DE3519095A1

DE3519095A1 - Verwendung von gm(pfeil abwaerts)1(pfeil abwaerts) oder eines davon abgeleiteten inneren esters zur therapie von gehirnschlaegen

Info

Publication number: DE3519095A1
Application number: DE19853519095
Authority: DE
Inventors: Francesco Della Valle; Silvana Padua/Padova Lorenzi; Aurelio Rom/Roma Romeo
Original assignee: Fidia SpA
Current assignee: Fidia SpA
Priority date: 1985-02-18
Filing date: 1985-05-28
Publication date: 1986-08-21
Also published as: EP0195169A2; GR851238B; IT1182209B; AU4274785A; IT8547698A0; ZA853834B; IT8547698A1; BE902752A; EP0195169A3; AU584090B2; JPS61189223A; US4940694A; LU85973A1

Description

Ganglioside sind komplexe Glykolipidmoleküle. Sie sind natürliche Bestandteile von Zellmembranen und bestehen aus einem Kohlenhydratrest, an den ein Ceramid- und ein Sialinsäurerest gebunden ist. Der Kohlenhydratrest enthält mindestens einen Galactose- oder Glucoserest und mindestens einen N-Acetylglucosamin- oder N-Acetylgalactosaminrest. Damit entspricht die Struktur eines Gangliosids der folgenden allgemeinen Formel;

- 1 Mol Ceramid

1 Mol einer Sialin- S " ^m*^ndestens ^X ^Mo1 Galactose oder _säure <^ Glucose

- mindestens 1 Mol N-Acetylglucosamin oder N-Acetylgalactosamin

in der alle Reste über eine glykosidische Bindung mineinander verbunden sind.

Es wurden bereits zahlreiche Ganglioside identifiziert, und es wurde gefunden, daß sie besonders häufig im Nervengewebe und insbesondere im Gehirngewebe vorkommen. Verschiedene Untersuchungen haben gezeigt, daß die interessantesten in Gangliosiden vorkommenden Sialinsäuren die

N-Acetylneuraminsäure (NANA) und, jedoch in einem geringeren Maße, die N-Glycolylneuraminsäure sind. Es wurde gefunden, daß von den zahlreichen bislang identifizierten Gangliosiden die folgenden Ganglioside in beträchtlichen Mengen in aus Rindergehirngewebe extrahierten Gangliosid-Gemischen vorkommen (die Ganglioside sind mit ihren international gebräuchlichen Abkürzungen bezeichnet):

G_Dlb (16%)

GaK l-£-»3 )GalNAC( 1-^—>4 )Gal (1-ß-» 4)Glc(

(D

NANA

NANA G_Tlb (19%)

GaI (l-&—>3)GaINAC(1-ß—^4)Gal (1—ß-^4)Glc( l-ß-»l )Ceramid

NANA NANA

NANA

(21%)

(40%)

5 1 9η9

ΝΑΝΑ

GaI(I-²-* 3) GaINAC(I :d

ΝΑΝΑ

4) GaI (Ι-²—»4) GIc (Ι-⁵—>1) Ceramid

ΝΑΝΑ

Dabei' bedeutet GIc Glucose, GalNAC N-Acetylgalactosarain, Gal Galactose und NANA N-Acetylneuraminsäure. Die Prozentangaben in Klammern geben die Menge jedes Gangliosids an, die im aus dem Rindergehirngewebe extrahierten Gangliosid-Gemisch vorgefunden wurde.

Ganglioside kommen hauptsächlich in den Membranen von Nervenzellen vor. Deshalb wurde vermutet, daß sie eine Rolle bei der Übertragung von Informationen über diese Membranen spielen (Fishmann P.H., Brady R.O. (1976), Science, 194, 906-915): Auch bei der Zell-Zell-Erlcennung und bei Wechselwirkungsphänomenen zwischen Zellen während der Differenzierung, bei der Reifung und beim synaptischen Kontakt während der neuronalen Reizleitung spielen die Ganglioside möglicherweise eine Rolle. Insbesondere ein Gangliosid, nämlich GM₁ (Monsialogangliosid), wurde mit neuralen. Differenzierungsprozessen im Cerebellum der Maus (Willinger M., Schachner M. (I980), Dev. Biol., 7²I-, 101-107) und mit der Neurit-Induktion in kortikalen Neuronen der Katze (Purpura D.P., Baker H.J. (1977), Brain Res., 143, 13-26) in Ver-

bindung gesetzt.

Auf eine bestimmte Funktion des Gangliosids GM₁ bei der Unterstützung der Ausbildung synaptischer Kontakte wurde durch Experimente geschlossen, bei denen gefunden wurde, daß eine GM,-Anreicherung die Ausbildung neuromuskulärer Verbindungen in Nerven-Muskel-Zellen-Mischkulturen erleichtert (Obata K. und Handa S. (1979)· Eine andere pharmakologische Wirkung bei der Anwendung exogener Ganglioside (eines Rinder-Gehirn-Extrakts) wurde von Gorio et al. gefunden (Gorio A., Carmignoto G., Pacci L., Finesso M. (1980), Brain Res., I97, 256-241). Gorio et al. konnten eine stimulierende Wirkung auf die Reinnervation feststellen. Diese beruht auf einem gesteigerten Nervenwachstum/ durch das sich eine frühe funktioneile Erholung peripherer Nerven nach traumatischen Zerstörungen ergibt. Es wurde gefunden, daß diese pharmakologische Wirkung auch im zentralen Nervensystem (ZNS) auftritt. Es wurde auch ein schnelleres Wiederauftreten der cholinergen Enzyraaktivität im Hippocampus der Ratte nach ausgedehnten durch Elektrokoagulationen hervorgerufenen Septumverletzungen festgestellt, wenn die Tiere intramuskulär mit exogenen Gangliosiden behandelt wurden (Woicik M., Ulas J., Oderfeld-Nowak B. (I982), Neuroscience, 7 (2), 495-499).Dabei wurde angenommen, daß diese beschleunigte Erholung cholinerger biochemischer Parameter im Hippocampus auf die Reinnervation des Hippocampus infolge erhöhten Nervenwachstums und auf die Wiederausbildung neuer cholinerger Nervenendigungen aus dem unbeschädigten Teil des Septums heraus zurückzuführen ist.

