JP2011518124A - 小胞体ターゲッティングリポソーム - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 細胞のER膜と融合することができるリポソームのような脂質粒子を含む組成物が提供される。脂質粒子はさらに、細胞のER内腔の内側の粒子の内側に被包された、治療薬またはイメージング剤のようなカーゴを送達することができる。組成物はHIVおよびHCV感染を含むウイルス感染のような、ウイルスによって引き起こされるか、またはウイルスに関連する疾患または状態を治療する、および/または予防することに有用でありうる。
【選択図】 図1。
Description
本出願は、2008年3月26日に出願された米国仮特許出願第61/039,638号に対する優先権を主張し、それはそのまま参照として本明細書に援用される。
本出願は一般に活性薬、たとえば治療薬および/またはイメージング剤を送達するための方法および組成物、さらにとりわけ、リポソームのような脂質粒子を利用する活性薬を送達するための方法および組成物に関する。
特記しない限り、“a”または“an”は“1以上”を意味する。
“治療薬”という用語は、ウイルス感染またはそれによって引き起こされる疾患のような生理的状態を治療することに役立ちうる、分子または化合物のような薬剤を表す。
CHEMSはコレステリルヘミスクシネート脂質を意味する。
本開示は米国特許出願公開第2008−0138351号をそのまま参照として援用する。
世界でおよそ1億7千万人、すなわち世界人口の3%(たとえばWHO,J.Viral.Hepat.1999;6:35−47を参照されたい)および米国のおよそ4百万人がC型肝炎ウイルス(HCV、HepC)に感染している。HCVに急性感染した人の約80%は慢性感染になる。それゆえ、HCVは慢性肝炎の主要な原因である。一旦慢性的に感染すると、ウイルスは治療なしではほとんど取り除けない。まれな症例では、HCV感染は臨床的に急性の疾患および肝不全さえ引き起こす。慢性HCV感染は個人間で劇的に変化することが可能で、ある人は臨床的に重要でないか、あるいは極めて軽度の肝臓疾患に罹患し、決して合併症を発症しないが、他の人は臨床的に明らかな慢性肝炎に罹患し、肝硬変発症に進行する可能性がある。HCVに罹患し、肝硬変を発症する人の約20%は末期肝臓疾患を発症し、そして原発性肝臓癌を発症するリスクが増大することになる。
脂肪滴(LD)は中性脂質貯蔵のために使用されうるオルガネラでありうる。LDは細胞質の中を活発に動き、ERを含む他のオルガネラと相互作用することができる。これらの相互作用は他のオルガネラへの脂質および蛋白質の輸送を促進すると考えられる。HCVキャプシド蛋白質(コア)は細胞内LDと会合し、感染性ウイルス粒子産生のために非構造(NS)蛋白質および複製複合体をLD−会合膜に能動的に動員することができる。HCV粒子はLDのすぐそばで観察されていて、ウイルスアセンブリーのいくつかのステップがLD周辺で起こりうることを示している(Miyanariら,Nature Cell Biology,9(2007)pp.1089−1097)。
HIVは後天性免疫不全症候群(AIDS)および関連する障害の原因因子である。少なくとも2種の別個のHIVの型:HIV−1およびHIV−2がある。さらに、これらの型のそれぞれの集団内に大量の遺伝的異質性が存在する。AIDS流行の開始以来、約2千万人が死亡し、概算では4千万を超える人々がHIV−1/AIDSに罹患しながら生存し、世界中で毎日1万4千人が感染している。
N−ブチル−1,5−ジデオキシ−1,5−イミノ−D−グルシトールとしても公知のNB−DNJはERグルコシダーゼIおよびIIによるプロセッシングを阻止することができ、そしてとりわけ、HIVおよびB型肝炎ウイルス(HBV)、C型肝炎ウイルス(HCV)のような肝炎ウイルス、ウシウイルス性下痢症ウイルス(BVDV)の糖蛋白質のミスフォールディングおよび/またはER−保持を引き起こすことによる有効な抗ウイルス薬であることが示されている。NB−DNJおよび他のN−置換デオキシノジリマイシン誘導体を合成する方法は、たとえば米国特許第5,622,972号、第4,246,345号、第4,266,025号、第4,405,714号および第4,806,650号に記載される。NB−DNJの抗ウイルス効果は、たとえば肝炎ウイルスに関しては米国特許第6,465,487号;第6,545,021号;第6,689,759号;第6,809,083号に、そしてHIVウイルスに関しては米国特許第4,849,430号において論じられる。
グルコシダーゼ阻害によって実証される抗ウイルス効果は、主にカルネキシン/カルレテキュリンサイクルに入ることを遮断することによる、ER内のウイルス糖蛋白質のミスフォールディングまたは保持の結果であると考えられている。伸長しているポリペプチド鎖におけるトリグルコシル化オリゴサッカライド(Glc3Man9GlcNAc2)のAsn−X−Ser/Thrコンセンサス配列への転移後、成熟炭水化物ユニットへのそれ以上のプロセッシングが起こりうる前に3つのα‐結合グルコース残基が遊離されることが必要である。さらに、適切なフォールディングのためにカルネキシン/カルレテキュリンサイクルに入ることを可能にするために2つの外側のグルコース残基が取り除かれなければならない。たとえば、Bergeron,J.J.ら,Trends Biochem.Sci.,1994,19,124−128;Peterson,J.R.ら,Mol.Biol.Cell,1995,6,1173−1184を参照されたい。初期のプロセッシングは、ERに位置し、α1−2結合グルコース残基を特に開裂し、内腔に配向した触媒ドメイン(グルコシダーゼI)を持つ膜内在性酵素に影響を受け;その後α1−3結合グルコース成分の両方を遊離するグルコシダーゼIIの作用を受ける。
リポソームは、分子障壁としての役割を果たす細胞膜を回避することによって、水溶性化合物を細胞の内側に直接送達することができる。pH感受性リポソーム製剤は、ホスファチジルエタノールアミン(PE)またはその誘導体、たとえばDOPEと、中性pHにおいて安定化剤としての役割を果たす酸性基を含む化合物の組み合わせを含むことができる。コレステリルヘミスクシネート(CHEMS)は、in vivoにおいて他の両親媒性安定化剤に比較してそのコレステロール基がPE含有小胞に高い安定性を与えるため、優れた安定化分子でありうる。リポソーム−媒介送達のin vivoでの効力は、それらの薬物動態および生体内分布に影響を与える血清成分(オプソニン)との相互作用に強く依存しうる。pH−感受性リポソームは、血液循環から速やかに除去され、肝臓および腎臓に蓄積するが、共有結合したポリエチレングリコール(PEG)を持つ脂質の包含は、DOPE:CHEMSリポソームの正味の負電荷を安定化し、長期の循環時間を導くことにより、細網内皮系(RES)によるクリアランスに打ち勝つことができる。DOPE−CHEMSおよびDOPE−CHEMS−PEG−PEリポソームならびにそれらの調製の方法は、たとえばV.A.Slepushkin,S.Simoes,P.Dazin,M.S.Newman,L.S.Guo and M.C.P.de Lima,J.Biol.Chem.272(1997)2382−2388;およびS.Simoes,V.Slepushkin,N.Duzgunes and M.C.Pedroso de Lima,Biomembranes 1515(2001)23−37に記載され、それらは共にそのまま参照として本明細書に援用される。
発明者らはPIまたはPS脂質(図1を参照されたい)の中の少なくとも1種を含む、リポソームまたはミセルのような脂質粒子は細胞により効率的に取り込まれ、そしてその細胞のER膜と融合してもよいと考える。発明者らはまた、PIまたはPS脂質の中の少なくとも1種を含む脂質粒子は、血液または血清のような血液成分中で高い安定性を有しうることを発見した。たとえば、PIまたはPS脂質の中の少なくとも1種を含むリポソームは、DOPE/CHEMSリポソーム(モル比6:3)またはDOPE/CHEMS/PEG−PE(モル比6:3:0.1)リポソームより、血清中で高い安定性を有しうる。
