DE3116695C2

DE3116695C2 - Neuer Pflanzenextrakt, Verfahren zu seiner Herstellung und ein ihn enthaltendes Arzneimittel

Info

Publication number: DE3116695C2
Application number: DE3116695A
Authority: DE
Inventors: Susumu Musashino Tokio/Tokyo Mitsuhashi; Muneaki Takase; Ichiro Maebashi Gunma Washizawa; Sosuke Tokio/Tokyo Yasui; Kimitomo Tokio/Tokyo Yoshioka
Original assignee: Zenyaku Kogyo Kk Tokio/tokyo Jp
Current assignee: Zenyaku Kogyo Kk Tokio/tokyo Jp
Priority date: 1980-04-30
Filing date: 1981-04-28
Publication date: 1985-03-07
Also published as: NL8102073A; FR2481704A1; IT8121484A0; US4501736A; FR2481704B1; IT1136593B; DE3116695A1; CA1153696A; CH652028A5; GB2076002B; GB2076002A

Abstract

Die Erfindung schlägt ein Extrakt vor, das aus Teilen von zur Gattung Epimedium sp. gehörenden Pflanzen durch Extraktion mit einem wäßrigen Medium, anschließende Entfettung des wäßrigen Extrakts und Abtrennung einer hochmolekulare Bestandteile enthaltenden Fraktion aus dem entfetteten wäßrigen Extrakt gewonnen werden kann. Das Extrakt ist als Immunostimulanz wirksam und kann somit in der Immunotherapie eingesetzt werden.

Description

(2) Löslichkeit:

(a) In Wasser löslich;

(b) unlöslich in Methanol, Äthanol, Azeton. Älhylazelal, Diälhyläthcr, Hexan und Chloroform;

(3) Farbreaktionen:

positiv auf die

(a) Anthron-Schwefeisäure-Reaktion,

(b) Bial's-Reaktion,

(c) Molisch's-Reaktion, (d) Skatol-Reaktion;

negativ auf die

(a) Ninhydrin-Reaktion,

(b) 2.4-DNP-Reaktion.

(c) Seliwanoffs-Reaktion,

(d) Naphtoresorzin-Reaktion;

Folgerung aus den Farbreaktionen:

Anwesenheit von Pentosen und Hcxosen im Extrakt;

Abwesenheit von Alpha-Aminosäuren, Carbonylgruppcn, Ketosen und Uronsäuren im Extrakt;

(4) Saccharid-Zusammensetzung:
Arabinose und Galactose

(5) Infrarot-Absorption.

»'££ (cm-')3400,1600,1400,1100(Fi g. 1);

(6) U.V.-Absorption:

8.325 (F ig. 2).

2. Verfahren zur Herstellung eines Extrakts nach Anspruch 1. dadurch gekennzeichnet, daß durch Extrak tion von Pflanzenteilen von der Gattung Epimcdiuni sp. mit Wasser oder mit einem (Semisch aus Wasser und einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel und Abtrennung der in den Pflan/cntcilcn enthaltenen Fettstoffe ein wäßriger, entfetteter Extrakt hergestellt und aus diesem durch fraktionierte Ausfällung oder Dialyse eine hochmolekulare Verbindungen enthaltende Fraktion gewonnen und diese ggf. durch Behandlung mit Wasser gereinigt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als mit Wasser vermischbares organisches Lösungsmittel ein niederer Alkohol, ein Keton oder ein Äther verwendet wird.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Lösungsmitte! für die Entfettung des wäI3rigen Extrakts ein niederer aliphatisehcr lister, ein halogcnicrter Kohlenwasserstoff, ein mit Wasser nicht mischbarer Äther oder ein aliphaiischer Kohlenwasserstoff vcrwcn det wird.

5. Arzneimittel gekennzeichnet durch einen Gehalt an einem Extrakt gemäß Anspruch 1 als pharmazeutischem Wirkstoff.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen neuen Pflanzenextrakt, der von l'flanzenteilcn der Gattung Epimedium sp. der Familie der Berberidazeen erhältlich ist, auf ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Extrakts, sowie auf ein ihn enthaltendes Arzneimittel.

Als zu der Gattung Epidcmium sp. gehörend sind folgende Pflanzen bekannt: Epimedium macranlhum, M. et. D.. var. violaceum, Fr.. Epimedium sagittatum, Bak., Epimedium macranthum, M. el. D., Epimedium koreanum, Nak., usw. Es handelt sich dabei um perennierende Krauler von natürlichem Wachstum in |apan. China und Korea, usw. Die Stiele, Blätter und Wurzeln werden in der chinesischen Medizin »liiyokaku« genannt. Aus dem Kraut dieser Pflanzen werden Infusionen hergestellt und als herzwirksame oder Ionisch wirksame Arznei verwendet. Dabei ist die Wirkung von der jeweils verwendeten Spezies im wesentlichen unabhängig. Unier der Bezeichnung »Barrenwort« ist eine Rohdroge auf dem Markt, die eine einzelne Spezies von Kpimcdium sp. oder eine Mischung verschiedener Spezies der Gattung Epimcdium sp. enthält. Die Bestandteile der genannten Rohdroge sind schon sehr früh untersuch! worden. Berichte hierüber wurden /.. B. veröffentlicht von: Akai et al.

[Yakugaku Zasshi. 55.537,705,719.788 und 1139 (1935)]: Tomita el al. [Yakugaku Zasshi, 77,114 und 212 (1957)]; Macda [Tokyo Iji Shinshi. 2795, 2133 (1932)]; Miyake [Okayama Igakukai Zasshi. 49, (10), 2O43 (1937)]; und llirashima et ai. [Clinical Report, 4,139 (1970)} Im einzelnen sind jedoch ihre Eigenschaften in vieler Hinsicht noch unklar.

Der aus Barren-wort früher hergestellte Extrakt wurde nach für die Herstellung von Pflanzenextrakten ^r> üblichen Methoden gewonnen. Dabei wurde die Probe lediglich mit Wasser oder wasserhaltigem Äthanol extrahiert.

Der vorliegenden Erfindung liegen weitere Untersuchungen der Barrcn-wort Droge zugrunde. Dabei wurde gefunden, daß durch Extraktion von Pflanzenteile von der Gattung Epimedium sp. mit Wasser oaer mit einem Gemisch aus Wasser und einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel und Abtrennung der in den Pflanzcrueilen enthaltenen Fettstoffe ein entfeiteter Extraktanteil gewonnen wird, aus dem durch fraktionierte Ausfällung oder Dialyse eine hochmolekulare Verbindungen enthaltende Fraktion gewonnen werden kann, die eine hervorragende imniunostimulierende Aktivität besitzt. Diese Untersuchungen und die hierbei erzielten Ergebnisse sind nachfolgend im einzelnen beschrieben.

Bei der Herstellung des erfindungsgemäßen Extrakts kann so vorgegangen werden, daß eine zur Gattung Epimedium sp. gehörende Pflanze oder Teile hiervon mit einer Lösungsmittelmischung aus Wasser und einem mit Wasser vermischbaren organischen Lösungsmittel oder mit Wasser allein extrahiert und dann der erhaltene Extrakt unter reduziertem Druck konzentriert wird. Als mit Wasser vermischbare organische Lösungsmittel können beispielsweise verwendet werden: niedere Alkohole wie Methanol, Äthanol und Isopropanol, Ketone wie Azeton und mit Wasser mischbare Äther wie Dioxan, sowie Mischungen solcher Lösungsmittel. Weiterhin kommen für diesen Zweck in Betracht: niedere aliphatische Säuren wie Essigsäure mit einer Konzentration von unter 1 N, mit Wasser vermischbare niedere Amine wie Äthanolamin in einer Konzentration von weniger als 1 mol/l und in Wasser leicht lösbare Alkalihydroxide wie Natriumhydroxid mit einer Konzentration von weniger als 1 N.

