CN102046151A - 靶向内质网的脂质体 - Google Patents

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CN102046151A CN2009801186452A CN200980118645A CN102046151A CN 102046151 A CN102046151 A CN 102046151A CN 2009801186452 A CN2009801186452 A CN 2009801186452A CN 200980118645 A CN200980118645 A CN 200980118645A CN 102046151 A CN102046151 A CN 102046151A
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雷蒙德·艾伦·德韦克
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Abstract

本发明提供了包含可与细胞ER(内质网)膜融合的脂质颗粒(例如脂质体)的组合物。所述脂质颗粒还可递送诸如治疗剂或显像剂之类的载荷，所述载荷包裹在细胞ER内腔中的颗粒内。所述组合物可用于治疗和/或预防由病毒引起的或与病毒相关的疾病，例如病毒感染，包括HIV(人类免疫缺陷病毒)和HCV(丙型肝炎病毒)感染。

Description

靶向内质网的脂质体
相关申请
本申请要求2008年3月26日提交的美国临时专利申请第61/039,638号的优先权，该美国临时专利申请在此通过引用完整并入。
技术领域
本申请总体上涉及递送诸如治疗剂和/或显像剂之类的活性剂的方法和组合物，更具体地，涉及利用诸如脂质体之类的脂质颗粒递送活性剂的方法和组合物。
发明内容
一种实施方式提供一种药物递送方法，所述方法包括对有相应需要的受治疗者进行包含脂质颗粒的组合物的给药，所述脂质颗粒含有至少一种PS脂质。
另一种实施方式提供一种治疗或预防HIV(人类免疫缺陷病毒)感染的方法，所述方法包括对有相应需要的受治疗者进行包含脂质颗粒的组合物的给药，所述脂质颗粒含有PS脂质或PI脂质中的至少一种，其中，所述脂质颗粒不含CHEMS(胆甾醇半琥珀酸酯)脂质。
又一种实施方式提供一种药物递送方法，所述方法包括对有相应需要的受治疗者进行包含脂质颗粒的组合物的给药，所述脂质颗粒含有至少一种多不饱和脂质。
又一种实施方式提供一种组合物，所述组合物包含脂质颗粒，所述脂质颗粒含有PS脂质。
又一种实施方式提供一种组合物，所述组合物包含脂质颗粒，所述脂质颗粒含有至少一种多不饱和脂质。
再一种实施方式是一种对病毒进行标记的方法，所述方法包括使受病毒感染的细胞与脂质颗粒接触，所述脂质颗粒含有：a)PI或PS脂质中的至少一种和b)至少一种标记的脂质，所述标记的脂质包含至少一种标记物，其中所述接触使所述标记物标记所述病毒。
附图说明
图1(A)-(G)描述了下列脂质的化学结构：(A)DOPE；(B)DOPC；(C)CHEMS；(D)PI；(E)PS；(F)Rho-PE以及(G)b-PE。
图2(A)-(H)显示了研究下列脂质体与Huh7.5细胞中ER(内质网)膜蛋白EDEM共定位的共聚焦显微图像：(A)PE∶CH(摩尔比3∶2)脂质体；(B)PE∶PC(3∶2)脂质体；(C)PE∶CH∶PI(3∶1∶1)脂质体；(D)PE∶PC∶PI(2∶2∶1)脂质体；(E)PE∶CH∶PS(3∶1∶1)脂质体；(F)PE∶PC∶PS(2∶2∶1)脂质体；(G)PE∶CH∶PI∶PS(3∶1∶0.5∶0.5)脂质体；(H)PE∶PC∶PI∶PS(1.5∶1.5∶1∶1)脂质体。
图3显示了脂质体递送的rh-DOPE与EDEM抗体的计算的共定位。
图4显示了由链霉亲和素捕获的标记的病毒颗粒相对于相同样品分泌的病毒体的总量(100％)的百分数，该百分数作为脂质体中b-PE摩尔百分数的函数。
图5显示了Rh-PE标记的JC-1 HCVcc(红色，左下小图)的共聚焦显微图像，所述Rh-PE标记的JC-1 HCVcc与原初Huh7.5细胞一起孵育1小时(MOI＝0.1)，之后洗涤细胞并在新鲜培养基中再孵育0、6或24小时。在各孵育时间之后，固定细胞并使用抗HCV核心抗体(绿色，右上小图)和DAPI(蓝色，左上小图)染色，然后将其固定至载玻片上并进行共聚焦显微显像。右下小图中显示了合并的图像。显示了各孵育阶段的典型图像。各图像的分辨率刻度条为10μm。
图6(A)-(C)显示了荧光显微图像，该荧光显微图像研究摩尔比3∶2的PE∶CH脂质体(A)、PE∶CH∶PI(3∶1∶1)脂质体(B)和PE∶CH∶PS(3∶1∶1)脂质体(C)掺入细胞膜中。
图7是表示Huh7.5细胞内靶向ER的脂质体的细胞摄取和脂质滞留增加的曲线图。数据显示了来自三个独立实验的一式三份样品的平均值和标准差(SD)。该曲线图表示两组数据，ER脂质体(黑线)和pH敏感性脂质体(红线)的细胞生长(虚线)和rh-PE脂质体摄取(实线)。Y轴表示被标准化至100％的这两组数据的最大值。100％细胞生长的最大值为2.4×10e6个细胞/ml(ER脂质体读数72小时)，rh-PE荧光的最大值为1.5×10e-3任意单位(AU)/细胞(ER脂质体读数96小时)。
图8(A)是表示从脂质体释放的钙黄绿素相对于荧光最大值的百分数的曲线图，所述荧光最大值通过在孵育阶段结束时添加Triton X-100以破坏脂质体膜而测定，所述百分数作为PE∶CH和PE∶PC∶PI∶PS脂质体的时间的函数。
图8(B)显示了在10％牛血清(FBS)或10％人血清的存在下或在无血清培养基中与Huh7.5细胞一起孵育24小时的Rh标记的脂质体(50μm的脂质浓度)的实验结果。在孵育时间之后，收获细胞，进行计数并在λex＝550nm、λem＝590nm检测荧光。将结果表示为所检测的各样品每个细胞的平均荧光。所有数据均表示来自三个独立实验的一式三份样品的平均值和标准差。
图9显示了Huh7.5细胞与包裹1×PBS的不同脂质体制剂一起孵育5天之后的活力。培养基中脂质终浓度的范围为0至500μM。结果表示来自三个独立实验的一式三份样品的平均值。
图10显示了PBMC与包裹1×PBS的不同脂质体制剂一起孵育5天之后的活力。培养基中脂质终浓度的范围为0至500μM。结果表示来自三个独立实验的一式三份样品的平均值。
图11显示了在使用脂质体处理5天的过程中HIV从感染的PBMC分泌。
图12显示了从脂质体处理的HIV感染的PBMC分泌的HIV病毒体的感染性。
图13显示了在完全DMEM/10％FBS中与Huh7.5细胞一起孵育45分钟的带有自猝灭钙黄绿素的、rh-PE标记的脂质体(脂质终浓度为50μM)的实验结果。在λex＝490nm、λem＝520nm检测孵育之后脂质体中的钙黄绿素的细胞内脱猝灭，通过在λex＝550nm、λem＝590nm荧光检测来测定相同孵育阶段过程中总的脂质体摄取。在37℃和4℃下进行测定，为了校正在无细胞内吞的情况下的脂质体结合，从37℃的数值减去所有4℃的数值。脂质体在Huh7.5细胞内递送包裹的钙黄绿素的能力通过计算孵育后处理的细胞内的钙黄绿素脱猝灭和rh-PE荧光的比值来检测。数据表示来自三个独立实验的一式三份样品的平均值和标准差。
图14显示了在使用1mM NB-DNJ(游离和脂质体介导的递送)处理5天的过程中HIV从感染的PBMC的分泌。
图15显示了从NB-DNJ脂质体或游离NB-DNJ处理的HIV感染的PBMC分泌的HIV病毒体的感染性。
图16显示了PBMC与包裹1mM NB-DNJ的不同脂质体制剂一起孵育5天后的活力。
图17显示了HCV从使用脂质体处理5天之后的急性和慢性感染的Huh7.5细胞的分泌。
图18显示了从脂质体处理的HCV感染(急性和慢性感染)的Huh7.5细胞分泌的HCV病毒体的感染性。
图19显示了未处理的Huh7.5细胞(左小图)和PE∶PC∶PI∶PS脂质体处理的Huh7.5细胞的共聚焦显微图像，所述细胞在孵育16小时后用BODIPY493/503(绿色)来标记，使LD(脂质小滴)显像。
图20显示了使用PE∶PC∶PI∶PS脂质体处理2小时并使用LD染色剂(绿色)标记的Huh7.5细胞的共聚焦显微图像(左小图)。将PE∶PC∶PI∶PS脂质体添加至细胞培养基至脂质终浓度为50μM。DAPI(蓝色)用作核染色剂。右下小图为合并的图像。黄色鉴定细胞内的共定位区域。
图21A显示了未处理的Huh7.5细胞(左小图)和PE∶PC∶PI∶PS脂质体处理的Huh7.5细胞(右小图)的共聚焦显微图像，所述Huh7.5细胞被孵育16小时并使用抗HCV核心抗体(红色)和LD染色剂(绿色)标记。图21B显示了未处理的细胞(左)和PE∶PC∶PI∶PS(右)细胞的合并图像(图21A中的白方框)的特写。图21C是存在(右)和不存在(左)PE∶PC∶PI∶PS脂质体的情况下HCV核心蛋白/LD相互作用的示意图。
图22A-22D显示了示例的多不饱和脂质的化学结构：22∶6PE(A)；20∶4PE(B)；22∶6PC(C)以及20∶4PC(D)。
图23A-B分别显示了(23A)在多种ER脂质体制剂存在下孵育4天过程中JC-1 HCVcc从感染的Huh7.5细胞(MOI＝0.5)的分泌，从500μl细胞上清液对所述分泌进行定量。通过定量PCR对上清液中的JC-1 HCVcc RNA进行定量来检测分泌。(23B)从脂质体处理的JC-1感染的Huh7.5细胞分泌的JC-1 HCVcc的感染性。通过下列步骤来测定分泌的HCVcc的感染性：感染原初Huh7.5细胞1小时，随后孵育Huh7.5细胞48小时，在该时间点固定细胞，并使用抗HCV核心抗体染色以对感染的细胞的数量进行定量，并用DAPI使所有细胞显像。
具体实施方式
术语定义
除非另有说明，不指出具体数目(“a”或“an”)是指“一个(种)或一个(种)以上”。
本文所使用的术语“病毒感染”可指一种疾病状态，在该疾病状态中病毒入侵健康细胞，利用细胞的复制机制来使细胞增殖或复制，并最终使细胞裂解，导致细胞死亡，病毒颗粒释放，并通过新产生的子代病毒来感染其他细胞。某些病毒导致的潜伏感染也可能是病毒感染的结果。
本文使用的术语“治疗或预防病毒感染”可指抑制特定病毒复制，抑制病毒传播，或预防病毒在其宿主中建立自身，以及缓解或减轻由病毒感染引起的疾病症状。如果治疗方法导致病毒载荷减小、发病率和/或致死率下降，则可认为该治疗方法是治疗性的。
术语“治疗剂”是指诸如分子或化合物之类的药剂，该药剂可辅助治疗生理病症，例如病毒感染或由此引起的疾病。
术语“脂质体”可被定义为含有脂质的双层结构颗粒，所述双层结构通常是球状双层结构。本文所述的脂质体可包括由下列缩略语表示的一种或一种以上脂质：
CHEMS表示胆甾醇半琥珀酸酯脂质。
DOPE表示二油酰基磷脂酰乙醇胺脂质。
DOPC表示二油酰基磷脂酰胆碱脂质。
PE表示磷脂酰乙醇胺脂质或其衍生物。
PEG-PE表示与聚乙二醇(PEG)共轭的PE脂质。PEG-PE的一个实例可为聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺脂质。PEG-PE中PEG组分的分子量可不同。
Rh-PE表示丽丝胺若丹明B-磷脂酰乙醇胺脂质。
MCC-PE表示1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[4-(p-马来酰亚胺甲基)环己烷-氨甲酰]脂质。
PI表示磷脂酰肌醇脂质。
PS表示磷脂酰丝氨酸脂质。
术语“细胞内递送”可指从脂质体向任何细胞内腔室递送包裹的物质。
IC50或IC90(抑制浓度50或90)可分别指代用于达到病毒感染降低50％或90％的治疗剂的浓度。
PBMC表示外周血单核细胞。
sCD4表示可溶性CD4分子。对于“可溶性CD4”或“sCD4”或“D1D2”是指位于水溶液中并可通过改变HIV Env的构象来模拟天然膜锚定CD4的活性的CD4分子或其片段，这是本领域普通技术人员所理解的。可溶性CD4的一个实例是在例如“Salzwedel等人，J.Virol.74：326 333，2000”中描述的二结构域可溶性CD4(sCD4或D1D2)。
MAb表示单克隆抗体。
DNJ表示脱氧野尻霉素。
NB-DNJ表示N-丁基脱氧野尻霉素。
NN-DNJ表示N-壬基脱氧野尻霉素。
BVDV表示牛病毒性腹泻病毒。
HBV表示乙型肝炎病毒。
HCV表示丙型肝炎病毒。
HIV表示人类免疫缺陷病毒。
Ncp表示非细胞病变的。
Cp表示细胞病变的。
ER表示内质网。
CHO表示中国仓鼠卵巢细胞。
MDBK表示马-达氏牛肾细胞。
PCR表示聚合酶链反应。
FOS表示游离低聚糖。
HPLC表示高效液相色谱法。
PHA表示植物血凝素。
FBS表示胎牛血清。
TCID50表示50％组织培养感染剂量。
ELISA表示酶联免疫吸附测定。
IgG表示免疫球蛋白。
DAPI表示4′，6-二脒基-2-苯基吲哚。
PBS表示磷酸盐缓冲盐水。
LD表示脂质小滴。
NS表示非结构的。
“MOI”是指感染复数。
相关申请
本发明公开内容通过引用完整并入了第2008-0138351号美国专利申请公布。
丙型肝炎
全世界大约1亿7千万人(即世界人口的3％)感染丙型肝炎病毒(HCV，HepC)(参见例如，WHO，J.Viral.Hepat.1999；6：35-47)，美国大约4百万人感染丙型肝炎病毒。大约80％的HCV急性感染个体变成慢性感染。因此，HCV是慢性肝炎的主要原因。一旦慢性感染，在不治疗的情况下病毒几乎不会被清除。在罕见的情况下，HCV感染导致临床上的急性疾病，甚至肝脏衰竭。慢性HCV感染在个体间可显著不同，其中有些个体具有临床上不明显的或最轻的肝脏疾病，且从不会发生并发症，其他个体具有临床上明显的慢性肝炎并且可继续发展为肝硬化。约20％的确实发展为肝硬化的HCV个体会发生末期肝疾病，并且发生原发性肝癌的危险增加。
抗病毒药物(例如，干扰素)单独或与利巴韦林联合，对于达80％的患者有效(Di Bisceglie，A.M，和Hoofnagle，J.H.2002，Hepatology 36，S121-S127)，但很多患者不耐受这种形式的联合治疗。
脂质小滴
脂质小滴(LD)可以是一种可用于储存中性脂质的细胞器。LD可通过细胞质动态移动，与其他细胞器(包括ER)相互作用。这些相互作用被认为促进脂质和蛋白质向其他细胞器运输。HCV衣壳蛋白(核心)可与细胞LD结合，并将非结构(NS)蛋白和复制复合物活跃募集至结合LD的膜，用于产生感染性病毒颗粒。已观察到HCV颗粒与LD非常接近，这说明病毒组装的一些步骤可在LD周围发生(Miyanari等人，Nature Cell Biology，9(2007)第1089-1097页)。
人类免疫缺陷病毒(HIV)
HIV是获得性免疫缺陷综合征(AIDS)及相关病症的病原体。有至少两种不同类型的HIV：HIV-1和HIV-2。另外，在这些类型各自的群体中存在大量的遗传异质性。由于AIDS流行病的发作，已有大约2千万人死亡，估计目前有超过4千万人感染有HIV-1/AIDS，全世界每天有14000人感染HIV-1/AIDS。
已经开发了许多抗病毒治疗剂和诊断能力，至少对于那些使用者来说，已经很大程度上改进了生命的数量和质量。大多数这些药物干扰病毒蛋白或进程，例如干扰逆转录和蛋白酶活性。不幸的是，这些治疗不消除感染，许多疗法的不利作用严重，目前使用的各类型的抗病毒剂存在HIV抗药性毒株。N-丁基-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-山梨醇
NB-DNJ，也称为N-丁基-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-山梨醇，可抑制ER糖苷酶I和II的加工，已显示为有效的抗病毒剂，其引起HIV和肝炎病毒(例如，乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV))、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)以及其他病毒的糖蛋白的错折叠和/或ER滞留。合成NB-DNJ和其他N-取代脱氧野尻霉素衍生物的方法在例如美国专利第5,622,972号、第4,246,345号、第4,266,025号、第4,405,714号以及第4,806,650号中描述。NB-DNJ对肝炎病毒的抗病毒作用在例如美国专利第6,465,487号、第6,545,021号、第6,689,759号、第6,809,083号中描述，NB-DNJ对HIV病毒的抗病毒作用在美国专利第4,849,430号中描述。