脂質粒子は対象においてウイルスによって引き起こされるか、またはウイルスに関連した疾患または状態を治療する、予防するおよび/またはモニターするために使用することができ、そのような対象は多くの場合哺乳類または鳥類のような温血動物でありうる。多くの場合、対象はヒトでありうる。多くの場合、該疾患または状態はウイルス感染でありうる。
ある態様では、少なくとも1種の薬剤、たとえば治療薬またはイメージング剤は脂質粒子内側に被包されてもよい。そのような薬剤は、たとえば、水溶性分子、ペプチドまたはアミノ酸であってもよい。被包された活性薬と一緒に脂質粒子を含む組成物は、活性薬が有効であることが公知の疾患または状態を治療する、予防する、またはモニターするために使用することができる。該疾患または状態は、活性薬の細胞内送達が有益であってもよい任意の疾患または状態であってもよい。
4,792,558号;第4,837,237号;第4,925,796号;第4,952,585号;第5,004,746号;第5,214,050号;第5,264,356号;第5,385,911号;第5,643,888号;第5,691,346号;第5,750,648号;第5,837,709号;第5,908,867号;第6,136,820号;第6,583,158号;第6,589,964号;第6,656,912号および米国特許公報20020006909;20020188011;20060093577;20060194835;20080131398に開示される。カスタノスペルミンおよびその誘導体が有効でありうる疾患および状態には、HIV感染を含むレトロウイルス感染;脳性マラリア;B型肝炎感染およびC型肝炎感染を含む肝炎感染;糖尿病ならびにリソソーム蓄積障害が挙げられるが、それらに限定されない。
R4は水素であるか、または除去され(すなわち、存在しない);そして
R5は水素、ヒドロキシ、アミノ、置換されたアミノ、カルボキシ、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキル、アリール、アラルキル、アルコキシ、ヒドロキシアルキル、アシルオキシ、もしくはアロイルオキシであるか、またはR3とR5は一緒にフェニルを形成し、そしてR4は除去される(すなわち、存在しない)。
ある態様では、脂質粒子を含む組成物は、脂質粒子とコンジュゲートするか、または粒子の脂質単層もしくは脂質二重層に挿入されうる、少なくとも1つのターゲッティング部分を含んでいてもよい。ある態様では、ターゲッティング部分はウイルスのエンベロップ蛋白質のリガンドであってもよいリガンド、またはウイルスのエンベロップ蛋白質に対する抗体であってもよい抗体であってもよい。そのような部分はウイルスに感染した細胞を粒子の目標にするために使用されてもよい。そのようなターゲッティング部分はまた、ウイルスに関連するか、またはウイルスによって引き起こされるウイルス感染に対する排除(sterilizing)免疫を獲得するために使用されてもよい。
ある態様では、脂質粒子はその脂質単層、または二重層に挿入された1以上の部分を含んでいてもよい。挿入部分の例としては、膜貫通蛋白質、蛋白質脂質コンジュゲート、標識脂質、脂溶性化合物またはいずれかその組み合わせが挙げられるが、それらに限定されない。
本発明者らはまた、少なくとも1種の多価不飽和脂質を含む脂質粒子、たとえばリポソームが、対象、たとえばヒトにおける、感染、たとえばウイルス感染を治療するおよび/または予防することにおいて有効であってもよいと考えている。
ある態様では、脂質粒子を含む組成物は細胞に投与されうる。細胞はウイルスに感染した細胞でありうる。多くの場合、接触した細胞は哺乳動物または鳥のような温血動物に由来する細胞でありうる。ある態様では、接触した細胞はヒトに由来する細胞でありうる。
ある態様では、脂質粒子は放射性ラベル、フルオロフォアラベルまたはビオチンラベルのような少なくとも1種のラベルにより標識される少なくとも1種の標識脂質を含み、それゆえ粒子自体を標識してもよい。
リポソームは記載されたすべてのアッセイに対して新たに調製された。脂質のクロロホルム溶液はガラス試験管に入れられ、溶媒は窒素ガス流下で留去された。特記しない限り、脂質フィルムは1xPBSバッファー中ボルテックスで攪拌することにより、最終脂質濃度5mMに水和された。生じたマルチラメラ小胞はMini−Extruder装置を使用し、ポア直径100nmのポリカーボネートフィルターを11回通して押し出された。リポソームは0.22μmフィルターユニットを使用して濾過滅菌された。図1(A)〜(E)はこれらの研究で使用された脂質を提示する:A.DOPE;B.DOPC;C.CHEMS;D.PI;E.PS。実験で使用されたPEG−PEはPEG(MW−2000)−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンであった。コレステリルヘミスクシネートを除くすべての脂質は、リポソームの調製のためのすべての物質と同じように、Avanti Polar Lipids(USA)から購入した。コレステリルヘミスクシネートはSigma(UK)から購入した。
この実験の目的は、PIおよび/またはPS脂質と一緒に、またはそれらを含まずにPEおよびPCまたはCHEMSを含むリポソームでHuh7.5細胞(ヒト肝臓細胞)を処置し、それらのER膜との共局在を確定することであった。リポソームはすべてのリポソームへのローダミン−タグ付きPE(Rh−PE)の組み込みによって標識された。Huh7.5細胞のER膜は抗−EDEM抗体を使用して標識された。EDEM抗体はSanta Cruz Biotechnology(USA)から購入した。共局在は共焦点顕微鏡によって確定された。顕著な共局在は、Huh7.5細胞のER膜と融合するリポソームの証拠として役立ちうる
2.1.リポソーム処置Huh7.5細胞のER膜とリポソームとの共局在を可視化するための特定の方法論:
脂質組成PE:CH、PE:PC、PE:CH:PI、PE:PC:PI、PE:CH:PS、PE:PC:PS、PE:CH:PI:PS、およびPE:PC:PI:PSを持つリポソームは先に記載のように調製され、可視化のためにRh−PEを1%(総モル)含んだ。Huh7.5細胞は番号1.5のガラスカバースライドに一晩接着させ、その後培地が交換され、最終脂質濃度50μMになるまで添加されたリポソームを含む新鮮な培地と取り替えられた。37℃/5%CO2で5分間インキュベーション後、リポソームを含む培地は除去され、細胞は1xPBSで2回洗浄され、付加的に30分間新鮮な培地中でインキュベーションされ、1xPBS/0.1%Tween−20で希釈された4%パラホルムアルデヒド中で15分間固定され、1xPBS/0.1%Tween−20で2回洗浄された。その後細胞は4μg/ml抗−EDEM抗体を含む1xPBS/0.1%Tween−20中で1時間インキュベーションされ、1xPBS/0.1%Tween−20で2回洗浄され、4μg/mlFITC−標識二次抗体を含む1xPBS/0.1%Tween−20中で1時間インキュベーションされ、さらに2回洗浄された。細胞はDAPIで染色され、その後顕微鏡スライドにマウントされた。Carl Zeiss LSM顕微鏡を使用して共焦点画像が撮られ、画像解析はLSMソフトウェアv5.10.を使用して行われた。図1Fはこれらのアッセイで使用されたRh−PE脂質の構造を示す。
図2(A)〜(F)は、脂質PIおよび/またはPSを含むリポソームがER−膜蛋白質EDEMと共局在したことを実証する。リポソームは5分間Huh7.5細胞と一緒にインキュベーションされ、その後培地は交換され、細胞はリポソームを含まない培地でインキュベーションされた。細胞は固定され、30分間インキュベーション後、抗−EDEM抗体(緑色、上部右画像)で探査され、リポソームに由来するRh−PE脂質との共局在(赤色、底部左画像)は共焦点顕微鏡により確定された。DAPI(青色、上部左画像)は核染料として使用される。共局在は統合画像(底部、右)内の黄色の存在によって測定された。実験は3回反復され、代表的な画像が示される。図2A.PE:CH(モル比3:2)リポソーム;図2B.PE:PC(3:2)リポソーム;図2C.PE:CH:PI(3:1:1)リポソーム;図2D.PE:PC:PI(2:2:1)リポソーム;図2E.PE:CH:PS(3:1:1)リポソーム;図2F.PE:PC:PS(2:2:1)リポソーム;図2G.PE:CH:PI:PS(3:1:0.5:0.5)リポソーム;図2H.PE:PC:PI:PS(1.5:1.5:1:1)リポソーム。
