LU86930A1 - Utilisation de gangliosides exogenes dens des maladies tumorales comme facteur de protection contre la toxite de medicaments antitumoraux - Google Patents

Description

%

UTILISATION DE GANGLIOSIDES EXOGENES DANS DES MALADIES TUMORALES COMME FACTEUR DE PROTECTION CONTRE LA TOXICITE DE MEDICAMENTS ANTITUMORAUX

5 La présente invention a pour objet une composition spécifique constituée dlun mélange de gangliosides et de ses fractions simples qui s'est révélé présenter un effet protecteur dans la neurotoxicité occasionnée par des antiblastiques. Les gangliosides représentent une famille de molécules 10 de glycolipides complexes, composants naturels de membranes cellulaires, et en particulier des membranes de neurone, impliquées dans les processus de développement, de différenciation et de régénération des neurones.

Des gangliosides exogènes sont incorporés dans les 15 membranes des neurones de façon stable (Toffano G. et coll.

(1980) : J. Neurochem. 35, (4), 861-866; Aporti F. et coll.

(1981) : Acta Oto-Laryingologica, 92, 433-347). Cette incorporation est associée à l'activation d'un système de membrane -f- + enzymatique, ATPase(Na ,K ) dont l'activité est essentielle a 20 la conduction de l'impulsion nerveuse. L'incorporation et l'activation enzymatiques ont été démontrées à la fois in vitro (Leon A. et coll. (1981): J. Neurochem. 37, (2), 350-537) et in vivo (Aporti F. et coll., 1981).

Les gangliosides sont des glycolipides acides apparte-25 nant à la famille des composés biologiques connus sous le nom de glycosphingolipides. Ceux-ci comprennent quatre motifs structurels de base: une longue chaîne amino-alcool, un acide gras, une fraction oligosaccharide et un ou plusieurs restes d’acide sialique.

30 2, * 2

La longue chaîne d'amino-alcool, présente dans les gan-gliosides cérébraux, est identifiée en tant que 4-sphingénine et sa chaîne analogue la plus longue en tant que 4-éicosa-sphingénine; ces composés sont communément désignés sous le 5 nom de sphingosines.

ch2oh H — C — NH_ I * H — C — OH n = 12 4-sphingénine f C n = 14 4-éicosasphingénine

10 H

H C

(rà2)n - CH3

Structure de sphingosines

Les composés saturés correspondants (sphinganines) sont 15 également présents dans les gangliosides en plus faibles proportions.

Un acide gras est lié par une liaison amidigue à la sphingosine de base. Dans les gangliosides cérébraux, cet acide gras est pour 95% de l'acide stéarique (18/0) . On ren-20 contre d'autres acides gras en plus faibles proportions, par exemple l'acide arachidique (20/0) , l'acide palmitique (16/0) Û ou l'acide palmitoléique (16/1 ). L*amino-alcool et l'acide gras forment ensemble un motif appelé céramide, qui représente la partie hydrophobe de la molécule de ganglioside.

25 La chaîne d'oligosaccharide liée au céramide caractérise la vaste famille des glycosphingolipides à laquelle appartiennent les gangliosides. Les sphingolipides sont classés en deux sous-groupes par rapport aux hydrates de carbone immédiatement liés au céramide. Le premier et le plus petit sous-groupe 30 dérive du galactosylcéramide. La plupart des glycosphingolipides, et donc pratiquement tous les gangliosides, appartiennent au sous-groupe dérivé du glycosylcéramide.

L'acide sialique est présent dans les gangliosides cérébraux principalement sous sa forme N-acétylée, mais la 35 forme N-glycolyle a été identifiée dans quelques espèces de gangliosides. Ce résidu est généralement connu sous le nom d'acide neuraminique (NANA ou NGNA).

» 3

COOH

«S CH3CCH 0H

HOCH i00H

HCOH ^

HCOH

ch2oh 10 Acide N-acétylneuraminique, chaîne ouverte et cycle d'hémicétal

Les propriétés hydrophiles des gangliosides sont dues à la chaîne d'oligosaccharide et au nombre de résidus sialiques liés à cette chaîne.

15 Distribution des gangliosides

La concentration la plus élevée en gangliosides se rencontre dans la matière grise cérébrale, qui contient environ 2,5 micromoles de NANA par gramme de matière humide (environ 0,4% du poids à sec, 0,6% du total des lipides) (Ledeen R., 20 Salsmar K., Cabrera M., J. Lipid. Res.: 9, 129, 1968). Environ 90% de la teneur totale en gangliosides du cerveau des mammifères est formée par les quatre gangliosides contenant une séquence d'oligosaccharide identique:

Gal (ß 1 + 3) GalNAc ( ß 1 + 4)Gal(ß 1 *· 4)Glc(ß 1 ·* l)Cer 25 La plupart des 10% restants du contenu des gangliosides cérébraux des mammifères comprennent les gangliosides manquants du motif galactose terminal ou du motif du galactosyl-N-acétyl-galactosamine (Svennerholm L., Mansson S., Li Y., J. Biol.

Chem. 248, 740, 1973).

30 Structure et nomenclature des gangliosides

Les gangliosides du cerveau sont isolés et purifiés par des modes opératoires chromatographiques. On détermine tout d'abord la structure du ganglioside Il est démontré que cette structure est commune aux quatre gangliosides majeurs 35 présents dans le cerveau des mammifères. La structure illustrée ci-dessous se réfère à celle décrite pour le G^ et elle est donnée à titre d'exemple. Le tableau 1 contient une description des quatre gangliosides majeurs du cerveau des 4 * mammifères.

STRUCTURE DU MONOSIALO GANGLIOSIDE GM1

OH CHjOH OH CTjOH

ch3-co-nh "‘vVo-V 0H VÖ-V°vu 0 »o co;h " rrr> ^

f 1 HC-HH

αοΛ^ ch2oh N-Tetr»os* C» 1 IKAe-G11-C1 c-^ph-F*ttyji^

Cer«*>i«le 15 Tableau 1 - Structures des quatre gangliosides majeurs du cerveau des mammifères ! · ! ! ! ! Symbole selon ! ! ! ! , _ . „ . , Abréviation selon la IUPAC-IUB R R' ! Svennerholm * ! j ! · 20 !_!_ ·_!_î ...