Was das Mischungsverhältnis von Wasser und dem organischen Lösungsmittel anbetrifft, so beträgt der Volumenanteil des organischen Lösungsmitiels vorzugsweise weniger als 50%. Im Hinblick auf die für die Zubereitung eines pulvcrförmigen (Trocken) Extrakts vorzunehmende Konzentration wird vorzugsweise ein Gemisch aus Wasser mit einem mit Wasser vermischbaren organischen Lösungsmittel verwendet.

Erfindungsgemäß können auf dem Markt erhältliche Kräuter von Barren-wort so wie sie in diesem vorliegen verwendet werden. Vorzugsweise soll jedoch der Extraktion noch eine Zerkleinerung in feine Teilchen vorausgehen.

Nachfolgend wird ein Ausführungsbeispiel der bei dem erfindungsgema'ßen Verfahren zur Anwendung kommenden Extraktionsoperation beschrieben:

Die Barrcn-wort Droge wird in dem vorerwähnten Exiraktions-Lösungsmittel bei Raumtemperatur über eine Zeitdauer von einigen 10 Stunden stehengelassen, wonach durch Abfiltrieren ein Filtrat erhalten wird. Der Rückstand wird in derselben Weise einer Extraktion und Filtration unterworfen, wobei diese Maßnahmen noch einige Male wiederholt werden. Die erhaltenen Filtrate werden miteinander vereinigt und bei reduziertem Druck konzentriert, wobei ein wäßriger Extrakt erhalten wird. Die Extraktion wird im allgemeinen bei Raumtcmperalur durchgeführt.

Zur Abkürzung der Hxtraktions/.eit kann jedoch auch Wärme angewendet werden. Hierbei wird vorzugsweise auf einem Wasserbad mit einer Wasserstemperatur von 35—55°C während 4—6 Stunden unter einem Riickflußkühler gearbeitet. Es kann nach der Perkolations-Melhode vorgegangen werden. Die Menge des cingesei/.tcn lösungsmittel beträgt das 5— 15fachc (V/W) der eingesetzten Pflanzenmenge von Epimedium sp. Der Extraktionsrückstand wird vorzugsweise drei Mal oder noch öfters unter denselben Bedingungen extrahiert, wobei das liisungsmiliel in einer Menge des 0,4—O.bfachen (V/V) von dem zuerst eingesetzten Lösungsmittel verwendet wird. Die Trennung kann durch Papicrfiltralion oder Zentrifugieren oder entsprechende Maßnahmen bewerkstelligt werden. Es werden jedoch bessere Ergebnisse mit einer Saugfiltration erzielt, wobei auf dem Markt befindliche Filterhilfen wie beispielsweise Radiolilc (von Showa Chemical Industry Co., Ltd.. Japan), Gelite (von Wako lunyaku Industry Co., Ltd., Japan) oder Fibra CeI (von Johns Manville Co„ Ltd.. USA), oder dergleichen, eingesetzt werden. Die Druckreduzierung wird unter Einsatz bekannter Techniken, z. B. mit einem Aspirator oder einer Vakuumpumpe oder dergleichen erreicht. Die Innenseite des Extraktionsgefäßes kann mil Glas oder Emaille überzogen sein; das Extraktionsgefäß kann jedoch auch aus nichtrostendem Stahl bestehen.

Der erhaltene wäßrige Extrakt wird hiernach entfettet. Dies erfolgt im allgemeinen durch Zugabe von einem oder mehreren organischen Lösungsmitteln wie: niedere aliphatische Ester wie Äthylazetat, halogenierte Kohlcnwasserstoffc wie Chloroform, mit Wasser nicht mischbare Äther wie Diethylether und aliphatische Kohlenwasserstoffe wie n-Hexan und dergl. Die Mischung wird hinreichend geschüttelt, wonach die wäßrige Schicht für sich gesammelt wird. Diese wird nochmals derselben Behandlung unterworfen, sodann auf einem Wasserbad crwiirnit. um das noch in geringer Menge zurückgebliebene organische Lösungsmittel zu entfernen. Durch Filtricrung wird dann ein entfetteter wäßriger Extrakt erhalten. Vorzugsweise wird das Lösungsmittel in einer bo Menge vom 0,5—1,5fachen (V/V) des wäßrigen Extrakts für jede Operation, die 3 bis 5mal wiederholt wird, eingesetzt. Es kann auch in der umgekehrten Reihenfolge vorgegangen werden, also daß die Entfettung zuerst und dann die Extraktion mit einem Lösungsmittel-Gemisch aus Wasser und einem mit diesem vermischbaren organischen Lösungsmittel durchgeführt wird.

Durch fraklionierie Ausfüllung. Dialyse oder andere in diesem Zusammenhang gleichwertige Arbeitsweisen b5 wird dann aus dem entfetteten wäßrigen Extrakt eine hochmolekulare Bestandteile enthaltende Fraktion gewonnen b/w. gesammelt, üs können auch mehrere der für diesen Zweck geeigneten Methoden miteinander kombiniert werden. Die gewonnene bzw. gesammelte Fraktion wird unter reduziertem Druck mit dem Ziel der

Gewinnung des pulverförmigen (Trocken) Extrakts konzentriert. Gegebenenfalls kann der erhaltene Extrakt durch nochmalige Behandlung durch Wasser gereinigt werden.

Nachfolgend wird zunächst die zur Gewinnung der die hochmolekularen Bestandteile enthaltenden Fraktion anwendbare fraktionierte Ausfällung und anschließend die Dialyse beschrieben.

(1) Ein mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel wird dem entfetteten wäßrigen Extrakt bei Raumtemperatur zugegeben, um die Fällung zu bewirken. Die Menge des verwendeten Lösungsmittels ist nicht kleiner als die des wäßrigen Extrakts (V/V). Das abgeschiedene Präzipitat wird durch !"titration gewonnen und mit einem mit Wasser vermischbaren organischen Lösungsmittel in einer Menge des 5 —20fachcn (V/W) des Präzipitats gewaschen. Das gewaschene Präzipitat wird in Wasser geschüttet in einer Menge des 20— SOfaehen

ίο (V/W) des Präzipitats. Hiernach wird ein mit Wasser vermischbares organisches Lösungsmittel der Lösung zugesetzt in einer Menge des 3fachen oder mehr (V/V) von der Lösung, um die wiederholte Ausfüllung zu erreichen. Das gebildete Präzipitat wird durch Filtration gewonnen und unter reduziertem Druck getrocknet, um das Extrakt zu erhalten. Als mit Wasser vermischbare organische Lösungsmittel können beispielsweise eingesetzt werden: niedere Alkohole wie Methanol und Äthanol, Ketone wie Azeton und dergl. Hs kann eine

!5 Mischung von zwei oder mehreren dieser organischen Lösungsmittel verwendet werden. Das so erhaltene Extrakt kann durch Extraktion mit Wasser gereinigt werden. Im einzelnen wird hierbei so vorgegangen, daß das Extrakt mit Wasser in einer Menge des 20fachcn oder noch mehr (V/W) bei Raumtemperatur vermischt und die Mischung genügend gerührt und dann filtriert wird. Das Filtrat wird unter reduziertem Druck bis zur Trockne konzentriert, wobei das gereinigte Extrakt erhalten wird. Hierbei wird die Abtrennung des Präzipilals von dem Filtrat durch Papierfiltration oder Zentrifugieren bewerkstelligt.