MetaMorphソフトウェア(v.7,Molecular Devices,Downingtown,PA,U.S.A.)を使用してパーセンテージ共局在が測定された。画像はメディアンフィルターセットを使用して3x3ピクセルにフィルター処理され、2つの画像(rh−PE/赤色画像およびEDEM/緑色画像)間の統合した共局在を確定するために使用される閾値は、それぞれに対して平均濃度プラス1標準偏差(SD)に設定された。報告された値は30細胞の平均値±SDを表す。
2.4.リポソームとERマーカー(EDEM)のパーセント共局在解析の結果:
画像共局在の定量の結果は、DOPE:CHまたはDOPE:DOPCリポソームへの20%PIまたは20%PSの組み込みがER膜との共局在を著しく増すことを示唆しうる。DOPE:CH:PIおよびDOPE:CH:PSからなるリポソームは、DOPE:CHだけの場合の13%(SD=6.6%)と比較して、それぞれ52%(SD=8.0%)および46%(SD=8.1%)の共局在を実証した。同様に、DOPE:DOPC:PIとDOPE:DOPC:PSの組成物は、DOPE:DOPCリポソームの場合の12%(SD=4.7%)と比較して、それぞれ64%(SD=8.1%)および48%(SD=7.6%)の共局在を実証した。DOPE:CHおよびDOPE:DOPCリポソーム内の20%PIと20%PSの組み合わせはさらにER膜への共局在を増し、その結果DOPE:CH:PI:PSリポソームは76%(SD=8.7%)のER膜共局在を実証し、88%(SD=3.5%)共局在がDOPE:DOPC:PI:PSリポソームにより観察された。
以下の実験の目的は、共焦点顕微鏡によって、ウシウイルス性下痢症ウイルス(BVDV)に感染したMadin−Darbyウシ腎臓(MDBK)細胞およびHCV細胞培養物(HCVcc)−感染Huh7.5細胞を、ER膜と共局在することが示されたリポソームにより処置し、そして分泌されたウイルス粒子内へのタグ付きリポソーム脂質の組み込みを調べることであった。BVDVおよびHCVは両方ともアセンブルし、ER膜から出芽するウイルスであり;従って分泌されたウイルス粒子へのリポソームを介して送達されるタグ付き脂質の組み込みは、これらの細胞のER膜とリポソームの融合を示唆する。HIV−1感染末梢血単核細胞(PBMC)は、細胞膜から出芽するウイルスへの脂質の組み込みを検出するための対照として使用される。
BVDV細胞培養物:Madin−Darbyウシ腎臓(MDBK)細胞は完全DMEM/10%FBS中、6ウェルプレートのウェル毎に3x105細胞で播種され、0.1の感染多重度(MOI)でncpBVDV株Pe515(National Animal Disease Laboratory,United Kingdom)に感染し、3日毎に10%(vol/vol)ウシ胎児血清を含む新鮮なRPMI1640培地2mlに1:8希釈で継代された。分泌されたBVDV粒子を定量するためのRT−PCRによって確定される安定な感染が達成された後、リポソーム処置が開始された。定量PCRは取り扱い説明書に従って、QIAampウイルスRNA精製キット(QIAamp Viral RNA Purification Kit)(QIAGEN)を使用して上清500μlに対して行われた。リアルタイムPCRは、SyBr Green Mix(QIAGEN)およびncpBVDV RNAに対して設計されたプライマー(フォワード:TAG GGC AAA CCA TCT GGA AG、リバースプライマー:ACT TGG AGC TAC AGG CCT CA)を使用して行われた。
Histopaque密度勾配遠心法(Sigma−Aldrich,Gillingham,U.K.)を使用して分離され、プールされ、完全RPMI(RPMIプラス10%FBS、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシンおよび2mM L−グルタミン)中で、フィトヘマグルチニン(PHA、5μg/ml)により48時間、その後インターロイキン−2(IL2、40U/ml)により72時間刺激された後、実験が開始された。特記しない限り、すべてのインキュベーションは37℃/5%CO2で行われた。細胞を感染させるために、4x106PHA−活性化PBMCおよび初代分離株ストックの100TCID50(50%組織培養感染量)は、6−ウェルプレートのウェル毎に、2ml完全RPMI/10%FBS中で一緒にインキュベーションされた。細胞は16時間感染し、完全RPMI培地で3回洗浄され、その後リポソームとのインキュベーションが開始された。
図1Gは使用されるビオチン化PE脂質(b−PE)の構造を示す。ビオチン−標識PE(b−PE)は、ERリポソーム、すなわちPIおよび/またはPS脂質を含むリポソームに0.1、0.5、1、5、または10モル%で組み込まれ、分泌されたHCVおよびBVDV(2種のER−出芽ウイルス)にタグを付けるための至適濃度は1%であると確定され、該濃度はそれぞれ分泌されたビリオンの総数の90%(SD=3.6%)および91%(SD=1.5%)を捕獲する(図4)。HIV−1の初代分離株(LAI)に感染したPBMCは同様にb−ERリポソームによって処置され、分泌されたHIV−1粒子はいずれも検出可能な量のタグ付き脂質を含まなかった(図4)。この結果は、生産的HIV−1アセンブリーは細胞膜で発生するため、脂質をERおよびER−結合膜に送達するためのこのシステムの特異性を強調することができる。
Huh7.5細胞は75cm2フラスコ中で十分にコンフルエントになるまで培養され、その後培地は50μMのrh−PE−標識22:6ERリポソームを含む培地に取り替えられた。細胞はそのまま48時間インキュベーションされ、PBSで2回洗浄され、リポソームを含まない新鮮な培地中で24時間インキュベーションされた。分泌された粒子を含む上清が採取された。分泌されたHCVccは定量PCRによって力価を測定され、分泌されたビリオンの感染力は先に記載のように確定された。共焦点顕微鏡によるrh−HCVccの可視化のために、ナイーブHuh7.5細胞は完全DMEM/10%FCS中で番号1.5のガラスカバースライドに一晩接着させ、その後、培地はrh−HCVccウイルスストックと取り替えられ、1時間インキュベーションされた。感染後、細胞はPBSで2回洗浄され、新鮮な培地は種々のインキュベーション期間に対して取り替えられ、1xPBSで2回洗浄され、メタノール:アセトン(1:1、vol:vol)で10分間固定され、そして最後に1xPBS/0.1%Tween−20で2回洗浄された。その後細胞は初代抗体を含む1xPBS/0.1%Tween−20中で1時間インキュベーションされ、1xPBS/0.1%Tween−20で4回洗浄され、蛍光−標識二次抗体を含む1xPBS/0.1%Tween−20中で1時間インキュベーションされ、さらに4回洗浄された。細胞はDAPIで染色され、顕微鏡スライドにマウントされた。共焦点画像はCarl Zeiss LSM顕微鏡を使用して撮られ、画像解析はLSMソフトウェアv5.10.を使用して行われた。
我々は1%rh−ERリポソームおよび固定―細胞共焦点顕微鏡観察を使用して、Huh7.5細胞におけるHCVcc感染を可視化している(図5)。Rh−タグ付きHCVccは1%rh−ERリポソームの存在下で48時間インキュベーション後24時間集められ、MOI=0.1でナイーブ細胞を1時間感染させるために使用された。固定共焦点画像は1時間感染後、ならびに6時間および24時間感染後ただちに撮られ、透過化された細胞は確かにHCVcc粒子を同定するために、抗−HCVコア抗体により探査された。これらの画像において、コア−陽性粒子は感染後1時間まで細胞表面上で直径およそ1μmの単一クラスターとして出現し、その時点でこのクラスターはエンドサイトーシスされるように見え、そしておよそ5μmのクラスターに広がる。この大きなクラスターは細胞の核に向かって移動し、感染した細胞の核の特徴的なくぼみを形成し(図5)、その時点でクラスターは消失し、rh−タグ付き脂質はHCVコア蛋白質から分離し始める。増大したコア蛋白質レベルが感染後およそ24時間目に細胞で観察されて、樹立された感染および新規なコア蛋白質合成を表してもよい。