! GM ! II -NeuAc-GgOse Cer ! H ! H ! î 1 ï 4 lit ! GD ! II3 -NeuAc-IV3- -NeuAc-GgOse Cer ! ΝΑΜΑ ! H ! i la i 4 ...

! GD^ ! II - (NeuAc) ^GgOse^Cer ! H ! NANA ! 25 ! GT ! II3 -(NeuAc)„-IV3- -NeuAc-GgOse Cer NANA ! NANA ! ! f lD f 2 4 t ! f * (Svennerholm L., (1963): J. Neurochem. 10, 613).

Un but de la présente invention est donc de procurer une méthode de traitement et de soin de la neurotoxicité due aux 30 agents antitumoraux, en se référant particulièrement aux vinca alcaloïdes, produisant une composition qui soit un mélange de gangliosides composés de GM^, GDla, GD.^ et GT^^ dans le rapport en pourcentage suivant.

GM1 - 21% 35 GDla - 40% GDlb - 16% GTlb “ 19%

Un autre objet de la présente invention est de procurer a k 5 une composition pharmaceutique contenant un mélange de gan-gliosides et leurs fractions simples, présentant une activité de protection contre la neurotoxicité des agents antitumoraux en se référant, en particulier, aux alcaloïdes antiblastiques 5 des séries vinca. Ceci signifie en particulier un mélange des gangliosides GM^ GDla, GDlb et GTlb présentant la composition en % indiquée ci-dessus.

Cette composition-possède une activité protectrice contre la toxicité des antiblastiques, utile dans le soin et le soulage-10 ment des effets secondaires toxiques d'une thérapeutique antitumorale à l'aide de substances chimiques.

Un autre but de la présente invention est de procurer un médicament utile à la prophylaxie des effets toxiques généraux ou des effets neurotoxiques chroniques occasionnés par l'admi-15 nistration d'agents antinéoplasiques.

L'invention a également pour objet l'utilisation d'un mélange de gangliosides, notamment un mélange de gangliosides GM^, GDla, GD^k et ^Tib' Pr^Paration d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement prophylactique des 20 effets toxiques généraux ou des effets neurotoxiques chroniques occasionnés par l'administration ultérieure d'agents antinéoplasiques.

Comme on l'a décrit ci-dessus, les gangliosides représentent une famille de molécules de glycolipides complexes qui 25 sont des composants naturels des membranes cellulaires. Etant donné que les gangliosides sont principalement associés aux membranes des neurones, il a été suggéré (Fishman et coll. (1976): Science, 194, 906-915) qu'ils pouvaient jouer un rôle dans le transfert de l'information à travers ces membranes. A 30 l'appui ce cette hypothèse, toute une série d'observations sur des événements dans lesquels interviennent les membranes cellulaires et où ces molécules sont impliquées et qui comprennent le développement des neurones (Dimpfel W. et coll.: dans "Gangliosides in Neurological and Neuromuscular Function, 35 Development and Repair", Rapport and Gorio, Raven Press 119-131, 1981), la différenciation (Leon A. et coll.: dans "Membranes in Growth & Development", Hoffman et coll., 311-320, 1981) et 6 la régénération (Gorio A. et coll. (1981a): dans "Gangliosides in Neurological and Neuromuscular Function, Development and Repair", Rapport and Gorio, Raven Press, 177-195).

Un mélange des gangliosides GM^, GD^a, GD^ et GT^, 5 purifiés pour leur utilisation parentérale, s'est avéré actif dans la stimulation de la réinnervation due à une croissance accrue des neurones (Gorio A. et coll. (1980)î Brain. Res.

197, 236-241). L’.activité qui favorise la croissance nerveuse des neurones a été confirmée à la fois dans des modèles de 10 culture de tissu de neurones in vitro (Roisen F.J. et coll. (1981): Science, 214, 577-578; Hauw J.J. et coll. (1981): Neurophysiologie. C.R. Acad. Sc. Paris, 292, (8), 569-571) et dans des modèles de dénervation animale in vivo (Gorio et coll., "Brain Res. 197, 236-241; Gorio A. et coll. (1981); 15 dans "Nervous System régénération. Birth Defects; original article sériés", 19, (4), 157-174, (1983), Haber B. et coll.).

Les modèles animaux in vivo (dénervation du muscle de contraction rapide du rat par écrasement du nerf sciatique, dénervation partielle du muscle soléaire du rat par résection 20 et dislocation de la racine L5 du nerf) ont donné des preuves à la fois électrophysiologique et morphologique d'une croissance accrue du nerf collatéral après traitement à l'aide de gangliosides exogènes (5 à 50 mg/kg par jour par injections parentérales), conduisant à une récupération fonctionnelle 25 plus rapide.

Des preuves électrophysiologiques fonctionnelles d'une guérison plus rapide du nerf lésé, dues au traitement par des gangliosides, ont été fournies par divers modèles d'animaux, y compris celui du rétablissement d'une fonction nerveuse senso-30 rielle après coupe du nerf (Norido F. et coll. (1981): Experientia, 37, 301-302); une diminution de la fonction cochléaire à la suite d'un bruit (Aporti F. et coll. (1977): Nuovo Arch. Otol. Rinol. Laringol. 5, (1), 25-32); des neuropathies diabétiques sur des souris génétiquement diabétiques 35 (Norido F. et coll., Muscle & Nerve, 5, 107-110, 1982); empoisonnement par une neurotoxine (Aporti F. et coll. (1981) : Acta Otolaryngologica 92, 433-437, (1981); Maroni M. et coll. Clinical Toxicology 18, (12), 1475-1484, 1981).

a

Sur la base de ces données expérimentales, on considère que le mélange des gangliosides GM1, GD.. , GD-, et GT , est thérapeutiquement utile dans toute une série d'atteintes affectant le système nerveux périphérique dans lesquelles une 5 réinnervation peut être stimulée et accélérée.

En outre, ce mélange de gangliosides s'est avéré utile grâce à son activité protectrice contre une neurotoxicité occasionnée par des antiblastiques en général, en se référant particulièrement aux alcaloïdes provenant des séries vinca. Ce 10 résultat représente l'objet de la présente invention.