(2) Mit dem entfetteten wäßrigen Extrakt wird cine semipermeable Membran wie /.. U. ein Dialyse-Zclluloscrohr beschickt; die Dialyse wird unter Verwendung von destilliertem Wasser oder Wasserlcitungswasser als äußere Flüssigkeit durchgeführt; die innere Flüssigkeit (in welcher die Fraktion mit den hochmolekularen Bestandteilen enthalten ist) wird gesammelt. Bessere Ergebnisse werden erzielt, wenn die äußere Flüssigkeit mit einem Rührer bewegt oder unter Strömung gehalten wird. Vorzug.sweisc wird die Dialyse während etwa einer Woche durchgeführt, falls die Operation mit einer unter Strömung befindlichen äußeren Flüssigkeit durchgeführt wird. Zusätzlich zu der Dialysen-Methode können angewendet werden: Gelfiltration, Ultrafiltration, Ultrazentrifugierung und Umkehrosmose. Zwei oder mehrere dieser Arbeitsweisen können miteinander kombiniert werden. Vom industriellen Standpunkt aus wird die Dialyse vorzugsweise unter Verwendung einer Dialyse-

jo Einrichtung durchgeführt, die eine hohle Fibcrmcinbran aufweist, z. B.: PVA Hollow Fiber Dialyzcr (von Kuraray Co., Ltd., Japan), SF Filtration System (von Kuraray Co„ Ltd., |apan) oder Nitto Module (von Nitto Denko Co., Ltd., Japan), oder dergleichen.

Die Aussalzungsoperation kann als der Dialyse vorausgehende Behandlung durchgeführt werden. Im einzelnen kann hierbei so vorgegangen werden, daß ein bekanntes wasserlösliches Salz, dem entfetteten wäßrigen

Extrakt bis zur Sättigung zugesetzt und das abgesetzte Präzipital aufgenommen und in Wasser aufgelöst und dann die Dialyseoperation durchgeführt wird. Für die Aussalzungsoperation können beispielsweise folgende Salze verwendet werden: Chloride wie Natriumchlorid, Calciumchlorid und Aluminiumchlorid, Nitrate wie Kaliumnitrat, Calciumnitrat und Aluminiumnitrat, sowie Sulfate wie Aminoniumsulfai und Magnesiumsulfat und dergl.

Die so erhaltene innere Flüssigkeit, welche die Fraktion mit den hochmolekularen Bestandteilen enthält, wird auf etwa i/10 konzentriert. Ein mit Wasser vermischbares organisches Lösungsmittel wird der konzentrierten Flüssigkeit in einer Menge von dem 3fachen oder noch mehr (V/V) von der konzentrierten Flüssigkeit zugegben. Das abgeschiedene Präzipitat wird durch Filtration gewonnen und unter reduziertem Druck getrocknet, um das Extrakt zu erhalten. Wie bei dem Ausführungsbeispiel (1) kann das Extrakt durch Extraktion mit Wasser gereinigt werden.

Der in dieser Weise nach der Erfindung erhaltene Extrakt weist die folgenden Charaktcristika auf:

(1) Eigenschaften:

(a) Braunes Pulver
äo (b) Schwach sauer (pH etwa 6,5 bei Auflösung von 100 mg des Extrakts in 50 ml Wasser)

(2) Löslichkeit:

(a) InWasserlöslich

(b) Unlöslich in Methanol, Äthanol, Azeton, Äthylazetat, Diälhylälher, Hexan und Chloroform

(3) Farbreaktionen:
Positiv bei

(a) Anthron-Schwefelsäure Reaktion (als Nachweis für Saccharide)

(b) Bial's Reaktion (als Nachweis für Pentosen)

W) (c) Molisch's Reaktion (als Nachweis für Saccharide)

(d) Skatol Reaktion (als Nachweis für Hcxosen)
aber negativ bei

(a) Ninhydrin Reaktion (als Nachweis für ^-Aminosäuren)

(b) 2,4-DNP-Reaktion(als Nachweis für Carbonylgruppcn)
b5 (c) Seliwanoffs Reaktion (als Nachweis für Ketosen)

(d) Naphtoresorzin Reaktion (als Nachweis für Uronsäuren)

(4) Saccharid-Zusumnienset/.iing:

Wenn 20 mg des Kxiraktes hydiolisicri werden unter Zugabe von Schwefelsäure (I-N H2SO4, 5 ml) zu der Lösung, um die Normalität der Lösungseinheit herzustellen, während 2 Stunden bei 100⁰C erhitzt, sodann durch Zugabe von Bariumhydroxid zu der Lösung neutralisiert und dann eine papierchromatographische Analyse durchgeführt wird, werden Ambitiöse und Galaktose festgestellt. ^

(3) Infrarot-Absorption:

Das Infrarot-Absorptionsspektrum ist in K i g. 1 gezeigt.
ν ü"; (cm ') 34<X), 1 bOO, 14(K), ! 100

(b) Ultraviolet !-Absorption:

Das Ulliiiviolelt-Absorptionsspcklnim ist in I·' i g. 2 gezeigt.
Λ JJ;? (nm) 280.325

Der nach dem erfiiulungsgemäßcii Verfahren erhältliche Extrakt unterscheidet sich von den bekannten, aus Harren-wort hergestellten Extruktcn durch die Abwesenheit von Fettstoffen und den Gehalt an hochmolekularen Substanzen, insbesondere Polysacchariden.

Dm die pharmakologische Nützlichkeit des erfindungsgemäUen Rxtrakts nachzuweisen, wurden die folgenden Tests durchgeführt:

20 I. Phagoeylischer Funktionstest mit Macrophagen

(1) Phagocylose an Staphylococcus aurcus

Als Versuchstiere wurden 7- bis 10-Wochen-alle weibliche Mäuse des ICR/JCL-Stumms (mit einem Körpergewicht von 27 ± 3 g) eingesetzt. 2 Tage nach der Verabreichung der Probe wurde die iniraperitoneale Injektion :s der Mäuse aus der mit der Probe behandelten Gruppe und der aus der Konirollgruppe stammenden Mäuse [behandelt mit phosphatgcpufferier physiologischer Kochsalzlösung mit einem pH von 7,0 (nachfolgend kurz »PBS« genannt)] mit RPMI-1640 Medium [G. E. Moore, The Journal of the American Medical Association, 199. Seilen 519—524 (1967)] (von Missui Seiyaku Co., Ltd., Japan) gewaschen, um peritoneale ausgewaschene Zellen (nachfolgend kurz »PEC« genannt) zu gewinnen; die gesammelten Zellen wurden entsprechend gepoolt. Die PEC wurden einmal mil RPMI-1640 Medium gewaschen und dann in 10%igem FBS-RPM1-1640 Mediuhi (durch Zugabe von 10% eines fötalen Rinderserums zu RPMI-1640 Medium erhaltenes Kulturmedium) suspendiert. Die Zellsuspension wurde auf 1 χ 10¹· Zellen pro ml durch Verwendung von Türk-Lösung eingestellt. Hiernach wurden 2 ml der so erhaltenen PEC-Suspension in eine TD-15-Flasche gebracht, an der vier Abdeckplatten aus Glas angebracht waren. Die Kultivierung wurde bei 37°C während 60 Minuten in einem 5% CO₂ Inkubator durchgeführt und 0,1 ml einer Suspension von Staphylococcus aureus 209 P mit einer Konzentration von 4 χ 10« Zellen pro ml zugegeben, wonach die Kultivierung während 20 Minuten weitergeführt wurde, um eine Phagocytosc herbeizuführen. Nach der Kultivierung wurde die Kulturflüssigkeit 3mal mit Hanks' Lösung [J. H. Hanks und R. F.. Wallace, Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine, 71. Seite 196 (1949)] (von Nissui Seiyaku Co., Lid, |apan) gewaschen. Die Macrophage-adhäricrenden gläsernen Abdeckplatten wurden mit Methanol fixier! und der Giemsa Fleckenmelhode unterworfen, um Proben für die Bestimmung bzw. Zählung der phagocytisierien Bakterien zu erhallen; 200 Macrophages wurden auf jeder gläsernen Abdeckplatte bestimmt (mikroskopisch mil einem öl-Immersions-Objektiv mil 1000-2000facher Vergrößerung), um das Phugacytose Verhältnis und die Duichschnittiszahl phagocylisierier Bakterien (phagocytisierte Bakterien Nummer I) zu bestimmen. Weiterhin wurde die Zahl der durch 100 phagocytisicrender Macrophages phagocytisierter Bakterien bestimmt, um die durchschnittliche Zahl phagocytisierter Bakterien zu ermitteln (phagocytisierte Bakterien Nummer II).