この実験の目的は、MDBK細胞を蛍光−標識リポソームで処置し、期間全体にわたってそれらの細胞膜への取り込みおよび組み込みをモニターすることであった。pH−感受性リポソーム、すなわち、PIおよびPS脂質を含まないDOPE−CHEMSまたはDOPE−CHEMS−PEG−PEリポソームは細胞に入ると考えてよく、そしてエンドソームにおけるリポソーム膜の破壊後、脂質はリソソームへのエンドソーム経路に沿って留まると考えられる。PIおよび/またはPS脂質を含むリポソームが細胞内の他の膜と融合することが可能であるならば、それらはpH−感受性リポソームに比較してより長い寿命を有するべきである。リポソームを介して細胞に送達されたRho−PE脂質は5分間処置後、MDBK細胞と一緒に48時間にわたり蛍光顕微鏡により可視化された。
PE:CH、PE:CH:PI、およびPE:CH:PSリポソームは先に記載のように調製され、可視化のために1%(総モル)のRh−PEを含んだ。MDBK細胞は50%のコンフルエンシーで6ウェルプレートに播種され、そのまま一晩接着させた。細胞は1xPBSで2回洗浄され,その後、2mlの完全RPMIに最終脂質濃度50μMになるまで添加されたRh−標識リポソームにより、5分間、37℃、5%CO2で処置された。5分間インキュベーション後、細胞は1xPBSで2回洗浄され、新鮮な完全RPMI培地2mlがそれぞれのウェルに添加され、そしてプレートはそのまま1、10、24、および48時間インキュベーションされた。それぞれのインキュベーション期間終了時に、細胞は2回洗浄され、1xPBS/0.1% Tween−20で希釈された4%パラホルムアルデヒド中で15分間固定され、1xPBS/0.1% Tween−20で2回洗浄された。細胞はイメージング前にDAPIで染色された。蛍光画像はNikon Eclipse TE2000−U顕微鏡により撮られ、画像解析はNikon ACT−1ソフトウェアv2.70を使用して行われた。
図6(A)〜(C)は、脂質PIまたはPSと組み合わせたPEからなるリポソームの蛍光顕微鏡画像がpH−感受性リポソームに比較して細胞膜への増大した組み込みを実証することを示す。MDBK細胞はRh−PE標識リポソームにより5分間処置され、その後細胞は洗浄され、そのまま培地中で1、10、24、および48時間だけインキュベーションされた。それぞれのインキュベーション期間後、細胞は固定され、Rh−PE脂質(赤色)は蛍光顕微鏡下で可視化される。DAPI(青色)は核染料として使用される。実験は2回反復され、1回の実験に由来する代表的な画像が示される。図A.PE:CH(モル比3:2)リポソーム。図6B.PE:CH:PI(モル比3:1:1)リポソーム。図6C.PE:CH:PS(モル比3:1:1)リポソーム。
4日間のインキュベーション期間にわたりHuh7.5細胞におけるリポソーム取り込み速度をモニターするために、細胞は培地中において最終脂質濃度50μMの、1%rh−PEを含むDOPE:CHおよびDOPE:DOPC:PI:PSリポソームと一緒にインキュベーションされた。細胞は低密度で播種され、リポソーム取り込みは細胞増殖に関して測定された。4日間インキュベーション後、処置されたHuh7.5細胞は洗浄され、いずれのリポソームも含まない培地に戻され、DOPE:CHおよびDOPE:DOPC:PI:PSリポソームを介して送達されるrh−DOPE脂質の半減期がモニターされた。
リポソームは先に記載のように調製され、細胞におけるそれらの取り込みをモニターするために1%(総モル)のrh−PEを含んだ。長期(4日間)リポソーム取り込みアッセイのために、Huh7.5細胞は2mlの完全DMEM培地/10%FBSのウェル毎に105細胞で6ウェルプレートに播種された。Rh−PE−標識リポソームは最終リン脂質濃度50μMになるまで細胞に添加され、37oC/5% CO2で2、24、48、72、および96時間、そのままインキュベーションされた。インキュベーション期間後、細胞は採取され、分析された。分析のために、細胞は1xPBSで2回洗浄され、計数され、200μlの1xPBS/0.5%Triton X−100に再懸濁され、そして96ウェルプレートに移されて、λex=550nm、λem=590nmにおいて分光蛍光光度計で読み取られた。先に記載のように96時間インキュベーション後の、Huh7.5細胞内側のrh−PE脂質の保持を測定するために、細胞は1xPBSで3回洗浄され、培地は新鮮なDMEM/10%FBSと取り替えられ、そして細胞はそのままさらに8、24、30、および48時間インキュベーションされた。インキュベーション期間後、細胞は採取され、先に記載のように解析された。
図7に示すように、活発に分裂するHuh7.5細胞は4日間のインキュベーション期間にわたり、DOPE:DOPC:PI:PSリポソームの継続した取り込みを実証した。4日目に、DOPE:DOPC:PI:PS−処置細胞は、1.5x10−3AU/細胞(SD=3.4x10−4AU/細胞)の蛍光を実証し、それはDOPE:CHリポソーム処置(2.5x10−4AU/細胞(SD=5.5x10−5AU/細胞))で観察された値より6倍大きかった。実際、DOPE:CH−処置細胞で観察された最大蛍光(5.0x10−4AU/細胞(SD=1.1x10−4))はたった24時間処置期間後に到達し、その後細胞に関連した蛍光はゆっくり減少し、減少したリポソーム取り込みもしくは増大したrh−PE脂質エフラックスのいずれか、または両方を示唆する。
薬物送達システムとしてのリポソームの一般的使用はいくつかの問題によって妨げられてきた。血清蛋白質に媒介されるリポソーム内容物の漏出はこれらの問題の1つである。カルセイン−被包リポソームを使用して、10%FBSを含む無細胞培地におけるリポソームの安定性を4日間にわたりモニターした。カルセインはリポソーム内側に被包されている場合は消光した状態である、水溶性、自己−消光フルオロフォアである;しかし、リポソーム不安定化が漏出およびその後のフルオロフォアの脱消光を誘発することになる。
10%FBS存在下でのリポソームの安定性をモニターするために、カルセイン−負荷リポソームが調製され、サイズ−排除クロマトグラフィーにより被包されていないカルセインから分離され、細胞の非存在下で、最終リン脂質濃度50μMになるまで完全DMEM/10%FBSに添加された。リポソームはそのまま4日間インキュベーションされ、24時間毎にリポソーム−含有培地の試料が採取され、リポソーム不安定化および周囲培地へのカルセインの漏出の結果としてのカルセイン脱消光をλex=490nm、λem=520nmにおいてモニターした。蛍光スケールを較正するために、4日間インキュベーション後、最終濃度1%になるまでのTriton X−100の添加はリポソーム膜を破壊し、100%カルセイン脱消光を達成した:%漏出=((In−I0)/(I100−I0))x100、式中I0は0時での蛍光であり、Inはn時での蛍光であり、そしてI100はTriton添加後に完全に脱消光したカルセイン蛍光である。
図8AはpH−感受性DOPE:CHおよびER−ターゲッティングDOPE:DOPC:PI:PSリポソーム内からのカルセイン遊離の割合を実証する。4日間インキュベーション後に、DOPE:PEリポソームからは58%(SD=12.6%)のカルセインが遊離されていたが、DOPE:DOPC:PI:PSリポソームからは32%(SD=9.2%)だけしかカルセインは遊離されず、血清の存在におけるより高い安定性を示唆した。
これらの実験の目的は、Huh7.5細胞およびPBMC両方の1ラウンド処置(5日間)にわたる細胞生存能力に対するリポソームの効果を確定することであった。