诸如NB-DNJ之类的糖苷酶抑制剂已显示出在治疗细胞培养物中和使用土拨鼠动物模型中的HBV感染方面有效，参见，例如，T.Block，X.Lu，A.S.Mehta，B.S.Blumberg，B.Tennant，M.Ebling，B.Korba，D.M.Lansky，G.S.Jacob以及R.A.Dwek，Nat Med.1998 May；4(5)：610-4。NB-DNJ抑制HBV颗粒的分泌并引起HBV DNA的细胞内滞留。
NB-DNJ已显示是抗BVDV、HCV的细胞培养模型的强抗病毒剂，参见，例如，Branza-Nichita N，Durantel D，Carrouee-Durantel S，Dwek RA，Zitzmann N.，J Virol.2001 Apr；75(8)：3527-36；Durantel，D.等人，J.Virol，2001，75，8987-8998；N.Zitzmann等人，PNAS，1999，96，11878-11882。使用NB-DNJ治疗导致病毒子代的感染性降低，对于分泌的病毒的实际数量的影响较小。
NB-DNJ已显示是抗HIV的抗病毒剂，治疗导致对从HIV感染的细胞释放的病毒颗粒的数量影响较小，然而，所释放的感染性病毒的数量大大减少，参见，例如，P.B.Fischer，M.Collin等人，(1995)，J.Virol 69(9)：5791-7；P.B.Fischer，G.B.Karlsson，T.Butters，R.Dwek以及F.Platt，J.Virol.70(1996a)，第7143-7152页，P.B.Fischer，G.B.Karlsson，R.Dwek以及F.Platt，J.Virol.70(1996b)，第7153-7160页。在HIV-1感染的患者中进行了涉及NB-DNJ的临床试验，结果显示抗病毒活性所需的浓度太高，导致患者中严重的副作用，参见，例如，Fischl M.A.，Resnick L.，Coombs R.，Kremer A.B.，Pottage J.C.Jr，Fass R.J.，Fife K.H.，Powderly W.G.，Collier A.C.，Aspinall R.L.等人，J.Acquir.Immune.Defic.Syndr.1994 Feb；7(2)：139-47。目前不存在对NB-DNJ治疗具有抗药性的突变的HIV毒株。
ER蛋白折叠以及糖苷酶I和II
由糖苷酶抑制所呈现的抗病毒作用被认为是ER中病毒糖蛋白错折叠或滞留的结果，这主要是通过阻断病毒糖蛋白进入钙联接蛋白/钙网织蛋白循环而进行的。在三糖基化寡糖(Glc3Man9GlcNAc2)转移至生长中的多肽链的Asn-X-Ser/Thr共有序列之后，三个α-连接的葡萄糖残基在可发生进一步加工成成熟的糖单元之前而被释放是必要的。另外，两个外部葡萄糖残基必须被修剪以使得进入钙联接蛋白/钙网织蛋白循环，进行合适的折叠，参见，例如，Bergeron，J.J.等人，Trends Biochem.Sci.，1994，19，124-128；Peterson，J.R.等人，Mol.Biol.Cell，1995，6，1173-1184。一开始的加工受到位于ER的具有内腔定向催化结构域的整膜酶(糖苷酶I)的影响，该酶特异性切割α1-2连接的葡萄糖残基，这之后发生糖苷酶II释放两个α1-3连接的葡萄糖组分的作用。
脂质体
脂质体可绕过用作分子屏障的细胞膜在细胞内直接递送水溶性化合物。pH敏感性脂质体制剂可涉及磷脂酰乙醇胺(PE)或其衍生物(例如DOPE)与用作中性pH下的稳定剂的含有酸性基团的化合物组合。由于胆甾醇半琥珀酸酯(CHEMS)与其他两性稳定剂相比其胆甾醇基团在体内赋予含有PE的小囊泡较高的稳定性，所以胆甾醇半琥珀酸酯(CHEMS)可为良好的稳定分子。脂质体介导的递送的体内功效很大程度上取决于与血清组分(调理素)的相互作用，该相互作用影响血清组分的药物代谢动力学和生物分布。pH敏感性脂质体可从血液循环被快速清除，在肝脏和脾脏中积累，然而包含具有共价连接的聚乙二醇(PEG)的脂质可通过稳定DOPE∶CHEMS脂质体上的净负电荷而克服被网状内皮系统(RES)清除，导致循环时间长。DOPE-CHEMS和DOPE-CHEMS-PEG-PE脂质体及其制备方法在下述文献中描述：例如，V.A.Slepushkin，S.Simoes，P.Dazin，M.S.Newman，L.S.Guo以及M.C.P.de Lima，J.Biol.Chem.272(1997)2382-2388；和S.Simoes，V.Slepushkin，N.Duzgunes和M.C.Pedroso de Lima，Biomembranes 1515(2001)23-37，这两个文献均在此通过引用完整并入。
包裹在DOPE-CHEMS(摩尔比6∶4)中的NB-DNJ的递送在美国专利申请号US2003/0124160中公开。
公开内容
本发明的发明人认为含有PI或PS脂质中的至少一种脂质的脂质颗粒(例如，脂质体或胶束)可由细胞高效摄取并与该细胞的ER膜融合(见图1)。发明人还发现含有PI或PS脂质中的至少一种脂质的脂质颗粒在血液或血液组分(例如血清)中可具有高稳定性。例如，含有PI或PS脂质中的至少一种脂质的脂质体在血清中比DOPE/CHEMS(摩尔比6∶3)脂质体或DOPE/CHEMS/PEG-PE(摩尔比6∶3∶0.1)脂质体具有更高的稳定性。
在一些实施方式中，脂质颗粒可含有摩尔浓度为至少5％或至少10％或至少15％或至少20％或至少25％或至少30％或3％至60％或5％至50％或10％至30％的PI和/或PS脂质。在一些实施方式中，脂质颗粒中PS脂质的摩尔浓度可为至少5％或至少10％或至少15％或至少20％或至少25％或至少30％或3％至60％或5％至50％或10％至30％。在一些实施方式中，脂质颗粒中PI脂质的摩尔浓度可为至少5％或至少10％或至少15％或至少20％或至少25％或至少30％或3％至60％或5％至50％或10％至30％。在一些实施方式中，脂质颗粒中PI和PS脂质的组合浓度可为至少5％或至少10％或至少15％或至少20％或至少25％或至少30％或3％至60％或5％至50％或10％至30％。
脂质颗粒还可含有一种或一种以上磷酯酰乙醇胺(PE)脂质或其衍生物，例如DOPE。在一些实施方式中，PE脂质可包括与标记物共轭的PE脂质，所述标记物可为，例如，荧光团标记物、生物素标记物或放射性标记物。图1A、1F以及1G显示了DOPE脂质、Rho-PE脂质(与荧光团标记物共轭的PE脂质的实例)以及b-PE脂质(与生物素标记物共轭的PE脂质的实例)的化学结构。
在一些实施方式中，脂质颗粒还可含有PC或CHEMS脂质体中的至少一种。而在一些其他实施方式中，脂质颗粒可以不含有PC和/或CHEMS脂质。
在一些实施方式中，含有PE、PC、PI以及PS脂质的脂质颗粒可为优选。这样的脂质颗粒可干扰细胞LD，这可导致从使用这些脂质颗粒处理的HCV感染的细胞分泌的HCV颗粒的感染性显著降低。含有PE、PC、PI以及PS脂质的脂质颗粒可用于将脂质引入HCV感染的细胞中以干扰LD/HCV核心蛋白相互作用。另外，含有PE、PC、PI以及PS脂质的脂质颗粒可竞争与HCV相同的细胞受体，因此胜于病毒进入细胞，降低病毒感染性。
病毒感染
脂质颗粒可用于治疗、预防和/或监测受治疗者体内由病毒引起的或与病毒相关的疾病或病症，在许多情况下，所述受治疗者可为温血动物，例如哺乳动物或鸟类。在许多情况下，所述受治疗者可为人类。在许多情况下，所述疾病或病症可为病毒感染。在一些实施方式中，含有PI或PS脂质中的至少一种脂质的脂质颗粒可用于治疗、预防和/或监测由属于黄病毒科的病毒引起的或与该病毒相关的疾病或病症。所述黄病毒科包括黄病毒属、丙型肝炎病毒属以及鼠疫病毒属。黄病毒属包括Gadgets Gully病毒(GGYV)，凯丹姆病毒(KADV)；科萨努尔森林病病毒(KFDV)；兰加特病毒(LGTV)；鄂木斯克出血热病毒(OHFV)；波瓦桑病毒(POWV)；罗亚尔农场病毒(RFV)；蜱传脑炎病毒(TBEV)；羊跳跃病病毒(LIV)；Meaban病毒(MEAV)；索马里滋里夫病毒(SREV)；为勒尼病毒(TYUV)；Aroa病毒(AROAV)；登革热病毒(DENV)1-4；凯多各病毒(KEDV)；Cacipacore病毒(CPCV)；科坦戈病毒(KOUV)；日本脑炎病毒(JEV)；墨莱溪谷脑炎病毒(MVEV)；圣路易脑炎病毒(SLEV)；尤苏它病毒(USUV)；西尼罗病毒(WNV)；雅温德病毒(YAOV)；科科贝拉病毒(KOKV)；巴格扎病毒(BAGV)；伊利乌斯病毒(ILHV)；以色列土耳其脑脊膜脑脊髓炎病毒(ITV)；恩塔亚病毒(NTAV)；坦布苏病毒(TMUV)；寨卡病毒(ZIKV)；斑齐病毒(BANV)；博博衣病毒(BOUV)；埃杰山病毒(EHV)；朱格拉病毒(JUGV)；萨博亚病毒(SABV)；塞皮克病毒(SEPV)；乌干达S病毒(UGSV)；韦塞尔斯布朗病毒(WESSV)；黄热病病毒(YFV)；恩特伯蝙蝠病毒(ENTV)；横濑病毒(YOKV)；阿波衣病毒(APOIV)；牛骨山脊病毒(CRV)；朱蒂亚帕病毒(JUTV)；摩多克病毒(MODV)；Sal Vieja病毒(SVV)；San Perlita病毒(SPV)；布卡拉沙蝙蝠病毒(BBV)；卡勒岛病毒(CIV)；达喀尔蝙蝠病毒(DBV)；蒙大拿鼠耳蝙蝠白细胞脑炎病毒(MMLV)；粉判蝙蝠病毒(PPBV)；里奥布拉伏病毒(RBV)。丙型肝炎病毒属包括丙型肝炎病毒(HCV，Hep C)。鼠疫病毒属包括边境病病毒；牛病毒性腹泻病毒(BVDV)；以及传统猪瘟病毒。由黄病毒引起的或与该病毒相关的疾病包括：登革热、日本脑炎，基亚萨努森林病，澳洲墨莱溪谷脑炎，圣路易脑炎，蜱传脑炎，西尼罗河脑炎以及黄热病。由丙型肝炎病毒引起的或与该病毒相关的疾病包括丙型肝炎病毒感染。由鼠疫病毒引起的或与该病毒相关的疾病包括经典猪瘟(CSF)和牛病毒性腹泻(BVD)或牛病毒性腹泻/粘膜病(BVD/MD)。
在一些实施方式中，脂质颗粒可用于治疗、预防和/或监测由属于肝DNA病毒科的病毒引起的或与该病毒相关的疾病或病症。肝DNA病毒科包括正嗜肝DNA病毒属和禽嗜肝DNA病毒属，正嗜肝DNA病毒属包括乙型肝炎病毒，禽嗜肝DNA病毒属包括鸭乙型肝炎病毒。由肝DNA病毒科引起的或与该病毒相关的疾病包括乙型肝炎病毒感染。
在一些实施方式中，脂质颗粒可用于治疗、预防和/或监测属于逆转录病毒科的病毒引起的或与该病毒相关的疾病或病症。逆转录病毒科包括：α逆转录病毒属，包括禽类白细胞增生病毒；β逆转录病毒属，包括小鼠乳腺瘤病毒；γ逆转录病毒属，包括鼠白血病病毒和猫白血病病毒；δ逆转录病毒属，包括牛白血病病毒和人T淋巴细胞病毒；ε逆转录病毒属，包括大眼梭鲈皮肤肉瘤病毒；慢病毒属，包括人类免疫缺陷病毒1，猿免疫缺陷病毒以及猫免疫缺陷病毒；泡沫病毒属，包括黑猩猩泡沫病毒。由属于逆转录病毒科的病毒引起的或与该病毒相关的疾病和病症包括HIV 1感染。
在一些实施方式中，脂质颗粒可用于治疗、预防和/或监测由含糖蛋白的病毒引起的或与该病毒相关的疾病或病症。当脂质颗粒作为组合物的一部分给药于受治疗者(例如人类)时，该脂质颗粒可用于治疗和预防感染，例如病毒感染。在一些实施方式中，这样的感染可为由含糖蛋白的病毒(即含有至少一种糖蛋白的病毒)引起的或与该病毒相关的感染。而在一些实施方式中，这样的感染可为肝炎感染，例如HCV感染或HBV感染。而在一些实施方式中，这样的感染可为逆转录病毒感染，例如HIV。而在一些实施方式中，所述感染可为黄病毒感染，例如HCV。当脂质颗粒用于治疗HIV感染时，它可减轻从HIV感染的细胞分泌的HIV颗粒的感染性。
当脂质颗粒用于治疗HCV感染时，它可干扰细胞LD并降低从HCV感染的细胞分泌的HCV颗粒的感染性。在这样的情况下，含有PE、PC、PI以及PS脂质的脂质颗粒可为优选的。
尽管本发明受到其操作理论的限制，但发明人认为含有PE、PC、PI以及PS脂质的脂质颗粒可竞争与HCV相同的细胞受体，因此胜于病毒进入细胞，降低病毒感染性。
活性剂
在一些实施方式中，诸如治疗剂或显像剂之类的至少一种药剂可被包裹在脂质颗粒内。这样的药剂可为例如水溶性分子、肽或氨基酸。包含具有包裹的活性剂的脂质颗粒的组合物可用于治疗、预防或监测已知所述活性剂对之有效的疾病或病症。所述疾病或病症可为所述活性剂的细胞内递送对之有益的任何疾病或病症。
含有PI和/或PS脂质的脂质颗粒的使用可使得包裹的物质递送至细胞的ER内腔中。
在一些实施方式中，包裹在脂质颗粒内的药剂可为α-糖苷酶抑制剂。在一些实施方式中，α-糖苷酶抑制剂可为ERα-糖苷酶抑制剂，ERα-糖苷酶抑制剂可为ERα-糖苷酶I抑制剂或ERα-糖苷酶II抑制剂。通常，可使用ERα-糖苷酶抑制剂来靶向依赖于与钙联接蛋白和/或钙网织蛋白相互作用以进行其病毒包膜糖蛋白合适折叠的任何病毒。
所述α-糖苷酶抑制剂可为这样的药剂，即，与不存在该药剂的情况下α-糖苷酶的酶活性相比，该药剂抑制宿主α-糖苷酶的酶活性至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％或更多。术语“α-糖苷酶抑制剂”包括抑制宿主α-糖苷酶活性的天然存在的药剂和合成的药剂。合适的α-糖苷酶抑制剂包括但不限于：脱氧野尻霉素和N-取代脱氧野尻霉素，例如通式I的化合物及其药学上可接受的盐：
Figure BPA00001257448500141
其中，R1选自：取代或非取代烷基，该烷基可为支链或直链烷基；取代或非取代环烷基；取代或非取代芳基；取代或非取代氧杂烷基；取代或非取代芳烷基，环烷基烷基，并且其中W、X、Y以及Z各自独立地选自：氢、烷酰基、芳酰基以及卤代烷酰基。
在一些实施方式中，R1可选自C1-C20烷基或C3-C12烷基。在一些实施方式中，R1可选自：乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、新戊基、异戊基、正己基、庚基、正辛基、正壬基以及正癸基。在一些实施方式中，R1可为丁基或壬基。
在一些实施方式中，R1可为氧杂烷基，所述氧杂烷基可为C1-C20烷基或C3-C12烷基，所述氧杂烷基还可含有1至5个或1至3个或1至2个氧原子。氧杂烷基的实例包括：-(CH2)2O(CH2)5CH3、-(CH2)2O(CH2)6CH3、-(CH2)6OCH2CH3以及-(CH2)2OCH2CH2CH3。
在一些实施方式中，R1可为芳烷基。芳烷基的实例包括：C1-C12-苯基，例如C3-苯基、C4-苯基、C5-苯基、C6-苯基以及C7-苯基。