Phagocytose Verhältnis - Zahl der phagocytisierenden Macrophagen _χ

200 (Macrophagen) ,„

........ .. . Zahl der phagocytisierten Bakterien

rnagocyus.cne „_aKlenen summer,=

Phagocytisierte Bakterien Nummer II = Zahl der phagocytisierten Bakterien

100 (phagocytisierende Macrophagen)

Aktverunasind χ = Jeder gemessene Wert (M) aus der behandelten Gruppe Jeder gemessene Wert (M) aus der nlcht-behandelten Gruppe

Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle I angegeben.

(2) Phagocylose-Test auf Salmonella Enteritis

Der Test wurde in derselben Weise wie unter (1) durchgeführt mit der Maßgabe, daß Salmonella Enterititis 116-45 als Testbakterium benutzt und die Kultivierung während 60 Minuten nach der Zugabe der Bakteriensuspension durchgeführt wurde. Die Bestimmung bzw. Ausrechnung wurde in derselben Weise wie unter (1) angegeben durchgeführt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle I wiedergegeben.

Tabelle I — Ergebnis des phagozytischen Funktionstests mil Macrophagcn

(I) Staphylococcus uurciis (2) Sulmoncllii

Test 1

Kontroll-Mäuse
Phagocytose Verhältnis (%) Phogocytisierte Bakterien Nummer I Phagocytisierte Bakterien Nummer Il

probenbehandelte Mäuse Phagocytose Verhältnis (%) Phagocytisierte Bakterien Nummer I Phagocytisierte Bakterien Nummer Il

Test 2

Kontroll-Mäuse

Phagocytose Verhältnis (%) Phagocytisierte Bakterien Nummer I Phagocytisierte Bakterien Nummer Il

probenbehandelte Mäuse Phogocytose Verhältnis (%) Phagocytisierte Bakterien Nummer I Phagocytisierte Bakterien Nummer Il

Test 3

Kontroll-Mäuse
Phagocytose Verhältnis (%) Phagocytisierte Bakterien Nummer I Phagocytisierte Bakterien Nummer Il

Anmerkungen zu Tabelle I:

37.3 ±2.3 (I) l,29±0,14(1) 3,55 ±0,33 (I)

55,73 ±4.25 (1,49) 2,79 ±0,47 (2.18) 4,99 ±0.57 (1,41)

24.8 ±2,1 (I) 0,59±0,04 (I) 2.39±0,19(l)

33,1 ±8,9 (1,34) 0.91 ±0.36(1.54) 2.59 ±0.39 (1.08)

26,83 ±2,57(1) 0,76 ±0,11(1) 3,O3±O.I4(1)

42,63 ±3.36 (1.59) 1.37 ±0.35 (1,80) 3,09 ±0,51 (1.02)

28,67 ±0.29(1) 0.48 ±0,06 (I) I.78±O,I3(I)

40.5 ±2.6 (1.41) 0.93 ±0,18 (1,94) 2.37 ±0,32 (1,33)

16.0 ±1.5 (1) 0.25 ±0.06 (I) 1.31 ±0.07(1)

18.5 ±1,5 (1,16) 0.36 ±0.02 (1.44) 1.37 ±0,06 (1.05)

28.67 ±0,29 (I) 0.48 ±0.06(1) l.78±0.13(l)

35.50 ±3.10(1.24) 0.68 ±0.06 (1.42)

1. In Tabelle I gibt jeder Wert den Durchschnittswert ± den Wert für die Standardabweichung an.

2. Der Aktivierungsindex ist in Klammern gesetzt.

3. Beim Test 1 wurde der gemäß nachstehendem Beispiel 12 hergestellte Extrakt subkutan in den Rücken einer Maus in einem Verhältnis von 32 μg/0,l ml(PBS)/Maus injiziert; eine Gruppe bestand aus 10 Mäusen.

4. Beim Test 2 wurde das gemäß nachstehendem Beispiel 25 hergestellte Extrakt subkutan auf dem Rücken einer Maus in einem Verhältnis von 48 μg/0.1 ml(PBS)/Maus injiziert; eine Gruppe bestand aus 10 Mäusen.

5. Bei dem Test 3 wurde das gemäß nachstehendem Beispiel 36 hergestellte Extrakt subkutan auf dem Rücken einer Maus in einem Verhältnis von 40,5 μg/0.1 ml (PBS)/Maus injiziert: eine Gruppe bestand aus 10 Mäusen.

(3) Rcliculocndothclial F-'unktions-Tesi

Die Probe wurde mit einer intraperiioneaien injektion einer 7-Wochcn-aitcn männlichen Maus des Stammes ICR/JCL (mit einem Körpergewicht von 30 ± 2 g) täglich während einer Zeitdauer von 5 Tagen verabreicht.

Um die Einflüsse auf die Phagacytosc in dem Rcliculocndolhelial-Syslcm festzustellen, wurde kolloidaler Kohlenstoff (Pelikan acting carbon Ci[/1431 a von Günther Wagner Co, Ltd, Westdeutschland) in die Schwanzvenen der betreffenden Mäuse der behandelten und der Kontroll-Gruppc nach 24 Siunden seil der letzten Behandlung injiziert. Das Abfangen des Kohlenstoffs in dem abgenommenen Blut wurde nach den folgenden Verfahren untersucht. Im einzelnen wurde kolloidaler Kohlenstoff mit einer physiologischen Kochsalzlösung verdünnt, die 3% Gelatine enthielt, so daß die Kohlenstoffkonzentration auf die Hälfte reduziert wurde. Die Verdünnung wurde in die Schwanzvene in einem Verhältnis von 10 ml/kg injiziert. Hiernach wurden 0.010 ml Blut vermittels einer mit Heparin behandelten Mikropipette nach der »eyepit puncturcw-Mcthodc entnommen und unmittelbar zur Verdünnung des Blutes in 2 ml einer 0,l%igcn NajCOj Lösung gegeben. Die Absorption wurde bei 650 nm mit einem »Hitach Double Beam Model 124« (von Hitachi Co, Ltd, Japan) gemessen. Der phagocytische Index wurde bestimmt durch Injektion der kolloidalen Kohlcnstoffvcrdünnung in die Vene. Abnahme von Blut nach 2 Minuten (ti) und 20 Minuten (ti) und durch eine auf den Kohlcnstoffkonzentrationcn (Ci und C2: nach 2 Minuten bzw. 20 Minuten) in den Blutproben basierende Rechnung nach folgender Gleichung:

