DK165621B - Anvendelse af gangliosidderivater til fremstilling af et farmaceutisk praeparat til forebyggelse af toxiske virkninger af antineoplastiske midler - Google Patents

Description

i

DK 165621 B

Den foreliggende opfindelse angår et specifikt præparat, som omfatter en blanding af gangliosider og dens enkelte fraktioner, som har vist ·*, sig at have beskyttende virkning mod neurotoxicitet, som er forårsaget af antiblastiske midler.

5 Gangliosider repræsenterer en familie af complexe glycolipidmoleky-ler, naturlige bestanddele af cellemembraner og især af de neuronale membraner, som er involveret i udviklings-, differentierings- og neuronal regenereringsprocesserne.

Exogene gangliosider inkorporeres i de neuronale membraner på en 10 stabil måde (G. Toffano et al., J. Neurochea., 35 (4), 1980, s. 861-866; F. Aporti et al., Acta Oto-Laryingologica, 92, 1981, s. 433-437). Denne inkorporering er associeret med aktiveringen af et enzymatisk membransystem, (Na+, K+)ATPase, hvis aktivitet er essentiel for nerveimpulsledning. Enzymatisk inkorporering og aktivering er 15 demonstreret både in vitro (A. Leon et al., J. Neurochem, 37 (2), 1981, s. 350-357) og in vivo (F. Aporti et al., 1981).

Gangliosider er sure glycolipider, som tilhører familien af biologiske forbindelser, som er kendt som glycosphingolipider. Disse omfatter fire grundstrukturelle enheder: Én lang aminoalkoholkæde, én 20 fedtsyre, én oligosaccharidfraktion og én eller flere sialsyrerester.

Den lange aminoalkoholkæde, som er til stede i cerebrale gangliosider, er identificeret som 4-sphingenin og dens længste kædeanalog som 4-eicosasphingenin. Disse forbindelser kendes sædvanligvis som sphin-gosiner.

CH20H

H-C-NH2

H-C-OH

25 1 n - 12 4-sphingenin

C

✓ A n - 14 2-eicosasphingenin H \/

C

J

(CH2)n “ CH3 Sphingosiners struktur

DK 165621 B

2

De tilsvarende mættede forbindelser (sphinganiner) er også til stede i gangliosider i mindre forhold.

En fedtsyre er bundet ved en amidbinding til den grundlæggende sphin-gosin. Denne fedtsyre er 95% stearinsyre (18:0) i cerebrale ganglio-5 sider. Andre fedtsyrer findes i mindre forhold, fx arachidinsyre (20:0), palmitinsyre (16:0) eller palmitoleinsyre (16:19). Aminoalko-holen og fedtsyren danner sammen en enhed, som kaldes et ceramid, som repræsenterer den hydrofobe del af gangliosidmolekylet.

Oligosaccharidkæden, som er bundet til ceramidet, kendetegner den 10 omfattende familie af glycosphingolipider, hvortil gangliosideme hører. Sphingolipider klassificeres i to undergrupper, som er baseret på carbonhydrater, som umiddelbart er bundet til ceramidet. Den første og mindste undergruppe stammer fra galactosylceramid. De fleste glycosphingolipider, og derfor praktisk talt alle gangliosi-15 der, tilhører undergruppen, som stammer fra glycosylceramid.

Sialsyre er hovedsageligt til stede i N-acetylform, i cerebrale gangliosider, men N-glycolylformen er identificeret i nogle gangliosidar-ter. Denne rest kendes sædvanligvis som neuraminsyre (NANA eller NGNA).

COOH

c=o

I L OH

^h2 CH3CONH

HCOH HO

CH3CONHCH ^°0H

I HO "Vs CH2OH

HOCH

HCOH

HCOH

CH20H

20 N-acetylneuraminsyre; åben kæde og hemiketalring.

v

DK 165621 B

3

Gangliosiders hydrofilicitet skyldes oligosaccharidkæden og antallet af sialsyrerester, som er bundet til denne kæde.

Fordeling af gangliosider:

Den højeste koncentration af gangliosider findes i den cerebrale grå 5 substans, som indeholder ca. 2,5 mikromol NANA pr. g våd substans (ca. 0,4% af den tørre vægt, 0,6% af totale lipider) (R. Ledeen, K.

Salsmar, M. Cabrera, J. Lipid Res., 9, 1968, s. 129). Ca. 90% af det totale gangliosidindhold fra mammale hjerner dannes af de fire gangliosider med en identisk oligosaccharidsekvens:

Ga 1 3) GalNAc^ 1 -» 4) Ga l(^ 1 4) Glc(£ l-*l) Cer 10 Det meste af de resterende 10% af det mammale cerebrale gangliosid-indhold omfatter manglende gangliosider ved den terminale galactose eller ved galactosyl-N-acetylgalactosamineriheden (L. Svennerholm, S.

Mansson, Y. Li, J. Biol Cheat., 248, 1973, s. 740).

Gangliosiders struktur og nomenklatur: 15 Cerebrale gangliosider blev isoleret og renfremstillet ved chromato-grafiske procedurer. Først blev G^-gangliosids struktur bestemt.

Denne struktur blev vist at være ens for de fire væsentligste gangliosider, som er til stede i den mammale hjerne. Den nedenfor illustrerede struktur refererer til G^ og anføres som et eksempel. Tabel 20 1 indeholder beskrivelser af de fire væsentligste mammale hjernegang- liosider.

