mg/kg i.m. + VCR 2,4 mg/kg i.v.2/10 Ganglioside 100 mg/kg i.m. + VCR 2,4 mg/kg i.v.1/10 Ganglioside 200 mg/kg i.m. + VCR 2.4 mg/kg i.v.0/10 Träger + VCR 2.6 mg/kg i. v.5/10 Ganglioside 50 mg/kg i.m. + VCR 2.6 mg/kg i.v.4/10 Ganglioside 100 mg/kg i.m. + VCR 2.6 mg/kg i.v.9/10 Ganglioside 200 mg/kg i.m. + VCR 2,6 mg/kg i.v.2/10

Tabelle 4

Effekt der subchronischen Vorbehandlung mit Gangliosiden (200 mg/kg; i.m.) auf die akute letale Vincristin (VCR)-Toxizität

Antitumoraler Effekt von Vincristin in Kombination mit Gangliosiden Materialien und Methoden

Für die einzelnen Tumore wurden die folgenden Stämme verwendet:

- Männliche Swiss-Schneidermäuse mit einem Gewicht von 27 g wurden für die Versuche mit Sarcoma S 180 verwendet.
- Weibliche C₅₇Bl-Mäuse mit einem Gewicht von 20 g wurden für die Versuche mit Melanom B16 verwendet.
- Männliche BDF₁-Mäuse mit einem Gewicht von 30 g wurden für die Versuche mit Leukämie L1210 verwendet.
- C₅₇-B₁-Mäuse mit einem Gewicht von 20 g wurden für die Experimente mit Lewis-lung verwendet.

Tumore Sarcom S 180

Dieser Tumor wurde in diesem Labor bereits über 10 Jahre in den gleichen Stamm an Mäusen transplantiert. Die Transplantation erfolgte durch sc-Inokulierung von 0,1 ml eines Tumorhomogenats, das durch feines Zerhacken von lebensfähigem Tumorgewebe erhalten wurde. Das Transplantat wurde wiederholt mittels einer Nadel (26 Gauge) in eine sterile Petrischale gegeben. Es wurden 0,1 ml Penicillin (20 000 Einheiten/ml) und Streptomycin (20 000 Einheiten/ml) zu der Lösung gegeben. Weiter wurden 5 mg Neomycin zugegeben.

Melanom B16

Dieser Tumor wurde durch Inokulation hergestellt wie oben für Sarcoma S 180 beschrieben.

L 1210

7 Tage nach der Inokulation von L1210-Zellen wurde den Tieren die Milz entnommen, die anschließend mit isotonischer Kochsalzlösung 1 : 100 fein gehackt wurde. 0,1 ml dieser Milz- und Leukämie-L1210-Zellsuspension wurde anschließend sc in die Flanke jeder BDF₁-Maus injiziert.

Lewis Lung (3 LL)

Dieser Tumor wurde durch Inokulierung in der gleichen Weise hergestellt, wie oben für Sarcom S 180 beschrieben.

Arzneimittel Vincristin

Es wurde ein Standardvial mit 1 mg Vincristin verwendet. Dieses wurde hergestellt mit einem geeigneten Volumen an Verdünnungslösung, um die für die Injektion von 0,1 ml/10 g Körpergewicht erforderliche Endkonzentration zu erzielen.

Cronassial

Eine Lösung dieser Substanz, die eine Mischung von vier Gangliosiden darstellt, wurde hergestellt durch Zugabe von sterilem destilliertem Wasser in einer Menge, die für eine Konzentration von 200 mg/kg in einem Volumen von 0,2 ml ausreicht. Diese Dosis wird Mäusen mit einem Gewicht von ungefähr 20 g verabreicht.

Ergebnisse

Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in Tabelle 5 zusammengestellt.

Tabelle 5

Antitumorale Aktivität mit und ohne Cronassial

Die Tests von Vincristin mit und ohne Cronassial an den Tumoren S180, B16 und L1210 zeigten, daß Cronassial die Antitumoraktivität, die Vincristin haben mag, nicht beeinträchtigt. Dies wird anhand der Inhibierung des Tumorwachstums während der mittleren Überlebenszeit gezeigt.

Im Gegenteil, die mit Leukämie L1210 erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß die durch die Toxizität von Vincristin alleine verursachte Sterblichkeit reduziert sein kann (bei Verabreichung mit Cronassial) und daß die Wirksamkeit von Vincristin gegen L1210 erhöht wird, wobei eine mittlere Überlebenszeit von 10,3 Tagen im Vergleich zu 7,8 Tagen für Vincristin alleine zu beobachten ist. Dieser Unterschied ist statistisch signifikant.