Phagocytischer Index: Kf =

Halbzeitwert im Blut: Γ1/2 -

Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle Il angegeben.
Tabelle Il — Ergebnisse des Reticuloendothelial Funktions-Tcsis

ίο

ri/2(min)

Tesi I

Konlrollmäuse 0,0137 ±0,0039 23,945± 7,793

probcnbehandclle Miiuse 0,0224 ±0,0096 16,281 ± 7,762

Test 2

Kontrollmäuse 0,0163±0,0081 23.505 + 13,595

probenbehandeltc Mäuse 0,0219±0,0104 15,948± 5,430

Test 3

Kontrollmäuse 0,0063±0,0009 48,550± 6,899

probenbehandeltc Mäuse 0.0115±0,0020 27,120± 5,111

Test 4

Konlrollmäuse 0,0l65±0,0064 21.377 ± 10,619

probenbehandelte Mäuse 0,0223 ± 0,0095 15,834 ± 5,969

Anmerkungen zu Tabelle II:

1. In Tabelle Il gibt jeder Wert den Durchschnittswert ± den Wert für die Standardabweichung an.

2. Beim Test 1 bestand eine Gruppe aus 12 Mäusen; das gemäß nachfolgendem Beispiel 12 erhaltene Extrakt wurde verabreicht in einem Verhältnis von 65 μg/0,l ml (PBS)/Maus/Tag.

3. Beim Test 2 bestand eine Gruppe aus 12 Mäusen; das gemäß nachfolgendem Beispiel 25 erhaltene Extrakt wurde verabreicht in einem Verhältnis von 97 jig/O,l ml (PBS)/Maus/Tag.

4. Beim Test 3 bestand eine Gruppe aus 6 Mäusen; das gemäß nachfolgendem Beispiel 26 erhaltene Extrakt wurde in einem Verhältnis von 132 μg/0,l ml (PBS)/Maus/Tag verabreicht.

5. Beim Test 4 bestand eine Gruppe aus 22 Mäusen; das gemäß nachfolgendem Beispiel 36 erhaltene Extrakt wurde in einem Verhältnis von 82 μg/0.1 ml (PBS)/Maus/Tag verabreicht.

Bei jedem der Tests 1 bis 4 wurde der phagoeylisehe Index durch Behandlung mit dem erfindungsgemäßen Extrakt erhöht und der Halb/.citwcrt im Blut verkürzt. Hieraus ist zu folgern, daß die Aktivität des Abfangens von kolloidalem Kohlenstoff in dem reticulocndothelialen System durch die Behandlung mit dem erfindungsgemäßen Kxtrakt verbessen wird. Die Macrophagen werden in freie und fixierte Typen eingeteilt. Die Zellen von den freien Typen sind im Knochenmark, Blut, der Bauchhöhle und Alveolus anwesend, während die Zellen der fixierten Typen hauptsächlich in der Milz, den Lymphknoten und der Leber vorliegen. Die Tests zur Feststellung der phagocytischen Aktivität auf Staphylococcus aurcus (I) und auf Salmonella (2) wurden mit den Zellen des freien Typs und der Retieuloendolhelial Test (3) auf Zellen des fixierten Typs durchgeführt. Aus den vorerwähnten Testcrgebnissen ist zu folgern, daß die Zahl der Bakterien und Fremdstoffe, die sowohl durch die Macrophagen des freien als auch fixierten Typs phagocytisiert werden, sich durch die Behandlung mit dem erfindungsge- so mäßen Extrakt erhöht.

II.C'ytostatischcrToxizitäistesi

(a) Als Versuchstiere wurden 7- bis 10-Wochen-altc weibliche Mäuse vom BALB/c Stamm mit einem Körpergewicht von 22±2g verwendet. Am Tag der Verabreichung der Probe wurden BC-47 Zellen (eine von an Blasenkrebs erkrankten Rallen des ACI Stammes gewonnene Zcllinie, die in einem Teslrohr einer Generationcnkultur unterworfen war) einer intraperitonealcn Injektion in einem Verhältnis von 1 χ 10⁷ Zellen pro Maus, sowohl aus der behandelten als auch der Kontrollgruppe (behandelt mit 0,1 ml PBS) zugegeben, um eine Immunisierung zu erreichen. 7 Tage nach der Immunisierung wurde die Bauchhöhle jeder Maus aus den beiden t>o vorgenannten Gruppen und aus der Gruppe normaler Mäuse mit RPM1-1640 Medium zwecks Gewinnung von PEC gewaschen. Die gesammelten Zellen wurden entsprechend gepoolt, die PEC 2 χ mit RPMI-1640 Medium gewaschen, durch Zentrifugieren 1 χ mit 20%igem FBS-RPMI-1640 Medium gewaschen und dann in dem zuletzt genannten Medium suspendiert Für jede Gruppe wurde die PEC-Konzentration auf 3,2XlO⁵ Zellen pro

ml auf dem Wege der Zellzahl-Bestimmung mit Trypanblau eingestellt.

(b) BC-47 Zellen, die in einem Testrohr kultiviert wurden, wurden in 20%igem FBS-RPMI-1640 Medium suspendiert, um eine Suspension von lebenden Zellen zu erhalten, die eine Konzentration von 8 χ 10⁴ lebenden Zellen Dro ml aufweist.

IO

15

25

30

35

45

50

55

(c) In einer horizontalen Mikroplatte vom Bodentyp zur Kultivierung von Zellen [Model N-1480 mit 96 Ausnehmungen (Vertiefungen), von NUNC CO. LTD, Schweden] wurden 0.1 ml pro Vertiefung von einer PEC Suspension (3,2 χ 10⁴ Zellen) und 0,1 ml pro Vertiefung einer rohrkultivierten Test-BC-47 ZcI!suspension (8x10' Zellen) einer Kultivierung bei 37°C während 24 Stunden in einem 5%igen CO₂ Inkubator unterworfen, wonach 0,Oi μθ von '⁴C Thymidin jeder Vertiefung zugesetzt und die Kultivierung unter denselben Bedingungen während 24 Stunden fortgesetzt wurde.

(d) Nach Beendigung der Kultivierung wurde jede Vertiefung mit PBS und BC-47 ausgewaschen wobei die auf dem Boden der Vertiefungen haftenden und wachsenden Zellen auf einem Filterpapier vermittels eines ZcII-sammlers vom Mini-Mush-Typ (von Dynaetech Co. Ltd. England) gesammelt wurden. Die Menge an ¹⁴C, die in den BC-47 Zellen jeder Vertiefung (die Zahl an ¹⁴C Atomen, die pro Minute zerstört wurden, dpni) gebunden war. wurde vermittels eines Flüssig-Szintillations-Zählcrs gemessen (Modell LSC-673 von Aloka Co. Ltd.. Japan).

Das Vermehrungs-lnhibierungs-Verhältnis wurde nach der folgenden Formel errechnet:

100 (%),

worin A die Menge (M)(dpm/Vertiefung) der '⁴C Atome bedeutet, die an die für sich allein kultivierten BC-47 Zellen gebunden sind und B für die Menge (M) (dpm/Vertiefung) der ¹⁴C Atome steht, die an BC-47 Zellen gebunden sind, die zusammen mit PEC der normalen Maus, der immunisierten Maus oder der immunisierten tind mit der Probe behandelten Maus kultiviert wurden.