Information d'introduction sur les gangliosides et le phénomène oncogène

Comme on l'a discuté ci-dessus, les gangliosides sont des composants de membranes omniprésents dont la majorité 15 existe dans le feuillet extérieur de la couche lipidique de la membrane du plasma (Ledeen R. (1984): TINS 8, 169-174).

Il est bien connu dans la littérature que les gangliosides sont impliqués dans des phénomènes de régulation et de reconnaissance cellulaire? il a donc été vérifié qu'ils jouent 20 un rôle dans le développement et la différenciation cellulaire. En outre, on sait que le phénomène oncogène est associé à des changements importants dans la surface cellulaire des glycosphingolipides (comprenant donc les gangliosides). Sur cette base, il a été émis l'hypothèse que les gangliosides 25 pouvaient jouer un rôle (jusqu'à maintenant pas bien défini) dans la régulation de la croissance, la différenciation et l'interaction cellulaire (Hakomori S. (1981): Ann. Rev. Biochem. 50, 733-764).

En fait, dans le développement et la différenciation 30 embryoniques et histogéniques, les actions intercellulaires sont favorisées par un changement continuel des molécules de la surface des cellules encodé par le programme génétique. Pendant ce processus, il se produit des changements remarquables, dépendant des phases, dans la teneur et la complexité 35 des gangliosides superficiels des cellules.

Quelques exemples de ce phénomène sont les suivants: a) expression de la toxine du tétanos (Koulakoff A. et coll. (1983): Develop. Biol. 100, 350-357) et de la * ** 8 toxine du choléra (Willinger M. et Schachner M. (1980) : Develop. Biol. 74, 101-117), la liaison des sites du CNS ne se produit que sur les neurones postmitotiques; b) dans l'épithélium intestinal, les cellules non différen- 5 ciées sont caractérisées par la présence de Lac-Cer,

Glu-Cer et l'absence de GM^, tandis que les cellules différenciées sont caractérisées par des niveaux élevés en GM3 (Ledeen R. (1984), TINS 8, 169-174); c) il y a une augmentation remarquable en GM^ lorsque les 10 cellules amyloïdes sont induites à se différencier dans les macrophages (Ledeen R. (1984) TINS 8, 168-174).

Ces exemples et d'autres exemples non mentionnés ici, tels que des modifications de gangliosides lors de contact cellule-cellule, suggèrent que l'expression des gangliosides 15 spécifiques à la surface des cellules est en corrélation avec le passage des programmes cellulaires de l'état de prolifération à l'état de non prolifération (Koulakoff A. et coll. (1983): Develop. Biol. 100, 350-357). En outre, leur expression peut définir une interaction cellule-cellule, une migra-20 tion cellulaire et une différenciation cellulaire.

A l'appui de cette dernière affirmation, on citera les expériences in vitro conduite par addition de gangliosides exogènes à la prolifération (par exemple 3T3, neuroblastome, gliome, etc.) ou à la non prolifération de cellules (neurones 25 primaires) en culture. Dans tous les cas, les gangliosides ajoutés de l'extérieur favorisent une différenciation cellulaire. Dans le cas de cellules proliférantes, cet effet est associé à une prolifération décroissante (voir ci-dessous) (Haber B. et Gorio A. eds (1984): J. Neurosci. Res.).

30 Le rôle possible des gangliosides dans une régulation de la croissance cellulaire a été suggéré par ce qui suit: a) la synthèse des gangliosides spécifiques est grandement améliorée en association avec une "inhibition de contact" d'une croissance cellulaire (Ledeen R. (1984) TINS 8, 35 169-174); b) la synthèse des gangliosides augmente lorsque la croissance cellulaire est stoppée ou induite dans des cellules transformées par des agents de différenciation /1 i, » 9 (Ledeen R. (1984) TINS 8, 169-174)? c) une addition exogène de gangliosides, y compris de GM^, incorporée dans des membranes de plasma inhibe la croissance des cellules et induit une inhibition de contact.

5 Cet effet a été observé dans toute une série de lignées cellulaires (c'est-à-dire 353, neuroblastome, gliome) (Haber B. et Gorio A. eds (1984): J. Neurosci. Res.?

Ledeen R. et coll. eds (1984)ï Adv. Exper. Med. and Biol. 174).

10 Donc, la synthèse des gangliosides augmente lorsque l'on stoppe la prolifération. En outre, un supplément exogène en gangliosides est capable de stopper ou de retarder la prolifération cellulaire. Il vaut la peine de noter que ce dernier effet n'est en aucune façon associé à une cytotoxicité.

15 Des changements de dispositions des gangliosides à la surface des cellules ont été observés dans divers types de cellules tumorales et en réponse spécifique à différents agents cancérigènes de transformation et on peut donc considérer qu'il s'agit d'un phénomène commun habituellement associé 20 à une transformation (Hakomori S. (1975): Biochim. Biophys.

Acta 417, 55-89.

Pendant une transformation oncogène, il se produit essentiellement trois catégories de changements dans les glycolipides, y compris les gangliosides à la surface des 25 cellules: une synthèse incomplète, une néosynthèse et des réarrangements dans l'organisation des membranes des molécules de glycolipides (Hakomori S. (1984): TIBS 10, 453-458). A la fois le précurseur qui s'accumule à cause d'une synthèse incomplète, et le néoglycolipide formé par néosynthèse (habi-30 tuellement des glycolipides ou gangliosides mineurs) sont tenus pour représenter une expression antigène "associée à une tumeur" lorsqu'elle n'est pas détectable à la surface de la cellule progénitrice. En outre, ces antigènes associés à une tumeur sont quelquefois caractérisés parce qu'ils ont une 35 composition inhabituelle de céramide.

Information de base sur l'association gangliosides-vincristine (VCR) destinée au traitement des maladies tumorales

La vincristine est un agent antinéoplasique largement

J

10 utilisé et il est utilisé avec succès dans le traitement des leucémies, des lymphomes et en général dans des formes avancées de cancer (Holland J.F. et coll. (1983): Cancer Res., 33, 1258-1264). L'inconvénient majeur d'une utilisation intensive 5 de vincristine dans les diverses pathologies tumorales est son degré élevé de toxicité et l'un de ces principaux effets secondaires est en particulier l'apparition de signes d'une neurotoxicité périphérique et autonome.