Das Nervenwachstumsphanomen ist eine physiologische Reaktion intakter Neuronen, die ihre normalen synaptischen Kontakte verloren haben. Das Wachstum infolge dieses Kontaktverlusts ist anscheinend ein Reparaturmechanismus, durch den eine funktioneile Wiederherstellung nach einer Beschädigung der Nervenverschaltungen erzielt wird. Es gibt be-

— ΟΙ trächtliche Hinweise für das Auftreten und die funktioneile Bedeutung solcher Reparaturmechanismen (Bjorklund A., Stenevi U. (1979), Physiological Reviews, 59 (1), 62-100, und Cottman C.W., Nieto-Sampedro M., Harris E. (I98I), Physiological Reviewes, 61 (3), 684-784). Mit schreitendem Verständnis dieser Mechanismen wurde die Hypothese der "ZNS-Neuroplastizität" aufgestellt. Diese steht dem lange aufrecht erhaltenen Dogma gegenüber, t demzufolge das ZNS von Erwachsenen nach einer Verletzung keine Reparaturmechanismen in Gang zu setzen vermag.

Das Monosialogangliosid GM₁ ist ein experimenteller Wirkstoff, der im Hinblick auf die durch experimentelle Modelle bestätigte Hypothese entwickelt wurde, nach der die exogene Anwendung dieses Gangliosids die Neuroplastizität des ZNS vorteilhaft beeinflußt, die Regenerierung im ZNS unterstützt und damit die funktionelle Erholung nach Gehirn- und RückenmarksVerletzungen beschleunigt.

Um die Auswirkungen einer exogenen GM₁-Anwendung bei traumatischen Zerstörungen . des ZNS zu bestimmen, wurde bei Ratten eine einseitige Halbdurchtrennung (Hemisektionj des ZNS durchgeführt·. Die Erholung dopaminerger Parameter der Substantia

25 nigra nach einseitiger Halbdurchtrennung konnte

durch eine Behandlung mit GM₁unterstützt werden (Toffano et al. (1983a), Brain Res., 26l, 165-166, Savoini et al. (I982)).' Ein Vergleich der zeitlichen Veränderungen der Tyrosinhydroxylase (TH)-Aktivität im verletzten Striatum von mit j50 mg/kg GM₁ intraperitoneal behandelter Tiere mit der zeitlichen Veränderung bei Ratten, die mit physiologischer Kochsalzlösung behandelt wurden, zeigt einen signifikanten Einfluß der GM₁-Behandlung auf die Wiederherstellung der TH-Aktivität. Bei mit GM₁ be-

³⁵ handelten Ratten wurde ein signifikanter Anstieg der

V von τη am Tag 14 gefunden, , der bis zum Ende des Bemax

-7-

1 obachtungszeitraums, also 76 Tage, anhielt- Die Wirkung von GM₁ war Dosis-abhängig. Ein signifikanter Anstieg der TH-abhängigen Immunfluoreszenz und des Hotnovanillinsäure (HVA)-Gehalts wurde auf der Seite" der Verletzung im Striatum von Ratten gemessen, die mit GM₁ behandelt wurden. In der mit GM₁ behandelten Gruppe war die Empfindlichkeit gegenüber Apomorphin (Drehverhalten) im Vergleich zur mit physiologischer Kochsalzlösung behandelten Gruppe signifikant verringert. Der Anstieg der TH-Aktivität, des HVA-Gehalts, der TH-verwandten Immunfluoreszenz, die im Striatum ipsilateral zur Verletzung gefunden wurde_; und die verringerte Empfindlichkeit verletzter Ratten gegenüber Apomorphin nach der GM₁-Behandlung passen mit der Schlußfolgerung zusammen, daß die funktioneile dopaminerge Reinnervation des Striatums durch eine GM₁-Behandlung nach einer Halbdurchtrennung erleichtert wird. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, daß die GM₁-Behandlung in einem Versuchsmodell für traumatische ZNS-Schädigungen eine Verbesserung biochemischer, morphologischer und funktioneller Marker dopaminerger Bahnen der Substantia nigra darstellt. Diese Wirkungen treten nur

auf der verletzten Seite auf und zwar während 14 Tagen nach der Halbdurchtrennung . Auf der unverletzten Gehirnseite des operierten Tieres wurden keine Veränderungen gefunden.
25

Weiteren Daten aus diesem Modell zufolge verhindert eine GM₁-Behandlung teilweise den Anstieg der TH-Aktivität, die durch die Halbdurchtrennung in der Substantia nigra ipslateral zur Verletzung verursacht wird. Gleichzeitig wurde ein signifikanter Anstieg der TH-Immunreaktivität sowohl im Striatum als auch in der Substantia nigra gefunden. Insbesondere unterstützte die ständige Behandlung mit GM₁ die TH-positiven Nervenendigungen im Striatum, verhinderte das Verschwinden TH-positiver Zellkörper in der Substantia nigra und induzierte das Auftreten längerer TH-positiver Neuriten gegenüber der Kontrollbehand-

*# WW *ϊ * · * W * * " W W 1

-δ-lung mit physiologischer Kochsalzlösung. Auch diese Daten sprechen für die angenommene Wirkung des Gangliosids GM₁ in diesem Modell, nämlich dafür, daß GM₁ die dopaminerge Reinnervation des Striatums erleichtert und funktionsfähige dopaminerge Zellkörper in der Substantia nigra schützt. Damit unterstützt diese pharmakologisehe Wirkung von GM₁ die erholungsfähige Neuroplastizität.