Der Aktivierungsindex wurde nach der folgenden Formel errechnet:

_C D '

worin Cdas Vermehrungs-Inhibierungs-Verhältnis (M)dcr immunisierten und mit der Probe behandelten Maus und D das Vermehrungs-Inhibierungs-Verhältnis (M) der immunisierten Maus (die nicht mit der Probe behandelt war) bedeutet.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle 111 angegeben.

Tabelle IH — Verbesserung der zellularen Immunisicrungwirkung

gebundene Menge
¹⁴

Test I BC-47 Zellen allein kultiviert normale Mäuse immunisierte Mäuse immunisierte und probenbehandeltc Mäuse

Test 2 BC-47 Zellen allein kultiviert normale Mäuse immunisierte Mäuse immunisierte und probenbehandelte Mäuse

Test 3 BC-47 Zellen allein kultiviert normale Mäuse immunisierte Mäuse immunisierte und probenbehandeltc Mäuse

Anmerkungen zu Tabelle III:

30 884,3 ±349.7

27 365,3 ±926,3

22 284.3 ±939,1

16 862,8 +725,8

11 208.2 ±411,1

9 905.4 ±429.6

6 081,6 ±819,0

2 920,3 ±176,1

11 208,2 ±411.1 9 905,4 ±429,6 6 649,83 ±819,0 3 960.2 ±310.7

Verniohrtings-	Aklivie-
Inhibicrtings-	riings-
Vcrhaltnis(%)	indcx
0
11.39
27,85	1
45,40	1,63
0
11.62	_
4<l,74	1.00
7J.95	1,62
0
11.62	_
40,67	1,00
64.67	1.59

1. Beim Test 1 wurde das gemäß nachfolgendem Beispiel 12 erhaltene Extrakt subkutan auf dem Rücken cinci

Maus in einem Verhältnis von 32 μg/0,1 ml (PBS)/Maus injiziert; eine Gruppe bestand aus 10 Mäusen.
bo 2. Bei dem Test 2 wurde das gemäß nachfolgendem Beispiel 25 erhaltene Extrakt subkutan auf dem Rückcr einer Maus in einem Verhältnis von 32 μg/0,1 ml (PBS)/Maus injiziert; eine Gruppe bestand aus 10 Mäusen. 3. Beim Test 3 wurde das gemäß nachfolgendem Beispiel 36 erhaltene Extrakt subkutan auf dem Rücken cinci Maus in einem Verhältnis von 40,5 μg/0,1 ml (PBS)/Maus inji/.iert; eine Gruppe bcsiand aus 10 Mäusen.

ei Die vorstehenden Eigebnisse zeigen, daß durch eine Verabreichung des erfindungsgemäßen Extrakts dii Vermehrung von BC-47 Zellen in den Mäusen inhibiert und hinsichtlich der UC-47 Zellen die zellulare Iniimini sicrung verbessert werden kann.

111. Akute Toxizitäts-Test

Die akute Toxizität wurde nach der Liehfield-Wilcoxon-Methode [J. Pharm. Exp. Ther„ 96, 99 (1949)] unter Verwendung männlicher Mäuse vom ICR/|CL Stamm untersucht Fs wurde gefunden, daß der LDso Wert (mg/kg) des nach den nachfolgenden Beispielen 12—36 erhaltenen Extrakts zwischen !,990 und 2,550 liegt (intrapcrilonealc Injektion).

Aus den vorstehend wiedergegebenen Untersuchungsergebnissen kann ohne weiteres abgeleitet werden, daß das erfindungsgemäße Extrakt wirksam für die Verhütung und inhibierung von Infektionskrankheiten bei Patienten mit verringerter Immunoaktivität eingesetzt werden kann, so z. B. bei älteren oder solchen Personen, die an Krebs erkrankt sind und mit carcinostatischen Mitteln behandelt werden, oder für die Heilung von bakteriellen Infektionskrankheiten, die gleich/eilig mit chemotherapeutischen Arzneimitteln behandelt werden. Das erfindungsgemäße Extrakt kann auch bei Patienten verabreicht werden, die an einer verringerten Leberfunktion leiden, um Fremdstoffe (z. B. Arzneimittel) zu eliminieren und so zu einer Verbesserung der Hypofunktion beizutragen.

Die erfindungsgemäßen Extrakte können dem menschlichen Körper oral, durch Injektion (intravenös, subku- μ tan oder intramuskulär) oder in irgendeiner anderen Art und Weise einverleibt werden.

Liegen die erfindungsgemäßen Extrakte als feste Zubereitungen für eine orale Verabreichung vor, so können sie die Form von Tabletten, einem Granulat, Pulvern, Kapseln od. dergl. aufweisen. Die Zubereitungen können Additive enthalten, so /_ B. einen Träger wie ein Saccharid oder eine Zellulose-Zubereitung, einen Binder wie Siärkepasie oder Methylzellulosc, einen Füllstoff, eine desintegrierend wirkende Substanz usw., also alle Substanzen, die normalerweise bei der Herstellung von Arzneimitteln verwendet werden. Falls die erfindungsgemäßen Extrakte als oral verabreichbare Flüssig-Zubereitungen verwendet werden sollen, so können sie in Form von wäßrigen Zubereitungen für innere Anwendung, Suspensionen, Emulsionen, Syrupen usw., vorliegen. Schließlich können sie auch in Form von Trockenprodukten angewendet werden, die vor Gebrauch aufgelöst werden.

Wenn die erfindungsgemäßen Extrakte oral bei erwachsenen Personen verabreicht werden, so kann die Dosis zwischen 3 und 20 mg/kg pro Tag liegen. Selbstverständlich kann die Dosis herauf- oder herabgesetzt werden, entsprechend den Erkrankungserscheinungen, dem Alter des Patienten, der Form der verabreichten Zubereitung usw.

Die nach der Erfindung erhältlichen Extrakte können in der Form wäßriger Lösungen, Suspensionen oder öliger oder wäßriger Emulsionen injiziert werden. Im allgemeinen werden jedoch die Injektionen durch Auflösen oder Suspendieren der Extrakte in wäßrigen flüssigen Medien wie sterilem Wasser, physiologischen Kochsalzlösungen, hergestellt. Falls erforderlich, können konventionelle Auflösungs-Hilfsstoffe, Stabilisatoren, Konservierungsmittel, Additive zur Herstellung isotonischer Lösungen, usw. den Injektionen beigegeben werden.

Die auf diese Weise erhaltenen Injcklions-Zubereitungcn können intravenös, intramuskulär, subkutan oder in irgendeiner anderen geeigneten Weise verabreicht werden. Werden die Injektionen bei Erwachsenen parenteral angewendet, so kann die Extrakt-Dosis 0,1—5 mg/kg pro Tag betragen. Selbstverständlich kann diese Dosis erhöht oder verringert werden, entsprechend den Krankheitsbedingungen, dem Alter des Patienten, der Form der verabreichten Zubereitung und der Verabreichungsmethode.

Die Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme von Aiisführungsbeispielen beschrieben, die jedoch die Reichweite der Erfindung nicht beschränken.

In den Beispielen 1 — 11 ist die Herstellung eines wäßrigen, fettfreien Extrakts angegeben als Vorstufe für die in den Beispielen 12—36 beschriebene Gewinnung des trockenen Extrakts.