La neuropathie apparaît typiquement sous la forme d'une 10 perte de réflexe des tendons, de paresthésies, douleur dans les muscles et faiblesse, constipation et douleur abdominale. Cette neutotoxicité impose des limitations sévères à l'application des doses nécessaires au traitement des pathologies tumorales et conduisent souvent à l'interruption de l'adminis-15 tration du médicament (Arnold A.M. et coll. (1984): The Lancet, Feb. 9th).

Le mécanisme de l'action antimitotique des alcaloïdes vinca consiste en une interférence avec l'assemblage des microtubules dans le faisceau mitotique. On pense que cet 20 effet de perturbation des microtubules est également responsable des altérations morphologiques des axones et des neurones chez les animaux d'expérience qui présentent des gonflements focaux des axones, des accumulations désorganisées de neurofilaments (Cho E.S. et coll. (1983): Arch. Toxicol. 52, 25 83-90) et des inclusions cristalloïdes microtubulaires dans les neurones (Sato M., Miyoshi K. (1984): Acta Neuropathol.

63, 150-159). D'un point de vue électrophysiologique, les études sur l'homme de McLeod et Penny (J. Neurol. Neurosurg. Psychiat. 32, 297-304, 1969) et Guiuheneuc et Coll. (J. Neurol. 30 Sei. 45, 355-366, 1980) indiquent que la neuropathie induite par la VCR est du type à rétromortalité, impliquant une dégénération distale rétrograde des axones. Ces processus de dégénération distale occasionnent une dénervation partielle du muscle cible. Dans cette situation, il apparaît que les séquen-35 ces de réparation prenant la forme de phénomènes de germination collatérale par des axones viables représentent l'essai de l'organisme de réinnerver les cibles abandonnées par des axones défaillants (Brown M.C. et coll. (1981): Ann. Rev.

> Λ 11

Neurosci. 4, 17-42).

McLeod et Penny (1969) ont trouvé que, après interruption d'une thérapie par la VCR, ces processus de réparation physiologique reprenaient de l'efficacité et permettaient une 5 régénération rapide des fibres nerveuses.

Il est d'autre part bien connu qu'une administration parentérale d'un mélange de gangliosides (marque déposée CRONASSIAL) à des animaux d'expérience stimule les processus de réparation dans le nerf périphérique grâce à un mécanisme qui facilite la 10 germination nerveuse (Gorio A. et coll. (1980): Brain Res.

197, 236-241). Les recherches cliniques intensives effectuées ont montré que ce médicament, le Cronassial , était thérapeutiquement recommandable dans toute une série de désordres du système nerveux périphérique dans lesquels une stimulation de 15 l'innervation réparative représentait un avantage clinique.

Ces neuropathies périphériques comprennent quelques formes toxiques, telles que par exemple les neuropathies iatrogènes occasionnées par des alcaloïdes vinca utilisés au traitement des néoplasies.

20 Dans le domaine spécifique des neuropathies induites par la vincristine, Dantona et coll. (1978): Rivista Scientifica ed Educazione Permanente, (Suppl. 9), 155-158, ont décrit une série de 40 patients présentant des syndromes neurotoxiques aigus induits par la vincristine. Ces patients ont reçu 20 mg O C Φ de Cronassial chaque jour pendant 20 jours et ensuite 10 mg par jour pendant plus de 10 jours. Les patients ont été interviewés régulièrement en portant une attention particulière à leurs symptômes et 57,5% des patients ont indiqué un degré significatif d'amélioration subjective. En particulier, on a 30 trouvé que le symptôme de paresthésie diminuait dès le quatrième jour après le début de la thérapeutique. Cette expérience exploratoire non contrôlée a été suivie d'un essai contrôlé chez un plus petit nombre de patients.

Azzoni (Il Policlinico, Sez. Medica, 84, (4), 255-262, 35 1968) a étudié sept patients traités au Cronassial® et a comparé les résultats obtenus avec ceux de sept patients comparables non traités en parallèle. Les patients traités ont ® reçu 20 mg de Cronassial par voie intramusculaire chaque jour Μ y 12 pendant 4 à 6 semaines en même temps qu'une administration de vincristine pour le traitement des désordres néoplasiques sousjacents. L'effet du traitement est surveillé par évaluation des symptômes de quatre altérations neurologiques ma-5 jeuresi les paresthésies, la perte de réflexe du mouvement des chevilles, la force de la dorsiflexion du pied et le mauvais fonctionnement intestinal. Le pointage des symptômes après le cycle de traitement est analysé au moyen de l'analyse séquentielle d'Armitage, vu le faible nombre de patients. Cette 10 analyse montre que la thérapeutique au Cronassial , au niveau de dosage essayé, est efficace dans la prévention de l'apparition de signes neurotoxiques modérés (paresthésie et perte du réflexe de mouvement de la cheville).

Etudes expérimentales pour la présente invention 15 Pour exclure les possibilités d'une interaction physico chimique ou biologique entre les gangliosides contenus dans le Cronassial® et la vincristine, et pour étudier la possibilité que l'activité antitumorale de la vincristine puisse être mise en échec par l'administration simultanée de Cronassial , on a 20 conduit diverses expériences chez des animaux avec administration concurrente de vincristine et de gangliosides. En particulier; 1. toxicité aiguë et chronique.

2. effet antitumoral.

25 1. Effet des gangliosides sur la toxicité aiguë de la vincris tine

Matériaux et méthodes;

Animaux; les souris sont subdivisées en groupes ne dépassant pas 8 dans des cages standards. On leur procure de 30 la nourriture et de l'eau ad libitum. Les animaux sont logés dans des chambres dans des conditions strictement contrôlées.

Médicaments;

On dilue 1 mg de vincristine pour obtenir la concentration nécessaire à l'injection de 0,1 ml/10 g de poids du 35 corps.