DK 165621 B

4

Monosial-gangliosid GMl's struktur

M CHjOH OH CH2OH

» yr co2« »V^r° >

»•oxK CH2OH Hc-OH

N-Tetraose Gål-GalNac-Gal-Gic-^ph-fedtsyre NANA ceramid 5 Tabel 1

De fire væsentligste mammale hjernegangliosiders strukturer

Symbol iflg. Forkortelser ifølge R R'

S vennerholm* IUPAC-IUB

10 GM^ II3 -NeuAc-GgOse^Cer Η H

GD^a II3 -NeuAc-IV3- -NeuAc-GgOse^Cer NANA H

GDj^ II3 - (NeuAc) 2Gg0se^Cer H NANA

GT^ II3 -(NeuAc)2-IV3- -NeuAc-GgOse^-

Cer NANA NANA

15 * (L. Svennerholm, 1963, J. Neurochem, 10, s. 613).

Et formål med den foreliggende opfindelse er derfor at tilvejebringe et præparat til forebyggelse af neurotoxicitet, som forårsages af antitumormidler, med særlig reference til vincaalkaloiderne, hvilket

DK 165621 B

5 præparat er en blanding af gangliosider bestående af GM^, GD^a, GD^ og i det følgende forhold, som er udtrykt i %: GMjl - 21% GD. - 40% la 5 GD., 16%

ID

GT.v - 19% lb

Et andet formål med den foreliggende opfindelse er at tilvejebringe et farmaceutisk præparat, som indeholder en blanding af gangliosider og deres enkelte fraktioner, som har en beskyttende virkning mod 10 neurotoxicitet, som er forårsaget af antitumormidler med særlig reference til alkaloide antiblastiske midler fra vincaserien. Dette betyder især en blanding af gangliosiderne GM^, GD^, GD^ og GT^ med den ovenfor nævnte procentvise sammensætning.

Dette præparat besidder en beskyttende virkning mod toxicitet, som er 15 forårsaget af antiblastiske midler, og det er anvendeligt ved helbredelse og lindring af de toxiske bivirkninger fra antitumorterapi med kemiske stoffer.

Et yderligere formål med den foreliggende opfindelse er at tilvejebringe et medikament, som er anvendeligt i profylaksen af generelle 20 toxiske virkninger eller kroniske neurotoxiske virkninger, som er forårsaget af administration af antineoplatiske midler.

Den foreliggende opfindelse angår også anvendelsen af en ganglio-sidblanding, især en blanding af gangliosider GM^, GD^, GD^ og GTlb, til fremstilling af et medikament til forebyggelse eller til 25 profylaktisk behandling af generelle toxiske virkninger eller kroniske neurotoxiske virkninger, som er forårsaget af den efterfølgende administration af antineoplastiske midler.

Som tidligere beskrevet repræsenterer gangliosider en familie af complexe glycolipidmolekyler, som er naturlige bestanddele af celle-30 membraner. Forudsat, at gangliosider hovedsagelig er associeret med neuronale membraner, er det blevet foreslået (Fishman og coll.,

Science, 194, 1976, s. 906-915), at de kan spille en rolle i informa-

DK 165621 B

6 tionsoverførslen gennem disse membraner. Understøtning af denne hypotese kommer fra en række observationer af begivenheder, som formidles af cellemembranerne, hvori disse molekyler er involveret og som inkluderer: neuronal udvikling (W. Dimpfel og coll.; I "Ganglio-5 sides in Neurological and Neuromuscular Function, Development and Repair", Rapport and Gorio, Raven Press, 1981, s. 119-134), differentiering (A. Leon og coll.; I "Membranes in Growth & Development", Hoffmann og coll., 1981, s. 311-320) og regenerering (A. Gorio og coll., 1981a: I "Gangliosides in Neurological and Neuromuscular 10 Function, Development and Repair", Rapport og Gorio, Raven Press, s. 177-195).

En blanding af gangliosiderne GM^, GD^, GD^ og GT^, som er ren-fremstillet til parenteral brug, har vist sig at være aktiv i stimulering af reinnervation, som er forårsaget af forøget neuronal vækst 15 (A. Gorio og coll., Brain Res., 197, 1980, s. 236-241). Aktiviteten, som fremmer nerveneuronal vækst, er blevet bekræftet både i modeller af neuronal vævskultur in vitro (F.J. Roisen og coll., Science, 214, 1981, s. 577-578; J.J. Hauw og coll., Neurophysiologie, 1981; C.R. -Acad, Sc. Paris, 292 (8), s. 569-571) og i modeller af dyre-denerva-20 tion in vivo (Gorio og coil., "Brain Res., 197, s. 236-241; A. Gorio og coll., 1981: I "Nervous system regeneration. Birth Defects; original article series", 19 (4), 1983, s. 157-174, B. Haber og coll).

Dyremodellerne in vivo (denervation af rotte hurtig twitchmuskel ved knusning af nervus ischiadicus, delvis denervation af rotte musculus 25 soleus ved resektion og dislokation af nerveroden L5) gav både elektrofysiologisk og morfologisk tegn på øget kollateral nervevækst efter behandling med exogene gangliosider (5-50 mg/kg/dag til paren-terale injektioner), hvilket resulterede i hurtigere funktionel restitution.