脂質組成PH:CH(3:2)、PE:PC(3:2)、PE:PI(3:2)、PE:CH:PI(3:1:1)、PE:PC:PI(1.5:1.5:2)、PE:PS(3:2)、PE:CH:PS(3:1:1)、PE:PC:PS(1.5:1.5:2)、PE:PI:PS(3:1:1)、PE:CH:PI:PS(3:1:0.5:0.5)およびPE:PC:PI:PS(1.5:1.5:1:1)を持つリポソームは先に記載のように調製された。Huh7.5細胞およびPBMCはそれぞれ200μlの完全DMEMおよびRPMI+IL2培地中5x104細胞/ウェルの濃度で96ウェルプレートに播種され、0〜500μMの範囲の最終脂質濃度を持つ1xPBSを被包したリポソームの存在下でインキュベーションされた。5日間のインキュベーション後、細胞生存能力は取扱説明書に従ってMTSを基礎にした細胞増殖アッセイ(CellTiter 96(登録商標),Promega,San Luis Obispo,U.S.A.)により確定された。
図9は、1xPBSを被包した異なるリポソーム製剤と一緒に5日間インキュベーション後のHuh7.5細胞の生存能力を示す。培地における最終脂質濃度は0〜500μMまで変動した。結果は、3回の独立した実験に由来するトリプリケート試料の平均値を表す。
これらの実験の目的は異なるリポソーム組成物で処置されたHIV−1−感染PBMCからのHIV−1分泌レベルの変化をモニターすることであった。
脂質組成PH:CH(3:2)、PE:PC(3:2)、PE:PI(3:2)、PE:CH:PI(3:1:1)、PE:PS(3:2)、PE:CH:PS(3:1:1)、PE:CH:PI:PS(3:1:0.5:0.5)およびPE:PC:PI:PS(1.5:1.5:1:1)を持つリポソームは先に記載のように調製された。薬物処置細胞から分泌されたビリオンによる感染の結果としてのHIVの分泌の変化は、指標細胞としての刺激されたPBMC、およびエンドポイントとしてのp24抗原産生の確定を使用して評価された。4人の正常(非感染)ドナーに由来するPBMCはHistopaque密度勾配遠心法(Sigma−Aldrich,Gillingham,U.K.)を使用して分離され、プールされ、そして完全RPMI(RPMIプラス10%熱―不活性化FBS、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、および2mM L−グルタミン)中で48時間フィトヘマグルチニン(PHA、5μg/ml)、続いて72時間インターロイキン−2(IL2、40U/ml)により刺激された。特記しない限り、すべての実験は96ウェルマイクロタイタープレートで行われ、すべてのインキュベーションは37oC/5%CO2で行われた。細胞を感染させるために、4x105PHA−活性化PBMCおよび初代分離株ストックの100TCID50(50%組織培養感染量)がそれぞれのウェルに添加された。16時間の夜通しのインキュベーション後、細胞は完全RPMI培地で3回洗浄され、適切な遊離薬物またはリポソーム処置剤(最終脂質濃度50μM)を含む完全RPMI/IL2に再懸濁された。5日目に、薬物―処置細胞から分泌されたHIVビリオンを含む上清は集められ、p24濃度はp24捕獲ELISAによってそれぞれに対して定量される。
図11は、5日間リポソーム処置した感染PBMCからのHIVの分泌を実証する。すべてのリポソームは1xPBS溶液を被包していて、最終脂質濃度50μMで細胞培養培地に添加されている。ウイルス分泌は、捕獲ELISAによる処置および無処置PBMC上清内のHIVコア蛋白質p24の定量後に計算された。結果は無処置対照に関したHIV分泌の百分率として提示され、2回の独立した実験に由来するトリプリケート試料の平均値を表す。アッセイはLAI(クレードB)、93UG067(クレードD)および93RW024(クレードA)を含む、3種の遺伝的に多様なHIV−1分離株に対して実施された。
これらの実験の目的は、異なるリポソーム組成物で処置されたHIV−1−感染PBMCから分泌されたHIV−1ビリオンの感染力の変化をモニターすることであった。
リポソームで処置された感染PBMCから分泌されたHIV−1ビリオンの感染力は、先の段落に記載のように、リポソーム−処置細胞から分泌されたHIVビリオンを含む上清を使用して確定された。すべての上清は完全RPMI/IL2中最終p24濃度10ng/mlに希釈され、100μlは最終p24濃度5ng/mlとなるようにやはり100μlの培地中の4x105PHA−活性化PBMCに添加され、そのまま一晩インキュベーションされた。翌日、細胞は記載のように洗浄され、200μlの新鮮なRPMI/IL2に再懸濁され、そのまま4日間インキュベーションされた後、上清が集められ、捕獲ELISAによってp24含量がアッセイされた。
図12はリポソーム−処置HIV−感染PBMCから分泌されたHIVビリオンの感染力を示す。分泌されたウイルス粒子はナイーブPBMCを感染させるために使用され、そして細胞を感染させる能力は、上清が除去され、細胞が5日間無処置のままでおかれた後にウイルス分泌を測定することによって確定された。結果は無処置対照に関したHIV感染力の百分率として提示され、2回の独立した実験に由来するトリプリケート試料の平均値を表す。アッセイは、LAI(クレードB)、93UG067(クレードD)および93RW024(クレードA)を含む、3種の遺伝的に多様なHIV−1分離株に対して実施された。
これらの実験では、自己−消光濃度の蛍光分子、カルセインを被包するローダミン−標識リポソームが調製され、Huh7.5細胞の存在下でインキュベーションされた。カルセインは細胞内空間に遊離されて脱消光するため、細胞内側への被包されたカーゴの送達は蛍光の増大によってモニターされた。
蛍光測定アッセイのために、5x106Huh7.5細胞は完全DMEM/10%FBSを含む25cm2フラスコに播種され、そのまま一晩置かれた。翌日、1%rh−PEを含むカルセイン−負荷リポソームが培地に添加され(最終リン脂質濃度50μM)、37℃または4℃でそのまま30分間インキュベーションされた。インキュベーション後、細胞は1xPBSで2回洗浄され、トリプシン/EDTA(Invitrogen)で剥がされ、さらに2回洗浄され、そして600μlPBSに再懸濁された。200μlのアリコート3つを使用して蛍光が測定され、平均が求められた。カルセイン脱消光はλex=485nmおよびλem=520nmで測定され、そしてローダミン蛍光はλex=550nmおよびλem=590nmで測定された。エンドサイトーシスしない状態で細胞に結合したリポソームの初期のカルセイン蛍光対ローダミン蛍光の比は、リポソームを4℃で細胞と一緒にインキュベーションすることによって得られ、そして37℃での値を調整するために使用される。
リポソームとの45分間インキュベーション後のHuh7.5細胞における平均rh−DOPE蛍光はリポソームの取り込みを反映し、そして平均カルセイン蛍光は細胞内脱消光、従って蛍光色素の遊離を示す。計算されたカルセイン蛍光対ローダミン蛍光の比は、細胞に結合したリポソーム毎に細胞内に遊離された水性マーカーの量の尺度として見なされる。DOPE:CHリポソームに対するカルセイン/ローダミン比は10.3(SD=2.6)であると計算されたが、DOPE:DOPC:PI:PSリポソームに対する比は15.7(SD=2.4)であり、152%(P=0.02、図13)の増大であった。
これらの実験の目的は、被包されたイミノ糖(すなわち、NB−DNJ)をHIV−感染PBMCに送達するリポソームの能力を確定することであった。脂質PIおよびPSを含むリポソームはpH−感受性リポソーム(PE:CH)およびpH−非感受性リポソーム(PE:PC)に比較された。
脂質組成PH:CH(3:2)、PE:PC(3:2)、PE:PI(3:2)、PE:CH:PI(3:1:1)、PE:PS(3:2)、PE:PI:PS(3:1:1)、PE:CH:PI:PS(3:1:0.5:0.5)およびPE:PC:PI:PS(1.5:1.5:1:1)を持つリポソームは、すべてのリポソームが1xPBS中の1mM NB−DNJを被包すること以外は先に記載のように調製された。HIV分泌アッセイは先に記載のように実行された。サイズ−排除クロマトグラフィーによってリポソームは被包されないNB−DNJから精製された。リポソームに関する結果は細胞培養培地に1mMの最終濃度で添加されたNB−DNJに関する結果と比較される。