On prépare une solution de gangliosides par addition d'eau distillée stérile à une quantité suffisante pour obtenir 13 une concentration finale de 200 mg/kg dans un volume de 0,2 ml. Cette dose est administrée à des souris pesant environ 20 g. Résultats

Les résultats sont reportés sur le tableau 2 à partir 5 duquel on peut voir que le mélange de gangliosides ne donne pas de protection contre la toxicité aiguë occasionnée par une simple dose intraveineuse de vincristine.

TABLEAU 2 10 Léthalité aiguë par la vincristine et le mélange vincristine + gangliosides chez la souris But: Réduction de la toxicité des médicaments antitumoraux.

! ! ! ! ! ! '· ! _ „ l _ . ! Nbre de survivants ! % de survivants ! 1c . Dose mg/kg , Voie/Temps ^ ! ! ! ! a 30 jours ! à 30 jours ! _I_S_!_!_ï ! ! ! ! ! ! S Vincristine J 3,0 ! e.v. ! 2/8 ! 25 ! ! II ! ! ! ! Vincristine + ! 3,0 ! e.v. î 1/8 ! 12,5 ! ! gangliosides ! 200 ! intrapéritonéale ! ! ! 20 · ! ! 6 h avant la VCR ! I ! !_!_!_!_!_! 2. Effet du traitement par les gangliosides sur la toxicité chronique de la vincristine Matériaux et méthodes: 25 Des souris mâles CD-I (ICR) BR (Charles River, Italie) pesant de 25 à 30 g, sont utilisées pour toute l’expérience. Les animaux sont logés par groupe de 10 par cage et alimentés avec de la nourriture standard de laboratoire et de l’eau du robinet ad libitum. Les animaux sont logés dans des chambres à 2q température constante (21° + leC) et une humidité relative constante (60%) avec des cycles éclairés/sombre contrôlés (lumière de 8 h du matin à 8 h du soir).

Du sulfate de vincristine (Lilly) est dissous dans une solution saline et injecté par voie intraveineuse à une dose 2g volumique de 10 ml/kg, tandis que les gangliosides sont solubilisés dans un tampon de phosphate (0,01M; pH 7,5) contenant 0,8% de NaCl et administrés par voie intramusculaire à une dose volumique de 5 ml/kg.

14

Prétraitement par les gangliosidesî

Le mélange (ou véhicule) de gangliosides est administré par voie intramusculaire chaque jour pendant 5 jours consécutifs, à doses différentes (50, 100 et 200 mg/kg) et la vin-5 cristine est injectée par voie intraveineuse 5 jours après le dernier traitement à l'aide des gangliosides (ou véhicule) à des doses de 2,4 et 2,6 mg/kg.

Post-traitement aux gangliosides:

Le mélange (ou véhicule) de gangliosides est administré 10 par voie intramusculaire à doses de 20 mg/kg 5 heures avant un traitement intraveineux par la vincristine pendant 5 jours consécutifs.

Les doses de vincristine sont de 2,2, 2,4 et 2,6 mg/kg.

Le taux de mortalité est estimé par le nombre d'animaux 15 qui meurent dans les premiers quatorze jours du traitement à la vincristine.

La signification statistique des taux de mortalité est estimée au moyen du test de probabilité exact de Fisher. Résultats 20 Les résultats des tests sont indiqués sur les tableaux 3 et 4 et on en a tracé une courbe sur la figure 1. Sur la base de la courbe des taux de mortalité après administration de vincristine, on choisit des doses comprises entre 2 et 3 mg/kg pour l'étude sur les gangliosides. La première expérience 25 compare les effets du traitement au ganglioside avant et après injection de vincristine.

Dans le cas du post-traitement, on effectue une seule administration de gangliosides pour exclure la possibilité que la plus grande efficacité du prétraitement à l'aide de gan-30 gliosides dans la réduction de la toxicité de la vincristine ne puisse être due qu'à la dernière injection de ganglioside.

Comme on la reporté sur la figure 1, une réduction de la toxicité de la vincristine est observée lorsque le mélange de gangliosides est administré sous-chroniquement avant mais non 35 après l'injection de vincristine. Cet effet est obtenu en utilisant la dose maximum de gangliosides (200 mg/kg). Lorsque

Jm 15 l'on administre des doses plus faibles du mélange de gangliosides, il est possible de noter un effet dépendant de la dose de l'action protectrice des gangliosides (tableau 3) à l'exception du taux anormal de mortalité du groupe traité par des 5 gangliosides (100 mg/kg) et la vincristine (2,6 mg/kg).

D'autres expériences ont été effectuées avec des doses de 200 mg/kg de gangliosides. On peut trouver les données correspondantes sur le tableau 4.

10 TABLEAU 3

Effet du prétraitement sous-chronique avec différentes doses de gangliosides sur la toxicité léthale aiguë de la vincristine (VCR) 15 _

Taux de

Traitement mortalité 20 . Véhicule + VCR 2,4 mg/kg i.v. .. 7/10 . Gangliosides 50 mg/kg i.m. + VCR 2,4 mg/kg i.v. .. 2/10 . Gangliosides 100 mg/kg i.m. + VCR 2,4 mg/kg i.v. .. 1/10 . Gangliosides 200 mg/kg i.m. + VCR 2,4 mg/kg i.v. .. 0/10 . Véhicule + VCR 2,6 mg/kg i.v. .. 5/10 25 . Gangliosides 50 mg/kg i.m. + VCR 2,6 mg/kg i.v. .. 4/10 . Gangliosides 100 mg/kg i.m. + VCR 2,6 mg/kg i.v. .. 9/10 . Gangliosides 200 mg/kg i.m. + VCR 2,6 mg/kg i.v. .. 2/10 30 i.m. = intramusculaire i.v. = intraveineuse 35

Jm 16 TABLEAU 4

Effet du prétraitement sous-chronique par des gangliosides (200 mg/kg i.m.) sur la toxicité léthale aiguë de la vincristine (VCR) - *P 0,01 vs. contrôles convenables 5 (test de probabilité exact de Fisher)

Taux de

Traitement mortalité

Nbre. % ^ . Véhicule sous-chronique + VCR 2,4 mg/kg i.v. ___ 19/50 38 . Gangliosides sous-chroniques + VCR 2,4 mg/kg i.v. ... 3/50 6 . Véhicule sous-chronique + VCR 2,6 mg/kg i.v. ... 30/50 60 . Gangliosides sous-chroniques + 15 VCR 2,6 mg/kg i.v. ... 17/50* 34

Effets antitumoraux de la vincristine en association avec des ^ gangliosides

Matériaux et méthodes:

Les souches suivantes sont utilisées pour les diverses tumeurs : - des souris Schneider suisse mâles pesant 27 g sont 25 utilisées pour les expériences sur le sarcome S180.