Die vorliegende Erfindung wurde durch Rezeptordichte-Analysen weitergeführt. Dabei wurden die Wirkungen einer ständigen GfL-Behandlung {10 mg/kg/ während 56 Tagen einmal täglich intraperitoneal) auf die degenerativen und regenerativen Merkmale von Dopamin (DA)-Neuronen der Substantia nigra von Ratten nach einer Halbdurchtrennung gemessen (L.F. Agnati et al. (1984), Acta Physiol. Scand. suppl. 532, 37-42). DA-Zellkörper der Substantia nigra und ihre Dendriten sowie die DA-Nervenendigungen des Striatums wurden immunozytochemisch mit der Tyrosinhydroxylase nachgewiesen. Bei jedem Tier wurde eine morphometrische Analyse der DA-Zellkörper, -Dendriten und -Nervenendigungen durchgeführt. Zusätzlich wurde der relative Gehalt an Tyroxinhydroxylase durch Messung der optischen Dichte bestimmt. Die Verteilung der DA-Rezeptoren im Striatum wurde durch quantitative Rezeptor-Autoradiographie gemessen. Dabei wurden als radioaktive Liganden der DA-Rezeptor-Antagonist ^H-Spiperon und der DA-Rezeptor-Agonist ^H-N-Propylnorapomorphin

verwendet. Die ständige GM₁-Behandlung bewirkte den Erhalt der Anzahl von DA-Zellkörpern in der Substantia nigra auf der verletzten Seite und steigerte

darüberhinaus die Dendritenlänge der DA-Nervenzellen im retikulären Bereich dieser Seite. Außerdem wurde bei

dieser Behandlung die Dichte von DA-Nervenendigungen im Striatum auf der verletzten Seite beibehalten und wahrscheinlich auch die Anzahl von Nervenzellen des Striatums, auf die die DA-Nervenfasern zulaufen. Ferner wurde der durch die Verletzung induzierten DA-Rezeptor-Überempfind-

* hf- Φ * * a. * * * »ft f * 4

Mt·* e » «

-9-

lichkeit durch die ständige Behandlung mit GM₁ entgegengewirkt. Daher wurde die Hypothese aufgestellt, daß durch eine Gangliosid-Behandlung verletzte DA-Nervenzellen nicht degenerieren, sondern ihre Dendriten verlängern und dadurch die Versorgung von DA-Zellkörpern mit unversehrten DA-Axonen verbessern . Diese verbesserten dendrodentritischen Wechselwirkungen können unverletzte DA-Zellen dazu befähigen, die Dichte ihrer Nervenendigungs-Netzwerke im Striatum durch kollaterales Wachstum zu erhöhen.

Biochemische Hinweise auf eine pharmakologische Wirksamkeit von exogenem GM₁ wurden auch in einem anderen Modell für traumatische ZNS-Schädigung erhalten. Es wurden die Wirkungen einer intramuskulären Behandlung mit dem Gangliosid GM₁ auf die Erholung der cholinergen Innervation des Hippocampus nach einer durch Elektroköagulation hervorgerufenen Verletzung im Septum von Ratten beschrieben, wobei die enzymatischen Aktivitäten im Zusammenhang _mit dem ACh-Stoffwechsel bestimmt wurden (Oderfeld-Nowak et al. (I982), Report for WHO Study Group on Neuroplasticity and Repair in CNS. Genf (CH), 28. Juni bis 2. Juli). In diesem Modell wurden auch Wirkungen auf den Stoffwechsel des endogenen GM₁ untersucht. Die ständige Anwendung von GM₁ erleichterte deutlich die Wiederherstellung der Enzymaktivitäten, die auf die cholinerge Innervation hinweisen. Verletzungen im Septum verursachten einen Abfall der GM₁-Spiegel im Hippocampus unbehan-

delter Tiere.
30

Es wurden spezifische biochemische Befunde über die pharmakologische Wirkung von GM₁ auf das ZNS erhalten. Dabei wurde die in vivo Modulation von Serotonin-Rezeptoren im dorsalen Bereich der Gehirnrinde von Ratten durch subchronische Behandlung mit GM₁ mit ^H-Spiperon gezeigt, das an Membranpräparationen behandelter Ratten gebunden wurde

j (Agnati et al. (1983b), Acta Physiol. Scand. , 117, 311-363) (10 mg/kg, während 3 Tagen täglich intraperitoneal). H-Spiperon-markierte Serotonin-Rezeptoren im dorsalen Bereich der Gehirnrinde wurden durch

GfL -Behandlung moduliert. H-Spiperon-markierte DA-Rezeptoren im Striatum wurden nicht moduliert.

Ebenso wurde die Degenerations-verhindernde und/xier das Wiederwachstum-stimulierende Aktivität in noradrenergen und serotonergen Neuronen gezeigt, die durch selektiv wirkende Neurotoxine in der neonatalen Phase der Gehirnentwicklung geschädigt wurden. Die neurotoxische Behandlung verursachte eine deutliche und andauernde Degeneration der distalen noradrenergen und serotonergen Nervenendigungsvorsprünge im Gehirn in Verbindung mit einer andauernden chemischen Sympathektomie. Bei Behandlung mit GM, (;5Oing/kg subcutan, 4 Tage lang nach der neurotoxischen Behandlung der Neugeborenen) zeigten die behandelten Tiere nach einem Monat deutliche Verbesserungen in den serotonergen Markern der Gehirnrinde gegenüber Kontrolluntersuchungen. Zusätzlich wurden leichte, der chemisch induzierten Sympathektom^. : entgegensteuernde Wirkungen festgestellt.

Zusammenhänge mit dem Verhalten, bei der Erholung von Ratten nach einer beidseitigen Schädigung des Nucleus caudatus

wurden ebenfalls beschrieben. Die ersten Ergebnisse bei dieser Untersuchung weisen darauf hin, daß eine intraperitoneale Behandlung mit GM, · (30 mg/kg, 14 Tage lang_r täglich) deutlich das Lernen einer Erkennungsaufgabe nach d_er chirurgischen Zerstörung des Nucleus caudatus verbesserte.

In all diesen Versuchen wurde jedoch die Wirkung von ₁ bei ständiger oder annähernd ständiger Behandlung erhalten.
35

Diese Daten geben keinen Hinweis auf eine rasche Wirkung von

. Sie legen eine solche Wirkung auch nicht nahe.