図14は1mMのフリーNB−DNJ対リポソームに媒介されて送達されたNB−DNJによる5日間処置の間の感染PBMCからのHIV分泌を示す。リポソームは1mM NB−DNJを被包していて、最終脂質濃度50μMで細胞培養培地に添加されている。ウイルス分泌は先に記載のように計算された。結果は無処置対照に関したHIV分泌の百分率として提示され、2つの独立した実験に由来するトリプリケート試料の平均値を表す。アッセイはLAI(クレードB)、93UG067(クレードD)および93RW024(クレードA)を含む、3種の遺伝的に多様なHIV−1分離株に対して実施された。
リポソームによって処置されたPBMCから分泌されたHIVビリオンの感染力は、すべてのリポソームが1xPBS中1mM NB−DNJを被包していること以外は先に記載のように確定された。リポソーム−処置細胞から分泌されたビリオンに関する結果はフリーNB−DNJ−処置細胞および無処置細胞から分泌されたものと比較される。
図15はNB−DNJ−リポソームまたはフリーNB−DNJ−処置HIV−感染PBMCから分泌されたHIVビリオンの感染力を示す。分泌されたウイルス粒子はナイーブPBMCを感染させるために使用され、そして細胞を感染させる能力は先に記載のように確定された。結果は無処置対照に関するHIV感染力の百分率として提示され、2回の独立した実験に由来するトリプリケート試料の平均値を表す。アッセイはAI(クレードB)、93UG067(クレードD)および93RW024(クレードA)を含む、3種の遺伝的に多様なHIV−1分離株に対して実施された。
これらの実験の目的は、PBMCの細胞生存能力に対する1mM NB−DNJを被包するリポソーム1ラウンド処置(5日間)の効果を確定することであった。
脂質組成PH:CH(3:2)、PE:PC(3:2)、PE:PI(3:2)、PE:CH:PI(3:1:1)、PE:PS(3:2)、PE:CH:PS(3:1:1)、PE:CH:PI:PS(3:1:0.5:0.5)およびPE:PC:PI:PS(1.5:1.5:1:1)を持つリポソームは、すべてのリポソームが1xPBS中の1mM NB−DNJを被包する以外は、先に記載のように調製された。1mM NB−DNJを被包するリポソームとの5日間インキュベーション後の細胞生存能力は先に記載のように確定された。
図16は、1mM NB−DNJを被包する異なるリポソーム製剤との5日間インキュベーション後のPBMC生存能力を示す。培地の最終脂質濃度は0から500μMまで変動した。結果は3回の独立した実験に由来するトリプリケート試料の平均値を表す。驚くべきことに、ある種のリポソーム内側のNB−DNJの被包はモック−処置対照に比較して,細胞増殖を160%にまで増大させるように見える。
これらの実験の目的は、異なるリポソーム組成物によって処置されたHCV−感染Huh7.5細胞からのHCV−1−分泌レベルの変化をモニターすることであった。
アッセイは感染後8日目(急性)および感染後50日目(慢性)の細胞に対して行われた。HCV−感染Huh7.5細胞は6ウェルプレートにおいて75%コンフルエンシーになるまで培養され、その後培地はウェル毎に総容量2mlの完全DMEM+50μMリポソームで取り替えられ、そのまま37℃/5%CO2で72時間インキュベーションされた。すべてのアッセイはトリプリケート試料により行われた。ウイルス分泌解析は、QIAGEN QIAampウイルスRNA精製キットを使用し、取り扱い説明書に従って上清500μlから抽出されたウイルスRNAに対する定量PCRによって行われた。分泌されたウイルスRNAの定量は、初めに逆転写酵素反応を使用することによる分離されたRNAからcDNAへの変換、続いてSyBr GreenミックスとHCV cDNAに対して設計されたプライマーを使用したリアル−タイムPCRによって行われた。
図17は、5日間のリポソーム処置後の、急性および慢性−感染両方の、感染Huh7.5細胞からのHCVの分泌を示す。すべてのリポソームは1xPBS溶液を被包し、最終脂質濃度50μMで細胞培養培地に添加されている。HCV分泌は定量PCRによる処置および無処置Huh7.5細胞の上清内のRNAの定量後計算された。結果は無処置対照に関するHCV RNA分泌の百分率として提示され、トリプリケート試料の平均値を表す。
この実験の目的は、異なるリポソーム組成物によって処置されたHCV−感染Huh7.5細胞から分泌されたHCVビリオンの感染力の変化をモニターすることであった。
リポソームで処置されたHuh7.5細胞から分泌されたHCVビリオンの感染力は、先の段落に記載のように、リポソーム−処置細胞から分泌されたHCVビリオンを含む上清を使用して確定された。ナイーブHuh7.5細胞は48−ウェルプレートにおいて75%コンフルエンシーになるまで培養され、その後培地はリポソーム−処置細胞から分泌されたHCVを含む上清200μlと取り替えられた。上清はそのまま1時間ナイーブHuh7.5細胞を感染させ、その後細胞は1xPBSで2回洗浄され、完全DMEM500μl中、2日間、37℃/5%CO2でインキュベーションされた。2日間のインキュベーション後、細胞は1xPBSで2回洗浄され、メタノール/アセトン(1:1、vol:vol)で10分間固定され、1xPBS/0.1%Tween−20で2回洗浄された。細胞は4μg/ml抗−HCVコア抗体を含む1xPBS/0.1%Tween−20中で1時間インキュベーションされ、1xPBS/0.1%Tween−20で2回洗浄され、4μg/mlFITC−標識二次抗体を含む1xPBS/0.1%Tween−20中で1時間インキュベーションされ、さらに2回洗浄され、そしてDAPIで染色された。蛍光画像は、先に記載のようにNikon Eclipse TE2000−U顕微鏡を使用して撮られた。感染した細胞の百分率は、HCVに感染した細胞の総数(抗−HCV抗体によって検出される)を計数し、アッセイにおける(DAPI染色によって検出される)細胞の総数で割ることにより計算される。
図18は急性および慢性−感染両方の、リポソーム−処置HCV−感染Huh7.5細胞から分泌されたHCVビリオンの感染力を示す。分泌されたウイルス粒子はナイーブHuh7.5細胞を感染させるために使用され、細胞を感染させる能力は、一旦上清が除去され、細胞が2日間無処置のまま置かれた後にHCVコア蛋白質の存在を測定することによって確定された。結果は、無処置対照に関するHCV感染力の百分率として提示され、トリプリケート試料の平均値を表す。
Huh7.5細胞はERリポソームの存在下で一晩インキュベーションされ、細胞LDに対するそれらの効果をモニターされた。LDはリポソーム−処置細胞において共焦点顕微鏡により可視化された。
ERリポソームPE:PC:PI:PS(1.5:1.7:1.5:0.3)は先に記載のように調製された。Huh7.5細胞は番号1.5ガラスカバースライドに一晩接着させ、その後培地は交換され、最終脂質濃度50μMになるまで添加されたリポソームを含む新鮮な培地と取り替えられた。37℃/5%CO2で16時間インキュベーション後、リポソームを含む培地は除去され、細胞は1xPBSで洗浄され、1xPBSで希釈された4%パラホルムアルデヒドで15分間固定され、1xPBSで2回洗浄された。その後細胞は20μg/mlのBODIPY493/503を含む1xPBS中で10分間インキュベーションされ、1xPBSで2回洗浄された。BODIPY 493/503はLDのまわりの微小環境の詳細な分析に適する。細胞はDAPIで染色され、その後顕微鏡スライドにマウントされた。共焦点画像はCarl Zeiss LSM顕微鏡を使用して撮られ、画像解析はLSMソフトウェアv5.10を使用して行われた。
図19は、16時間インキュベーション後にLDを可視化するためにBODIPY 493/503(緑色)で探査された、無処置Huh7.5細胞(左パネル)およびPE:PC:PI:PSリポソーム−処置Huh7.5細胞(右パネル)の実験の結果を示す。PE:PC:PI:PSリポソームは最終脂質濃度50μMになるまで細胞培養培地に添加された。DAPI(青色)は核染料として、および画像濃度を標準化するために使用される。結果は、PE:PC:PI:PSリポソームによるHuh7.5細胞の処置はLDの形成を減少させることを示唆する。