30 Funktionel elektrofysiologisk tegn på hurtigere helbredelse af den læderede nerve, som skyldtes behandling med gangliosider, er blevet demonstreret i forskellige dyremodeller, herunder sensorisk nerve-funktion efter overskæring af nerven (F. Norido og coll., Experien-tia, 37, 1981, s. 301-302); nedsættelse af cocleær funktion efter 35 støj (F. Aporti og coll., Nuovo Arch. Otol. Rinol. Laringol., 5 (1), 7

DK 165621 B

1977, s. 25-32), diabetisk neuropati hos genetisk diabetiske mus (F.

Norido et coll., Muscle & Nerve, 5, 1982, s. 107-110), neurotoxinfor-giftning (F. Aporti og coll., Acta Otolaryngologica, 92, 1981, s.

433-437; M. Maroni og coll., Clinical Toxicology, 18 (12), 1981, s.

5 1475-1484).

På basis af disse eksperimentelle data betragtes blandingen af gang-liosiderne GM^, GD^a, GD^ og GT^ som terapeutisk anvendelig inden for et bredt område af sygdomme, som påvirker det perifere nervesystem, hvor reinnervation kan stimuleres og fremskyndes.

10 Denne gangliosidblanding har yderligere vist sig at være anvendelig på grund af dens beskyttende virkning mod neurotoxicitet, som forårsages af antiblastiske midler generelt, med særlig reference til alkaloiderne, som er afledt fra vincaserien. Dette resultat viser formålet med den foreliggende opfindelse.

15 Introducerende information om gangliosider og det onkogene fænomen

Som diskuteret ovenfor er gangliosider allestedsnærværende membrankomponenter, hvoraf flertallet er til stede i den ydre del af plasmamembranens lipidlag (R. Ledeen, TINS, 8, 1984, s. 169-174).

Det er velkendt fra litteraturen, at gangliosider er involveret i 20 reguleringsfænomener og cellulær genkendelse; det er derfor sandsyn-liggjort, at de spiller en rolle i udvikling og cellulær differentiering. Det vides yderligere, at det onkogene fænomen er associeret med vigtige ændringer i celleoverfladens glycosphingolipider (inklusiv således gangliosider). På dette grundlag er det blevet postu-25 leret, at gangliosider kan spille en rolle (som endnu ikke er veldefineret) i vækstregulering, differentiering og celleinteraktion (S. Hakomori, Ann. Rev. Biochem., 50, 1981, s. 733-764).

I embryonal og histogen udvikling og differentiering medieres de cellulære interaktioner ved en kontinuerlig ændring af celleoverfla-30 demolekylerne, som kodes af et genetisk program. Under denne proces opstår der bemærkelsesværdige faseafhængige ændringer i celleover-fladegangliosidindholdet og -complexiteten.

»

DK 165621 B

8

Eksempler på dette fænomen er: a) Ekspression af bindingssteder i CNS for tetanustoxin (A.

-4»

Koulakoff et al., Develop. Biol., 100, 1983, s. 350-357) og koleratoxin (M. Willinger og M. Schachner, Develop. Biol., 74, 5 1980, s. 101-117) opstår kun på postmitotiske neuroner; b) De udifferentierede celler i tarmepitelet er kendetegnet ved tilstedeværelse af Lac-Cer, Glu-Cer og fravær af GM3, medens de differentierede celler er kendetegnet ved høj koncentration af GM3 (R. Ledeen, TINS, 8, 1984, s. 169-174); 10 c) Der er en bemærkelsesværdig forøgelse af GM^, når de amyloide celler induceres til differentiering i makrofager (R. Ledeen, TINS, 8, 1984, s. 169-174).

Disse og andre eksempler, som ikke er nævnt her, såsom gangliosid-modifikationer ved celle-celle-kontakt antyder, at ekspression af 15 specifikke gangliosider på celleoverfladen er korreleret til ændringen af celleprogrammer fra det proliferative til det ikke-prolifera-tive stadium (A. Koulakoff et al., Develop. Biol., 100, 1983, s. 350-357). Deres ekspression kan yderligere definere celle-celle-inter-aktion, cellemigration og celledifferentiering.

20 Støtte for dette sidste stammer fra in vifcro-forsøg, som er udført ved tilsætning af exogene gangliosider til prolifererende (fx 3T3, neuroblastom, gliom, etc.) eller non-prolifererende celler (fx primære neuroner) i kultur. I alle tilfælde forøger de exogent tilsatte gangliosider celledifferentieringen. I tilfældet af prolifererende 25 celler er denne virkning associeret med nedsat proliferation (se nedenfor) (B. Haber og A. Gorio, red., J. Neurosci. Res., 1984).

Gangliosiders mulige rolle i reguleringen af cellevækst er blevet foreslået som følger: a) Syntese af specifikke gangliosider er stærkt forøget i associ- 30 ation med "kontaktinhibering" af cellevækst (R. Ledeen, TINS, 8, 1984, s. 169-174), b) Gangliosidsyntese øges, når cellevækst standses eller indu-

DK 165621 B

9 ceres i transformerede celler ved differentierende midler (R.

Ledeen, TINS, 8, 1984, s. 169-174), c) Exogen tilsætning af gangliosider, inklusiv GMj_, som inkorporeres i plasmamembraner, inhiberer cellevækst og inducerer 5 kontaktirihibering. Denne virkning er observeret i et antal cellelinjer (dvs. 3T3, neuroblastom, gliom) (B. Haber og A.