- des souris femelles C^Bl pesant 20 g sont utilisées pour les expériences sur le mélanome B16.

- des souris mâles BDF^ pesant 30 g sont utilisées pour les expériences sur la leucémie L1210.

30 - des souris C^Bl pesant 20 g sont utilisées pour les expériences sur le poumon de Lewis.

Tumeurs:

Sarcome S180: cette tumeur est transplantée dans la même souche de souris de ce laboratoire pendant plus de 10 ans. Les 35 transplantations sont effectuées par inoculation sous cutanée de 0,1 ml d'homogénéisât de tumeur obtenu en éminçant finement 17

Jm du tissu tumoral viable, en le faisant passer plusieurs fois à travers une aiguille n° 26 dans une boîte de Pétri stérile.

0,1 ml de pénicilline (20 000 u/ml) et de la streptomycine (20 000 u/ml) sont ajoutés à la solution. On ajoute également 5 5 mg de néomycine.

Mélanome B16; cette tumeur se prépare par inoculation de la même façon que pour le sarcome S180.

L1210: les -rates sont retirées des animaux sept jours après inoculation de cellules L1210 et on les émince finement 10 en présence d'une solution saline isotonique 1/100. 0,1 ml de cette suspension de rates et de leucémie L1210 sont alors injectés par voie sous-cutanée dans le flanc de chaque souris BDF1.

Poumon de Lewis (3LL); cette tumeur est préparée par 15 inoculation de la même façon que pour le sarcome S180. Médicaments;

Vincristine: on utilise une fiole standard contenant 1 mg de vincristine. On la prépare à l'aide d'un volume convenable de solution de dilution pour obtenir la concentration 20 finale nécessaire pour l'injection dans 0,1 ml pour 10 g de poids du corps.

Cronassial: une solution de cette substance, qui représente un mélange de quatre gangliosides, est préparée par addition d'un volume d'eau distillée stérile suffisant pour 25 obtenir une concentration de 200 mg/kg dans un volume de 0,2 ml. On administre cette dose à des souris pesant approximativement 20 g.

Résultats :

Les résultats de ces études sont reportés sur le ta-30 bleau 5.

35 Μ 18 TABLEAU 5

Activité antitumorale avec et sans CRONASSIAL

! i i ï i i i i ! ! Tumeur l Hôte l Médicament l Dose ! Jours. ! Voie î Temps ! Poids moyen de ! 5 î î ! ! rag/kg! ! ! ! la tumeur (g) ! !_!_!_!_!_!_!_!_! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! S180 ! SN ! VCR ! 0,5 ! 1-6 ! i.p. ! ! 0,64 ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! S180 ! SN ! VCR ) ! 0,5 ! 1-6 ! i.p. î ! Q ! ! ! ! CRON) ! 200 ! 1-6 ! i.p. ! 6 h avant VCR ! ’ ! 1Q ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! S180 ! SN ! Contrôles CMC ! ! ! ! ! 1,05 ! !_!_!_!_!_!_!_î_! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! B16 ! C B1 ! VCR ! 0,5 ! 1-4, 7-11 ! i.p. ! ! 1,46 ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! B16 C B1 ! VCR ) ! 0,5 ! 1-4, 7-11 ! i.p. ! ! ! ! ! ! CRON) ! 200 ! 1-4, 7-11 ! i.p. ! 6 h avant VCR ! * ! 15 « Il ! ! ! ï ! ! ! B16 ! C B1 ! Contrôles CMC ! ! ! i ! 2,33 ! !_!_!_!_!_I_!_!_! ! ! ! ! ! ! ! ! ï ! ! ! ! ! ! ! ! Temps moyen de ! ! ! ! ! ! ï ! ! survie (gg) ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 20 ! L1210 ! BDF ! VCR ! 1,0 ! 1-3 ! i.p. ! ! 7,8 ! ! ! ! ï î ! ! ! ! ! L1210 ! BDF ! VCR ) ! 1,0 î 1-3 ! i.p. ! ! ! ! ! ! CRON) ! 200 ! 1-3 ! i.p. ! 6 ti avant VCR ! ’ ! * ; ; » t i« i j ! L1210 ! BDF ! Contrôles CMC ! ! ! ! ! 8,0 ! !_i 1 !_! î_! ?_;_! 25 La vincristine, avec et sans Cronassial, testée sur des tumeurs S180, B16 et L1210, montre que le Cronassial n'interfère avec aucune activité antitumorale que puisse présenter la vincristine,comme le montre l'inhibition de la croissance d'une tumeur en moyenne et en temps de survie moyen.

30 Au contraire, les résultats obtenus avec la leucémie L1210 montrent que la mortalité occasionnée par la toxicité de la vincristine seule peut être réduite (si on l'administre en même temps que du Cronassial) et que l'efficacité de la vincristine vis-à-vis de la L1210 est améliorée, avec un temps 35 moyen de survie de 10,3 jours par comparaison avec 7,8 jours pour la vincristine seule. Cette différence est statistiquement significative.

19

COMPOSITION PHARMACEUTIQUE

Pour la nouvelle application thérapeutique selon la présente invention, la formulation de gangliosides doit contenir les gangliosides individuels dans les proportions suivan-5 tes;

Gangliosides individuels Pourcentage en poids GM^ de 19 à 23 GD^ de 36 à 44 la GDlb de 14 à 18 10 GTlb de 17 à 21

Dans une formulation particulière que l'on préfère, les gangliosides individuels sont associés les uns aux autres dans les proportions pondérales suivantes: GM1 ............ 21% 15 GDla........... 40% GD-. ........... 16% lb GTlb........... 19%

Pour préparer une composition pharmaceutique selon la présente invention, la formulation doit de préférence contenir 20 un titre total en gangliosides (GM, + GD, + GD,, + GT,,_) de 1 la lb lb 95,0% (calculé par rapport au poids sec). Les préparations peuvent être des solutions de dérivés de gangliosides ou des poudres lyophilisées du dérivé en association avec un ou plusieurs véhicules ou diluants pharmaceutiquement accepta-25 blés, contenant un milieu de phosphate au pH convenable et isosmotiques aux fluides physiologiques. Chaque dose de la composition doit contenir entre 10 et 100 mg du mélange de gangliosides.