PE:PC:PI:PSリポソームはHuh7.5細胞においてLD形成を妨害することが示されたため、これらのリポソームが細胞内LDと直接相互作用するかどうかを確定するために以下の実験が行われた。共局在を確定するために、Rh−PE標識リポソームはHuh7.5細胞と2時間インキュベーションされ、その後Rh−PE脂質および細胞内LDは共焦点顕微鏡によって可視化された。
ERリポソームPE:PC:PI:PS(1.5:1.7:1.5:0.3)は先に記載のように調製され、可視化のために1%(総モル)のRh−PEを含んだ。Huh7.5細胞は番号1.5ガラスカバースライドに一晩接着させ、その後培地は交換され、最終脂質濃度50μMになるまで添加されたRh−PE標識リポソームを含む新鮮な培地と取り替えられた。37℃/5%CO2で2時間インキュベーション後、リポソームを含む培地は除去され、細胞は固定され、先に記載のようにBODIPY493/503で染色された。細胞はDAPIで染色され、その後顕微鏡スライドにマウントされた。共焦点画像は先に記載のように撮られた。
図20は、PE:PC:PI:PSリポソーム(赤色)で2時間処置され、LD染料(緑色)で探査されたHuh7.5細胞の実験の結果を示す。PE:PC:PI:PSリポソームは最終脂質濃度50μMまで細胞培養培地に添加された。DAPI(青色)は核染料として使用される。底部−右パネルは統合画像である。黄色は細胞内の共局在領域を同定する。
HCVコア蛋白質と細胞内LD間の相互作用の妨害は、主としてHCV−感染細胞からの非−感染性ウイルス粒子の分泌を導くことができる。
ERリポソームPE:PC:PI:PS(1.5:1.7:1.5:0.3)は先に記載のように調製された。HCV遺伝子型JFH1による感染後8日目にHuh7.5細胞は番号1.5ガラスカバースライドに一晩接着させ、その後培地は交換され、最終脂質濃度50μMになるまで添加されたリポソームを含む新鮮な培地と取り替えられた。37℃/5%CO2で16時間インキュベーション後、リポソームを含む培地は除去され、細胞は1xPBSで2回洗浄され、メタノール/アセトン(1:1、vol:vol)で10分間固定され、1xPBS/0.1%Tween−20で2回洗浄された。次に細胞は3μg/ml抗−HCVコア抗体を含む1xPBS/0.1%Tween−20中で1時間インキュベーションされ、1xPBS/0.1%Tween−20で2回洗浄され、4μg/mlAlexaFluor550−標識二次抗体を含む1xPBS/0.1%Tween−20中で1時間インキュベーションされ、さらに2回洗浄された。細胞は20μg/mlのBODIPY493/503を含む1xPBSと一緒に10分間インキュベーションされ、1xPBSで2回洗浄され、その後DAPIで染色され、そして先に記載のようにマウントされた。共焦点画像は先に記載のように撮られた。
図21Aは、16時間インキュベーションされ、抗−HCV抗体(赤色)およびLD染色(緑色)によって探査された、無処置Huh7.5細胞(左パネル)とPE:PC:PI:PSリポソーム−処置Huh7.5細胞(右パネル)に関する実験の結果を示す。PE:PC:PI:PSリポソームは最終脂質濃度50μMになるまで細胞培養培地に添加された。DAPI(青色)は核染料として使用される。底部−右パネルは統合画像である。黄色は細胞内の共局在領域を同定する。図21Bは無処置(左)およびPE:PC:PI:PSリポソーム−処置(右)細胞両方の統合画像(白四角)の拡大を提示する。図21CはPE:PC:PI:PSリポソームの存在下(右)および非存在下(左)におけるHCVコア蛋白質/LD相互作用の概念図である。
HCVに対するERリポソームの抗ウイルス活性を高めるために、PEおよびPC脂質(現在すべての実験において18:1一価不飽和)は多価不飽和PEおよびPC脂質(22:6および/または20:4のいずれか)によって取り替えることができる。
方法は、急性JC−1 HCVcc感染に関して先に13&14節において記載のものと同じである。
図23Aで実証したように、18:1および20:4脂質は両方とも無処置対照に比較してHCVcc分泌の増大を導いた(それぞれ218%、SD=34.4%および159%、SD=21.6%)。22:6ERリポソームだけが50μMの濃度で有意に27%(SD=11.3%)HCV分泌を減少させることが示され;同様の減少が50μMの22:6PEG−ERリポソーム処置(23%、SD=6.6%)により観察された。分泌されたウイルス粒子の感染力を測定するために、リポソーム−処置HCVccに由来する上清を使用してナイーブHuh7.5細胞を感染させ、感染した細胞数は感染後48時間目に定量された。図23Bは、すべてのリポソーム処置による、それどころか増大したウイルス分泌を引き起こす18:1および20:4ERリポソーム処置による、HCV感染力の有意な減少を示す。50μM22:6ERリポソームによる処置はHCV感染力を91%(SD=2.2%)減少させた。試験した最も低い22:6ERリポソームの濃度1μMでさえ、感染力を52%(SD=5.3%)減少させ、22:6多価不飽和(pu)ERリポソームがウイルス感染の強力な阻害剤であることを示唆する。
Claims (106)
- 少なくとも1種のPS脂質を含む脂質粒子を含む組成物を、薬物送達が必要な宿主に投与することを含む、薬物送達の方法。
- 脂質粒子がリポソームである、請求項1に記載の方法。
- 脂質粒子がPE、CHEMS、PIまたはSP脂質の中の少なくとも1種をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 脂質粒子がPE脂質を含み、そしてPE脂質とPS脂質間のモル比が0.5:1から20:1まで変動する、請求項3に記載の方法。
- 脂質粒子中のPE脂質とPS脂質間のモル比が1:1から10:1まで変動する、請求項4に記載の方法。
- PE脂質がDOPE脂質およびPEG−PE脂質を含む、請求項5に記載の方法。
- 脂質粒子がPE、PIおよびPC脂質を含む、請求項3に記載の方法。
- ウイルスによって引き起こされるか、またはウイルスに関連した疾患または状態を治療するか、または予防するために適用される、請求項1に記載の方法。
- 疾患または状態がウイルス感染である、請求項8に記載の方法。
- 前記投与がウイルスに感染した細胞の小胞体膜への、脂質粒子の中の1種以上の脂質の組み込みに帰着する、請求項8に記載の方法。
- ウイルスがフラビウイルス科に属する、請求項8に記載の方法。
- 感染がC型肝炎感染である、請求項11に記載の方法。
- 前記投与がC型肝炎ウイルスに感染した細胞における脂肪滴の産生を低減させる、請求項12に記載の方法。
- 前記投与が脂肪滴とC型肝炎ウイルスのコア蛋白質との相互作用を阻止する、請求項12に記載の方法。
- 前記投与がC型肝炎ウイルスの感染力を低減させる、請求項12に記載の方法。
- ウイルスがレトロウイルス科に属する、請求項8に記載の方法。
- ウイルスがHIV−1ウイルスである、請求項16に記載の方法。
- 組成物が脂質粒子に被包された少なくとも1種の活性薬をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記投与が、感染を引き起こすウイルスに感染した細胞の小胞体膜への少なくとも1種の活性薬の送達に帰着する、請求項18に記載の方法。
- 少なくとも1種の活性薬がイミノ糖を含む、請求項18に記載の方法。
- 少なくとも1種の活性薬がアルファグルコシダーゼ阻害剤を含む、請求項18に記載の方法。
- 少なくとも1種の活性薬がイオンチャンネル阻害剤を含む、請求項18に記載の方法。
- 少なくとも1種の活性薬がN−置換デオキシノジリマイシンを含む、請求項18に記載の方法。
- 少なくとも1種の活性薬がN−ブチルデオキシノジリマイシンを含む、請求項18に記載の方法。
- 少なくとも1種の活性薬が少なくとも1種の抗−HIV薬を含む、請求項18に記載の方法。
- 少なくとも1種の活性薬が少なくとも1種の抗−肝炎薬を含む、請求項18に記載の方法。
- 少なくとも1種の活性薬が免疫刺激薬または免疫調節薬およびヌクレオチドまたはヌクレオシド抗ウイルス薬の中の少なくとも1種を含む、請求項18に記載の方法。
- 組成物が抗ウイルス蛋白質をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 抗ウイルス蛋白質が脂質粒子の脂質単層または二重層の中に挿入されるか、または脂質粒子とコンジュゲートする、請求項28に記載の方法。