在一些实施方式中，通式I的化合物可选自但不限于下述化合物及其药物上可接受的盐以及它们中的任何两种或多种的混合物：N-(正己基-)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-山梨醇；N-(正庚基-)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-山梨醇；N-(正辛基-)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-山梨醇；N-(正辛基-)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-山梨醇四丁酸酯；N-(正壬基-)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-山梨醇四丁酸酯；N-(正癸基-)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-山梨醇四丁酸酯；N-(正十一烷基-)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-山梨醇四丁酸酯；N-(正壬基-)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-山梨醇；N-(正癸基-)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-山梨醇；N-(正十一烷基-)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-山梨醇；N-(正十二烷基-)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-山梨醇；N-(2-乙基己基)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-山梨醇；N-(4-乙基己基)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-山梨醇；N-(5-甲基己基)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-山梨醇；N-(3-丙基己基)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-山梨醇；N-(1-戊基戊基己基)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-山梨醇；N-(1-丁基丁基)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-山梨醇；N-(7-甲基辛基-)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-山梨醇；N-(8-甲基壬基)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-山梨醇；N-(9-甲基癸基)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-山梨醇；N-(10-甲基十一烷基)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-山梨醇；N-(6-环己基己基-)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-山梨醇；N-(4-环己基丁基)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-山梨醇；N-(2-环己基乙基)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-山梨醇；N-(1-环己基甲基)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-山梨醇；N-(1-苯基甲基)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-山梨醇；N-(3-苯基丙基)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-山梨醇；N-(3-(4-甲基)-苯基丙基)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-山梨醇；N-(6-苯基己基)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-山梨醇；N-(正壬基-)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-山梨醇四丁酸酯；N-(正癸基-)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-山梨醇四丁酸酯；N-(正十一烷基-)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-山梨醇四丁酸酯；N-(正十二烷基-)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-山梨醇四丁酸酯；N-(2-乙基己基)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-山梨醇四丁酸酯；N-(4-乙基己基)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-山梨醇四丁酸酯；N-(5-甲基己基)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-山梨醇四丁酸酯；N-(3-丙基己基)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-山梨醇四丁酸酯；N-(1-戊基戊基己基)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-山梨醇四丁酸酯；N-(1-丁基丁基)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-山梨醇四丁酸酯；N-(7-甲基辛基-)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-山梨醇四丁酸酯；N-(8-甲基壬基)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-山梨醇四丁酸酯；N-(9-甲基癸基)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-山梨醇四丁酸酯；N-(10-甲基十一烷基)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-山梨醇四丁酸酯；N-(6-环己基己基-)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-山梨醇四丁酸酯；N-(4-环己基丁基)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-山梨醇四丁酸酯；N-(2-环己基乙基)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-山梨醇四丁酸酯；N-(1-环己基甲基)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-山梨醇四丁酸酯；N-(1-苯基甲基)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-山梨醇四丁酸酯；N-(3-苯基丙基)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-山梨醇四丁酸酯；N-(3-(4-甲基)-苯基丙基)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-山梨醇四丁酸酯；N-(6-苯基己基)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-山梨醇四丁酸酯。
N-取代脱氧野尻霉素可对下列美国专利中公开的疾病和病症有效：第4,849,430号；第4,876,268号；第5,411,970号；第5,472,969号；第5,643,888号；第6,225,325号；第6,465,487号；第6,465,488号；第6,515,028号；第6,689,759号；第6,809,083号；第6,583,158号；第6589,964号；第6,599,919号；第6,916,829号；第7,141,582号。N-取代脱氧野尻霉素可对下列疾病和病症有效，包括但不限于：HIV感染；包括丙型肝炎和乙型肝炎感染在内的肝炎感染；包括泰-萨克斯病、戈谢病、克拉贝病和法勃雷病在内的溶酶体脂质贮积病；以及纤维囊泡症。
在一些实施方式中，α-糖苷酶抑制剂可为N-氧杂烷基化脱氧野尻霉素或N-烷氧基脱氧野尻霉素，例如美国专利第4,639,436号中描述的N-羟乙基脱氧野尻霉素(Miglitol或Glyset)。
在一些实施方式中，α-糖苷酶抑制剂可为澳粟精胺和/或澳粟精胺衍生物，例如美国专利申请第2006/0194835号中公开的通式(I)的化合物及其药学上可接受的盐，包括6-O-丁酰基澳粟精胺(西戈斯韦)和PCT公布号WO01054692中公开的通式II的化合物及其药学上可接受的盐。
澳粟精胺及其衍生物对下列美国专利中公开的疾病和病症有效：第4,792,558号、第4,837,237号、第4,925,796号、第4,952,585号、第5,004,746号、第5,214,050号、第5,264,356号、第5,385,911号、第5,643,888号、第5,691,346号、第5,750,648号、第5,837,709号、第5,908,867号、第6,136,820号、第6,583,158号、第6,589,964号、第6,656,912号，以及美国专利申请公布第20020006909号、第20020188011号、第20060093577号、第20060194835号、第20080131398号。澳粟精胺及其衍生物可下列疾病和病症有效，包括但不限于：包括HIV感染在内的逆转录病毒感染；脑型疟疾；包括乙型肝炎和丙型肝炎感染在内的肝炎感染；糖尿病以及溶酶体脂质贮积病。
在一些实施方式中，α糖苷酶抑制剂可为阿卡玻糖[O-4，6-二脱氧-4-[[(1S，4R，5S，6S)-4，5，6-三羟基-3-(羟甲基)-2-环-己-1-基]氨基]-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-O-→-D-吡喃葡萄糖基-(1-→4)-D-葡萄糖)或Precose
Figure BPA00001257448500171
阿卡玻糖在美国专利第4,904,769号中公开。在一些实施方式中，α糖苷酶抑制剂可为阿卡玻糖的高度纯化形式(参见，例如，美国专利第4,904,769号)。
在一些实施方式中，包裹在脂质体内的药剂可为离子通道抑制剂。在一些实施方式中，所述离子通道抑制剂可为抑制HCV p7蛋白活性的药剂。离子通道抑制剂及其鉴定方法在美国专利公布2004/0110795中详细论述。合适的离子通道抑制剂包括通式I的化合物及其药学上可接受的盐，包括N-(7-氧杂壬基)-1，5，6-三脱氧-1，5-亚氨基-D-半乳糖醇(N-7-氧杂壬基-6-MeDGJ或UT231B)以及N-10-氧杂十一烷基-6-MeDGJ。合适的离子通道抑制剂还包括但不限于：N-壬基脱氧野尻霉素、N-壬基脱氧半乳糖野尻霉素以及N-氧杂壬基脱氧半乳糖野尻霉素。
在一些实施方式中，包裹在脂质体内的药剂可为亚氨基糖。合适的亚氨糖包括天然存在的亚氨基糖和合成的亚氨基糖。
在一些实施方式中，所述亚氨基糖可为脱氧野尻霉素或N-取代脱氧野尻霉素衍生物。合适的N-取代脱氧野尻霉素衍生物的实例包括但不限于：本申请通式II的化合物，美国专利第6,545,021号的通式I的化合物，以及N-氧杂烷基化脱氧野尻霉素，例如美国专利第4,639,436号中描述的N-羟乙基脱氧野尻霉素(Miglitol或Glyset
Figure BPA00001257448500172
)。
在一些实施方式中，亚氨基糖可为澳粟精胺或澳粟精胺衍生物。合适的澳粟精胺衍生物包括但不限于：美国专利申请第2006/0194835号中公开的通式I的化合物及其药学上可接受的盐，以及PCT公布号WO01054692中公开的通式II的化合物及其药学上可接受的盐。
在一些实施方式中，亚氨基糖可为脱氧半乳糖野尻霉素或其N-取代衍生物，例如PCT公布号WO99/24401和WO01/10429中公开的那些。合适的N-取代脱氧半乳糖野尻霉素衍生物的实例包括但不限于：N-烷基化脱氧半乳糖野尻霉素(N-烷基-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-半乳糖醇)，例如N-壬基脱氧半乳糖野尻霉素和N-氧杂烷基化脱氧半乳糖野尻霉素(N-氧杂-烷基-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-半乳糖醇)，例如N-7-氧杂壬基脱氧半乳糖野尻霉素。
在一些实施方式中，亚氨基糖可为N-取代1，5，6-三脱氧-1，5-亚氨基-D-半乳糖醇(N-取代MeDGJ)，包括但不限于通式II的化合物：
Figure BPA00001257448500181
其中，R选自取代或非取代烷基，取代或非取代环烷基，取代或非取代杂环基，或取代或非取代氧杂烷基。在一些实施方式中，取代或非取代烷基和/或取代或非取代氧杂烷基包含1至16个碳原子，或4至12个碳原子，或8至10个碳原子。在一些实施方式中，取代或非取代烷基和/或取代或非取代氧杂烷基包含1至4个氧原子，在其他实施方式中包含1至2个氧原子。在其他实施方式中，取代或非取代烷基和/或取代或非取代氧杂烷基包含1至16个碳原子和1至4个氧原子。因此，在一些实施方式中，R选自但不限于：-(CH2)6OCH3、-(CH2)6OCH2CH3、-(CH2)6O(CH2)2CH3、-(CH2)6O(CH2)3CH3、-(CH2)2O(CH2)5CH3、-(CH2)2O(CH2)6CH3以及-(CH2)2O(CH2)7CH3。N-取代MeDGJ在例如PCT公布号WO01/10429中公开。
在一些实施方式中，包裹在脂质体内的药剂可包括具有通式III的含氮化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BPA00001257448500182
其中，R12是诸如C1-C20或C1-C6或C7-C12或C8-C16之类的烷基，并还可含有1至5个或1至3个或1至2个氧，R12可为氧杂取代的烷基衍生物。氧杂取代的烷基衍生物的实例包括3-氧杂壬基、3-氧杂癸基、7-氧杂壬基以及7-氧杂癸基。
R2是氢，R3是羧基，或C1-C4烷氧基羰基或R2和R3一起是或-(CXY)n-其中，n是3或4，各X独立地是氢、羟基、氨基、羧基、C1-C4烷基羧基、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4羟基烷基、C1-C6酰氧基或芳酰氧基，各Y独立地是氢、羟基、氨基、羧基、C1-C4烷基羧基、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4羟基烷基、C1-C6酰氧基、芳酰氧基，或者是缺失(即不存在)；
R4是氢或缺失(即不存在)；以及
R5是氢、羟基、氨基、取代氨基、羧基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷基、芳基、芳烷基、烷氧基、羟基烷基、酰氧基或芳酰氧基，或R3和R5一起形成苯基且R4缺失(即不存在)。
在一些实施方式中，含氮化合物具有下列通式：
Figure BPA00001257448500192
Figure BPA00001257448500201
其中，R6-R10各自独立地选自下列基团：氢、羟基、氨基、羧基、C1-C4烷基羧基、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4羟基烷基、C1-C4酰氧基以及芳酰氧基，R11是氢或C1-C6烷基。所述含氮化合物可为N-烷基化哌啶、N-氧杂烷基化哌啶、N-烷基化吡咯烷、N-氧杂烷基化吡咯烷、N-烷基化苯胺、N-氧杂烷基化苯胺、N-烷基化吡啶、N-氧杂烷基化吡啶、N-烷基化吡咯、N-氧杂烷基化吡咯、N-烷基化氨基酸或N-氧杂烷基化氨基酸。在一些实施方式中，N-烷基化哌啶、N-氧杂烷基化哌啶、N-烷基化吡咯烷或N-氧杂烷基化吡咯烷化合物可为亚氨基糖。例如，在一些实施方式中，所述含氮化合物可为具有如下通式的N-烷基-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-半乳糖醇(N-烷基-DGJ)或N-氧杂-烷基-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-半乳糖醇(N-氧杂-烷基-DGJ)，
或具有如下通式的N-烷基-1，5，6-三脱氧-1，5-亚氨基-D-半乳糖醇(N-烷基-MeDGJ)或N-氧杂-烷基-1，5，6-三脱氧-1，5-亚氨基-D-半乳糖醇(N-氧杂-烷基-MeDGJ)：
Figure BPA00001257448500203