Überraschenderweise wurde jedoch nunmehr bei der üntersuchung von GM.. in einem experimentellen Modell eines Gehirnschlags eine sofort einsetzende Wirkung gefunden.

Diese klinisch sehr wichtigen Befunde werden im folgenden beschrieben.
10

Der Wirkstoff im erfindungsgemäßen Arzneimittel ist das Natriumsalz des Gangliosids GM,, das eines der Hauptganglioside des Nervengewebes von Säugern ist, sowie der von diesem abgeleitete innere Ester. Der Ausdruck "Ganglio-

¹⁵ sid" ist die Trivialbezeichnung für

Sialinsäure-enthaltende Glykosphingolipide. Diese komplexen Glykolipide sind sauer, wasserlöslich und nicht dialysierbar. Das Gangliosidmoiekül ist amphipathisch, besteht aus einem lipophilen Rest, der Sphingosin und Fettsäuren enthält, insbesondere Stearinsäure, sowie aus einem hydrophilen Oligosaccharid-Rest. Das Gangliosid GM₁ ist ein Monosialogangliosid (die Mitglieder der Gangliosidfamilie unterscheiden sich durch unterschiedliche Anzahl und Lage der Sialinsäurereste im MoIekül). Das Monosialogangliosid GM₁ kann als Hauptverbindung der Reihe der Ganglioside betrachtet werden, denn die Umsetzung komplexerer Ganglioside im Rahmen des Stoffwechsels führt jedenfalls zum Gangliosid GM₁. Svennerholra (Svennerholm L. (I963), J. Neurochem., I9, 613-623) hat ein Zuordnungssystem und eine Nomenklatur vorgeschlagen, die mittlerweile allgemein gebräuchlich ist. Andere Benennungen sind:

- Monosialotetrahexosylgangliosid, Natriumsalz

- II -alpha-N-Acetylneuraminosyl-gangliotetraglycosyl ceramid, Natriumsalz (IUPAC-IUB Benennung)

- ll^-alpha-NeuAc-GgOse^Cer, Natriumsalz (IUPAXI-UB Abkürzung)

COPY

- Registriernummer im Chemical Abstract: RN (57758-47-7).

Die Bezeichnung GM, stimmt mit dem Svennerholm-System überein.
5

Komplexere Abkürzungen wurden im IUPAC-IUB Lipid-Dokument (1977) vorgeschlagen.

Extraktions- und Reinigungsverfahren

Das Monosialogangliosid ist eine biologische Substanz, die aus Rindergehirn erhältlich ist und die folgende Strukturformel hat:

■■Timm

Il3-alpha-NeuAc-GgOse4Cer

25

Das Natriumsalz des Monosialogetrahexosylgangliosids GM₁ kann als hochreines Produkt gemäß dem von Tettamanti et al. (Biochimica et Biophysica Acta (1975)* 296, Ι6θ-170) beschriebenen Verfahren isoliert werden oder von Pidia S.p.A., Abano Terme, Italien, erhalten werden. Wenn man von gefrorenen Rindergehirnen ausgehend ein mehrstufiges Reinigungsverfahren durchführt, das im wesentlichen eine Lösungsmittelextraktion, eine flüssig/flüssig Trennung, eine Phospholipidentfernung durch Methanolyse und eine Molekularfiltration umfaßt, erhält man ein hochreines Gangliosidgemisch, das als Wirkstoff in In-

^ektionspräparaten verwendet werden kann und im Vergleich zu einem Standard bekannter Struktur und Reinheit das Gangliosid GM₁ in einer Konzentration zwischen etwa 18 und 24 % enthält. Diese Verbindung wird aus dem Gemisch durch ein zweistufiges Hochdruckflüssigkeitschromatographieverfahren abgetrennt. Die Endausbeute beträgt annähernd 75 % der Theorie. Die erhaltene Substanz wird zum Natriumsalz umgesetzt, dialysiert und ausgefällt. Der Niederschlag wird in Wasser wieder aufgelöst, sterilfiltriert und lyophilisiert. Die Reinheit der erhaltenen Verbindung beträgt gemäß photodensitometrischer Messung im Vergleich 2u einem Standard mit bekannter Struktur und Reinheit mehr als 98 % des Trockengewichts.

Die nach dieser Reinigung erhaltene Verbindung hat die folgenden chemischen Eigenschaften:

Molekulargewicht

1*574 (berechnet unter der Voraussetzung, daß 1 Mol NANA,

20 1 Mol Glucose, 2 Mol Galactose, 1 Mol Galactosamin,

Sphingosin 18 : 1, Stearinsäure und Natriumsalz vorliegen).
Aussehen
Geruchlos, hygroskopisch, weißes, cremiges Pulver.

25 Löslichkeit

Löslich in Wasser, Methanol-Wasser und Methanol-Chloroform. Im Prinzip unlöslich in Methanol, Aceton, Chloroform, Diäthyläther und Hexan.
Schmelzpunkt

30 207 bis 250⁰C.
Beschreibung

- Identität Positiv in drei Tests (Strukturanalyse durch Gaschromatographie der einzelnen Komponenten, IR-Spektrum, TLC in zwei verschiedene nen Lösungsmitteln, Identität von Natrium)

τ·, pn (t tjäwitiUtsi- -, „ . ^ ^ Volumenprozent) ''^ ^a ^'^J

-* " ** "' " *" 351909b

- Verlust beim Trocknen weniger als 0,3 %

- Verunreinigungen (TLC) weniger als 2 %

- Lösungsmittelreste weniger als 0,2 %

- Sulfatasche 4,0 bis 5 %,

Beispiel pharmazeutischer Zubereitungen Erfindungsgemäß wird das Gangliosid GM₁, vorzugsweise ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon, insbesondere das Natriumsalz, als Arzneimittel im Gemisch mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Exzipientien, Trägern oder Verdünnungsmitteln zubereitet. Das Gangliosid GM₁ kann als Wirkstoff in pharmazeutischen Zubereitungen Menschen oder Tieren intramuskulär, subcutan oder intradermal sowie durch intravenöse Injektion oder Infusion verabreicht werden. Die Zubereitungen können Lösungen der Verbindung oder ein lyophilisiertes Pulver der Verbindung zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Trägern oder Verdünnungsmitteln darstellen und in gepuffertem Medium enthalten sein, das einen geeigneten pH-Wert hat und gegenüber physiologischen Flüssigkeiten isotonisch ist. Die anzuwendende Dosierung hängt von der gewünschten Wirkung und von der gewünschten Anwendungsart ab.