B e i s ρ i e I 1

40 Liter 50%igen Äthanols (V/V) wurden S kg fein zerkleinertem, auf dem Markt erhältlichen Barren-wort (Epimedium koreanuin, Nak. des Korea-Wuchses) zugesetzt und in der Wärme eine Extraktion bei 50°C während b Stunden auf einem Wasserbad unter Verwendung eines Rückflußkühlers durchgeführt. Nach der Extraktion wurde die Mischung solange sie noch wurm war filtriert und der Rückstand nochmals 3 χ in derselben Weise wie zuvor extrahiert, wobei jedesmal 20 Liter frischen 50%igen Äthanols (V/V) verwendet wurden. Die angefallenen Filtraic wurden miteinander vereinigt und bei 45°C unter reduziertem Druck konzentriert, wobei 30 Liter eines wäßrigen Extrakts erhalten wurden. Dieser Extrakt wurde in einen Scheidetrichter gebracht, wonach 20 Liter Äthylazetat zugegeben und die Mischung genügend geschüttelt wurde. Es wurde lediglich die wäßrige Schicht gewonnen, die nochmals 3 χ in derselben Weise wie vorher extrahiert wurde, wobei jedesmal 20 Liter frisches Äthylazetat verwendet wurden. Die wäßrige Schicht wurde unter reduziertem Druck konzentriert und das restliche Äthylazetat durch Destillation entfernt. Beim Abfiltrieren des Rückstandes wurden 22,5 Liter eines fcttfrcicn wäßrigen Extrakts erhalten.

Beispiel 2

20 Liter Wasser wurden 2 kg fein zerkleinertem, auf dem Markt erhältlichen Barren-wort (Epimedium koreanuni, Nak. des Korea-Wuchses) zugegeben und in der Wärme eine Extraktion bei 50°C während 6 Stunden auf einem Wasserbad unter Verwendung eines Rückflußkühlers durchgeführt. Nach der Extraktion wurde die Mischung, solange sie noch warm war, filtriert und der Rückstand nochmals 3 χ in derselben Weise wie vorher extrahiert, wobei jedesmal 10 Liter Wasser verwendet wurden. Sämtliche Filtrate wurden zusammengebracht und dann bei 45"C unter reduziertem Druck konzentriert. Dabei wurden 12 Liter eines wäßrigen Extrakts erhalten. Hieraus wurden 9 Liter eines entfetteten wäßrigen Extrakts hergestellt, entsprechend der im Beispiel 1 beschriebenen Arbeitsweise.

IO 15 20 25

40

50

60

3ί 16 695

B e i s ρ i e! 3

20 Liter 50%igen Äthanols (V/V) wurden 2 kg fein zerteiltem, auf dem Markt erhältlichen Barren-wort (Epimedium macranthum, M. et D„ var„ violaceum, Frl. des Japan-Wuchses) zugesetzt und die Mischung ruhig bei Raumtemperatur Ober Nacht stehengelassen. Hiernach wurde die Mischung filtriert und der Rückstand nochmals 3 χ in derselben Weise wie zuvor extrahiert, wobei jedesmal 10 Liter frischen 50%igen Äthanols (V/V) verwendet wurden. Die miteinander vereinigten Fütrate wurden dann bei 45°C unter reduziertem Druck konzentriert Dabei fielen 12 Liter eines wäßrigen Extrakts an. Hieraus wurden 9 Liter eines entfetteten wäßrigen Extrakts entsprechend der im Beispiel 1 beschriebenen Arbeitsweise erhalten.

Beispiel 4

20 Liter Wasser wurden 2 kg fein zerkleinertem, auf dem Markt erhältlichen Barren-wort (Epimedium macranthum, M. et. D, var, violaceum, Frl. des Japan-Wuchses) zugesetzt, wonach die Mischung bei Raumtemperatur über Nacht still stehengelassen wurde. Sie wurde dann filtriert und der Rückstand wurde nochmals 3 χ in derselben Weise wie vorher extrahiert, wobei jedesmal 10 Liter frischen Wassers verwendet wurden. Die miteinander vereinigten Filtrate wurden dann bei 45°C unter reduziertem Druck konzentriert. Dabei wurden 12 L iter eines wäßrigen Extrakts erhalten, aus dem in derselben Weise wie in Beispiel 1 beschrieben 9,0 Liter eines fettfreien wäßrigen Extrakts hergestellt wurden.

Beispiel 5

16 Liter Äthylazetat wurden 2 kg fein zerteiltem, auf dem Markt erhältlichen Barren-wort (Epimedium sagittatum, Bak. des China-Lueta-Wuchses) zugesetzt, wonach eine Extraktion in der Wärme bei 50°C auf einem Wasserbad während 6 Stunden unter Verwendung eines Rückflußkühlcrs durchgeführt wurde. Nach der Extraktion wurde die Mischung solange sie noch warm war filtriert und der Rückstand nochmals 2 χ in derselben Weise wie vorher extrahiert, wobei jedesmal 16 Liter frischen Äthylazclats verwendet wurden. Der nach der Entfernung des in Äthylazetats löslichen Anteils verbleibende Rückstand wurde luftgetrocknet, wonach 16 Liter Wasser dem Rückstand zugesetzt wurden. Die Mischung wurde bei 50⁰C während 6 Stunden auf einem Wasserbad unter Verwendung eines Rückfluökühlers extrahiert. Hiernach wurde der Rückstand nochmals 2 χ wie zuvor extrahiert und filtriert, wobei jedesmal 16 Liter frischen Wassers verwendet wurden. Die Filtrate wurden miteinander vereinigt, bei 45⁰C unter reduziertem Druck konzentriert und filtriert. Dabei fielen 9,0 Liter eines wäßrigen Extrakts an.

Beispiele 6—11

Es wurden 2 kg fein zerteiltes, auf dem Markt erhältliches Barren-wort (F.pimedium macranthum, M. et. D.. var, violaceum, Frl. des Japan-Wuchses) in derselben Weise wie in Beispiel I beschrieben behandelt, mil der Maßgabe, daß die nachfolgend angegebenen Lösungsmittel für die Extraktion und Entfettung verwendet wurden. Die erhaltenen Ergebnisse sind ebenfalls nachstehend aufgeführt:

Beispiel Nr. Extraktions-Lösungsmittcl Kn tfcllungs-Lösungsmittel

Menge des cnlfcltelcn wäßrigen Kxtrakts(lt)

6	50% Methanol (V/V)
7	50% Azeton (V/V)
8	50% Dioxan (V/V)
9	500/0 Äthanol (V/V)
10	500/0 Äthanol (V/V)
11	50% Äthanol (V/V)

Äihylazctat Älhyla/.ctat Äthylazclal

Chloroform

Diäthyläthcr

n-Hexan

Beispiel 12

9.0 9.0 9.0 9.0 9,0 9,0

13,5 Liter Äthanol wurden 4,5 Liter des gemäß Beispiel 1 erhaltenen entfetteten wäßrigen Extrakts zugesetzt. Die Mischung wurde gerührt und über Nacht stehengelassen. Das abgesetzte Präzipitat wurde durch Filtration gewonnen und mit 100 ml Äthanol gewaschen und in 400 ml Wasser aulgelöst. Der lösung wurden 1.6 Liter Äthanol zugegeben und der abgesetzte Niederschlag durch Filtration gewonnen. Der Niederschlag wurde unter reduziertem Druck getrocknet, wobei 10 g des Extrakts erhalten wurden. Dieses wurde dann mit 500 ml Wasser aufgenommen und filtriert. Das Filtrat wurde konzentriert und getrocknet unter reduziertem Druck. Es wurden 8 g eines gereinigten Extrakts in der Form eines braunen Pulvers erhallen.