Gorio, red. J. Neurosci., Res., 1984; R. Ledeen et al., red.,

Adv. Exper. Med. and Biol., 174, 1984).

Som følge deraf øges gangliosidsyntese, når proliferationen standses.

10 Yderligere er exogen gangliosidsupplering i stand til at standse eller forsinke celleproliferation. Det er værd at bemærke, at denne sidste virkning ikke på nogen måde er associeret med cytotoxicitet.

Ændringer i gangliosidmønstre på celleoverfladen er observeret i forskellige typer tumorceller og som et specifikt respons på for-15 skellige transformerende carcinogene midler og kan derfor betragtes som et almindeligt fænomen, som sædvanligvis er associeret med transformering (S. Hakomori, Biochem. Biophys. Acta, 417, 1975, s. 55-89.

Under onkogen transformering opstår tre kategorier af ændringer i det væsentlige i celleoverfladeglycolipider, herunder gangliosider: 20 ufuldstændig syntese, neosyntese og organisatorisk membranrearran-gementer af glycolipidmolekylerne (S. Hakomori, TIBS, 10, 1984, s.

453-458). Både forstadiet, som akkumulerer på grund af ufuldstændig syntese, og neoglycolipidet, som dannes ved neosyntese (sædvanligvis mindre glycolipider eller gangliosider), formodes at være en "tu-25 morassocieret" antigen-ekspression, når det ikke kan påvises på stamcellens overflade. Disse tumorassocierede antigener er yderligere til tider kendetegnet ved at have en usædvanlig ceramidsammensætning.

Basisinformation om associationen mellem gangliosider-vincristin (VCR) og behandlingen af tumorsygdomme.

30 Vineristin er et bredt anvendt antineoplastisk middel, og det anvendes med held i behandlingen af leukæmi, lymfom og generelt i fremskredne stadier af cancer (J.F. Holland et al, Cancer Res., 33, 1983, s. 1258-1264). Den væsentligste ulempe ved udstrakt anvendelse af

DK 165621 B

10 vineristin ved de forskellige tumorpatologier er dets høje toxici-tetsgrad, og i særdeleshed er én af de vigtigste bivirkninger indtræden af symptomer på perifer og autonom neurotoxicitet.

-k

Neuropatien viser sig typisk som tab af senereflekser, paræstesier, 5 muskelsmerte og svaghed, forstoppelse og mavesmerter. Denne neurotoxicitet medfører alvorlige begrænsninger i anvendelsen af doserne og administreringer, som er nødvendige for at helbrede tumorpatologier, og dette medfører ofte ophør af administration af lægemidlet (A.M. Arnold et al., The Lancet, 9. februar 1985).

10 Vincaalkaloidernes antimitotiske virkningsmekanisme består af en forstyrrelse af mikrotubulussamlingen i det mitotiske spindelapparat.

Denne mikrotubulussplittende virkning formodes også at være ansvarlig for morfologiske ændringer af axoner og neuroner hos forsøgsdyr, som viser fokale axonale opsvulmninger, opløste neurofilamentakkumulerin-15 ger (E.S. Cho et al., Arch. Toxicol., 52, 1983, s. 83-90) og mikrotu-bulære krystalloide inklusioner i neuroner (M. Sato, K. Miyoshi, Acta Neuropathol., 63, 1984, s. 150-159). Fra et elektrofysiologisk synspunkt indikerede undersøgelserne i mennesket, udført af McLeod og Penny (J. Neurol. Neurosurg. Psychiat, 32, 1969, s. 297-304) og 20 Guiheneuc et al. (J.Neurol. Sci., 4-5, 1980, s. 355-366), at VCR-induceret neuropati var af en ,,dying-back"-type, som involverede distal, retrograd axonal degenerering. Disse distale degenererings-processer medfører delvis denervation af målmusklen. I denne situation synes reparative sekvenser i form af kollaterale spirefænomener 25 ("sprouting") på levedygtige axoner at repræsentere organismens forsøg på at reinnervere målcellerne, som var forladt af de indskrumpede axoner (M.C. Brown et al., Ann. Rev. Neurose!., 4, 1981, s.

14-42).

McLeod og Penny (1969) påviste, at efter afbrydelse af VCR-terapi 30 genvinder disse fysiologiske reparationsprocesser effektivitet og tillader hurtig regenerering af nervefibrene. På den anden side vides det, at parenteral administration af gangliosidblanding af GM^, GDia, GDlb °g GTlb (CRONASSIAL®) til forsøgsdyr stimulerer reparationsprocesser i den perifere nerve ved en mekanisme, som er baseret på 35 facilitering af nervespiring (A. Gorio et al., Brain Res., 197, 1980,

DK 165621 B

11 s. 236-241). Den omfattende kliniske' forskning har vist, at lægemidlet Cronassial® er terapeutisk tilrådeligt ved en lang række af perifere nervesystemsygdomme, hvor stimulering af reparativ inner- Λ vation repræsenterer en klinisk fordel. Sådanne perifere neuropatier 5 omfatter nogle toxiske former såsom iatrogene neuropatier, som er forårsaget af vincaalkaloider, som anvendes i behandlingen af neopla-sier.