Die Beispiele beschreiben die Erfindung.

Beispiel 1 Eine Ampulle enthält folgende Substanzen:

- Natriumsalz des Monosialotetrahexosylgangliosids GM₁

- dibasisches Natriumphosphat .

- monobasisches Natriumphosphat

- Natriumchlorid

- Wasser zur Injektion, q.s. ad 35

	0	20	mg
12H₂O	16	6	mg
. 2H₂O	2	,5	mg
	,0	mg
	,0	ml

	4o,o	mg
12H₂O	β,ο	mg
. 2H₂O	0,5	mg
	i6,o	mg
	2,0	ml

Beispiel 2

Eine Ampulle enthält folgende Substanzen:

- Natriumsalz des Monosialotetrahexosylgangliosids GM₁

c J-

- dibasisches Natriumphosphat .

- monobasisches Natriumphosphat

- Natriumchlorid

- Wasser zur Injektion, q.s. ad

Beispiel 3

Eine Ampulle enthält folgende Substanzen:

- Natriumsalz des Monosialotetrahexosylgangliosids GM₁ 100,0 mg

- dibasisches Natriumphosphat . 12H₂O 15*0 mg

- monobasisches Natriumphosphat . 2H₂O 1,25 mg

- Natriumchlorid 40,0 mg

- Wasser zur Injektion, q.s. ad 5,0 ml

Erfindungsgemäß wird ebenso berücksichtigt, daß der von

GM₁ abgeleitete innere Ester bei der Behandlung von Gehirnschlag auch die Durchblutung eines ischämischen Gehirns erhöht, ohne dabei den arteriellen Blutdruck zu verändern. Die abgeleiteten inneren Ester sind beispielsweise im US-P-¹I- 476 119 und in der EP~- 0 072 722 ^veröffentlicht am 23. Februar 1983^ beschrieben.

Die inneren Ester von G-angliosiden werden durch eine Reaktion zwischen der Carboxylgruppe des Sialinsäurerests mit der Hydroxylgruppe eines der Kohlenhydratreste oder eines

weiteren angrenzenden Sialinsäurerests innerhalb desselben Gangliosidmoleküls gebildet. Die Bildung der inneren Esterbindung in Verbindung mit der normalen glykosidischen Bindung zwischen der Sialinsäure und dem Kohlenhydratrest ■ erzeugt einen Lactonring, der meist ein Fünf- oder Sechs-

ring ist und für die Struktur der von Gangliosiden abgeleiteten inneren Ester charakteristisch ist. Verschiedene

innere Ester können Je nachdem, welche Bindung im einzelnen entsteht, gebildet werden. Jedoch werden die inneren Esterderivate im allgemeinen von einem Kohlenhydratrest, mindestens einem Ceramid- und mindestens einem S±alinsäurerest gebildet, in dem eine oder mehrere der Sialinsäuren eine Esterbindung mit einem Kohlenhydratrest und/ oder eine oder mehrere der Sialinsäuren eine Esterbindung mit einer angrenzenden Sialinsäure aufweist. Die bevorzugten Derivate sind solche, die vollständig lactonisiert sind, d.h. in denen jede Sialinsäure eine Esterbindung mit der Carboxylgruppe eines Kohlenhydratrests oder mit der Hydroxygruppe einer angrenzenden Sialinsäure aufweist.

Gemäß der vorliegenden Erfindung ist es von besonderem !5 Interesse, daß die inneren Esterderivate des Gangliosids GM₁ gemäß dem beispielsweise im US-P-4 47β ΙΙ9 beschriebenen Verfahren und gemäß der vorstehend genannten EP-O 072,722 hergestellt werden kann.

Beispielsweise kann ein innerer Ester als Derivat von GM₁ nach den folgenden Verfahren hergestellt werden.

Beispiel 4

8 g GM₁ (Natriumsalz) werden in 80 ml destilliertem Was_ser gelöst und durch eine Säule, enthaltend 10 g Dowex 50 w χ 8 (100 bis 200 Mesh (149 Ms 74 um), Trimethylammoniumform) chromatographiert.

Das unter vermindertem Druck getrocknete Produkt wird mit Hilfe eines Beschallungsbades in 200 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran,enthaltend 4 ml Triäthylamin, gelöst.

Diese Lösung wird langsam zu βθθ ml wasserfreiem Tetrahydrofuran, enthaltend 20 mMol 2-Chlor-l-raethyl-pyridiniumsalz (wenn das Anion beispielsweise Jod sein kann, ist dies Toluol-4-sulfonat, Trifluormethansulfonat usw.),

innerhalb von 4 Stunden unter ständigem Rühren und bei einer konstanten Temperatur von 45°C zugefügt.

Die Umsetzung wird 18 Stunden bei 45°C durchgeführt. Der Überschuß der eingesetzten Substanz wird abfiltriert,und das Gemisch wird in einem Stickstoffstrom konzentriert. Der Rückstand wird in 80 ml Chloroform/Methanol 1/1 wieder gelöst und in 400 ml Aceton ausgefällt. Das Produkt wird schließlich unter vermindertem Druck getrocknet. 10

Die Ausbeute beträgt 7,0 g (88,4 % d.Th.).