Beispiele 1 3 — 22

Die Extrakte und gereinigten Extrakte gemäß der Erfindung wurden jeweils aus 4,5 Liter der bei den Beispielen 2 bis 11 anfallenden entfetteten wäßrigen Extrakte erhalten und zwar unter Anwendung der in Beispiel 12 beschriebenen Arbeitsweise. Die Ergebnisse sind nachfolgend angegeben:

10

Beispiel Nr. verwendetes, entfettetes wäßriges Extrakt

Menge des zunächst
erhaltenen Extrakts (g)

Menge des gereinigten Extrakts (g)

13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

wäßriges Extrakt gemäß Beispiel 2 wäßriges Extrakt gemäß Beispiel 3 wäßriges Extrakt gemäß Beispiel 4 wäßriges Extrakt gemäß Beispiel 5 wäßriges Extrakt gemäß Beispiel f wäßriges Extrakt gemäß Beispiel 7 wäßriges Extrakt gemäß Beispiel 8 wäßriges Extrakt gemäß Beispie! 9 wäßriges Extrakt gemäß Beispiel 10 wäßriges Extrakt gemäß Beispiel 11

17.5
8.8
10,5
9,3
93
8,9
8,8
8,9
9,0
8,1

14,0
7,0
7.5
7.5
7,5
7.1
7,0
7,1
7,2

Beispiel 23

Das nach Beispiel 1 erhaltene entfettete wäßrige Extrakt (4,5 Liter) wurde in derselben Weise wie im Beispiel 12 beschrieben behandelt mit der Maßgabe, daß Methanol als Fällungs-Lösungsmittel anstelle von Äthanol verwendet wurde. Zunächst fielen 4.6 g Extrakt und dann 2,6 g gereinigtes Extrakt an.

Beispiel 24

Das in Beispiel I erhaltene entfettete wäßrige Extrakt (4,5 Liter) wurde in der in Beispiel 12 beschriebenen Weise behandelt mit der Maßgabe, daß Azeton als Fällungs-Lösungsmittel anstelle von Äthanol eingesetzt wurde. Zunächst fielen 8,8 g des Extrakts und dann 6,4 g gereinigtes Extrakt an.

Beispiel 25

Das nach Beispiel 1 erhaltene entfettete wäßrige Extrakt (4,5 Liter) wurde für die Dialyse in ein Zelluloserohr gebracht (Visking-Rohr von Union Carbide Co., Ltd., U.S.A.). Die Dialyse wurde mit in Strömung befindlichem Wasser während einer Woche durchgeführt. Die innere Flüssigkeil (mit der die hochmolekularen Bestandteile enthaltenden Fraktion) wurde unter reduziertem Druck auf 500 ml konzentriert. 2,01 Äthanol wurden der konzentrierten Flüssigkeit zugesetzt und der ausgefallene Niederschlag durch Filtration abgetrennt. Der Niederschlag wurde unter reduziertem Druck getrocknet, wobei 12 g an Extrakt anfielen. Hiernach wurde das Extrakt mit 500 ml Wasser extrahiert und filtriert und das Filtrat unter reduziertem Druck konzentriert und dann getrocknet, wobei 10 g eines gereinigten Extrakts als braunes Pulver anfielen.

Beispiele 26 bis 33

Die gemäß Beispielen 2 bis 11 anfallenden entfetteten wäßrigen Extrakte (jeweils 4,5 Liter) wurden entsprechend der in Beispiel 25 beschriebenen Arbeitsweise behandelt. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind nachfolgend angegeben:

10

15

20

25

30

35

40

Beispiel Nr.	verwendetes, entfettetes wäßriges lixlrakt	Menge des zunächst	Menge des
		erhaltenen Extrakts(g)	gereinigten
			Extrakts (g)
26	wäßriges Extrakt gemäß Beispiel 2	12,0	10,0
27	wäßriges Extrakt gemäß Beispiel 5	10,0	8,0
28	wäßriges Extrakt gemäß Beispiel 6	11,2	10,0
29	wäßriges Extrakt gemäß Beispiel 7	10,6	9,0
30	wäßriges Extrakt gemäß Beispiel H	10,6	8,6
31	wäßriges Extrakt gemäß Beispiel 9	10,6	8,8
32	wäßriges Extrakt gemäß Beispiel 10	10,8	8,6
ii	wäßriges Extrakt gemäß Beispiel 11	9,8	8,0
	Beispiel 34

Das gemäß Beispiel 3 erhaltene entfettete wäßrige Extrakt (4,5 I) wurde unter Verwendung eines PVA Ilohlfaser-Dialysaiois, der eine Polyvinylalkohol-Hohlfasermembran (Modell KL-I-30 von Kuraray Co., Ltd., |apan)dialysiert. 1,6 ! Äthanol wurden der so erhaltenen, konzentrierten Flüssigkeit (400 ml) zugegeben und das abgeschiedene Prä/.ipitäi durch Filtration abgetrennt. Dieses wurde unter reduziertem Druck getrocknet, wobei zunächst 10,6 g des l-xtrakts anfielen. Hiernach wurde das Extrakt mit 500 ml Wasser extrahiert und abfiltriert und das Fillrat unter reduziuriem Druck konzentriert und getrocknet. Dabei ergaben sich 8,5 g gereinigtes

50

55

b0

65

Beispiel 35

Das gemäß Beispiel 4 erhaltene entfettete wäßrige Extrakt wurde nach der Arbeitsweise des Beispiels 34 behandelt. Dabei ergaben sich zunächst 6,1 g Extrakt und dann 4,5 g gereinigtes Extrakt. 5

Beispiel 36

Das nach Beispiel 1 erhaltene entfettete wäßrige Extrakt (4,5 I) wurde unter Rühren allmählich mit Amiiiuniumsulfat vermischt bis die Sättigungskon/cntration von Animoniumsulfat erreicht war. Hiernach wurde die

lü Mischung über Nacht still stehengelassen. Der abgesetzte Niederschlag wurde durch Filtration abgctrenni. luftgetrocknet und mit 6 I Wasser extrahiert. Das Extrakt wurde zur Dialyse in ein Zelluloscrohr (Visking-Kohr von Union Carbide, Co., Ltd., U.S.A.) gebracht und die Dialyse mit unter Strömung befindlichem Wasser während 6 Tagen durchgeführt. Die innere Flüssigkeil (mit der die hochmolekularen Bestandteile enthaltenden Fraktion) wurde unter reduziertem Druck auf 500 ml konzentriert. 2,0 I Äthanol wurden der konzentrierten

!5 Flüssigkeit zugesetzt und der ausgefällte Niederschlag durch Filtration abgetrennt. Das gewonnene Filirai wurde unter reduziertem Druck getrocknet. Dabei ficien zunächst 8,i g Extrakt an. Dieses wurde mil 500 m!

Wasser extrahiert und filtriert. Nach der Konzentration und Trocknung des Filtrals unter reduziertem Druck

ergaben sich 6,0 g gereinigtes Extrakt.

Die gemäß den Beispielen 12 bis 36 erhaltenen Extrakte wiesen die obengenannten, der Kennzeichnung der

20 Extrakte dienenden Charakteristika (Parameter) auf.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Hochmolekulare Bestandteile enthaltender Extrakt, erhältlich aus Pflanzenteile,-! der Gattung lipidcmium sp. durch wäßrige Extraktion, Entfernung der Fettbestandteile und Abtrennen der hochmolekularen Bestandteile aus den wäßrigen Anteilen daraus, gekennzeichnet durch folgende Parameter:

(1) Erscheinungsform:

(a) Braunes Pulver;

(b) schwach sauer (pH etwa 6,5 bei Auflösung von 100 mg des Extrakts in 50 ml Wasser);