Pharmazeutische Mittel

Erfindungsgemäß soll die Gangliosidformulierung die einzelnen Ganglioside in folgenden Anteilen enthalten:

Einzelne GangliosideGew.-%

- GM₁von 10 bis 23 - GD_1avon 36 bis 44 - GD_1bvon 14 bis 18 - GT_1bvon 17 bis 21

Bei einer bevorzugten Formulierung werden die einzelnen Ganglioside in folgenden Mengen kombiniert:

GM₁- 21% GD_1a- 40% GD_1b- 16% GT_1b- 19%

Zur Herstellung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Mittel soll die Formulierung vorzugsweise einen Gesamtgangliosidtiter (GM₁+GD_1a+GD_1b+GT_1b) von 95% (berechnet als Trockengewicht) enthalten. Die Präparate können Lösungen der Gangliosidverbindungen oder ein gefriergetrocknetes Pulver der Verbindungen zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch annehmbaren Trägern oder Verdünnungsmitteln sein, die ein Phosphatmedium von geeignetem pH enthalten, das isoosmotisch mit physiologischen Flüssigkeiten ist. Jede Dosis des Mittels soll zwischen 10 und 100 mg der Gangliosidmischung enthalten.

Die jeweilige Dosierung hängt von dem gewünschten Effekt und der Verabreichungsart ab. Beispielsweise kann die Dosierung zwischen 1,43 und 0,143 mg an Wirkstoff pro kg/Körpergewicht pro Tag bei einer Standarddosierung zwischen 100 und 10 mg betragen. Die Zusammensetzung einiger pharmazeutischer Mittel ist nachfolgend angegeben:

Präparat Nr. 1

Jedes 2 ml Vial enthält:

- Gangliosidmischung folgender Zusammensetzung: 100 mg GM₁21% GD_1a40% GD_1b16% GT_1b19%
- Phosphatpuffer pH 7,6 M/100 in pyrogenfreiem, sterilem, destilliertem Wasser, q.s.p. 2 ml

Präparat Nr. 2

Jedes 2 ml Vial enthält:

- Gangliosidmischung folgender Zusammensetzung: 10 mg GM₁21% GD_1a40% GD_1b16% GT_1b19%
- Phosphatpuffer pH 7,6 M/100 in pyrogenfreiem, sterilem, destilliertem Wasser, q.s.p. 2 ml

Präparat Nr. 3

Jedes 2 ml Vial enthält:

- Gangliosidmischung folgender Zusammensetzung: 25 mg GM₁21% GD_1a40% GD_1b16% GT_1b19%
- Phosphatpuffer pH 7,6 M/100 in pyrogenfreiem, sterilem, destilliertem Wasser, q.s.p. 2 ml

Präparat Nr. 4

Jedes Vial mit gefriergetrocknetem Inhalt enthält:

- Gangliosidmischung folgender Zusammensetzung: 75 mg GM₁21% GD_1a40% GD_1b16% GT_1b19%

Ein 2 ml Vial mit Lösungsmittel enthält:

- Mannit 25 mg
- Phosphatpuffer pH 7,6 M/100 in pyrogenfreiem, sterilem, destilliertem Wasser, q.s.p. 2 ml

Allgemeine Schlußfolgerungen und therapeutische Anwendungsmöglichkeiten

Die bei der Verhütung der chronischen Vincristintoxizität durch gemeinsame Verabreichung einer Gangliosidmischung erhaltenen Ergebnisse sind überraschend, weil es nicht möglich ist, diesen allgemeinen Schutzeffekt mit dem bereits früher beobachteten, neuronalen reparativen Effekt der Ganglioside allein in Zusammenhang zu bringen. Auf Basis der früheren, mit Gangliosiden erhaltenen Ergebnisse wurde die Hypothese aufgestellt, daß Ganglioside die Vincristinneuropathie verhindern können, nicht aber diejenigen Neuropathien, die durch chronische Toxizität allgemeinen Charakters verursacht werden.

Die von Vincristin am stärksten betroffenen drei Bereiche sind das hämatologische System, das Gastrointestinale System und das Nervensystem. Andererseits ist es schwierig, den Schutzeffekt der Ganglioside zu erklären, wenn dieser lediglich als Effekt auf das zentrale oder autonome Nervensystem betrachtet wird, weil die durch Vincristin verursachte und an den Tieren bestimmte Mortalität nicht nur ihren Auswirkungen auf das periphere oder autonome Nervensystem zugeschrieben werden kann. Dies bedeutet deshalb, daß die Ganglioside ihre Wirkung durch einen Mechanismus allgemeinerer Art entfalten, der sich von dem anhand früherer Untersuchungen als Hypothese aufgestellten Mechanismus unterscheidet.