Dünnschichtchromatographie: Auf Silikagelplatten mit dem Lösungsmittelsystem Chloroform/Methanol/CaClp 0,3 # (55/45/10) ist der-R_f-Wert des Endproduktes mit 0,70 höher als der R_f-Wert von 0,65 der Ausgangsverbindung. Die chromatographischen Ergebnisse zeigen damit, daß keine Ausgangsverbindung mehr enthalten ist. Durch Behandlung mit einer 0.1N Lösung von Na₂CO, 1 Stunde bei 6o°C wird die Esterbindung gespalten und das ursprüngliche Gangliosid erhalten.

Das nt-Spektrum des inneren Esters von GM,, erhalten auf einer KBr-Tablette, zeigt eine typische Ester-Absorption bei 1750 cm"¹.

Beispiel 5

8 g GM₁ (Natriumsalz) werden in 8o ml destilliertem Wasser gelöst und durch eine Säule enthaltenden Dowex 50 w x 8 (100 bis 200 Mesh (149 bis 74 pn), Pyridiniumform) chromatographiert.

Das unter vermindertem Druck getrocknete Produkt wird in 800 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran und 2,1 g (30 mMol) Xthoxyacetylen gelöst.

Das Gemisch wird 3 Stunden rektifiziert. Der Rückflußkühler ist dabei auf -K
ventil ausgestattet.

ler ist dabei auf -1O°C gekühlt und mit einem Trocknungs-

Nach Entfernung de s Lösungsmittels und des Äthoxyacetylen-Überschusses wird der Rückstand in 8o ml Chloroform/lYIethanol 1/1 gelöst und in 400 ml Aceton ausgefällt.

Die Ausbeute beträgt γ,2 g (91 % d.Th.). 10

Dünnschichtchromatographie: Auf Silikagelplatten mit dem Lösungsmittelsystem Chloroform/Methanol/CaClg 0,3 % (55/45/10) ist der R_f-Wert des Endprodukts mit 0,70 höher als der der Ausgangsverbindung (0,56)· Die Ergebnisse der Chromatographie zeigen, daß keine Rückstände der Ausgangsverbindung mehr enthalten sind. Durch Behandlung mit einer 0,1N Lösung von Na₂CO, 1 Stunde bei 6o°C wird die Esterbindung gespalten und das ursprüngliche Gangliosid

erhalten. 20

Das IR-Spektrum des inneren Esters von GM,* erhalten auf einer KBr-Tablette, zeigt die typische Ester-Absorption bei 1750 cm"¹.

²⁵ Beispiel6

8 g GM₁ (Natriumsalz) werden in 80 ml destilliertem Wasser gelöst und durch eine Säule, enthaltend 10 g Dowex 50 w χ 8 (100 bis 200 Mesh (149 bis 74 pm), Pyridinium-

form), chromatographiert. 30

Das unter vermindertem Druck getrocknete Produkt wird in 200 ml wasserfreiem Pyridin gelöst und zu einer Lösung von 1,26 g (5 mMol) des zwitterionischen Woodward Reagens (N-Xthyl-S-phenyl-isoxazolium-^'-sulfonat) in 200 ml wasserfreiem Pyridin zugefügt. Das'Reaktionsgemisch wird 10 Tage bei Raumtemperatur gerührt.

Nach Abfiltrieren der überschüssigen Ausgangsstoffe und vollständiger Entfernung des Lösungsmittels wird der Rückstand in 80 ml Chloroform/Methanol 1/1 gelöst und in 400 ml Aceton ausgefällt.

Die Ausbeute beträgt 6,3 g (79,5 % d.Th.).

DünnBchichtchromatographie: Auf Silikagelplatten wird· mit dem Lösungsmittelsystem Chloroform/iyiethanol-GaClp 0.,3Ji (55Λ5/1Ο) für das Endprodukt ein R_f-Wert von 0,70 ermittelt, der höher ist als der R_f-Wert der Ausgangsverbindung (0,65). Die Ergebnisse der Chromatographie zeigen, daß keine Ausgangsverbindung mehr enthalten ist. Durch Behandlung mit einer 0,1N Lösung von Na₂CO^₅,

1 Stunde lang bei 6o°C, wird die Esterbindung gespalten und das Ursprungsgangliosid erhalten.

Das IR-Spektrum des inneren Esters von GM₁, erhalten auf einer KBr-Tablette, zeigt die typische Ester-Absorption bei I750 cm"¹.

Die folgenden Zubereitungen sind Beispiele pharmazeutischer Zubereitungen, die den vom Gangliosid GM- abgeleiteten inneren Ester enthalten. 25

Zubereitung Nr. 1

Eine lyophilisierte Ampulle enthält:

- innerer Ester von GM₁ 20,0 mg Bine Pufferampulle enthält die folgenden

Verbindungen:

- dibasisches Natriumphosphat .

- monobasisches Natriumphosphat

- Natriumchlorid

- Wasser zur Injektion, q.s. ad

12H₂O	6,0	mg
. 2H₂O	0,5	mg
	16,0	mg
	2,0	ml

100,0	mg	mg
15,0	mg	ml
1,25 mg
4o,o
5,0

¹ Zubereitung Nr. 2

Eine lyophilisierte Ampulle enthält:

- innerer Ester von GM₁

Eine Pufferampulle enthält die folgenden 5 Verbindungen:

- dibasisches Natriumphosphat . 12HpO

- monobasisches Natriumphosphat . 2H₂O

- Natriumchlorid

- Wasser zur Injektion, q.s. ad 10

Biologische Aktivität im Kurzzeittest: Der folgende biologische Test und die aus ihm erhaltenen Daten zeigen die Vorteile der Behandlung von Gehirnschlagpatienten mit GM₁. Als Testmodell wurden männliche Katzen mit induzierter örtlicher cerebraler Ischämie verwendet .