Inden for det specielle område af vineristininduceret neuropati beskrev Dantona et al. (Rivista Scientifica ed Educazione Permanente, 10 (suppl. 9), 1978, s. 155-158) en serie på 40 patienter med akut neurotoxisk syndrom induceret af vineristin. Disse patienter modtog 20 mg Cronassial® dagligt i 20 dage efterfulgt af 10 mg dagligt i mere end 10 dage. Patienterne blev regelmæssigt interviewet med særlig opmærksomhed på deres symptomer, og 57,5% af patienterne 15 rapporterede en signifikant grad af subjektiv bedring. Især paræs-tesisymptomet påvistes at aftage så tidligt som fjerdedagen efter terapistart. Dette ukontrollerede prøveforsøg blev efterfulgt af et kontrolleret forsøg med et mindre patientantal.

Azzoni (Il Policlinico, Sez. Medica, 85 (4), 1978, s. 255-262) under-20 søgte 7 Cronassial®-behandlede patienter mod 7 ubehandlede sammenlignelige patienter parallelt. De behandlede patienter modtog 20 mg Cronassial® intramuskulært dagligt i 4-6 uger samtidig med vineris-tin-administration på grund af tilgrundliggende neoplastisk sygdom. Behandlingseffekten vurderedes ved symptom-måling af fire væsentlige 25 neurologiske ændringer: paræstesie, ankeltrækningsarefleksi, fodens kraft ved dorsal flektion og tarmdysfunktion. Symptom-målinger efter behandlingscyklus blev analyseret ved hjælp af "Armitage sequential analysis" på grund af det lille patientantal. Denne analyse viste, at Cronassial®-terapi med det forsøgte doseringsniveau var effektiv til 30 at forhindre fremkomsten af moderate neurotoxiske symptomer (paræs-tesier og tab af ankeltrækningsrefleks).

Eksperimentelle undersøgelser ifølge den foreliggende opfindelse

For at udelukke mulighederne for en fysisk-kemisk eller biologisk interaktion mellem gangliosiderne, som indeholdes i Cronassial® og

DK 165621 B

12 vineristin, og for at undersøge muligheden for, at vineristins anti-tumorale virkning kan svækkes ved samtidig administration af Cron-assial®, udførtes forskellige dyreforsøg med samtidig administration af vineristin og gangliosider, med særligt henblik på: 5 1. akut og kronisk toxicitet 2. antitumoral virkning.

1. Gangliosiders virkning på akut vincristintoxicitet Materiale og metoder

Dyr: Mus blev opdelt i grupper på maksimum 8 i standardbure. Føde og 10 vand tilførtes ad libitum. Dyrene blev opbevaret i rum under strengt kontrollerede betingelser.

Lægemidler: 1 mg vineristin blev fortyndet for at opnå den nødvendige koncentration til injektion af 0,1 ml/10 g legemsvægt.

15 En gangliosidopløsning blev fremstillet ved tilsætning af sterilt destilleret vand i en mængde, som var tilstrækkelig til at opnå en slutkoncentration på 200 mg/kg i et volumen på 0,2 ml. Denne dosis blev administreret til mus, som vejede ca. 20 g.

20 Resultater

Resultaterne er anført i tabel 2, hvoraf det ses, at gangliosidblandingen ikke beskytter mod akut toxicitet fra enkelt intravenøs dosis vineristin.

DK 165621 B

13 TABEL 2

Akut lethalitet af vineristin og vineristin + gangliosider i mus

Formål: Reduktion af antitumorale lægemidlers toxicitet

Dosis, Rute/tid Antal over- % Overlev- 5 mg/kg levende efter ende efter 30 dage 30 dage

Vineristin 3,0 intravenøst 2/8 25

Vincristin+ 3,0 intravenøst 10 gangliosider 200 intraperitonealt 6 timer 1/8 12,5

før VCR

2. Gangliosidbehandlingens virkning på kronisk vincristintoxicitet 15 Materialer og metoder

Hanmus CD-I (ICR) BR (Charles River, Italien), som vejede 25-30 g, blev anvendt under hele forsøget. Dyrene blev opbevaret i grupper på 10 pr. bur og fodret med standardlaboratoriemad og ledningsvand ad libitum. Dyrene blev opbevaret ved konstant stuetemperatur (21°C ± 20 1°C) og relativ fugtighed (60%) med kontrollerede perioder af lys/- mørke (lys fra kl. 8.00 til 20.00).

Vincristinsulfat (Lilly) blev opløst i saltvand og injiceret intravenøst med et dosisvolumen på 10 ml/kg, mens gangliosiderne blev opløst i en phosphatbuffer (0,01M, pH 7,5), som indeholdt 0,8% NaCl, og blev 25 administreret intramuskulært med et dosisvolumen på 5 ml/kg.

Forbehandling med gangliosider:

Gangliosidblanding (eller bærer) blev administreret intramuskulært dagligt i 5 efter hinanden følgende dage med forskellige doser (50, 100 og 200 mg/kg), og vineristin injiceredes intravenøst i 5 timer

DK 165621 B

14 efter den sidste behandling med gangliosider (eller bærer) med doser på 2,4 og 2,6 mg/kg.

Efterbehandling med gangliosider:

Gangliosidblanding (eller bærer) blev administreret intramuskulært i 5 doser på 200 mg/kg 5 timer før intravenøs behandling med vineristin i 5 på hinanden følgende dage.