除非另外指明碳原子的数目，本文所使用的基团具有下列特性：烷基具有1至20个碳原子，为直链或支链，取代或非取代的。烷氧基具有1至16个碳原子，为直链或支链，取代或非取代的。烷氧基羰基为具有2至16个碳原子的酯基。烯氧基具有2至16个碳原子，1至6个双键，为直链或支链，取代或非取代的。炔氧基具有2至16个碳原子，1至3个三键，为直链或支链，取代或非取代的。芳基具有6至14个碳原子(例如，苯基)，为取代或非取代的。芳烷氧基(例如，苯氧基)和芳酰氧基(例如，苯酰氧基)具有7至15个碳原子，为取代或非取代的。氨基可为伯氨基、仲氨基、叔氨基或季氨基(即，取代的氨基)。氨基羰基为具有1至32个碳原子的酰氨基(例如，取代的酰氨基)。取代基可包括选自下述的取代基：卤素、羟基、C1-C10烷基、C2-10烯基、C1-10酰基或C1-10烷氧基。
N-烷基化氨基酸可为N-烷基化的天然存在的氨基酸，例如N-烷基化的α-氨基酸。天然存在的氨基酸为20种常见的α-氨基酸(Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Ser、Thr、Asp、Asn、Lys、Glu、Gln、Arg、His、Phe、Cys、Trp、Tyr、Met以及Pro)之一，以及作为天然产物的其他氨基酸，例如，正亮氨酸、乙基甘氨酸、鸟氨酸、甲基丁烯基-甲基苏氨酸以及苯基甘氨酸。氨基酸侧链(例如R5)的实例包括H(甘氨酸)、甲基(丙氨酸)、-CH2C(O)NH2(天门冬酰胺)、-CH2-SH(半胱氨酸)以及-CH(OH)CH3(苏氨酸)。
N-烷基化化合物可通过对氨基(或亚氨基)化合物进行还原烷基化来制备。例如，可将氨基或亚氨基化合物暴露于醛和还原剂(例如，氰基硼氢化钠)以对胺进行N-烷基化。类似地，N-氧杂烷基化化合物可通过对氨基(或亚氨基)化合物进行还原烷基化来制备。例如，可将氨基或亚氨基化合物暴露于氧杂醛和还原剂(例如，氰基硼氢化钠)以对胺进行N-氧杂烷基化。
所述含氮化合物可包含一种或一种以上保护基团。各种保护基团是公知的。通常，保护基团的种类并不重要，只要它在化合物其他位置上的任何后续反应的条件下是稳定的，并且在合适的时候可被除去而不对该分子的其余部分产生不利影响。另外，在实质性的合成转化完成之后保护基团可被另一保护基团取代。明显地，如果化合物与本文公开的化合物的区别仅在于所公开的化合物的一种或一种以上保护基团已被不同的保护基团取代，那么该化合物在本发明的范围内。其他实例和条件可参见Greene，Protective Groups in Organic Chemistry，(第1版，1981，Greene和Wuts，第2版，1991)。
所述含氮化合物可通过例如结晶或色谱方法来进行纯化。该化合物可使用立体特异性氨基或亚氨基化合物作为起始材料以立体特异性的方式来制备。
在长链N-烷基化化合物的制备中用作起始材料的氨基和亚氨基化合物可商购获得(Sigma，St.Louis，MO；Cambridge Research Biochemicals，Norwich，Cheshire，United Kingdom；Toronto Research Chemicals，Ontario，Canada)或可通过已知的合成方法来制备。例如，所述化合物可为N-烷基化亚氨基糖化合物或其氧杂-取代的衍生物。亚氨基糖可为例如脱氧半乳糖野尻霉素(DGJ)、1-甲基-脱氧半乳糖野尻霉素(MeDGJ)、脱氧野尻霉素(DNJ)、altrostatin、2R，5R-二羟基甲基-3R，4R-二羟基吡咯烷(DMDP)，或其衍生物、对映异构体或立体异构体。
在一些实施方式中，包裹在脂质颗粒内的药剂可为通式IV或通式V的化合物：
Figure BPA00001257448500221
其中，R是：
Figure BPA00001257448500222
R′是：
Figure BPA00001257448500231
R1是取代或非取代烷基，R2是取代或非取代烷基，W1-4独立地选自：氢、取代或非取代烷基、取代或非取代卤代烷基、取代或非取代烷酰基、取代或非取代芳酰基或取代或非取代卤代烷酰基；X1-5独立地选自：H、NO2、N3或NH2；Y不存在或是除了羰基外的取代或非取代C1-烷基，Z选自化学键或NH；条件是当Z是化学键时，Y不存在，以及条件是当Z是NH时，Y是除了羰基外的取代或非取代C1-烷基；Z′是化学键或NH。通式IV和V的化合物及其合成方法在例如美国专利公布号US2007/0275998中公开。通式IV和V的化合物的非限制性实施例包括N-(N′-{4′叠氮基-2′-硝基苯基)-6-氨基己基)-脱氧野尻霉素(NAP-DNJ)和N-(N′-{2，4-二硝基苯基)-6-氨基己基)-脱氧野尻霉素(NDP-DNJ)。
多种亚氨基糖化合物的合成已有描述。例如，合成DNJ衍生物的方法已知，在例如美国专利第5,622,972号、第5,401,645号、第5,200,523号、第5,043,273号、第4,994,572号、第4,246,345号、第4,266,025号、第4,405,714号以及第4,806,650号中描述。合成其他亚氨基糖衍生物的方法已知，在例如美国专利第4,861,892号、第4,894,388号、第4,910,310号、第4,996,329号、第5,011,929号、第5,013,842号、第5,017,704号、第5,580,884号、第5,286,877号以及第5,100,797号和PCT公布号WO 01/10429中描述。2R，5R-二羟基甲基-3R，4R-二羟基吡咯烷(DMDP)的对映异构体特异性合成由Fleet和Smith(Tetrahedron Lett.26：1469-1472，1985)描述。
显像剂可为标记的或荧光水性材料，例如钙黄绿素，或荧光标记的分子，例如siRNA、抗体或其他小分子抑制剂。标记的亲脂材料也可掺入脂质颗粒中以掺入细胞膜，例如用于对细胞中的脂质体显像的rh-PE脂质和用于显像或纯化的带有标记物的其他相似脂质。这还可包括用于显像或纯化的带有荧光部分(moiety)或其他标记物的标记的亲脂蛋白或药物。
靶向部分
在一些实施方式中，包含脂质颗粒的组合物可含有至少一种靶向部分，该靶向部分可与脂质颗粒共轭或嵌入该颗粒的脂质层或脂质双层。在一些实施方式中，所述靶向部分可为配体或抗体，所述配体可为病毒包膜蛋白的配体，所述抗体可为针对病毒包膜蛋白的抗体。这样的部分可用于将所述颗粒靶向受病毒感染的细胞。这样的靶向部分还可用于实现针对与病毒相关或由病毒引起的病毒感染的消除性免疫。
在一些实施方式中，所述靶向部分可包括gp120/gp41靶向部分。在这样的情况中，包含脂质颗粒的组合物可优选用于治疗和/或预防HIV-1感染。gp120/gp41靶向部分可包括sCD4分子或单克隆抗体，例如IgG 2F5或IgG b12抗体。
在一些实施方式中，所述靶向部分可包括E1或E2靶向部分，例如来自HCV的E1或E2蛋白。在这样的情况中，包含脂质颗粒的组合物可优选用于治疗和/或预防HCV感染。在一些情况中，靶向部分还可以是靶向E1和/或E2蛋白的分子(例如这些蛋白的特异性抗体)，和细胞受体的可溶性部分(例如可溶性CD81或SR-BI分子)。
嵌入部分
在一些实施方式中，脂质颗粒可含有嵌入其脂质层或脂质双层的一种或一种以上部分。嵌入部分的实例包括但不限于：跨膜蛋白，蛋白质脂质共轭物，标记的脂质，亲脂化合物或它们的任何组合。
在一些实施方式中，嵌入部分可包括脂质-PEG共轭物。这样的共轭物可增加脂质颗粒的体内稳定性和/或增加其循环时间。
在一些实施方式中，嵌入部分可包括长烷基链亚氨基糖，例如，C7-C16烷基或氧杂烷基取代的N-脱氧野尻霉素(DNJ)或C7-C16烷基或氧杂烷基取代的脱氧半乳糖野尻霉素(DGJ)。长烷基链亚氨基糖的非限制性实例包括N-壬基DNJ和N-壬基DGJ。
在一些实施方式中，嵌入部分可包括荧光团-脂质共轭物，荧光团-脂质共轭物可用于标记与脂质双层颗粒接触的细胞的ER膜。这样的标记可用于原核细胞内的活细胞显像和/或固定细胞显像。
含有PI和/或PS脂质的脂质颗粒的使用可导致将嵌入部分递送至细胞的ER膜中。
多不饱和脂质颗粒
本发明的发明人还认为含有至少一种多不饱和脂质的脂质颗粒(例如脂质体)可有效治疗和/或预防受治疗者(例如人类)体内的感染，例如病毒感染。
在一些实施方式中，所述多不饱和脂质可构成脂质颗粒的总脂质的至少5％(按摩尔)或至少10％(按摩尔)或至少15％(按摩尔)或至少20％(按摩尔)或至少25％(按摩尔)或至少30％(按摩尔)或至少35％(按摩尔)或至少40％(按摩尔)或至少45％(按摩尔)或至少50％(按摩尔)或至少55％(按摩尔)或至少60％(按摩尔)或至少65％(按摩尔)或至少70％(按摩尔)或至少75％(按摩尔)或至少80％(按摩尔)或至少85％(按摩尔)或至少90％(按摩尔)或至少95％(按摩尔)。
本文所使用的术语“多不饱和脂质”是指在其疏水尾端中含有一个以上不饱和化学键(例如双键或三键)的脂质。
在一些实施方式中，多不饱和脂质在其疏水尾端中可具有2至8个或3至7个或4至6个双键。
本文所使用的术语“多不饱和脂质颗粒”是指含有至少一种多不饱和脂质的脂质颗粒。
在一些实施方式中，所述脂质颗粒可含有一种以上多不饱和脂质。
优选地，所述多不饱和脂质颗粒含有多不饱和PE或多不饱和PC脂质中的至少一种。图22A-D提供了示例的多不饱和PE和PC脂质的化学结构。
所述脂质颗粒还可含有一种或一种以上其他脂质(例如，PI、PS或CHEMS)。
含有多不饱和PE或多不饱和PC脂质中的至少一种脂质的多不饱和脂质颗粒可用于治疗、预防和/或监测病毒引起或与病毒相关的疾病或病症，例如上文公开的疾病或病症。在许多实施方式中，这样的疾病或病症可为病毒感染。在一些实施方式中，这样的感染可为肝炎感染，例如HCV感染或HBV感染。而在一些实施方式中，这样的感染可为诸如HIV之类的逆转录病毒感染。而在一些实施方式中，所述感染可为黄病毒感染，例如HCV感染。
在一些实施方式中，所述多不饱和脂质颗粒可包裹至少一种活性剂，例如上文公开的药剂。
在一些实施方式中，所述多不饱和脂质颗粒可含有嵌入所述颗粒的脂质层或脂质双层中的至少一种部分，所述部分可为上文公开的任何嵌入部分。
在一些实施方式中，包含脂质颗粒的组合物可含有与该颗粒结合的靶向部分，该靶向部分又可为上文公开的任何靶向部分。
在一些实施方式中，含有PE、PC、PI以及PS脂质(其中至少一种是不饱和的)的多不饱和脂质颗粒可优选用于治疗或预防HCV感染。尽管本发明不受其操作理论的限制，发明人认为含有PE、PC、PI以及PS脂质的多不饱和脂质颗粒可显著降低HCV病毒体从HCV感染的细胞分泌，这是因为多不饱和脂质递送至HCV复制的部位(该部位是ER膜)可减少HCV RNA复制和后续的HCV分泌。
给药
在一些实施方式中，可将包含脂质颗粒的组合物给药于细胞。所述细胞可为受病毒感染的细胞。在许多情况中，所接触的细胞可为温血动物(例如哺乳动物或鸟类)的细胞。在一些实施方式中，所接触的细胞可为人类的细胞。在一些实施方式中，将所述包含脂质颗粒的组合物给药于个体。受治疗者可为温血动物，例如哺乳动物或鸟类。在许多情况中，受治疗者可为人类。在一些实施方式中，所述包含脂质颗粒的组合物可通过静脉注射给药。而在一些实施方式中，所述包含脂质颗粒的组合物可通过除了静脉注射以外的胃肠外途径给药，所述胃肠外途径例如腹膜内途径、皮下途径、真皮内途径、表皮内途径、肌内途径或经皮肤途径。而在一些实施方式中，所述包含脂质颗粒的组合物可经粘膜表面给药，所述粘膜表面例如，眼、鼻内、肺、肠、直肠或泌尿道表面。含有脂质的组合物(例如脂质体组合物)的给药途径在例如“A.S.Ulrich，Biophysical Aspects of Using Liposomes as Delivery Vehicles，Bioscience Reports，第22卷，第2版，2002年4月，129-150”中公开。
与非脂质体方法相比，经脂质颗粒(例如脂质体)将诸如NB-DNJ之类的治疗剂递送至ER内腔中可降低抑制ER-糖苷酶所需的该治疗剂的有效量。例如，对于NB-DNJ而言，IC90可减小至少100、或至少500、或至少1000、或至少5000、或至少10000、或至少50000或至少100000。NB-DNJ的有效抗病毒量的这种减小可导致所给药的NB-DNJ的终浓度低于哺乳动物(特别人类)体内毒性水平一个或一个以上数量级。
在一些情况中，可使包含含有治疗剂(例如NB-DNJ)的脂质颗粒的组合物与一种或一种以上其他治疗剂(例如抗病毒剂)联合可与感染的细胞接触。在一些情况中，这些其他治疗剂可与NB-DNJ一同包裹在脂质颗粒中。而在一些情况中，使感染的细胞与这些其他治疗剂的接触可导致将所述其他治疗剂施用于包含所述细胞的受治疗者。所述其他治疗剂的给药可通过将所述治疗剂添加至所述组合物来进行。而在一些情况中，所述其他治疗剂的给药可与包含含有NB-DNJ的脂质颗粒的组合物的给药分开进行。这样的分开给药可通过与包含脂质颗粒的组合物相同或不同的给药途径来进行。
联合治疗不仅可减小抗病毒活性所需的药剂的有效剂量，由此降低其毒性，而且还可改进由于通过多重机制攻击病毒而导致的绝对抗病毒作用。
另外，联合治疗可提供防止或减少发生病毒抗药性的发生机会的方式。
可与含有NB-DNJ的脂质体联合使用的具体其他治疗剂可取决于所治疗的疾病或病症。例如，对于诸如HBV、HCV或BVDV感染之类的肝炎感染，这样的治疗剂可为核苷或核苷酸抗病毒剂和/或免疫刺激剂/免疫调节剂。可与NB-DNJ联合用于治疗肝炎的各种核苷药剂、核苷酸药剂以及免疫刺激剂/免疫调节剂在2004年2月10日授予Jacob等人的美国专利第6,689,759号中举例说明。例如，对于丙型肝炎感染的治疗而言，可将NB-DNJ与作为核苷药剂的l-b-D-呋喃核糖基-1H-1，2，4-三唑-3-羧酰胺(利巴韦林)和作为免疫刺激剂/免疫调节剂的干扰素(例如干扰素α)联合包裹在脂质体中。使用利巴韦林和/或干扰素治疗肝炎感染在例如美国专利第6,172,046号、第6,177,074号、第6,299,872号、第6,387,365号、第6,472,373号、第6,524,570号以及第6,824,768号中讨论。
对于治疗HIV感染而言，可与含有NB-DNJ的脂质体联合使用的治疗剂可为抗HIV剂，所述抗HIV剂可为例如核苷逆转录酶(RT)抑制剂，例如(-)-2′-脱氧-3′-硫代胞苷-5′-三磷酸盐(3TC)；(-)-顺式-5-氟代-1-[2-(羟基-甲基)-[1，3-氧硫杂环戊-5-基]胞嘧啶(FTC)；3′-叠氮基-3′-脱氧胸腺嘧啶(AZT)和二脱氧-肌苷(ddI)；非核苷逆转录酶抑制剂，例如N11-环丙基-4-甲基-5，11-二氢-6H-二吡啶[3，2-b：2′3′-e]-[1，4]二氮杂-6-酮(奈韦拉平)、蛋白酶抑制剂或它们的组合。抗HIV治疗剂可两种或三种联合使用，例如AZT、DDI以及奈韦拉平联合。
在一些实施方式中，包裹在脂质颗粒内的药剂可为例如在美国专利申请第11/832,891号的第14-20页公开的药剂，该文献在此通过引用完整并入。当脂质颗粒的脂质与ER膜融合后，脂质颗粒可将所包裹的药剂递送至ER的内腔中。
标记的脂质
在一些实施方式中，所述脂质颗粒可包括至少一种标记的脂质，该标记的脂质使用至少一种标记物(例如，放射性标记物、荧光团标记物或生物素标记物)进行标记，由此使得所述颗粒自身被标记。
所述标记的脂质颗粒可用于特异性标记细胞的ER膜，之后可对细胞的ER膜显像。通过该技术可显像的细胞类型并非特别受限。可通过例如活动显像或固定显像来进行显像。固定显像可指对可使用固定介质(例如多聚甲醛)固定的死亡细胞进行显像。可对细胞进行透化并用抗体对细胞进行标记以在固定和显像之前检测特定的蛋白或标记物。对于活细胞显微术而言，在发生显像的同时细胞在介质中仍旧是活的。
标记的颗粒可用于标记病毒。可使用这样的方法进行标记的病毒的实例包括ER出芽病毒(例如BVDV和HCV)。当所述标记物为荧光团标记物时，所标记的脂质双层颗粒可用于对标记的病毒进行显像，所述显像可为活动显像和/或固定显像。当所述标记物为生物素标记物时，标记的脂质颗粒可用于纯化标记的病毒颗粒。在一些情况中，可使用链酶亲和素进行这样的纯化。链酶亲和素可与琼脂糖凝胶微珠连接用于分批纯化生物素标记的物质。
本发明进一步通过下列实施例来举例说明，但不限于这些实施例。
实施例
1.脂质体制备