Darüber hinaus kann dieser Effekt reproduziert werden mit anderen Antitumormitteln, wie Mitozantron, cis-Platin, Methotrexat, Adriamycin, Daunomycin und Cyclophosphamid, bei denen ein hoher Grad allgemeiner und neuronaler Toxizität zu beobachten ist. Es ist zu betonen, daß die Ganglioside die antitumorale Aktivität von Vincristin nicht negativ beeinflussen. Bei experimentieller Leukämie ist sogar ein positiver Effekt auf das Arzneimittel zu beobachten.

Bei der therapeutischen Anwendung ist zu beachten, daß

- die exogene Zugabe von Gangliosiden zu Zellinien in Transformation die Zellproliferation verringert oder verlangsamt und die Zelldifferenzierung begünstigt,
- der Effekt der Ganglioside nicht cytotoxisch und reversibel ist,
- der antiproliferative Effekt der Ganglioside abhängig sein kann vom Zelltyp und vielleicht von der Abhängigkeit der in Betracht gezogenen Zellen vom Wachstumsfaktor für die Proliferation.

Vincristin andererseits inhibiert die Zellproliferation unabhängig vom Zelltyp und dem in Betracht gezogenen Wachstumsfaktor. Diese Effekte sind jedoch der Cytotoxizität von Vincristin sowohl gegenüber transformierten als auch gegenüber nicht-transformierten proliferativen Zellen zuzuschreiben. Als solche kann die Gangliosid- VCR-Assoziation bei Tumorerkrankungen als valid betrachtet werden. Die Ganglioside ermöglichen es, geringere Dosen an VCR als Antitumormittel zu verwenden, so daß als Ergebnis der cytotoxische Effekt von VCR auf normale Zellen verringert wird. Andererseits ist es bekannt, daß die Verabreichung von Antitumorarzneimitteln, wie VCR, an Tumorpatienten schwere Nebenwirkungen verursacht. Es ist deshalb wünschenswert, eine Verringerung dieser Nebenwirkungen (die auf einer allgemeineren Toxizität der Arzneimittel beruhen) zu erzielen.

Zusammenfassend läßt sich feststellen, daß die erhaltenen Ergebnisse von den erwarteten sehr verschieden sind, weil sie nicht auf das Nervensystem zurückführen. Sie zeigen im Gegenteil eine schützende oder prophylaktische Wirkung gegen die Nebenwirkungen allgemeiner toxischer Natur, die durch Verabreichung von Antitumormitteln der Vinca-Reihe verursacht werden. Diese Art der Wirkung ermöglicht es den Behandlungszeitraum mit Vincristin zu verlängern, wobei die Dosis hoch genug gewählt werden kann, um das Tumorwachstum zu verlangsamen und gleichzeitig das Einsetzen der erwähnten Nebenwirkungen zu verzögern.

Eine Verabreichung der Gangliosidmischung, insbesondere der Cronassial-Mischung, führt zu einer Prophylaxe gegen allgemeine toxische Effekte oder chronische neurotoxische Effekte, die durch Verabreichung antineoplastischer Mittel verursacht werden. Die prophylaktische Aktivität ist insbesondere evident, wenn die Gangliosidmischung vor Verabreichung des antineoplastischen Mittels gegeben wird.

Claims

1. Verwendung einer Mischung der Ganglioside GM₁, GD_1a, GD_1b und GT_1b zur Verhütung oder prophylaktischen Behandlung allgemeiner toxischer Effekte oder chronischer neurotoxischer Effekte, die durch die nachfolgende Verabreichung antineoplastischer Mittel verursacht werden.

2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Gangliosidmischung etwa 19 bis 23 Gew.-% GM₁, etwa 36 bis 44 Gew.-% GD_1a, etwa 14 bis 18 Gew.-% GD_1b und etwa 17 bis 21 Gew.-% GT_1b enthält.

3. Verwendung nach Anspruch 2, wobei die Gangliosidmischung etwa 21 Gew.-% GM₁, etwa 40 Gew.-% GD_1a, etwa 16 Gew.-% GD_1b und etwa 19 Gew.-% GT_1b enthält.

4. Verwendung nach Anspruch 2, wobei die Gangliosidmischung etwa 23 Gew.-% GM₁, etwa 40 Gew.-% GD_1a, etwa 16 Gew.-% GD_1b und etwa 19 Gew.-% GT_1b enthält.

5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Gangliosidmischung in einer Standarddosierung von 100 bis 10 mg verabreicht wird.

6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das antineoplastische Mittel ein Vinca-Alkohol ist.

7. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das antineoplastische Mittel Vincristin, Mitozantron, cis-Platin, Methotrexat, Adriamycin, Daunomycin oder Cyclophosphamid ist.

8. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das antineoplastische Mittel Vincristin ist.

9. Verwendung der Ansprüche 1 bis 8, wobei der neurotoxische Effekt im Verlust des Sehnenreflexes, in Parästhesie, Muskelschmerz, Muskelschwäche, Konstipation oder Bauchschmerz besteht.