La dose particulière dépend de l'effet recherché et de 30 la voie d'administration. La dose peut par exemple être comprise entre 1,43 et 0,143 mg de composé actif par kilo de poids du corps par jour, la dose standard étant comprise entre 100 et 10 mg. Quelques compositions pharmaceutiques peuvent être par exemple les suivantes: 35 Préparation n° 1

Chaque fiole de 2 ml contient: <s* 20 - un mélange de gangliosides dans les proportions; 100 mg GM1 ............ 21% GDla........... 40% GDlb........... 16% 5 GTlb ........... 19% - tampon de phosphate à pH 7. 6M/100 dans de l’eau distillée stérile apyrogène, q.s. pour 2 ml.

Préparation n° 2 . ·

Chaque fiole de 2 ml contient: 10 - un mélange de gangliosides dans les proportions: 10 mg Gï^ ............ 21% GDla........... 40% GDlb........... 16% GTlb........... 19% 15 - tampon de phosphate à pH 7. 6M/100 dans de l'eau distil lée stérile apyrogène, q.s. pour 2 ml.

Préparation n° 3

Chaque fiole de 2 ml contient; - un mélange de gangliosides dans les proportions: 25 mg 20 GΜχ ............ 21% GDla........... 40% GDlb........... 16% GTlb........... 19% - tampon de phosphate à pH 7. 6M/100 dans de l'eau distil- 25 lée stérile apyrogène, q.s. pour 2 ml.

Préparation n° 4

Chaque fiole lyophilisée contient: - un mélange de gangliosides dans les proportions: 75 mg GM^ ............ 21% 30 GDla........... 40% GDlb........... 16% GTlb........... 19%

Une fiole de 2 ml de solvant contient: - mannitol: 25 mg 35 - tampon de phosphate à pH 7. 6M/100 dans de l'eau distil lée stérile apyrogène, q.s. pour 2 ml.

CONCLUSIONS GENERALES ET UTILISATIONS EN THERAPEUTIQUE

21

Les résultats présentés sur la prévention de la toxicité chronique de la vincristine par une administration simultanée d'un mélange de gangliosides sont surprenants, puisqu'il n'est pas possible d'associer cet effet protecteur général à l'effet 5 réparateur sur les neurones des gangliosides seuls observés dans une recherche antérieure. En fait, sur la base des résultats antérieurs obtenus avec les gangliosides, on émet l'hypothèse que les gangliosides peuvent empêcher une neuropathie de la vincristine et non ces neuropathies occasionnées par une 10 toxicité chronique d'un caractère plus général.

Les trois zones les plus affectées par la vincristine sont le système hématologique, le système gastro-intestinal et le système nerveux. D'autre part, il est difficile d'expliquer l'effet protecteur des gangliosides lorsque celui-ci n'est 15 considéré que comme un effet sur les systèmes nerveux central et autonome puisque la mortalité déterminée sur les animaux par la vincristine ne peut être attribuée qu'à ces effets sur les systèmes nerveux périphérique ou autonome. Ceci implique donc que les gangliosides agissent au moyen d'un mécanisme 20 d'action d'une nature plus générale et différent de celui dont l'hypothèse a été émis dans les études antérieures.

En outre, l'effet pourrait être reproduit avec d'autres médicaments antitumoraux tels que par exemple la mitozantrone, le cysplatinum, méthotrexate, adriamycine, daunomicine et le 25 cyclophosphamide, qui présentent un degré élevé de toxicité à la fois général et sur le système nerveux. Il est important de noter que les gangliosides n'interfèrent pas négativement avec l'activité antitumorale de la vincristine et, dans le cas d'une leucémie expérimentale, il apparaîtrait une efficacité 30 positive du médicament.

En considérant son utilisation en thérapeutique, il est essentiel d'observer que: - l'addition exogène de gangliosides avec des lignées cellulaires en transformation diminue ou ralentit la 35 prolifération des cellules et favorise la différencia tion des cellules.

- l'effet des gangliosides n'est pas cytotoxique et il est # 22 réversible.

- l'effet antiprolifération des gangliosides peut dépendre du type de cellule et peut être de la dépendance des cellules considérées sur le facteur de croissance pour 5 la prolifération.

D'autre part, la vincristine inhibe la prolifération des cellules indépendamment du type des cellules, et du facteur de croissance considéré. Cependant, ces effets sont dus à sa cytotoxicité à la fois sur les cellules proliférantes trans-10 formées et non transformées. En tant que telle, l'association gangliosides-VCR dans les maladies tumorales peut être considérée comme valide. Les gangliosides peuvent rendre possible l'utilisation de doses plus faibles de VCR comme médicaments antitumoraux, et ceci présente le résultat de diminuer l'effet 15 cytotoxique de la VCR sur les cellules normales. D'autre part, il est bien connu que l'administration de médicaments antitumoraux tels que la VCR chez des patients qui souffrent de tumeurs, occasionne de sérieux effets secondaires. Il est donc très souhaitable d'amener une réduction de ces effets secondaires 20 (qui sont dus à une toxicité plus générale de médicaments).

En résumé, les données obtenues se sont avérées très différentes de celles auxquelles on s'attendait puisqu'elles ne se ramènent pas au système nerveux. Elles sont plutôt tout à fait indicatives d'une action protectrice ou prophylactique 25 contre les effets secondaires d'une nature générale toxique occasionnés par l'administration d'antiblastiques des séries vinca. Ce type d'action rend possible de prolonger la période de traitement par la vincristine à des doses assez élevées pour ralentir la croissance des tumeurs et en même temps 30 retarder l'apparition des effets secondaires mentionnés ci-dessus.