制备新鲜脂质体用于所描述的所有测定。将脂质的氯仿溶液置于玻璃试管中，在氮气气流下蒸发溶剂。除非另有说明，通过在1×PBS缓冲液中进行涡旋振荡将脂质膜水合至脂质终浓度为5mM。使用微型挤压机(Mini-Extruder)装置通过孔直径为100nm的聚碳酸酯过滤器挤压所产生的多层囊泡11次。使用0.22μm过滤装置对脂质体进行过滤灭菌。图1(A)-(E)显示了这些研究中使用的脂质：A.DOPE；B.DOPC；C.CHEMS；D.PI；E.PS。实验中使用的PEG-PE是PEG(MW-2000)-二硬酯酰基磷脂酰乙醇胺。除了胆甾醇半琥珀酸酯以外的所有脂质均购自Avanti Polar Lipids(USA)，所有用于制备脂质体的材料也均购自Avanti Polar Lipids(USA)。胆甾醇半琥珀酸酯购自Sigma(UK)。
2.含有PI和/或PS的脂质体定位至ER
该实验的目的是使用含有PE和PC或CHEMS的脂质体(有或没有PI和/或PS)来处理Huh7.5细胞(人肝细胞)，以测定它们与ER膜的共定位。通过将若丹明标记的PE(Rh-PE)掺入所有脂质体来对脂质体进行标记。使用抗EDEM抗体来标记Huh7.5细胞的ER膜。EDEM抗体购自Santa Cruz Biotechnology (USA)。通过共聚焦显微术来测定共定位。明显的共定位可用作脂质体与Huh7.5细胞的ER膜融合的证据。
2.1用于对脂质体与脂质体处理的Huh7.5细胞的ER膜共定位进行显像的具体方法：
具有脂质构成PE∶CH、PE∶PC、PE∶CH∶PI、PE∶PC∶PI、PE∶CH∶PS、PE∶PC∶PS、PE∶CH∶PI∶PS以及PE∶PC∶PI∶PS的脂质体如先前所述制备，包含用于显像的1％(总摩尔)的Rh-PE。使Huh7.5细胞过夜附着至1.5号盖玻片上，然后使用含有添加至脂质终浓度为50μM的脂质体的新鲜培养基替代和更换培养基。在37℃/5％CO2条件下孵育细胞5分钟之后，除去含有脂质体的培养基，使用1×PBS洗涤细胞两次，并在新鲜培养基中再孵育细胞30分钟，然后在稀释于1×PBS/0.1％Tween-20的4％多聚甲醛中固定15分钟，并在1×PBS/0.1％Tween-20中洗涤两次。然后，将细胞在含有4μg/ml抗EDEM抗体的1×PBS/0.1％Tween-20中孵育1小时，在1×PBS/0.1％Tween-20中洗涤两次，将细胞在含有4μg/ml FITC标记的二抗的1×PBS/0.1％Tween-20中孵育1小时，并再洗涤两次。使用DAPI对细胞进行染色，然后将其固定至载玻片上。使用Carl Zeiss LSM显微镜取共聚焦图像，并使用LSM软件v5.10进行图像分析。图1F显示了用于这些测定的Rh-PE脂质的结构。
2.2 Huh7.5细胞中不同脂质体与ER标志物EDEM的共定位：
图2(A)-(F)显示了含有脂质PI和/或PS的脂质体与ER膜蛋白EDEM共定位。将脂质体与Huh7.5细胞一起孵育5分钟，然后更换培养基，并在无脂质体的培养基中孵育细胞。孵育30分钟之后将细胞固定并使用抗EDEM抗体(绿色，右上图像)对细胞进行标记，通过共聚焦显微术检测该细胞与脂质体中的Rh-PE脂质的共定位(红色，左下图像)。DAPI(蓝色，左上图像)用作核染色剂。通过在合并的图像(右下)内存在黄色来检测共定位。实验重复三次，显示典型的图像。图2A.PE∶CH(3∶2)脂质体；图2B.PE∶PC(3∶2)脂质体；图2C.PE∶CH∶PI(3∶1∶1)脂质体；图2D.PE∶PC∶PI(2∶2∶1)脂质体；图2E.PE∶CH∶PS(3∶1∶1)脂质体；图2F.PE∶PC∶PS(2∶2∶1)脂质体；图2G.PE∶CH∶PI∶PS(3∶1∶0.5∶0.5)脂质体；图2H.PE∶PC∶PI∶PS(1.5∶1.5∶1∶1)脂质体。
使用上文所述获得的图像来对脂质体与ER膜标志物(EDEM)的共定位进行定量。
2.3.对图像共定位进行定量的方法：
使用MetaMorph软件(v.7，Molecular Devices，Downingtown，PA，U.S.A.)测定共定位百分数。使用设置为3×3像素的中值滤波器过滤图像，将用于测定两个图像(rh-PE/红色图像和EDEM/绿色图像)之间整合的共定位的阈值各自设定在平均强度加1个标准差(SD)。报告的数值表示30个细胞的平均值±SD。
2.4.脂质体与ER标志物(EDEM)共定位百分数分析的结果：
图像共定位的定量结果可提示20％PI或20％PS掺入DOPE∶CH或DOPE∶DOPC脂质体中显著增加与ER膜的共定位。与单独DOPE∶CH的13％(SD＝6.6％)的共定位相比，DOPE∶CH∶PI和DOPE∶CH∶PS构成的脂质体分别表现了52％(SD＝8.0％)和46％(SD＝8.1％)的共定位。类似地，与DOPE∶DOPC脂质体的12％(SD＝4.7％)的共定位相比，DOPE∶DOPC∶PI和DOPE∶DOPC∶PS的组合物分别表现了64％(SD＝8.1％)和48％(SD＝7.6％)的共定位。DOPE∶CH和DOPE∶DOPC脂质体内20％PI和20％PS的组合进一步增加向ER膜的共定位，使得DOPE∶CH∶PI∶PS脂质体表现76％(SD＝8.7％)的ER膜共定位，并且观察到DOPE∶DOPC∶PI∶PS脂质体88％(SD＝3.5％)的ER膜共定位。
图3显示了通过使用MetaMorph软件对每份脂质体制剂分析30个单个的细胞来测定脂质体递送的rh-DOPE与EDEM抗体的计算的共定位，其中，对于每个图像将用于测定共定位百分数的阈值设定至平均强度加上1个标准差(SD)。所显示的结果表示30个细胞的平均共定位和标准差。
这些结果可表明，仅与PE组合的含有脂质PI和/或PS的脂质体显示了在5分钟的脂质体脉冲和30分钟的跟踪之后在Huh7.5细胞中与ER标志物的共定位增加。由于ER脂质体(即，含有PI和/或PS脂质的脂质体)表现了与ER标志物明显的共定位，荧光标记的ER脂质体可用作快速和价廉的技术用于标记真核细胞中ER膜。
3.经ER脂质体递送的脂质掺入已知从ER膜组装和出芽的病毒的包膜中
下列实验的目的是使用脂质体(通过共聚焦显微镜显示与ER膜共定位)处理牛病毒性腹泻病毒(BVDV)感染的马-达氏牛肾细胞(MDBK)和HCV细胞培养物(HCVcc)感染的Huh7.5细胞，并且寻找分泌的病毒颗粒内标记的脂质体脂质的掺入。BVDV和HCV均为从ER膜组装和出芽的病毒，因此，经脂质体递送的标记的脂质掺入分泌的病毒颗粒提示脂质体与这些细胞的ER膜融合。HIV-1感染的外周血单核细胞(PBMC)用作对照以检测脂质掺入从质膜出芽的病毒。
3.1.使用生物素化的PE脂质监测脂质体脂质掺入分泌的病毒颗粒的具体方法：
BVDV细胞培养物：以3×105个细胞/孔将马-达氏牛肾细胞(MDBK)接种在6孔培养板的完全DMEM/10％FBS中，使用ncp BVDV毒株Pe515(英国国家动物疾病实验室)以0.1的感染复数(MOI)来感染，每3天以1∶8的稀释度将其传代至含有10％(体积/体积)胎牛血清的2ml新鲜RPMI 1640培养基中。在获得稳定的感染(如通过RT-RCR检测以对分泌的BVDV颗粒进行定量)之后开始脂质体处理。遵照制造商的方案使用QIAamp病毒RNA纯化试剂盒(QIAGEN)对500μl上清液进行定量PCR。使用SyBr Green Mix(QIAGEN)和针对ncp BVDV RNA的引物(正向引物：TAG GGC AAA CCA TCT GGA AG；反向引物：ACT TGG AGC TAC AGG CCT CA)进行实时PCR。
JC-1 HCV细胞培养物(HCVcc)：在含有10％胎牛血清(FBS)的完全DMEM(100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素，2mM L-谷氨酰胺，以及1×MEM)中培养Huh7.5细胞(Apath，LLC，Saint Louis，U.S.A.)。所有培养均在37℃/5％CO2下进行。以MOI＝0.5感染细胞1小时，当超过50％的细胞被检测为HCVcc感染阳性(如通过HCV核心蛋白免疫荧光所检测的)时，开始脂质体处理。分别使用定量PCR和核心蛋白免疫荧光来测定上清液中的病毒RNA的定量和分泌颗粒的感染性。
HIV细胞培养物：使用Histopaque密度梯度离心(Sigma-Aldrich，Gillingham，U.K.)分离来自4位未感染供体的外周血单核细胞(PBMC)，汇集，并在完全RPMI(RPMI加10％FBS，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素，2mM L-谷氨酰胺)中使用植物血凝素(PHA，5μg/ml)刺激48小时，之后使用白介素-2(IL2，40U/ml)刺激72小时，然后开始实验。除非另有说明，所有培养均在37℃/5％CO2下进行。为了感染细胞，在6孔培养板每孔2ml完全RPMI/10％FBS中一起孵育4×106PHA激活的PBMC和100 TCID50(组织培养物感染剂量50％)的原始分离株原液。感染细胞16小时，并使用完全RPMI培养基洗涤三次，然后开始与脂质体一起孵育。
分泌的生物素标记的颗粒的纯化：在75cm2烧瓶中培养病毒感染的细胞，然后使用含有50μM b-PE标记的22∶6 ER脂质体的培养基更换培养基，并孵育48小时。在PBS中洗涤细胞两次，并在无脂质体的新鲜培养基中再孵育24小时。收获含有分泌颗粒的上清液，使用台盼蓝染色对细胞进行计数，并使用PBS将上清液标准化成样品细胞数量。通过定量PCR对分泌的HCVcc和BVDV进行滴定，测定分泌的病毒体的感染性。通过p24捕获ELISA对HIV-1进行定量。高性能链霉亲和素琼脂糖凝胶(GE Healthcare)用于捕获生物素化的颗粒。通过在PBS中1∶50(体积∶体积)稀释来洗涤琼脂糖凝胶微珠两次，在室温下轻柔混合5分钟，并以1500rpm离心3分钟来沉淀。在PBS中重悬浮琼脂糖凝胶以形成50％淤浆，并将其添加至培养上清液(每10ml培养上清液200μl 50％淤浆)。在室温下轻柔摇动孵育琼脂糖凝胶和上清液1小时，然后如上所述在PBS中洗涤琼脂糖凝胶微珠5次。为了对b-PE标记的病毒体的量进行定量，取出1ml培养上清液，其中500μl用于总病毒定量，500μl在链霉亲和素琼脂糖凝胶上被捕获，在PBS中洗涤5次，通过将微珠与病毒RNA裂解缓冲液(QIAGEN)一起孵育以进行HCVcc和BVDV RT-PCR分析或通过在1％empigen中孵育用于p24HIV ELISA测定而将其直接用于RNA定量。
3.2.b-PE脂质掺入分泌的病毒颗粒：
图1G显示了所使用的生物素化的PE脂质(b-PE)的结构。
以0.1mol％、0.5mol％、1mol％、5mol％或10mol％将生物素标记的PE(b-PE)掺入ER脂质体(即，含有PI和/或PS脂质的脂质体)，测定用于标记分泌的HCV和BVDV(两种ER出芽病毒)的最佳浓度为1％，分别捕获分泌的病毒体的总量的90％(SD＝3.6％)和91％(SD＝1.5％)(图4)。还使用b-ER脂质体处理使用HIV-1的原始分离株(LAI)感染的PBMC，分泌的HIV-1颗粒无一含有可检测量的标记的脂质(图4)。该结果可以凸显该系统用于将脂质体递送至ER和ER相关膜的特异性，因为在质膜发生了产生性的HIV-1组装。
图4显示了含有b-PE脂质的ER脂质体(50μM的脂质终浓度)与JC-1感染的Huh7.5细胞、BVDV感染的MDBK细胞或HIV-1感染的PBMC一起孵育48小时的实验结果。洗涤感染的细胞，使用链霉亲和素-琼脂糖凝胶树脂捕获在接下来的24小时孵育阶段过程中在不存在脂质体的情况下所分泌的b-PE标记的病毒颗粒。将结果表示为由链霉亲和素捕获的标记的病毒颗粒相对于相同样品内分泌的病毒体的总量(100％)的百分数。
图4中的结果可表明经ER定位的脂质体(含有PE连同PI和/或PS的脂质体)递送至BVDV感染的MDBK细胞和HCVcc感染的Huh7.5细胞的脂质存在于脂质体处理过程分泌的大多数BVDV和HCVcc病毒包膜中，但不存在于HIV包膜中。因为已知BVDV和HCV从ER膜组装和出芽，而HIV从质膜组装和出芽，这进一步证明了含有PI和/或PS脂质的脂质体能够与细胞的ER膜融合。
在使用ER脂质体处理后掺入ER出芽的病毒中的标记的脂质不限于生物素化的脂质，荧光脂质也可用于产生含有荧光脂质的病毒体以通过荧光显微术进行显像。
3.3.在rh-PE脂质体处理之后使用共聚焦显微术对rh-PE标记的HCVcc进行显像的方法：
在75cm2烧瓶中将Huh7.5细胞培养至完全汇合，然后使用含有50μMrh-PE标记的22∶6 ER脂质体的培养基更换培养基。孵育细胞48小时，在PBS中洗涤两次，然后于无脂质体的新鲜培养基中孵育24小时。收获含有分泌颗粒的上清液。通过定量PCR对分泌的HCVcc进行滴定，并且如上所述对分泌的病毒体的感染性进行检测。对于通过共聚焦显微术对rh-HCVcc的显像，使得原初Huh7.5细胞在完全DMEM/10％FCS中过夜附着于1.5号盖玻片上，然后使用rh-HCVcc病毒原液更换培养基并孵育1小时。在感染之后，使用PBS洗涤细胞两次，更换新鲜培养基用于多次孵育，使用1×PBS洗涤两次，于甲醇∶丙酮(1∶1，体积∶体积)中固定10分钟，最后于1×PBS/0.1％Tween-20中洗涤两次。然后于含有一抗的1×PBS/0.1％Tween-20中孵育细胞1小时，于1×PBS/0.1％Tween-20中洗涤4次，于含有荧光标记的二抗的1×PBS/0.1％Tween-20中孵育1小时，再洗涤4次。使用DAPI对细胞进行染色，然后将其固定至载玻片上。使用Carl Zeiss LSM显微镜取共聚焦图像，并使用LSM软件v5.10进行图像分析。
3.4.通过共聚焦显微术对rh-PE标记的HCVcc进行显像：
使用1％rh-ER脂质体和固定细胞共聚焦显微术，我们观察到Huh7.5细胞中的HCVcc感染(图5)。在存在1％rh-ER脂质体的情况下孵育48小时之后收集rh标记的HCVcc 24小时，并以MOI＝0.1将其用于感染原初细胞1小时。在1小时感染之后以及感染后6小时和24小时立即取固定的共聚焦图像，使用抗HCV核心抗体标记透化的细胞以阳性鉴定HCVcc颗粒。在这些图像中，直至感染后1小时，核心阳性颗粒显示为在细胞表面上直径大约1μm的单集落，在该时间点该集落表现为变得细胞内吞，并扩散成大约5μm的集落。该大集落向细胞的细胞核移动，形成感染的细胞的细胞核的特征性凹陷(indent)(图5)，在该处该集落分散，rh标记的脂质开始与HCV核心蛋白分离。在大约感染后24小时，观察到细胞中核心蛋白水平增加，这可表示感染建立和核心蛋白从头合成。
图5显示了Rh-PE标记的JC-1 HCVcc(红色，左下小图)与原初Huh7.5细胞一起孵育1小时(MOI＝0.1)的实验结果，之后洗涤细胞并在新鲜培养基中再孵育0、6或24小时。在各孵育时间之后，固定细胞并使用抗HCV核心抗体(绿色，右上小图)和DAPI(蓝色，左上小图)染色，然后将其固定至载玻片上，并进行共聚焦显微显像。右下小图显示了合并的图像。显示了各孵育阶段的典型图像。尽管固定细胞共聚焦显微术用于这些分析，但该技术提供了使用广泛选择的脂质-荧光团共轭物标记病毒体用以通过活细胞显微术跟踪的方法。该类型的掺入技术不限于生物素或荧光标记的脂质，因为其他脂质共轭物或跨膜蛋白也可以掺入ER脂质体中用于特异性递送至细胞的ER膜。
4.经ER脂质体递送的脂质比pH敏感性脂质体在细胞中具有更长的寿命
该实验的目的是使用荧光标记的脂质体处理MDBK细胞以监测其随时间摄取和掺入细胞膜。认为不含有PI和PS脂质的pH敏感性脂质体(即，DOPE-CHEMS或DOPE-CHEMS-PEG-PE脂质体)可进入细胞，并且认为在内涵体中脂质体膜破裂之后脂质继续沿内涵体途径到达溶酶体。如果含有PI和/或PS脂质的脂质体能够与细胞内的其他膜融合，则它们比pH敏感性脂质体应具有更长的寿命。在使用MDBK细胞处理5分钟之后，通过荧光显微镜经48小时的时间观察经脂质体递送至细胞的Rho-PE脂质。
4.1.用于监测脂质体掺入细胞膜中的具体方法：