Test der Gehirndurchblutung bei einem experimentellen Gehirnschlag

Die Experimente wurden mit 13 männlichen Katzen (Körpergewicht 2,5 bis 3,5 kg) durchgeführt, die mit 4o mg/kg Natriumpentobarbitol anästhesiert waren. Die örtliche cerebale Ischämie wurde durch Abklemmung des proximalen Teils der linken mittleren Gehirnarterie (MCA) mit einer kleinen Mayfield-Klammer erzielt. Nach 2 Stunden wurde die Klammer entfernt und die Durchblutung der MCA setzte wieder ein. 8 von 13 der auf diese Weise behandelten Tiere wurden mit dem Gangliosid GM₁ (30 mg/kg) und mit dem von GM-, abgeleiteten inneren Ester (5 mg/kg), intravenös behandelt, nachdem die MCA wieder frei durchblutet war.

Um die Veränderungen des cerebrokortikalen Volumen^CW) zu bestimmen, wurde reflektiertes Licht bei einer cerebrokortikalen NADH-Fluoreszenz sowie die Reflection bei 366 nm nach Eke et al. (Am. J. Physiol. (1979), 236, 759-768)

gemessen. Auf diese Weise wurde auch die mittlere Durchflußzeit während der das. Blut durch, den Cortex strömt (t ) und die

Gehirndurchblutung (CBF) ermittelt. j)_{er zu} Anfang der Experimente während 'der Kontrollzeit gemessene Wert wurde als Bezugsgröße verwendet und zu 100 % CW angenommen. Um den Referenzwert von t ■ zubestimmen, wurden 0,1 bis 0,5ml isoosmotische und oxygenierte Dextranlösung in die Zungenarterie injiziert. Die Durchlfußzeit wurde aus Blutverdünnungs-induzierten Reflektionsreaktionen durch die Flächen/Höhenanalyse (Maier und Zierler (1954), J. Appl. Physiol. 6, 731-744) berechnet. Der Referenzwert von t wurde zu 100 % angenommen. Um 0 # CW zu bestimmen, wurde das Blut aus dem Gehirn über die Zungenarterie herausgewaschen. Der Unterschied der kortikalen Reflektion zwisehen Blut-perfundiertem (100 # CW) und Blut-freiem (0 % CW) Gehirn wurde linear geteilt, um die CW-Veränderung zu berechnen. Schließlich wurden CBF-Veränderungen durch Teilung der Prozentwerte von CW durch die Prozentwerte von t berechnet (Maier und Zierler: J.Appl.

physiol. (1954), 6, 731-744, Eke et al., 1979). Gleichzeitig wurde der arterielle Blutdruck an der Femur-Arterie aufgezeichnet. Die Parameter wurden mit einem Achtkanal-Hewlett-Packard Polygraph aufgezeichnet.

²⁵ Ergebnisse

Die -Abklerranung &_er mittleren Gehirnarterie (MCA) führte zu ähnlichen Veränderungen des cerebrokortikalen Yaskulären Volumens und der mittleren Durchflußzeit während der das Blut durch den Cortex strömt, wie bei der kortikalen Durchblutung in Ge-

³⁰ hirnschlaggruppen. Am Ende der Äbklemmung der

mittleren Gehirnarterie betrug der CBF-Wert 16,4 + 4,6$, 23,1 + 6,8 % und 29,8 + 4,2 % des preischämischen Referenzwertes bei unbehandelten _/ mit GM₁ und dem inneren Esterderivat von GM₁ behandelten Gehirnschlaggruppen.

³⁵ 6o Minuten nach der Wiederdurchblutung der mitt-

eri<= ergab siob ein ΊΗ M

-22-

des CBP-Wertes bei mit GM, und dem inneren Esterderivat von GM₁ behandelten Gehirnschlaggruppen. Bei nicht behandelten Gehirnschlaggruppen war der CBF-Wert geringfügig kleiner als derpraeischämisehe Referenzwert. Mit anderen Worten verbesserte also die Behandlung mit GM₁ und dem inneren Ester von GM₁ den CBF-Wert deutlich^ ohne dabei den arteriellen Blutdruck zu verändern (vgl. Tabellen I und II). Während der späteren Phasen der Erholung blieb der CBF-Wert bei Gehirnschlaggruppen, die mit GM₁ und dem inneren Ester von GM. behandelt wurden, annähernd gleich, während sich der Wert bei nicht behandelten Gehirnschlaggruppen langsam wieder auf der Höhe des praeischamischen Referenzwertes einpegelte.

ω cn

ω ο

to σι

bo ο

Tabelle I

Wirkung der Behandlung mit GM, (50 rag/kg, i.v.) und der Behandlung mit dem inneren Ester von GM, (5 g/kg, i.v.) . · auf die Kinetik der Erholung des CBF-Werts _un& _auf ^en arteriellen Blutdrück nach ischämischer Schädigung durch leichte bis schwere Ischämie infolge einer 120-minütigen Abklemmung der mittleren · Gehirnarterie (MCA) .

Gruppen

Kontrolle

CBF%

120 Min.. Abklernmung CBP^

.2 Min. Durch- 6o Min. blutung Dttrchblu-CBP^ tung

120 Min. Durchblu tung

I8o Min. Durchblutung

240 Min. Durchblutung

Unbehandelt

X n.5 + Standard abweichung Behandelt mit	100 0	16,4 4,6	106,1 28,4	77,6 13,1	78,1 7,7	84,3 12	91,6 9,7	I to U) I	# ΐ β ft 9 me » • ♦ » > t • SJ- ♦ ο -» · » « «
GM₁ ¹X n.5 + Standardab weichung Behandelt mit	100 0 dem	23,1 6,8 inneren	■ 171,2 31,4	185,2 31,8	151,0 19,0	190,6 6,9	198,2 12,3	« "Ti«
liisrer von UM₁	100 0	29,8 4,2	170,5 32,6	188,3 36,9	182,5 28,2	178,3 35,5	185,6 31,2	, . rt » *• f ·** ■ SI
X n. 4 ^x Standard- abweicnune

Die Werte sind als Durchschnittswerte + Standardabweichung angegeben; η gibt die durchschnittliche Anzahl von Experimenten an.

Die Verbindungen wurden intravenös bei geöffneter Abklemmung der mittleren Gehirnarterie verabreicht. Der durchschnittliche arterielle Blutdruck war zwischen diesen Gruppen kaum unterschiedlich.