L'administration du mélange de gangliosides, en particu-lier le mélange Cronassial , procure une prophylaxie des effets toxiques secondaires ou des effets neurotoxiques chro-35 niques occasionnés par l'administration d'agents antinéoplasiques. L'activité prophylactique est particulièrement évidente lorsque le mélange de gangliosides est administré avant l'administration de l'agent antinéoplasique.

23 * L’invention ayant été ainsi décrite, il est évident qu'on peut lui apporter plusieurs variantes. Ces variantes ne doivent pas être prises en dehors du but essentiel de la présente invention et toutes ces modifications doivent être 5 considérées évidentes par un spécialiste et doivent être comprises dans la portée des revendications suivantes.

10 15 20 25 30 35

Claims (25)

1. Un agent de prévention et de prophylaxie des effets toxiques généraux ou des effets neurotoxiques chroniques occasionnés par l'administration d'agents antinéoplasiques, 5 destiné à être administré aux patients avant l'administration de ces agents néoplasiques et qui comprend comme ingrédient actif un mélange de gangliosides GM^, GD^a, GD^ et GT^·

2. Un agent selon la revendication 1, dans lequel ce mélange de gangliosides contient entre environ 19 et 23% de

10 GM-, entre environ 36 et 44% de GD, , entre environ 14 et 18% 1f laf de GD^k et entre environ 17 et 21% de GT^ en poids.

3. Un agent selon la revendication 2, dans lequel ce mélange de gangliosides contient environ 21% de GM^, environ 40% de GD, , environ 16% de GD,. et environ 19% de GT,, en la lb lb 15 poids.

4. Un agent selon la revendication 2, dans lequel ce mélange de gangliosides contient 23% de GM^, environ 40% de GDia, environ 16% de GD.^ et environ 19% de GT^ en poids.

5. Un agent selon l'une quelconque des revendications 1 20 à 4, dans lequel cet agent antinéoplasique est un alcaloïde vi nca.

6. Un agent selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel cet agent antinéoplasique appartient au groupe formé par: vincristine, mitozantrone, cysplatinum, 25 méthotrexate, adriamycine, daunomicine et cyclophosphamide.

7. Un agent selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel cet agent antinéoplasique est la vincristine.

8. A titre de médicament pour la réduction des effets toxiques généraux ou des effets neurotoxiques chroniques 30 occasionnés par l'administration d'agents antinéoplasiques, consistant en un mélange de gangliosides GM^, GDlaf GDib et GTj^ avant l'administration de ces agents antinéoplasiques.

9. Un médicament selon la revendication 8, dans laquelle ce mélange de gangliosides contient entre environ 19 et 23% de

35 GM^, entre environ 36 et 44% de GD^&, entre environ 14 et 18% de GD^ et entre environ 17 et 21% de GT^ en poids.

10.- Un médicament selon la revendication 9, dans laquelle 25 .r ' l ce mélange de gangliosides contient environ 21% de GM^, environ 40% de GDla, environ 16% de GDlb et environ 19% de GT^b en poids.

11. Un médicament selon la revendication 9, dans laquelle 5 ce mélange de gangliosides contient environ 23% de GM^, envi- - ron 40% de GD. , environ 16% de GD.. et environ 19% de GT.. en la 1b lb poids.

12. Un médicament selon l'une quelconque des revendications 8 à 11, dans laquelle ce mélange de gangliosides est 10 administré à une dose standard comprise entre 100 et 10-mg.

13. Un médicament selon l'une quelconque des revendications 8 à 13, dans laquelle cet agent antinéoplasique est un alcaloïde vinca.

14. Un médicament selon l'une quelconque des revendica-15 tions 8 à 13, dans laquelle cet agent antinéoplasique appartient au groupe formé par: vincristine, mitozantrone, cyspla-tinum, méthotrexate, adriamycine, daunomicine et cyclophospha-mi de.

15. Un médicament selon l'une quelconque des revendica-20 tions 8 à 13, dans laquelle cet agent antinéoplasique est la vincristine.

16. Un médicament selon l'une quelconque des revendications 8 à 15, pour le traitement des effets neurotoxiques incluant la perte des réflexes d'un tendon, des paresthésies, 25 une douleur musculaire, une faiblesse musculaire, la constipation ou une douleur abdominale.

17. Un médicament selon l'une quelconque des revendications 8 à 16, destiné à être administré avant le traitement par ces agents antinéoplasiques. 30 18,- Un médicament selon l'une quelconque des revendica tions 8 à 17, destiné à être administré quotidiennement pendant 5 jours consécutifs, avant traitement avec ces agents néoplasiques. 19, - Un médicament selon la revendication 18, dans laquelle 35 destiné à être administré environ 5 heures après la dernière administration de ce mélange de gangliosides.

20. Utilisation d'un mélange de gangliosides GM^, GD^&, * % 26 t GD^ et pour la préparation d'une composition pharmaceu tique destinée au traitement d’effets toxiques généraux ou d’effets neurotoxiques chroniques occasionnés par l'administration ultérieure d'agents antinéoplasiques.

21. Une utilisation selon la revendication 20, dans laquelle ce mélange de gangliosides contient entre environ 19 et 23% de GM^, entre environ 36 et 44% de GD^a, entre environ 14 et 18% de GD^. et entre environ 17 et 21% de GT^ en poids.

22. Une utilisation selon la revendication 21, dans 10 laquelle ce mélange de gangliosides contient environ 21% de GM^, environ 40% de GD^a, environ 16% de GD^ et environ 19% de GT^ en poids.

23. Une utilisation selon la revendication 21, dans laquelle ce mélange de gangliosides contient environ 23% de

15 GM-, environ 40% de GD. , environ 16% de GD-, et environ 19% 1 la’ 1b de GT^ en poids.

24. Une utilisation selon l'une quelconque des revendications 20 à 23, dans laquelle cet agent antinéoplasique est un alcaloïde vinca. 20 25.- Une utilisation selon l’une quelconque des revendi cations 20 à 24, dans laquelle cet agent antinéoplasique appartient au groupe formé par: vincristine, mitozantrone, cysplatinum, méthotrexate, adriamycine, daunomicine et cyclo-phosphami de. 25 26.- Une utilisation selon l’une quelconque des revendi cations 20 à 24, dans laquelle cet agent antinéoplasique est la vincristine. 30 35