PE∶CH、PE∶CH∶PI以及PE∶CH∶PS脂质体如先前所述制备，包含用于显像的1％(总摩尔数)的Rh-PE。将MDBK细胞接种至6孔培养板成50％汇合，并使得过夜附着。在1×PBS中洗涤细胞两次，然后在37℃、5％CO2条件下，使用添加至2ml完全RPMI达脂质终浓度为50μM的Rh标记的脂质体处理。在孵育5分钟之后，在1×PBS中洗涤细胞两次，将2ml新鲜的完全RPMI培养基添加至各孔，孵育培养板1、10、24以及48小时。在各孵育时间结束时，洗涤细胞两次，然后在稀释于1×PBS/0.1％Tween-20的4％多聚甲醛中固定15分钟，并在1×PBS/0.1％Tween-20中洗涤两次。使用DAPI对细胞进行染色，然后显像。使用Nikon Eclipse TE2000-U显微镜取荧光图像，并使用Nikon ACT-1软件v2.70进行图像分析。
4.2.脂质体掺入细胞膜：
图6(A)-(C)显示了由脂质PE与PI或PS组合而构成的脂质体呈现出与pH敏感性脂质体相比掺入细胞膜增加的荧光显微图像。使用Rh-PE标记的脂质体处理MDBK细胞5分钟，然后洗涤细胞，并使得仅在培养基中孵育1、10、24以及48小时。在各孵育时间之后，固定细胞，并在荧光显微镜下观察Rh-PE脂质(红色)。DAPI(蓝色)用作核染色剂。重复实验两次，并显示来自一个实验的典型图像。图6A.PE∶CH(摩尔比3∶2)脂质体。图6B.PE∶CH∶PI(摩尔比3∶1∶1)脂质体。图6C.PE∶CH∶PS(摩尔比3∶1∶1)脂质体。
图6中的结果显示由PE与PI或PS组合构成的脂质体能够掺入MDBK细胞膜中。而经PE∶CH脂质递送至细胞的Rh-PE脂质几乎在从细胞培养基去除脂质体之后24小时消失，经PE∶CH∶PI和PE∶CH∶PC递送的脂质仍旧存在于细胞中超过48小时，提示较多掺入膜中。
4.3.对所处理的细胞中的脂质体摄取和脂质滞留进行定量：
为了监测Huh7.5细胞中经4天孵育时间的脂质体摄取的速率，在培养基中将细胞与含有脂质终浓度为50μM的1％rh-PE的DOPE∶CH和DOPE∶DOPC∶PI∶PS脂质体一起孵育。在低密度下接种细胞，对脂质体摄取相对于细胞生长进行检测。在4天孵育之后，洗涤处理的Huh7.5细胞并将其返回至无任何脂质体的培养基，以监测经DOPE∶CH和DOPE∶DOPC∶PI∶PS脂质体递送的rh-DOPE脂质的半衰期。
4.4.对处理的细胞中的脂质体摄取和脂质滞留进行定量的方法：
脂质体如先前所述制备，含有1％(总摩尔数)的rh-PE用于监测它们在细胞中的摄取。对于长期(4天)脂质体摄取测定而言，以105个细胞/孔(2ml完全DMEM培养基/10％FBS)将Huh7.5细胞接种至6孔培养板上。将rh-PE标记的脂质体添加至细胞达磷脂终浓度为50μM，在37℃/5％CO2下孵育细胞2、24、48、72以及96小时。在孵育时间之后，收获细胞并进行分析。对于分析，在1×PBS中洗涤细胞两次，进行计数，重悬浮于200μl 1×PBS/0.5％TritonX-100，并将其转移至96孔培养板，在荧光分光光度计中在λex＝550nm、λem＝590nm读数。为了检测在如上所述96小时孵育之后Huh7.5细胞内rh-PE脂质的滞留，在1×PBS中洗涤细胞三次，使用新鲜DMEM/10％FBS更换培养基，并再孵育细胞8、24、30以及48小时。在孵育时间之后，如上所述收获细胞并进行分析。
4.5.Huh7.5细胞中脂质体摄取和脂质滞留测定的结果：
如图7所示，经4天孵育时间活跃分化的Huh7.5细胞显示了持续的DOPE∶DOPC∶PI∶PS脂质体摄取。在第4天，DOPE∶DOPC∶PI∶PS处理的细胞显示了1.5×10-3AU/细胞(SD＝3.4×10-4AU/细胞)的荧光，是所观察的DOPE∶CH脂质体处理(2.5×10-4AU/细胞(SD＝5.5×10-5AU/细胞))的6倍。事实上，仅在24小时处理阶段(5.0×10-4AU/细胞(SD＝1.1×10-4))之后在DOPE∶CH处理的细胞中观察到达到最大荧光，之后细胞相关的荧光缓慢减少，提示脂质体摄取减少或rh-PE脂质外流增加，或脂质体摄取减少和rh-PE脂质外流增加均有。
根据这些实验，在从培养基去除脂质体之后DOPE∶CH脂质体中的rh-DOPE脂质显示在细胞中大约7小时的半衰期。在使用DOPE∶DOPC∶PI∶PS脂质体处理的细胞的情况中，rh-DOPE半衰期延长至大约29小时，提示这些脂质体更多掺入所处理的细胞膜中。
图7显示了靶向ER的脂质体的实验结果，显示Huh7.5细胞内细胞摄取和脂质滞留增加。将Rh标记的脂质体(50μM的脂质终浓度)与Huh7.5细胞一起孵育4天(96小时)。在整个孵育阶段监测脂质体向细胞中的摄取，将其表示为所观察到的每个细胞DOPE∶CH脂质体(红色，实线)和DOPE∶DOPC∶PI∶PS脂质体(黑色，实线)相对于最大值(1.5×10-3AU/细胞，DOPE∶DOPC∶PI∶PS脂质体，96小时读数)的荧光。在λex＝550nm、λem＝590nm检测荧光。在96小时孵育之后，洗涤细胞并将其置于新鲜培养基(无脂质体)，以监测再经48小时细胞内rh-DOPE脂质的滞留。显示了DOPE∶CH脂质体(红色，虚线)和DOPE∶DOPC∶PI∶PS脂质体(黑色，虚线)相对于最大值(2.4×106个细胞/ml，DOPE∶DOPC∶PI∶PS脂质体，72小时读数)在孵育阶段过程中的细胞生长。数据显示了来自三个独立实验的一式三份样品的平均值和标准差。
5.ER脂质体显示了在血清存在下提高的稳定性和细胞摄取：
脂质体作为药物递送系统的一般用途受到几种问题的阻碍。其中一个问题就是血清蛋白介导的脂质体内容物的流失。包裹钙黄绿素的脂质体用于经4天时间监测含有10％FBS的无细胞培养基中脂质体的稳定性。钙黄绿素是一种当包裹在脂质体内时仍猝灭的水溶性自猝灭荧光团，然而，脂质体脱稳定化将诱导荧光的流失和继后的脱猝灭。
5.1.用于对FBS中脂质体稳定性和细胞摄取进行定量的方法：
为了监测在10％FBS存在下脂质体的稳定性，制备了带有钙黄绿素的脂质体，通过尺寸排阻色谱法其与未包裹的钙黄绿素分离，并在无细胞的情况下将其添加至完全DMEM/10％FBS中，磷脂终浓度为50μM。孵育脂质体4天，每24小时取含有脂质体的培养基的样品，以监测λex＝490nm、λem＝520nm脂质体脱稳定化和钙黄绿素流失至周围培养基中而导致的钙黄绿素脱猝灭。在4天孵育之后添加终浓度达1％的Triton X-100破坏脂质体膜，实现100％钙黄绿素脱猝灭，从而对荧光范围进行标准化：％流失＝((In-I0)/(I100-I0))×100，其中I0是在0时间的荧光，In是在n时间的荧光，I100是在添加Triton之后总共脱猝灭的钙黄绿素荧光。
对于细胞摄取测定而言，脂质体如先前所述制备，含有1％(总摩尔数)的rh-PE用于监测其在细胞中的摄取。对于存在或不存在血清的情况下短期脂质体摄取测定而言，将rh-PE标记的脂质体添加至6孔培养板中培养至汇合的Huh7.5细胞中，使得在无血清完全DMEM或添加10％FBS或10％人血清(Sigma)的完全DMEM中磷脂终浓度为50μM，并孵育24小时。在孵育之后，在1×PBS中洗涤细胞两次，进行计数，重悬浮于200μl的1×PBS/0.5％Triton X-100中，并将其转移至96孔培养板，在分光光度计中在λex＝550nm、λem＝590nm读数。
5.2.在10％血清存在下对脂质体稳定性和细胞摄取进行定量的测定结果：
图8A显示了钙黄绿素从pH敏感性DOPE∶CH和靶向ER的DOPE∶DOPC∶PI∶PS脂质体中释放的速率。在孵育4天之后，58％(SD＝12.6％)的钙黄绿素从DOPE∶PE脂质体中释放，而仅32％(SD＝9.2％)的钙黄绿素从DOPE∶DOPC∶PI∶PS脂质体中流失，提示在血清的存在下稳定性更大。
为了监测FBS和人血清对脂质体摄取至Huh7.5细胞中的影响，将DOPE∶CH和DOPE∶DOPC∶PI∶PS脂质体制备成在膜内含有1％rh-PE，并在存在无血清培养基和含有10％FCS或10％人血清的培养基的情况下将其与Huh7.5细胞一起孵育24小时(磷脂终浓度为50μM)。将细胞中的脂质体摄取表示为24小时孵育阶段之后每个细胞的荧光量(任意单位，AU)。观察到与无血清培养基相比在存在FBS的情况下DOPE∶CH脂质体摄取显著减少(分别为5.0×10-4AU/细胞(SD＝7.0×10-5AU/细胞)和8.2×10-4AU/细胞(SD＝2.1×10-4AU/细胞)，P＝0.02，图8B)。在存在人血清的情况下无显著差异。相比之下，与无血清培养基相比在FBS存在下DOPE∶DOPC∶PI∶PS脂质体显示了摄取显著增加(分别为6.6×10-4AU/细胞(SD＝8.4×10-5AU/细胞)和3.1×10-4AU/细胞(SD＝1.2×10-4AU/细胞)，P＝0.003，图8b)。另外，与FBS相比，人血清的存在显著增加Huh7.5细胞中的DOPE∶DOPC∶PI∶PS脂质体摄取的效率(1.4×10-3AU/细胞(SD＝1.8×10-4AU/细胞)，P＝0.001，图8B)。
图10A-B显示的实验结果呈现了在存在血清的情况下靶向ER的脂质体具有提高的稳定性和细胞摄取。(A)在完全DMEM+10％FBS中孵育带有自猝灭钙黄绿素的脂质体(脂质终浓度为50μM)，在37℃孵育4天。每24小时，培养物样品用于检测在λex＝485nm、λem＝520nm钙黄绿素脱猝灭。将结果表示为从脂质体释放的钙黄绿素相对于最大荧光的百分数，该百分数通过在孵育阶段结束时添加Triton X-100破坏脂质体膜来测定。(B)在存在10％牛血清(FBS)，10％人血清情况下或在无血清培养基中将rh标记的脂质体(50μM的脂质浓度)与Huh7.5细胞一起孵育24小时。在孵育时间之后，收获细胞，进行计数，并在λex＝550nm、λem＝590nm检测荧光。将结果表示为所检测的各样品每个细胞的平均荧光。所有数据均表示来自三个独立实验的一式三份样品的平均值和标准差。
这些使用DOPE∶DOPC∶PI∶PS脂质体的研究可提示与DOPE∶CH脂质体相比该磷脂组合可表现与细胞和血清更有利的相互作用。在存在10％FBS的情况下，在4天孵育之后，与DOPE∶CH脂质体相比，DOPE∶DOPC∶PI∶PS脂质体表现了45％或更少的包裹的载荷的流失。在FBS的存在下，DOPE∶DOPC∶PI∶PS脂质体还表现了摄取至Huh7.5细胞中增加，在人血清的存在下进一步增加。相比之下，与无血清培养基相比，在FBS存在下，DOPE∶CH脂质体摄取表现为受抑制。尽管本发明受到其操作理论限制，这些结果可提示靶向ER的脂质体(即，含有PI和/或PS脂质的脂质体)通过不同细胞受体(如DOPE∶CH脂质体使用的那些)内吞，经该机制的细胞内吞可通过血清的存在而提高。
6.Huh7.5细胞和PBMC中的ER脂质体细胞毒性
这些实验的目的是测定经使用Huh7.5细胞和PBMC一轮处理(5天)脂质体对细胞活力的影响。
6.1.用于测定Huh7.5细胞和PBMC中的细胞毒性的具体方法：
如先前所述制备具有脂质构成为PE∶CH(3∶2)、PE∶PC(3∶2)、PE∶PI(3∶2)、PE∶CH∶PI(3∶1∶1)、PE∶PC∶PI(1.5∶1.5∶2)、PE∶PS(3∶2)、PE∶CH∶PS(3∶1∶1)、PE∶PC∶PS(1.5∶1.5∶2)、PE∶PI∶PS(3∶1∶1)、PE∶CH∶PI∶PS(3∶1∶0.5∶0.5)以及PE∶PC∶PI∶PS(1.5∶1.5∶1∶1)的脂质体。将Huh7.5细胞和PBMC分别以5×104个细胞/孔(200μl完全DMEM和RPMI+IL2培养基)的浓度接种于96孔培养板中，并在脂质终浓度为0-500μM的包裹1×PBS的脂质体存在下孵育。在孵育5天之后，按照制造商的方案，通过基于MTS细胞增殖测定来检测细胞活力(CellTiter96
Figure BPA00001257448500401
Promega，San Luis Obispo，U.S.A.)。
6.2.当使用PBS脂质体处理5天时Huh7.5细胞和PBMC中的细胞毒性
图9显示了在Huh7.5细胞与包裹1×PBS的不同脂质体制剂一起孵育5天之后的活力。培养基中的脂质终浓度的范围为0至500μM。结果表示来自三个独立实验的一式三份样品的平均值。
图10显示了在PBMC与包裹1×PBS的不同脂质体制剂一起孵育5天之后的活力。培养基中的脂质终浓度的范围为0至500μM。结果表示来自三个独立实验的一式三份样品的平均值。
图9和图10的结果可表示出当以大于60μM的浓度添加至细胞时仅含有脂质CHEMS的脂质体在Huh7.5细胞和PBMC中具有细胞毒性。与pH敏感性脂质体(PE∶CH)相比，无该脂质的ER脂质体表现出几乎没有细胞毒性(如果有也非常小)，因此优选用于体内用途。
7.HIV-1从使用ER脂质体处理的感染的PBMC的分泌
这些实验的目的是监测HIV-1从使用不同脂质体组合物处理的HIV-1感染的PBMC的分泌水平的变化。
7.1.单轮HIV分泌测定的具体方法：
如先前所述制备具有脂质构成为PE∶CH(3∶2)、PE∶PC(3∶2)、PE∶PI(3∶2)、PE∶CH∶PI(3∶1∶1)、PE∶PS(3∶2)、PE∶CH∶PS(3∶1∶1)、PE∶CH∶PI∶PS(3∶1∶0.5∶0.5)以及PE∶PC∶PI∶PS(1.5∶1.5∶1∶1)的脂质体。使用刺激的PBMC作为指示细胞并将p24抗原产生的测定作为终点来评价从药物处理的细胞分泌的病毒体的感染而导致的HIV分泌变化。使用Histopaque密度梯度离心(Sigma-Aldrich，Gillingham，U.K.)分离来自4位正常(未感染的)供体的PBMC，汇集，并在完全RPMI(RPMI加10％热灭活的FBS，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素，以及2mM L-谷氨酰胺)中使用植物血凝素(PHA，5μg/ml)刺激48小时，然后使用白介素-2(IL2，40U/ml)刺激72小时。除非另有说明，所有实验均在96孔微量滴定板中进行，所有孵育均在37℃/5％CO2下进行。为了感染细胞，将4×105PHA激活的PBMC和100TCID50(组织培养感染剂量50％)的原始分离株原液添加至各孔。在过夜孵育16小时之后，使用完全RPMI培养基洗涤三次，并重悬浮于含有合适的游离药物或脂质体处理的完全RPMI/IL2中(脂质终浓度为50μM)。在第5天，收集从药物处理的细胞分泌的含有HIV病毒体的上清液，并通过p24捕获ELISA对p24浓度进行定量。
7.2.单轮HIV分泌测定的结果：
图11显示了在使用脂质体处理5天期间HIV从感染的PBMC的分泌。所有脂质体均包裹1×PBS溶液，并以50μM的脂质终浓度添加至细胞培养基中。在对处理的和未处理的PBMC的上清液内的HIV核心蛋白p24进行定量之后通过捕获ELISA来计算病毒分泌。将结果表示为HIV分泌相对于未处理的对照的百分数，所述结果表示来自两个独立实验的一式三份样品的平均值。对HIV-1的三种遗传差异分离株进行测定，所述分离株包括LAI(进化枝B)、93UG067(进化枝D)以及93RW024(进化枝A)。
图11的结果可表明与未处理的对照相比含有PI脂质的ER脂质体能够使从PBMC分泌的HIV减少大约20％。不含有PI脂质的靶向非ER的脂质体(PE∶CH和PE∶PC)以及ER脂质体对HIV分泌无影响。
8.从使用ER脂质体处理的感染的PBMC分泌的HIV-1的感染性
这些实验的目的是监测从使用不同脂质体组合物处理的HIV-1感染的PBMC分泌的HIV-1病毒体的感染性的变化。
8.1.用于单轮HIV感染性测定的具体方法：
如先前部分所述使用含有从脂质体处理的细胞分泌的HIV病毒体的上清液来测定从使用脂质体处理的PBMC分泌的HIV病毒体的感染性。将所有上清液在完全RPMI/IL2中稀释至最终p24浓度为10ng/ml，将100μl添加至4×105PHA激活的PBMC(也是在100μl培养基中)，最终p24浓度为5ng/ml，过夜孵育。如所述洗涤第二天的细胞，将其重悬浮于200μl新鲜RPMI/IL2，孵育4天，然后收集上清液，并通过捕获ELISA测定p24含量。
8.2.单轮HIV感染性测定的结果：
图12显示了从脂质体处理的HIV感染的PBMC分泌的HIV病毒体的感染性。分泌的病毒颗粒用于感染原初PBMC，当去除上清液并持续5天不处理细胞时，通过检测病毒分泌来测定病毒颗粒感染细胞的能力。将结果表示为相对于未处理的对照HIV感染性的百分数，所述结果表示来自两个独立实验的一式三份样品的平均值。对HIV-1的三种遗传差异分离株进行测定，所述分离株包括LAI(进化枝B)、93UG067(进化枝D)以及93RW024(进化枝A)。