CD CD CO

ω öd to fco ι-· ι-*

cn ο σι ο σι ο οι

Tabelle I - Fortsetzung

Bei der Injektion der Verbindungen betrug der mittlere arterielle Blutdruck in der
unbehandelten Gruppe I50 + 7>3 ™ Hg, bei den .mit GM₁ behandelten Tieren I60 + 3,2 mm Hg
und bei der mit dem inneren Ester von GM₁ behandelten Gruppe von Tieren 148 + 6,2.

GO I";

CD CD CO

^{ω ω} fco to t- _

⁰¹OOiOOi ο' σι ^

Tabelle II

Veränderungen verschiedener physiologischer Parameter nach der Öffnung der Abklemmung
der mittleren Gehirnarterie (MCA) .

mit GM, be- mit dem inneren Ester des

Kontrolle handelte Gruppe Gangliosids GM₁ behandelte

Gruppe

C 0-60 R-60 R-120 R-180 C 0-60 R-60 R-120 R-180 C 0-60 R-60 R-120 R-180

132,0 153 147,5 147,5 147,5 133,0 146 168,0 159,0 166,0 146,2 150 165,7 147,5 162,3

1 \ Hg 4,6 8,3 5,8 5,8 5,8 5,1 9,1 7,4 10,3 6,8 6,2 4,1 5,0 2,5 3,5

5	,0	4,	5	5	,0	5	,5	b	,0
0	,7	0,	8	0	,5	0	,5	0	,SB'·.'
									t fts —ft— · *

:p 4,5 5,0 5,4 5,4 5,2 4,9 5,4 9,5 10,0 11,5
π Hg 0.6 0,5 0,8 0,8 0,7 0,6 0,8 2,2 2,0 2,2

C = Kontrollzeitraumj 0-βθ = βθ minütige Ablemmung

R-60, R-120, R-180 = 60, 120 und I80 Minuten nach Wiederöffnung der Abklemmung.
MABP = Blutdruck der Hauptarteriej
ICP = intrakranialer Druck.

CD CD CO

Die Ergebnisse verdeutlichen durch die Änderungen des CBP-Wertes, daß die 120rainütige Abklemmung der mittleren Gehirnarterie in beiden experimentellen Gehirnschlaggruppen ein ähnliches Ausmaß einer fortgeschrittenen Ischämie verursachte. Nach Wiederöffnung der mittleren Gehirnarterie ergibt sich aus dem CBF-Wert der nichtbehandelten Gehirnschlaggruppe eine kurze und leichte gegenwirkende Hyperämie, in den mit GM₁ oder dem inneren Ester von GM₁ behandelten Gehirnschlaggruppen dagegen ergab sich eine deutliche und anhaltende gegenwirkende Hyperämie.

Schlußfolgerung und therapeutische Anwendung

Bei der Auswertung der gesamten Befunde ist zu beachten, daß diese für GM₁ und seinen inneren Ester gezeigte schnell

einsetzende Wirkung ergänzend zu der Wirkung bei der ständigen Behandlung ist, die in den vorstehend beschriebenen Modellen für die Erholung des ZNS beobachtet wurden. Der Vorteil der Befunde ist, daß mit ihrer Hilfe die Stoffwechselversorgung von Zellen in einem durch Ischämie geschädigten

20 Bereich verbessert wird.

Der Befund, daß das Gangliosid GM₁ und sein innerer Ester den CBF-Wert in einem vorher ischämischen Gehirn ohne Xnderung des arteriellen Blutdrucks erhöhen kann, . ist von beachtlicher klinischer Bedeutung. Während frühere Forschungsarbeiten nur die Wirkungen bei der ständigen Langzeitbehandlung mit diesen Verbindungen zeigten, wurde erfindungsgemäß überraschend gefunden, daß die Verabreichung von GM₁ oder seines inneren Esterderivats an Gehirnschlagpatienten einen schnell wirkenden therapeutischen Effekt durch die Steigerung der Gehirndurchblutung hat. Diese Verwendung von GM₁ und seinem inneren Esterderivat ist deshalb von erheblicher klinischer Bedeutung für-die Erholung und die Kontrolle von Gehirnschädigungen ^bei Gehirnschlagpatienten.

-27-

Wie vorstehend erläutert wurde, bezieht sich die Erfindung auf den Kurzzeiteffekt von GM₁ und seines inneren EstersUQd. aamit auf die Steigerung des CEP-Wertes. Dieser Kurzzeiteffekt tritt besonders bei der Anwendung von GM₁ oder dem abgeleiteten, innerere Ester· innerhalb von 10 Tagen, vorzugsweise innerhalb von 7 Tagen, nach dem Gehirnschlag auf. GM₁ oder sein inneres Esterderivat werden in der bevorzugtesten Ausführungsform innerhalb der ersten 1 oder 2 Tage nach dem Gehirnschlag verabreicht. Auf diese Art und Weise wird die beste Wirkung von GM₁ oder seinem inneren Esterderivat durch Steigerung der Stoffwechselversorgung der Gehirnzellen erzielt und damit der Gehirntod verhindert.

Claims

Case: 259-12IP _{28>
Mai 1985}

PIDIA S.p.A. Abano, Italien 10

" Verwendung von GM₁ oder eines davon abgeleiteten inneren Esters zur Therapie von Gehirnschlägen"

Patentansprüche

' 1. Verwendung des Gangliosids GM₁ oder eines davon abgeleiteten inneren Esters oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes des genannten Gangliosids GM₁ oder eines davon abgeleiteten inneren Esters zur Behandlung

²⁵ von Gehirnschlag.
2. Verwendung des Gangliosids GM₁ oder eines davon abgeleiteten inneren Esters oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes des genannten Gangliosids GM₁ oder eines davon abgeleiteten inneren Esters zur Erhöhung der Gehirndurchblutung und zur Verhinderung des Gehirntods.

J>. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2_f wobei der genann te von GM₁ abgeleitete innere Ester ein vollständig lactonisierter innerer Ester von GM_n ist.