Vincristindosis var på 2,2, 2,4 og 2,6 mg/kg.

Mortalitetsraten blev estimeret ved antallet af dyr, som døde inden for de første 14 dage af vineristinbehandling.

10 Den statistiske signifikans mellem mortalitetsraterne blev beregnet ved hjælp af Fischer's eksakte sandsynlighedstest.

Resultater

Resultaterne af forsøgene er anført i tabel 3 og 4 og grafisk afbildet i fig. 1. På basis af mortalitetsratekurven efter administra-15 tion af vineristin valgtes doser mellem 2 og 3 mg/kg til undersøgelsen med gangliosider. Det første forsøg sammenlignede virkningerne af gangliosidbehandling før og efter vineristininjektion.

I tilfældet af efterbehandling blev en enkelt administration af gangliosider givet for at udelukke muligheden for, at den større effekti-20 vitet af forbehandling med gangliosider til at reducere vineristin-toxicitet muligvis kun skyldtes den sidste gangliosidinjektion.

Som vist i fig. 1 observeredes en reduktion af vincristintoxicitet, når ganglios idblandingen blev administreret subkronisk før, men ikke efter vineristininjektion. Denne effekt blev opnået ved at anvende 25 maksimumdosis af gangliosider (200 mg/kg). Når mindre doser af gang-liosidblandingen blev administreret, var det muligt at notere en dosisafhængig effekt af gangliosiders beskyttende virkning (tabel 3) med undtagelse af den abnorme mortalitetsrate for gruppen, som var behandlet med gangliosider 100 mg/kg og vineristin 2,6 mg/kg.

DK 165621 B

15

Yderligere forsøg udførtes med doser på 200 mg/kg gangliosider. De relative data kan ses i tabel 4.

TABEL 3

Subkronisk forbehandlingseffekt med forskellige doser af gangliosider på 5 akut lethal vincristin(VCR)-toxicitet

Behandling Mortali tetsrate Bærer + VCR 2,4 mg/kg, i.v. 7/10 10 Gangliosider 50 mg/kg, i.m. + VCR 2,4 mg/kg, i.v. 2/10

Gangliosider 100 mg/kg, i.m. + VCR 2,4 mg/kg, i.v. 1/10

Gangliosider 200 mg/kg> i.m. + VCR 2,4 mg/kg, i.v. 0/10 Bærer + VCR 2,6 mg/kg, i.v. 5/10

Gangliosider 50 mg/kg, i.m. + VCR 2,6 mg/kg, i.v. 4/10 15 Gangliosider 100 mg/kg, i.m. + VCR 2,6 mg/kg, i.v. 9/10

Gangliosider 200 mg/kg, i.m. + VCR 2,6 mg/kg, i.v. 2/10 i.m. - intramuskulært i.v. - intravenøst 20 TABEL 4

Subkronisk forbehandlingseffekt af gangliosider (200 mg/kg, intra-muskulært) på akut lethal vineristin(VCR)-toxicitet.

Behandling Mortalitetsrate antal % 25 _

Subkronisk bærer + VCR 2,4 mg/kg, i.v. 19/50 38

Subkroniske gangliosider + VCR 2,4 mg/kg, i.v. 3/50* 6

Subkronisk bærer + VCR 2,6 mg/kg, i.v. 30/5060

Subkroniske gangliosider + VCR 2,6 mg/kg, i.v. 17/50* 34 30 _ *P <0,01 mod passende kontroller (Fischer's eksakte sandsynligheds- test) i.v. - intravenøst

Vineristins antitumorvirkning associeret med gangliosider

DK 165621 B

16

Materialer og metoder:

De følgende stammer blev anvendt til de forskellige tumorer: <4.

Han-Swiss-Schneider-mus, som vejede 27 g, blev anvendt til forsøgene med sarcoma S180.

5 - Hun-C^Bl-mus, som vejede 20 g, blev anvendt til forsøg med melanoma B16.

Han-BDF^-mus, som vejede 30 g, blev anvendt til forsøg med leukæmi L1210.

C^yBl-Mus, som vejede 20 g, blev anvendt til forsøg med Lewis 10 lungetumor.

Tumorer:

Sarcoma S180: Denne tumor er blevet transplanteret i den samme musestamme i ansøgernes laboratorium i mere end 10 år. Transplantationen blev udført ved subcutan inokulering af 0,1 ml tumorhomogenat, 15 som var udvundet fra fintskåret levende tumorvæv og passeret gentagne gange gennem en 26 gauge-nål til en steril petriskål. 0,1 ml penicillin (20.000 U/ml) og streptomycin (20.000 U/ml) blev sat til opløsningen. 5 mg neomycin blev også tilsat.

Melanom B16: Denne tumor blev fremstillet ved inokulering på samme 20 måde som beskrevet for sarcoma S180.

L1210: Milte blev fjernet fra dyrene 7 dage efter inokulering af L1210-celler og blev derefter fintskåret i isotonisk saltvand 1:100.

0,1 ml miltsuspension og leukæmi L1210-cellesuspension blev derefter injiceret subcutant i flanken på hver BDF^-mus.

25 Lewis-lunge tumor (3LL) : Denne tumor blev fremstillet ved inokulering på samme måde som beskrevet for sarcoma S180.

Lægemidler:

Vineristin: Et standardhætteglas, som indeholder 1 mg vineristin, blev anvendt. Det var fremstillet med et passende volumen fortyn

DK 165621 B

17 dingsopløsning for at give slutkoncentrationen, som var nødvendig til injektion af 0,1 ml/10 g legemsvagt.