图12的结果可表明某些ER脂质体能够减小从处理的PBMC分泌的病毒颗粒的感染性。观察到由脂质CHEMS与PI和/或PS组合而构成的ER脂质体的最大抗病毒活性，其中病毒颗粒的感染性比未处理的病毒体的感染性小20％。非ER脂质体(PE∶CH和PE∶PC)以及ER脂质体PE∶PS对病毒感染性无影响。
9.ER脂质体表现出比pH敏感性脂质体更高效的细胞内载荷释放
在这些实验中，将若丹明标记的脂质体制备成包裹自猝灭浓度的钙黄绿素(一种荧光分子)，并在Huh7.5细胞存在的情况下孵育。由于钙黄绿素释放至细胞内空间且变为脱猝灭的，通过荧光的增加来监测细胞内包裹的载荷的递送。
9.1用于检测Huh7.5细胞中脂质体的细胞内递送的具体方法：
对于荧光测定而言，将5×106Huh7.5细胞接种至25cm2烧瓶在完全DMEM/10％FBS中过夜。第二天，将含有1％rh-PE的带有钙黄绿素的脂质体添加至培养基(磷脂终浓度为50μM)，在37℃或4℃下孵育30分钟。在孵育之后，在1×PBS中洗涤细胞两次，使用胰蛋白酶/EDTA(Invitrogen)使细胞脱离，再洗涤细胞两次，并重悬浮于600μl PBS中。将三等份200μl用于进行荧光检测，并取平均值。在λex＝485nm和λem＝520nm检测钙黄绿素脱猝灭，并在λex＝550nm和λem＝590nm检测若丹明荧光。通过将脂质体与细胞一起在4℃下孵育来获得无细胞内吞的情况下与细胞结合的脂质体的起始钙黄绿素与若丹明荧光比值，并将该比值用于调整37℃下的数值。
9.2.Huh7.5细胞中包裹的钙黄绿素从脂质体中的细胞内释放：
在与脂质体一起孵育45分钟之后Huh7.5细胞中的平均rh-DOPE荧光反映了脂质体的摄取，平均钙黄绿素荧光提示细胞内脱猝灭，并因此提示荧光染色剂的释放。将所计算的钙黄绿素与若丹明荧光的比值作为测量各细胞结合脂质体的细胞内释放的水性标志物的量的标准。DOPE∶CH脂质体的钙黄绿素/若丹明比值计算为10.3(SD＝2.6)，而DOPE∶DOPC∶PI∶PS脂质体的钙黄绿素/若丹明比值计算为15.7(SD＝2.4)，增加了152％(P＝0.02，图13)。
图13显示带有自猝灭的钙黄绿素的、rh-PE标记的脂质体(50μM的脂质终浓度)与Huh7.5细胞在完全DMEM/10％FBS中一起孵育45分钟的实验结果。在λex＝490nm、λem＝520nm检测孵育后，脂质体中钙黄绿素的细胞内脱猝灭和相同孵育过程中总脂质体的摄取通过λex＝550nm、λem＝590nm的荧光检测来测定。在37℃和4℃下进行测定，并对无细胞内吞的脂质体结合进行校正，从37℃数值减去所有4℃数值。在孵育之后，通过计算处理的细胞中钙黄绿素脱猝灭和rh-PE荧光的比值来检测脂质体在Huh7.5细胞内递送包裹的钙黄绿素的能力。数据表示来自三个独立实验的一式三份样品的平均值和标准差。
图13中呈现的结果可提示，由PE与PI和/或PS组合构成的脂质体与PE∶CH脂质体(特别设计用于高效细胞内递送包裹的化合物的脂质体组合物)相比各脂质体的细胞内钙黄绿素释放水平增加。在这些测定中，PE∶PC∶PI∶PS脂质体表现出比PE∶CH脂质体大1.5倍的钙黄绿素释放。
10.HIV-1从使用包裹1mM NB-DNJ的脂质体处理的PBMC的分泌
这些实验的目的是测定脂质体将包裹的亚氨基糖(即，NB-DNJ)递送至HIV感染的PBMC的能力。将含有脂质PI和PS的脂质体与pH敏感性脂质体(PE∶CH)和pH非敏感性脂质体(PE∶PC)进行比较。
10.1.单轮HIV分泌测定的具体方法：
如先前所述制备具有脂质构成为PE∶CH(3∶2)、PE∶PC(3∶2)、PE∶PI(3∶2)、PE∶CH∶PI(3∶1∶1)、PE∶PS(3∶2)、PE∶CH∶PS(3∶1∶1)、PE∶CH∶PI∶PS(3∶1∶0.5∶0.5)以及PE∶PC∶PI∶PS(1.5∶1.5∶1∶1)的脂质体，除了所有脂质体包裹了于1×PBS中的1mM NB-DNJ。如先前所述进行HIV分泌测定。通过尺寸排阻色谱法从未包裹的NB-DNJ中纯化脂质体。将脂质体的结果与在细胞培养基中添加NB-DNJ至1mM终浓度的那些结果进行比较。
10.2单轮HIV分泌测定的结果：
图14显示了在使用1mM NB-DNJ(游离和脂质体介导的递送)处理5天过程中HIV从感染的PBMC的分泌。脂质体包裹1mM NB-DNJ，并以50μM的脂质终浓度添加至细胞培养基中。如先前所述计算病毒分泌。将结果表示为相对于未处理的对照的HIV分泌的百分数，所述结果表示了来自两个独立实验的一式三份样品的平均值。对HIV-1的三种遗传差异分离株进行测定，所述分离株包括LAI(进化枝B)、93UG067(进化枝D)以及93RW024(进化枝A)。
图14的结果可表明含有脂质PI或PS的脂质体能够将抗病毒NB-DNJ递送至HIV感染的PBMC而实现与PE∶CH脂质体相比相似(如果不是更好的话)的抗病毒活性，所述抗病毒活性通过HIV分泌的减少来确定。
11.从使用包裹1mM NB-DNJ的脂质体处理的感染的PBMC分泌的HIV-1的感染性：
这些实验的目的是测定脂质体将包裹的亚氨基糖(即，NB-DNJ)递送至HIV感染的PBMC的能力。将含有脂质PI和PS的脂质体与pH敏感性脂质体(PE∶CH)和pH非敏感性脂质体(PE∶PC)进行比较。
11.1.单轮HIV感染性测定的具体方法：
如先前所述检测使用脂质体处理的PBMC分泌的HIV病毒体的感染性，除了所有脂质体均包裹了于1×PBS中的1mM NB-DNJ。将从脂质体处理的细胞分泌的病毒体的结果与从游离NB-DNJ处理的细胞和未处理的细胞分泌的病毒体的那些结果进行比较。
11.2.单轮HIV感染性测定的结果：
图15显示了从NB-DNJ脂质体或游离NB-DNJ处理的HIV感染的PBMC分泌的HIV病毒体的感染性。分泌的病毒颗粒用于感染原初PBMC，如前所述测定其感染细胞的能力。将结果表示为相对于未处理的对照HIV感染性的百分数，所述结果表示来自两个独立实验的一式三份样品的平均值。对HIV-1的三种遗传差异分离株进行测定，所述分离株包括LAI(进化枝B)、93UG067(进化枝D)以及93RW024(进化枝A)。
图15的结果可表明与未处理的对照相比，使用包裹1mM NB-DNJ的ER脂质体处理HIV感染的PBMC使HIV的分泌和感染性降低。pH敏感性脂质体(不含有PI和PS脂质的脂质体)和含有脂质PI和PS的脂质体之间的比较结果显示当包裹1mM NB-DNJ时抗病毒活性无显著差异。
通过将gp120/gp41靶向分子(例如CD4的可溶形式)与包裹药物的脂质体的外表面化学连接可进一步提高抗病毒活性。靶向分子除了中和游离病毒颗粒而预防感染以外，还会通过受体介导的细胞内吞而导致带有药物的脂质体向HIV感染的细胞中的摄取增加。
12.PBMC中包裹1mM NB-DNJ的ER脂质体的细胞毒性：
这些实验的目的是测定经使用PBMC一轮处理(5天)包裹1mM NB-DNJ的脂质体对细胞活力的影响。
12.1.测定PBMC中细胞毒性的具体方法：
如先前所述制备具有脂质构成为PE∶CH(3∶2)、PE∶PC(3∶2)、PE∶PI(3∶2)、PE∶CH∶PI(3∶1∶1)、PE∶PS(3∶2)、PE∶CH∶PS(3∶1∶1)、PE∶CH∶PI∶PS(3∶1∶0.5∶0.5)以及PE∶PC∶PI∶PS(1.5∶1.5∶1∶1)的脂质体，除了所有脂质体均包裹于1×PBS中的1mM NB-DNJ。如先前所述测定与包裹1mM NB-DNJ的脂质体一起孵育5天后的细胞活力。
12.2.使用包裹1mM NB-DNJ的脂质体处理后的PBMC活力：
图16显示了PBMC与包裹1mM NB-DNJ的不同脂质体制剂一起孵育5天后的活力。培养基中的脂质终浓度的范围为0至500μM。结果表示来自三个独立实验的一式三份样品的平均值。
图16的结果表明了脂质体内包裹1mM NB-DNJ不具有其他细胞毒活性。令人惊讶地，某些脂质体内包裹NB-DNJ显示了与模拟处理的对照相比细胞增殖增加至160％。
13.HCV从ER脂质体处理的Huh7.5细胞的分泌
这些实验的目的是监测HCV-1从使用不同脂质体组合物处理的HCV感染的Huh7.5细胞分泌的水平变化。
13.1.单轮HCV分泌测定的方法：
在感染后8天(急性)和感染后50天(慢性)对细胞进行测定。在6孔培养板中将HCV感染的Huh7.5细胞培养至75％汇合，然后使用完全DMEM+50μM脂质体(总体积为每孔2ml)更换培养基，在37℃/5％CO2下孵育72小时。所有测定均使用一式三份样品进行。遵照制造商的方案，通过定量PCR对使用QIAGEN QIAamp病毒RNA纯化试剂盒从500μl上清液提取的病毒RNA进行病毒分泌分析。使用逆转录酶反应通过将分离的RNA转化为cDNA然后使用SyBrGreen混合物和针对HCV cDNA的引物通过实时PCR对分泌的病毒RNA进行定量。
13.2.单轮HCV分泌测定的结果：
图17显示了在使用脂质体处理5天后HCV从感染(急性感染和慢性感染)的Huh7.5细胞的分泌。所有脂质体均包裹1×PBS溶液，并以50μM的脂质终浓度添加至细胞培养基。在通过定量PCR对处理的和未处理的Huh7.5细胞的上清液中的RNA进行定量之后计算HCV分泌。将结果表示为相对于未处理的对照HCV RNA分泌的百分数，所述结果表示一式三份样品的平均值。
14.从使用ER脂质体处理的Huh7.5细胞分泌的HCV的感染性
这些实验的目的是监测从使用不同脂质体组合物处理的HCV感染的Huh7.5细胞分泌的HCV病毒体的感染性的变化。
14.1.单轮HCV感染性测定的方法：
如先前部分所述使用含有从脂质体处理的细胞分泌的HCV病毒体的上清液检测从使用脂质体处理的Huh7.5细胞分泌的HCV病毒体的感染性。在48孔培养板中将原初Huh7.5细胞培养至75％汇合，然后使用200μl含有从脂质体处理的细胞分泌的HCV的上清液更换培养基。使上清液感染原初Huh7.5细胞1小时，之后，使用1×PBS洗涤细胞两次，然后在37℃/5％CO2下在500μl完全DMEM中孵育2天。在孵育2天之后，使用1×PBS洗涤细胞两次，在甲醇/丙酮(1∶1，体积/体积)中固定10分钟，在1×PBS/0.1％Tween-20中洗涤两次。然后在含有4μg/ml抗HCV核心抗体的1×PBS/0.1％Tween-20中孵育细胞1小时，在1×PBS/0.1％Tween-20中洗涤两次，在含有4μg/ml FITC标记的二抗的1×PBS/0.1％Tween-20中孵育1小时，再洗涤两次，并使用DAPI染色。如先前所述使用Nikon Eclipse TE2000-U显微镜取荧光图像。通过对测定中的细胞总数(通过DAPI染色检测的)除HCV感染的细胞总数(通过抗HCV抗体检测的)进行计数来计算感染的细胞的百分数。
14.2.单轮HCV感染性测定的结果：
图18显示了从脂质体处理的HCV感染(急性和慢性感染)的Huh7.5细胞分泌的HCV病毒体的感染性。分泌的病毒颗粒用于感染原初Huh7.5细胞，当去除上清液并持续2天不处理细胞时，通过检测原初细胞中的HCV核心蛋白的存在来测定病毒颗粒感染细胞的能力。将结果表示为相对于未处理的对照HCV感染性的百分数，所述结果表示一式三份样品的平均值。
使用所选的ER脂质体和pH敏感性脂质体(PE∶CH)处理HCV感染的Huh7.5细胞的结果提示所有脂质体均增加病毒颗粒的分泌，然而，与未处理的颗粒相比，分泌颗粒的感染性显著降低。
15.ER脂质体减少Huh7.5细胞中LD的形成
在ER脂质体的存在下过夜孵育Huh7.5细胞以监测它们对细胞LD的影响。通过共聚焦显微术观察脂质体处理的细胞中的LD。
15.1.用于观察Huh7.5细胞内的LD的方法：
如先前所述制备ER脂质体PE∶PC∶PI∶PS(1.5∶1.7∶1.5∶0.3)。使Huh7.5细胞过夜附着于1.5号盖玻片上，然后使用含有添加至脂质终浓度为50μM的脂质体的新鲜培养基替代和更换培养基。在37℃/5％CO2下孵育16小时之后，去除含有脂质体的培养基并使用1×PBS洗涤细胞，在稀释于1×PBS的4％多聚甲醛中固定15分钟，在1×PBS中洗涤两次。然后使用含有20μg/mlBODIPY493/503的1×PBS孵育细胞10分钟，并在1×PBS中洗涤两次。BODIPY 493/503适于LD周围微环境的详细分析。使用DAPI对细胞进行染色，然后将其固定至载玻片上。使用Carl Zeiss LSM显微镜取共聚焦图像，并使用LSM软件v5.10进行图像分析。
15.2.在使用ER脂质体处理16小时后Huh7.5细胞内LD显像的结果：
图19显示了在孵育16小时后使用BODIPY 493/503(绿色)对未处理的Huh7.5细胞(左小图)和PE∶PC∶PI∶PS脂质体处理的Huh7.5细胞(右小图)进行标记使LD显像的实验结果。将PE∶PC∶PI∶PS脂质体添加至细胞培养基至脂质终浓度为50μM。DAPI(蓝色)用作核染色剂并用于对图像强度进行标准化。
结果提示，使用PE∶PI∶PS∶PC脂质体处理Huh7.5细胞减少LD形成。
16.Huh7.5细胞中ER脂质体与LD的共定位
由于PE∶PC∶PI∶PS脂质体显示干扰Huh7.5细胞中LD形成，进行下列实验以测定这些脂质体是否直接与细胞LD相互作用。将Rh-PE标记的脂质体与Huh7.5细胞一起孵育2小时，然后通过共聚焦显微术观察Rh-PE脂质和细胞LD以检测共定位。
16.1.观察LD和脂质体的细胞内共定位的方法：
ER脂质体PE∶PC∶PI∶PS(1.5∶1.7∶1.5∶0.3)如先前所述制备，包含用于显像的1％(总摩尔数)的Rh-PE。使Huh7.5细胞过夜附着于1.5号盖玻片上，然后使用含有添加至脂质终浓度为50μM的Rh-PE标记的脂质体的新鲜培养基替代和更换培养基。在37℃/5％CO2下孵育2小时之后，去除含有脂质体的培养基，固定细胞，并如前所述使用BODIPY493/503对细胞进行染色。使用DAPI对细胞进行染色，然后将其固定至载玻片上。如前所述取共聚焦图像。
16.2.在孵育2小时之后Huh7.5LD与脂质体的共定位：
图20显示了使用PE∶PC∶PI∶PS脂质体(红色)处理2小时并使用LD染色剂(绿色)标记的Huh7.5细胞的实验结果。将PE∶PC∶PI∶PS脂质体添加至细胞培养基至脂质终浓度为50μM。DAPI(蓝色)用作核染色剂。右下小图是合并的图像。黄色鉴定了细胞内的共定位区。
结果提示在仅处理2小时之后PE∶PI∶PS∶PC脂质体可在Huh7.5细胞内与LD相互作用。
17.使用ER脂质体处理HCV感染的Huh7.5细胞抑制HCV核心蛋白与LD的结合
干扰HCV核心蛋白和细胞LD之间相互作用可导致原始的非感染性病毒颗粒从HCV感染的细胞分泌。
这些实验的目的是测定脂质体处理是否减少Huh7.5细胞内HCV核心蛋白和LD的共定位。
17.1.用于观察LD和HCV核心蛋白细胞内共定位的方法：
如先前所述制备ER脂质体PE∶PC∶PI∶PS(1.5∶1.7∶1.5∶0.3)。在使用HCV基因型JFH1感染后8天，使Huh7.5细胞过夜附着于1.5号盖玻片上，然后使用含有添加至脂质终浓度为50μM的脂质体的新鲜培养基替代和更换培养基。在37℃/5％CO2下孵育16小时之后，去除含有脂质体的培养基，并使用1×PBS洗涤两次，于甲醇∶丙酮(1∶1，体积/体积)中固定10分钟，并于1×PBS/0.1％Tween-20中洗涤两次。然后，于含有3μg/ml抗HCV核心抗体的1×PBS/0.1％Tween-20中孵育细胞1小时，于1×PBS/0.1％Tween-20中洗涤两次，于含有4μg/ml AlexaFluor 550标记的二抗的1×PBS/0.1％Tween-20中孵育1小时，并再洗涤两次。然后将细胞与含有20μg/ml BODIPY493/503的1×PBS一起孵育10分钟，并在1×PBS中洗涤两次，然后如先前所述进行DAPI染色和固定。如先前所述取共聚焦图像。
17.2.在使用ER脂质体处理16小时之后Huh7.5LD与HCV核心蛋白的共定位：
图21A显示了未处理的Huh7.5细胞(左小图)和PE∶PC∶PI∶PS脂质体处理的Huh7.5细胞(右小图)孵育16小时并使用抗HCV核心抗体(红色)和LD染色剂(绿色)对上述两种细胞进行标记的实验结果。将PE∶PC∶PI∶PS脂质体添加至细胞培养基至脂质终浓度为50μM。DAPI(蓝色)用作核染色剂。右下小图为合并的图像。