- 組成物が脂質粒子とコンジュゲートするか、または脂質粒子の脂質単層または二重層の中に挿入されるターゲッティング部分を含む、請求項1に記載の方法。
- ターゲッティング部分がgp120/gp41ターゲッティング部分を含む、請求項30に記載の方法。
- ターゲッティング部分がsCD4分子を含む、請求項30に記載の方法。
- ターゲッティング部分がモノクローナル抗体を含む、請求項30に記載の方法。
- ターゲッティング部分がEIまたはE2ターゲッティング部分を含む、請求項30に記載の方法。
- 宿主がヒトである、請求項1に記載の方法。
- PS脂質またはPI脂質の中の少なくとも1種を含む脂質粒子を含む組成物を、薬物送達が必要な宿主に投与することを含む、HIV感染を治療するか、予防する方法であって、前記脂質粒子がCHEMS脂質を含まない、前記方法。
- 脂質粒子がリポソームである、請求項36に記載の方法。
- 脂質粒子がさらにPE脂質を含む、請求項36に記載の方法。
- PE脂質がDOPE脂質またはPEG−PE脂質の中の少なくとも1種を含む、請求項38に記載の方法。
- 脂質粒子がPC脂質をさらに含む、請求項36に記載の方法。
- 組成物が脂質粒子中に被包された少なくとも1種の抗−HIV薬を含む、請求項36に記載の方法。
- 少なくとも1種の抗−HIV薬がイミノ糖を含む、請求項41に記載の方法。
- 少なくとも1種の抗−HIV薬がアルファグルコシダーゼ阻害剤を含む、請求項41に記載の方法。
- 少なくとも1種の抗−HIV薬がN−置換デオキシノジリマイシンを含む、請求項41に記載の方法。
- 少なくとも1種の抗−HIV薬がN−ブチルデオキシノジリマイシンを含む、請求項44に記載の方法。
- 組成物が脂質粒子とコンジュゲートするか、または脂質粒子の脂質単層または二重層の中に挿入されるターゲッティング部分をさらに含む、請求項36に記載の方法。
- ターゲッティング部分がgp120/gp41ターゲッティング部分を含む、請求項46に記載の方法。
- ターゲッティング部分がsCD4分子を含む、請求項46に記載の方法。
- ターゲッティング部分がモノクローナル抗体を含む、請求項46に記載の方法。
- 少なくとも1種の多価不飽和脂質を含む脂質粒子を含む組成物を、薬物送達が必要な対象に投与することを含む、薬物送達の方法。
- 脂質粒子がリポソームである、請求項50に記載の方法。
- 脂質粒子が多価不飽和PE脂質および多価不飽和PC脂質の中の少なくとも1種を含む、請求項50に記載の方法。
- 脂質粒子が多価不飽和PE脂質および多価不飽和PC脂質を含む、請求項52に記載の方法。
- 脂質粒子が多価不飽和22:6PE脂質を含む、請求項52に記載の方法。
- 脂質粒子が多価不飽和22:6PC脂質を含む、請求項52に記載の方法。
- 脂質粒子が多価不飽和22:6PC脂質および多価不飽和22:6PE脂質を含む、請求項52に記載の方法。
- ウイルスによって引き起こされるか、またはウイルスに関連した疾患または状態を治療するか、または予防するために適用される、請求項52に記載の方法。
- ウイルスがフラビウイルス科に属する、請求項57に記載の方法。
- 疾患または状態がC型肝炎感染である、請求項57に記載の方法。
- 前記投与がHCV RNA複製を低減させる、請求項59に記載の方法。
- ウイルスがER−出芽ウイルスである、請求項57に記載の方法。
- ウイルスが糖蛋白質含有ウイルスである、請求項57に記載の方法。
- 組成物が脂質粒子に被包された少なくとも1種の活性薬をさらに含む、請求項50に記載の方法。
- 少なくとも1種の活性薬がイミノ糖を含む、請求項63に記載の方法。
- 少なくとも1種の活性薬がアルファ−グルコシダーゼ阻害剤を含む、請求項63に記載の方法。
- 少なくとも1種の活性薬がイオンチャンネル阻害剤を含む、請求項63に記載の方法。
- 少なくとも1種の活性薬がN−置換デオキシノジリマイシンを含む、請求項63に記載の方法。
- 少なくとも1種の活性薬がN−ブチルデオキシノジリマイシンを含む、請求項63に記載の方法。
- 少なくとも1種の活性薬が少なくとも1種の抗−肝炎薬である、請求項63に記載の方法。
- 組成物が抗ウイルス蛋白質をさらに含む、請求項63に記載の方法。
- 脂質粒子とコンジュゲートするか、または脂質粒子の脂質単層または二重層の中に挿入されるターゲッティング部分を組成物が含む、請求項70に記載の方法。
- 対象がヒトである、請求項50に記載の方法。
- PS脂質を含む脂質粒子を含む組成物。
- 脂質粒子がリポソームである、請求項73に記載の組成物。
- 脂質粒子がPE、CHEMS、PI、PCまたはSP脂質の中の少なくとも1種をさらに含む、請求項73に記載の組成物。
- 脂質粒子がPE脂質を含み、そしてPE脂質とPS脂質間のモル比が0.5:1から20:1まで変動する、請求項75に記載の組成物。
- 脂質粒子中のPE脂質とPS脂質間のモル比が1:1から10:1まで変動する、請求項76に記載の組成物。
- PE脂質がDOPE脂質およびPEG−PE脂質を含む、請求項75に記載の組成物。
- 脂質粒子がPE、PIおよびPC脂質を含む、請求項75に記載の組成物。
- 脂質粒子中のPS脂質のモル濃度が少なくとも10%である、請求項73に記載の組成物。
- 脂質粒子中のPSのモル濃度が少なくとも20%である、請求項80に記載の組成物。
- 脂質粒子がPI脂質をさらに含み、そして脂質粒子中のPS脂質とPI脂質の合わせたモル濃度が少なくとも10%である、請求項73に記載の組成物。
- 脂質粒子中のPS脂質とPI脂質の合わせたモル濃度が少なくとも20%である、請求項82に記載の組成物。
- 少なくとも1種の多価不飽和脂質を含む脂質粒子を含む組成物。
- 脂質粒子がリポソームである、請求項84に記載の組成物。
- 脂質粒子が多価不飽和PE脂質または多価不飽和PC脂質の中の少なくとも1種を含む、請求項84に記載の組成物。
- 脂質粒子が多価不飽和PE脂質および多価不飽和PC脂質を含む、請求項84に記載の組成物。
- 脂質粒子が多価不飽和22:6PE脂質を含む、請求項84に記載の組成物。
- 脂質粒子が多価不飽和22:6PC脂質を含む、請求項84に記載の組成物。
- 脂質粒子が多価不飽和22:6PC脂質および多価不飽和22:6PE脂質を含む、請求項84に記載の組成物。
- 脂質粒子中の多価不飽和脂質のモル濃度が少なくとも20%である、請求項84に記載の組成物。
- 細胞と、a)PI脂質またはPS脂質の中の少なくとも1種、およびb)少なくとも1種のラベルを含む少なくとも1種の標識脂質を含む脂質粒子を接触させることを含む方法。
- 脂質粒子がリポソームである、請求項92に記載の方法。
- 脂質粒子がPEおよびCHEMS脂質の中の少なくとも1種をさらに含む、請求項92に記載の方法。
- 脂質粒子がPE脂質を含み、そしてPE脂質とPS脂質間のモル比が0.5:1から20:1まで変動する、請求項94に記載の方法。
- 脂質粒子中のPE脂質とPS脂質間のモル比が1:1から10:1まで変動する、請求項95に記載の方法。
- PE脂質がDOPE脂質およびPEG−PE脂質を含む、請求項94に記載の方法。
- 脂質粒子がPS、PE、PIおよびPC脂質を含む、請求項92に記載の組成物。
- ウイルスがER−出芽ウイルスである、請求項92に記載の方法。
- ウイルスがHCVウイルスまたはHBVウイルスである、請求項99に記載の方法。
- 少なくとも1種の標識脂質がフルオロフォア−脂質コンジュゲートを含む、請求項92に記載の方法。
- 少なくとも1種の標識脂質がビオチン−脂質コンジュゲートを含む、請求項92に記載の方法。
- 前記の接触が細胞のER膜をラベルで標識することに帰着する、請求項92に記載の方法。
- 細胞がER出芽ウイルスに感染した細胞であり、前記の接触が細胞から出芽するウイルス粒子のラベルによる標識に帰着する、請求項92に記載の方法。
- 標識ウイルス粒子を精製することをさらに含む、請求項104に記載の方法。
- 標識したウイルス粒子を画像処理することをさらに含む、請求項104に記載の方法。
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