Cronassial: En opløsning af dette stof, som er en blanding af fire gangliosider, blev fremstillet ved at tilsatte et volumen sterilt 5 destilleret vand, som var tilstrækkeligt til at give en koncentration på 200 mg/kg i en volumen på 0,2 ml. Denne dosis blev administreret til mus, som vejede ca. 20 g.

Resultater

Resultaterne for disse undersøgelser er anført i tabel 5.

10 TABEL 5

Antitumorvirkning med og uden CRONASSIAL

Tumor Vært Læge- Dosis Dage Rute Tid, Middeltu- middel mg/kg timer morvægt, g 15 S180 SN VCR 0,5 1-6 i.p. 0,64 S180 SN VCR ) 0,5 1-6 i.p.

CRON ) 200 1-6 i.p. 6, før 0,69

VCR

S180 SN kontrol- 20 ler CMC 1,05 B16 C57B1 VCR οΤδ 1-4, 7-11 i.p. 1746 B16 C57B1 VCR ) 0,5 1-4, 7-11 i.p.

CRON ) 200 1-4, 7-11 i.p. 6, før 25 VCR 1,66 B16 C57B1 kontroller CMC 2,33

Middel over- 30 levelsestid (dage) L1210 BDF1 VCR 1,0 1-3 i.p. 7,8 L1210 BDF1 VCR ) 1,0 1-3 i.p.

CRON ) 200 1-3 i.p. 6, før 35 VCR 10,3 L1210 BDF1 kontroller CMC 8,0

DK 165621 B

18

Vineristin med og uden Cronassial, som blev testet i tumorerne S180, B16 og L1210, viste, at Cronassial ikke påvirker vineristins antitumorvirkning som vist ved inhibering af tumorvækst og ved den gennem- ' «i.

snitlige overlevelsestid.

5 Modsat dette viste resultaterne, som var opnået med leukæmi L1210, at mortaliteten, som var forårsaget af vineristins toxicitet alene, kunne reduceres (hvis vineristin blev administreret sammen med Cronassial) , og at vineristins effektivitet mod L1210 blev forstærket med en gennemsnitlig overlevelsestid på 10,3 dage sammenlignet med 10 7,8 dage for vineristin alene. Denne forskel er statistisk signifi kant.

Farmaceutisk præparat

Til den hidtil ukendte terapeutiske anvendelse ifølge den foreliggende opfindelse skulle gangliosidformuleringen indeholde de individuel-15 le gangliosider i de følgende forhold:

Individuelle gangliosider Vægtprocent - <% 19-23 - GDla 36-44 - GDlb 14-18 20 - GTib 17-21 I en særlig foretrukket formulering er de individuelle gangliosider kombineret i de følgende vægtforhold: GMj^ - 21% GD, - 40% la 25 GD., - 16% lb GT., - 19% lb

For at fremstille et farmaceutisk præparat ifølge den foreliggende opfindelse bør formuleringen fortrinsvis indeholde en titer af totale gangliosider (GMj+GD^a+GD^b+GT^b) på 95,0% (udregnet på basis af tør 30 vægt). Præparaterne kan være opløsninger af gangliosidforbindelser eller frysetørrede pulvere af forbindelsen associeret med én eller

DK 165621 B

19 flere farmaceutisk acceptable bærere eller fortyndingsmidler, som indeholder et phosphatmedium med en passende pH og isosmotisk med fysiologiske væsker. Hver dosis af præparatet bør indeholde mellem 10 ·< og 100 mg af gangliosidblandingen.

5 Den bestemte dosis afhænger af den ønskede virkning og administrationsruten. Fx kan dosis være mellem 1,43 og 0,143 mg af den aktive forbindelse pr. kg legemsvægt pr. dag med standarddosis på mellem 100 og 10 mg. Nogle mulige farmaceutiske præparater kan indeholde følgende: 10 Præparat nr. 1

Hvert 2 ml hætteglas indeholder: .Gangliosidblanding i forholdene: 100 mg GMi 21% GD, 40% la .15 GD., 16%

Ib GT., 19% lb phosphatbuffer, pH 7,6M/100 i apyrogent, sterilt, destilleret vand q.s.a. 2 ml

Præparat nr. 2 20 Hvert 2 ml hætteglas indeholder:

Gangliosidblanding i forholdene: 10 mg GMi 21% GD. 40% la GDlb 16% 25 GT,, 19% lb phosphatbuffer, pH 7.6M/100 i apyro gent, sterilt, destilleret vand q.s.a. 2 ml

DK 165621 B

20

Præparat nr. 3

Hvert 2 ml hætteglas indeholder:

Gangliosidblanding i forholdene: 25 mg GMil 21% 5 GD, 40% la GDlb 16% GTib 19% phosphatbuffer, pH 7,6M/100 i apyrogent, sterilt, destilleret vand q.s.a. 2 ml 10 Præparat nr. 4

Hvert frysetørret hætteglas indeholder:

Gangliosidblanding i forholdene: 75 mg GMj_ 21% GD. 40% la 15 GD,, 16%

Ib GTlb 19%

Et 2 ml hætteglas opløsningsmiddel indeholder: mannitol 25 mg phosphatbuffer, pH 7,6M/100 i 20 apyrogent, sterilt, destilleret vand q.s.a. 2 ml

Generelle konklusioner og anvendelser inden for terapi.