黄色鉴定细胞内共定位的区域。图21B显示了未处理的(左)和PE∶PC∶PI∶PS脂质体处理(右)的细胞的合并图像的特写(白方框)。图21C是在存在(右)和不存在(左)PE∶PC∶PI∶PS脂质体的情况下HCV核心蛋白/LD相互作用的示意图。
大的LD/HCV核心囊泡的存在是产生感染性病毒颗粒所必需的。这些结果表明了使用PE∶PC∶PI∶PS脂质体处理HCV感染的Huh7.5细胞可减少HCV核心蛋白与细胞LD的结合，这最可能可解释从ER脂质体处理的细胞分泌的HCV颗粒的感染性的降低。
18.通过经ER脂质体将多不饱和脂质递送至HCV感染的Huh7.5细胞来降低HCV分泌和感染性
为了提高ER脂质体针对HCV的抗病毒活性，可使用多不饱和PE和PC(22∶6和/或20∶4)代替PE和PC脂质(目前在所有实验中均18∶1，为单不饱和)。
图22A-D显示了掺入多不饱和ER脂质体中的多不饱和脂质的化学结构。A.22∶6PE，B.20∶4PE，C.22∶6PC，D.20∶4PC。为了研究ER脂质体作为HCV抗病毒剂的潜在作用，使用多种脂质体组合物处理JC-1感染的Huh7.5细胞，以监测它们对HCVcc分泌和感染性的影响。除了22∶6 ER脂质体(22∶6 PE∶22∶6PC∶PI∶PS，1.5∶1.5∶1∶1)和22∶6 PEG-ER脂质体(含有3％PEG-PE脂质的22∶6多不饱和ER脂质体)之外，还包括20∶4 ER脂质体(20∶4 PE∶20∶4 PC∶PI∶PS，1.5∶1.5∶1∶1)和18∶1 ER脂质体(18∶1 PE∶18∶1 PC∶PI∶PS，1.5∶1.5∶1∶1)以监测不同脂质体的脂质饱和度对HCV复制的影响。
18.1.监测脂质体处理之后HCVcc分泌和感染性的方法：
方法与上文13和14节所述的用于急性JC-1 HCVcc感染的那些方法一致。
18.2.在使用脂质体处理4天的过程中的HCVcc的分泌：
如图23A所显示，与未处理的对照样品(分别218％，SD＝34.4％，和159％，SD＝21.6％)相比，18∶1和20∶4脂质均导致HCVcc分泌增加。仅22∶6 ER脂质体显示在浓度为50μM条件下HCV分泌显著降低27％(SD＝11.3％)，在用50μM22∶6 PEG-ER脂质体处理的情况下观察到相似的降低(23％，SD＝6.6％)。为了检测分泌的病毒颗粒的感染性，将来自脂质体处理的HCVcc上清液用于感染原初Huh7.5细胞，在感染后48小时对感染的细胞的数量进行定量。图23B显示了所有脂质体处理的HCV的感染性均显著降低，甚至使导致病毒分泌增加的18∶1和20∶4 ER脂质体处理的HCV的感染性也显著降低。使用50μM 22∶6 ER脂质体处理使HCV感染性降低91％(SD＝2.2％)。甚至所检测的最低浓度(1μM)的22∶6 ER脂质体也使感染性降低52％(SD＝5.3％)，提示22∶6多不饱和(pu)ER脂质体是病毒感染性的潜在抑制剂。
图23A显示了对在存在多种ER脂质体制剂的情况下在4天孵育过程中从感染的Huh7.5细胞(MOI＝0.5)分泌的、500μl细胞上清液中的JC-1 HCVcc进行定量。通过定量PCR对上清液中的JC-1 HCVcc RNA进行定量来检测分泌。图23B显示了从脂质体处理的JC-1感染的Huh7.5细胞分泌的JC-1 HCVcc的感染性。通过下列步骤来测定分泌的HCVcc的感染性：感染原初Huh7.5细胞1小时，然后孵育48小时，在该时间点固定细胞且使用抗HCV核心抗体进行染色以对感染的细胞的数量进行定量，并使用DAPI对所有细胞进行显像。
图23A-B的数据可提示，与先前所述的ER脂质体(18∶1脂质)相似，含有22∶6脂质的ER脂质体可显著降低分泌的HCV病毒体的感染性。目前，由22∶6多不饱和脂质构成的ER脂质体最优选用于开发成抗HCV治疗剂。
尽管上文描述了优选的具体实施方式，应理解本发明不限于此。对于本领域普通技术人员来说可对所公开的实施方式进行多种修改，且所述修改均在本发明的范围内。
本申请文件中引用的所有公开出版物、专利申请以及专利均在此通过引用完整并入。

Claims (106)

1.一种药物递送方法，该方法包括对有相应需要的受治疗者进行包含脂质颗粒的组合物的给药，所述脂质颗粒含有至少一种PS脂质。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述脂质颗粒是脂质体。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述脂质颗粒还含有以下脂质中的至少一种：PE、CHEMS、PI、PC或SP脂质。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述脂质颗粒含有PE脂质，所述PE脂质和所述PS脂质之间摩尔比的范围为0.5∶1至20∶1。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述脂质颗粒中所述PE脂质和所述PS脂质之间摩尔比的范围为1∶1至10∶1。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述PE脂质包括DOPE脂质和PEG-PE脂质。
7.根据权利要求3所述的方法，其中，所述脂质颗粒含有PE、PI以及PC脂质。
8.根据权利要求1所述的方法，所述方法适用于治疗或预防由病毒引起的或与病毒相关的疾病或病症。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述疾病或病症为病毒感染。
10.根据权利要求8所述的方法，其中，所述给药导致所述脂质颗粒的一种或一种以上脂质掺入受病毒感染的细胞的内质网膜。
11.根据权利要求8所述的方法，其中，所述病毒属于黄病毒科。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述感染是丙型肝炎感染。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述给药减少受丙型肝炎病毒感染的细胞中脂质小滴的产生。
14.根据权利要求12所述的方法，其中，所述给药抑制所述脂质小滴与丙型肝炎病毒的核心蛋白的相互作用。
15.根据权利要求12所述的方法，其中，所述给药减小丙型肝炎病毒的感染性。
16.根据权利要求8所述的方法，其中，所述病毒属于逆转录病毒科。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述病毒是HIV-1病毒。
18.根据权利要求1所述的方法，其中，所述组合物还包含包裹在所述脂质颗粒中的至少一种活性剂。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述给药导致所述至少一种活性剂递送至导致感染的病毒所感染的细胞的内质网中。
20.根据权利要求18所述的方法，其中，所述至少一种活性剂包括亚氨基糖。
21.根据权利要求18所述的方法，其中，所述至少一种活性剂包括α糖苷酶抑制剂。
22.根据权利要求18所述的方法，其中，所述至少一种活性剂包括离子通道抑制剂。
23.根据权利要求18所述的方法，其中，所述至少一种活性剂包括N-取代脱氧野尻霉素。
24.根据权利要求18所述的方法，其中，所述至少一种活性剂包括N-丁基脱氧野尻霉素。
25.根据权利要求18所述的方法，其中，所述至少一种活性剂包括至少一种抗HIV剂。
26.根据权利要求18所述的方法，其中，所述至少一种活性剂包括至少至少一种抗肝炎剂。
27.根据权利要求18所述的方法，其中，所述至少一种活性剂包括至少一种免疫刺激剂或免疫调节剂和核苷酸或核苷抗病毒剂。
28.根据权利要求1所述的方法，其中，所述组合物还包含抗病毒蛋白。
29.根据权利要求28所述的方法，其中，将所述抗病毒蛋白嵌入所述脂质颗粒的脂质层或脂质双层或与所述脂质颗粒共轭。
30.根据权利要求1所述的方法，其中，所述组合物包含与所述脂质颗粒共轭或嵌入所述脂质颗粒的脂质层或脂质双层中的靶向部分。
31.根据权利要求30所述的方法，其中，所述靶向部分包括gp120/gp41靶向部分。
32.根据权利要求30所述的方法，其中，所述靶向部分包括sCD4分子。
33.根据权利要求30所述的方法，其中，所述靶向部分包括单克隆抗体。
34.根据权利要求30所述的方法，其中，所述靶向部分包括E1或E2靶向部分。
35.根据权利要求1所述的方法，其中，所述受治疗者是人类。
36.一种治疗或预防HIV的方法，该方法包括对有相应需要的受治疗者进行包含脂质颗粒的组合物的给药，所述脂质颗粒含有PS脂质或PI脂质中的至少一种，其中，所述脂质颗粒不含有CHEMS脂质。
37.根据权利要求36所述的方法，其中，所述脂质颗粒为脂质体。
38.根据权利要求36所述的方法，其中，所述脂质颗粒还含有PE脂质。
39.根据权利要求38所述的方法，其中，所述PE脂质包含DOPE脂质或PEG-PE脂质中的至少一种。
40.根据权利要求36所述的方法，其中，所述脂质颗粒还含有PC脂质。
41.根据权利要求36所述的方法，其中，所述组合物包含包裹在所述脂质颗粒中的至少一种抗HIV剂。
42.根据权利要求41所述的方法，其中，所述至少一种抗HIV剂包括亚氨基糖。
43.根据权利要求41所述的方法，其中，所述至少一种抗HIV剂包括α糖苷酶抑制剂。
44.根据权利要求41所述的方法，其中，所述至少一种抗HIV剂包括N-取代脱氧野尻霉素。
45.根据权利要求44所述的方法，其中，所述至少一种抗HIV剂包括N-丁基脱氧野尻霉素。
46.根据权利要求36所述的方法，其中，所述组合物还包含与所述脂质颗粒共轭或嵌入所述脂质颗粒的脂质层或脂质双层中的靶向部分。
47.根据权利要求46所述的方法，其中，所述靶向部分包括gp120/gp41靶向部分。
48.根据权利要求46所述的方法，其中，所述靶向部分包括sCD4分子。
49.根据权利要求46所述的方法，其中，所述靶向部分包括单克隆抗体。
50.一种药物递送方法，所述方法包括对有相应需要的受治疗者进行包含脂质颗粒的组合物的给药，所述脂质颗粒含有至少一种多不饱和脂质。
51.根据权利要求50所述的方法，其中，所述脂质颗粒是脂质体。
52.根据权利要求50所述的方法，其中，所述脂质颗粒含有多不饱和PE脂质或多不饱和PC脂质中的至少一种。
53.根据权利要求52所述的方法，其中，所述脂质颗粒含有多不饱和PE脂质和多不饱和PC脂质。
54.根据权利要求52所述的方法，其中，所述脂质颗粒含有多不饱和22∶6PE脂质。
55.根据权利要求52所述的方法，其中，所述脂质颗粒含有多不饱和22∶6PC脂质。
56.根据权利要求52所述的方法，其中，所述脂质颗粒含有多不饱和22∶6PC脂质和多不饱和22∶6PE脂质。
57.根据权利要求52所述的方法，所述方法适用于治疗或预防由病毒引起的或与病毒相关的疾病或病症。
58.根据权利要求57所述的方法，其中，所述病毒属于黄病毒科。
59.根据权利要求57所述的方法，其中，所述疾病或病症是丙型肝炎感染。
60.根据权利要求59所述的方法，其中，所述给药减少HCV RNA复制。
61.根据权利要求57所述的方法，其中，所述病毒是ER出芽病毒。
62.根据权利要求57所述的方法，其中，所述病毒是含有糖蛋白的病毒。
63.根据权利要求50所述的方法，其中，所述组合物还包含包裹在所述脂质颗粒中的至少一种活性剂。
64.根据权利要求63所述的方法，其中，所述至少一种活性剂包括亚氨基糖。
65.根据权利要求63所述的方法，其中，所述至少一种活性剂包括α糖苷酶抑制。
66.根据权利要求63所述的方法，其中，所述至少一种活性剂包括离子通道抑制剂。
67.根据权利要求63所述的方法，其中，所述至少一种活性剂包括N-取代脱氧野尻霉素。
68.根据权利要求63所述的方法，其中，所述至少一种活性剂包括N-丁基脱氧野尻霉素。
69.根据权利要求63所述的方法，其中，所述至少一种活性剂包括至少一种抗肝炎剂。
70.根据权利要求63所述的方法，其中，所述组合物还包含抗病毒蛋白。
71.根据权利要求70所述的方法，其中，所述组合物包含与所述脂质颗粒共轭或嵌入所述脂质颗粒的脂质层或脂质双层中的靶向部分。
72.根据权利要求50所述的方法，其中，所述受治疗者是人类。
73.一种包含脂质颗粒的组合物，所述脂质颗粒含有PS脂质。
74.根据权利要求73所述的组合物，其中，所述脂质颗粒是脂质体。
75.根据权利要求73所述的组合物，其中，所述脂质颗粒还含有以下脂质中的至少一种：PE、CHEMS、PI、PC或SP脂质。
76.根据权利要求75所述的组合物，其中，所述脂质颗粒含有PE脂质且所述PE脂质和所述PS脂质之间摩尔比的范围为0.5∶1至20∶1。
77.根据权利要求76所述的组合物，其中，所述脂质颗粒中所述PE脂质和所述PS脂质之间摩尔比的范围为1∶1至10∶1。
78.根据权利要求75所述的组合物，其中，所述PE脂质包括DOPE脂质和PEG-PE脂质。
79.根据权利要求75所述的组合物，其中，所述脂质颗粒含有PE、PI以及PC脂质。
80.根据权利要求73所述的组合物，其中，所述脂质颗粒中所述PS脂质的摩尔浓度为至少10％。
81.根据权利要求80所述的组合物，其中，所述脂质颗粒中所述PS脂质的摩尔浓度为至少20％。
82.根据权利要求73所述的组合物，其中，所述脂质颗粒还含有PI脂质，且其中所述脂质颗粒中所述PS脂质和所述PI脂质的组合摩尔浓度为至少10％。
83.根据权利要求82所述的组合物，其中，所述脂质颗粒中所述PS脂质和所述PI脂质的组合摩尔浓度为至少20％。
84.一种包含脂质颗粒的组合物，所述脂质颗粒含有至少一种多不饱和脂质。
85.根据权利要求84所述的组合物，其中，所述脂质颗粒是脂质体。
86.根据权利要求84所述的组合物，其中，所述脂质颗粒含有多不饱和PE脂质或多不饱和PC脂质中的至少一种。
87.根据权利要求84所述的组合物，其中，所述脂质颗粒含有多不饱和PE脂质和多不饱和PC脂质。
88.根据权利要求84所述的组合物，其中，所述脂质颗粒含有多不饱和22∶6PE脂质。
89.根据权利要求84所述的组合物，其中，所述脂质颗粒含有多不饱和22∶6PC脂质。
90.根据权利要求84所述的组合物，其中，所述脂质颗粒含有多不饱和22∶6PC脂质和多不饱和22∶6PE脂质。
91.根据权利要求84所述的组合物，其中，所述脂质颗粒中所述多不饱和脂质的摩尔浓度为至少20％。
92.一种包括使细胞与脂质颗粒接触的方法，所述脂质颗粒含有a)PI或PS脂质中的至少一种和b)至少一种标记的脂质，所述标记的脂质包含至少一种标记物。
93.根据权利要求92所述的方法，其中，所述脂质颗粒是脂质体。
94.根据权利要求92所述的方法，其中，所述脂质颗粒还含有PE脂质和CHEMS脂质中的至少一种。
95.根据权利要求94所述的方法，其中，所述脂质颗粒含有PE脂质，且所述PE脂质和所述PS脂质之间摩尔比的范围为0.5∶1至20∶1。
96.根据权利要求95所述的方法，其中，所述脂质颗粒中所述PE脂质和所述PS脂质之间摩尔比的范围为1∶1至10∶1。
97.根据权利要求94所述的方法，其中，所述PE脂质包括DOPE脂质和PEG-PE脂质。
98.根据权利要求92所述的方法，其中，所述脂质颗粒含有PS、PE、PI以及PC脂质。
99.根据权利要求92所述的方法，其中，所述病毒是ER出芽病毒。
100.根据权利要求99所述的方法，其中，所述病毒是HCV病毒或HBV病毒。
101.根据权利要求92所述的方法，其中，所述至少一种标记的脂质含有荧光团-脂质共轭物。
102.根据权利要求92所述的方法，其中，所述至少一种标记的脂质含有生物素-脂质共轭物。
103.根据权利要求92所述的方法，其中，所述接触导致所述标记物标记所述细胞的ER膜。
104.根据权利要求92所述的方法，其中，所述细胞是被ER出芽病毒感染的细胞，且其中，所述接触导致所述标记物标记从所述细胞出芽的病毒颗粒。
105.根据权利要求104所述的方法，所述方法还包括纯化所述标记的病毒颗粒。
106.根据权利要求104所述的方法，所述方法还包括对所述标记的病毒颗粒进行显像。
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