De opnåede resultater med forebyggelsen af kronisk vincristintoxici-tet ved samtidig administration af en gangliosidblanding var over-· raskende, eftersom det ikke er muligt at associere denne generelle 25 beskyttende virkning med den neuronale reparative virkning af gang-liosider alene, hvilket var observeret ved tidligere forskning. På basis af tidligere resultater, som var opnået med gangliosider, var det ganske vist antaget, at gangliosider kunne forhindre vincristin-neuropati og ikke neuropatier, som var forårsaget af kronisk toxici-30 tet af mere generel karakter.

DK 165621 B

21

De tre områder, som mest påvirkes af vineristin, er det hæmatologiske system, mave - tarmkanalen og nervesystemet. På den anden side er det vanskeligt at forklare gangliosiders beskyttende virkning, når dette kun betragtes som en effekt på det centrale eller autonome nervesy-5 stem, eftersom den af vineristin forårsagede mortalitet, som er målt i dyr, ikke kun kan skyldes dets virkninger på det perifere eller autonome nervesystem. Dette medfører derfor, at gangliosider virker ved hjælp af en virkningsmekanisme af mere generel art og forskellig fra mekanismer, som var antaget i tidligere undersøgelser.

10 Virkningen kunne ydermere reproduceres med andre antitumorlægemidler såsom mitozantron, cysplatin, methotrexat, adriamycin, daunomycin og cyclophosphamid, som medfører en høj grad af toxicitet både generelt og neuronalt. Det er vigtigt at bemærke, at gangliosider ikke negativt påvirker vineristins antituraorvirkning, og i tilfældet af eks-15 perimentel leukæmi syntes der at være positiv virkning af lægemidlet.

Med hensyn til anvendelse inden for terapien er det essentielt at observere, at: den exogene tilførsel af gangliosider til cellelinjer i transformation nedsætter eller forsinker celleproliferation og 20 favoriserer celledifferentiering, gangliosiders virkning ikke er cytotoxisk og er reversibel, gangliosiders antiproliferative virkning kan afhænge af celletypen og måske af den pågældende celles afhængighed af vækstfaktor til proliferation.

25 På den anden side inhiberer vineristin celleproliferation uafhængigt af celletypen og den pågældende vækstfaktor. Dets virkninger skyldes imidlertid dets cytotoxicitet mod både transformerede og ikke-trans-formerede prolifererende celler. Som sådan kan associationen af gang-liosid-VCR til tumorsygdomme betragtes som velbegrundet. Gangliosider 30 kan gøre det muligt at anvende mindre doser af VCR som antitumorlægemiddel og dermed mindske VCR's cytotoxiske effekt på de normale celler. På den anden side er det velkendt, at administration af antitumorlægemidler såsom VCR til patienter, som lider af tumorer, medfører alvorlige bivirkninger. Det er derfor meget ønskeligt at

Claims (10)

1. Anvendelse af en blanding af gangliosider GMj_, GD^, GD^ og GT^ til fremstilling af et farmaceutisk præparat til forebyggelse af 25 generelle toxiske virkninger eller kroniske neurotoxiske virkninger, som er forårsaget af administration af antineoplastiske midler.

2. Anvendelse ifølge krav 1, kendetegnet ved, at gangliosidblandingen indeholder mellem ca. 19 og 23% GM^, mellem ca. 36 og 44% GD^a, mellem ca. 14 og 18%

30 GD^ °g mellem ca. 17 og 21% GT^ baseret på vægt. DK 165621 B 23

3. Anvendelse ifølge krav 2, kendetegnet ved, at gangliosidblandingen indeholder ca. 21% GM^, ca. 40% GD^a, ca. 16% GD^ og ca. 19% GT^ baseret på vægt.

4. Anvendelse ifølge krav 2, 5 kendetegnet ved, at gangliosidblandingen indeholder ca. 23% GM^, ca. 40% GD^a, ca. 16% GD^ og ca. 19% GT^ baseret på vægt.

5. Anvendelse ifølge et hvilket som helst af kravene 1-4, kendetegnet ved, at det antineoplastiske middel er et vincaalkaloid.

6. Anvendelse ifølge et hvilket som helst af kravene 1-5, kendetegnet ved, at det antineoplastiske middel tilhører gruppen, som består af vineristin, mitozantron, cisplatin, metho-trexat, adriamycin, daunomycin og cyclophosphamid.

7. Anvendelse ifølge et hvilket som helst af kravene 1-5, 15 kendetegnet ved, at det antineoplastiske middel er vin-cristin.

8. Anvendelse ifølge et hvilket som helst af kravene 1-7, kendetegnet ved, at den neurotoxiske virkning omfatter tab af senereflekser, paræstesier, muskelsmerter, muskelsvaghed, for- 20 stoppelse eller mavesmerter.

9. Anvendelse ifølge et hvilket som helst af kravene 1-8, kendetegnet ved, at gangliosidblandingen er til subkronisk administration før behandling med de antineoplastiske midler.

10. Anvendelse ifølge et hvilket som helst af kravene 1-9, 25 kendetegnet ved, at gangliosidblandingen er til daglig administration i 5 efter hinanden følgende dage før behandling med de antineoplastiske midler.