DE60206531T2

DE60206531T2 - Ein kräutermolekül als potentielles anti-leukämisches arzneimittel

Info

Publication number: DE60206531T2
Application number: DE60206531T
Authority: DE
Inventors: Santu Bandyopadhyay; Bikash Chandra Pal; Samir Battacharya; Keshab Chandra Roy; Gautam Bandyopadhyay
Original assignee: Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Current assignee: Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Priority date: 2002-05-31
Filing date: 2002-12-20
Publication date: 2006-07-13
Anticipated expiration: 2022-12-21
Also published as: JP4440767B2; CN100515416C; DE60206531D1; CN1646112A; RU2004135078A; WO2003101446A1; US20030229140A1; EP1511475B1; AU2002348746A1; RU2314096C2; CA2488287A1; JP2005531593A; EP1511475A1

Description

Technisches Gebiet
Diese Erfindung betrifft die Behandlung von akuter und chronischer myeloischer Leukämie (AML und CML) und ferner von lymphatischer/lymphocytischer Leukämie durch Chlorogensäure (CA), die aus einem Blattextrakt von Piper betel isoliert wurde. Myeloische Leukämie, sowohl akute (AML) als auch chronische (CML), und lymphatische/lymphocytische Leukämie sind letal, es gibt keinen auf die Zerstörung der Leukämiezellen gerichteten Wirkstoff und diese Zellen sprechen schlecht auf eine Chemotherapie an, die immer unspezifisch ist, wodurch normale Zellen nachteilig beeinflusst werden. Die einzigartige Eigenschaft einer Therapie mit einer Komponente (Chlorogensäure) von Piper betel ist das Abtöten von myeloischen Krebszellen und lymphatischen/lymphocytischen Krebszellen, wobei andere normale Zellen unbeeinflusst bleiben.
Verweise auf den technischen Hintergrund und den Stand der Technik:
Myeloische Leukämie wird üblicherweise in zwei Gruppen unterteilt: Akute myeloische Leukämie (AML) und chronische myeloische Leukämie (CML). AML ist durch eine Erhöhung der Zahl der Knochenmarkzellen im Knochenmark und einen Stillstand bei deren Reifung gekennzeichnet. In den Vereinigten Staaten beträgt das jährliche Auftreten von AML etwa 2,4 pro 100 000 und es nimmt mit dem Alter fortschreitend bis zu einem Spit zenwert von 12,6 pro 100 000 Erwachsene eines Alters von 65 Jahren oder älter zu. CML ist eine maligne klonale Erkrankung hämopoetischer Stammzellen. Das mittlere Alter bei der Präsentation beträgt 53 Jahre, doch tritt sie in allen Altersgruppen einschließlich Kindern auf. Die natürliche Geschichte von CML besteht aus der Progression von einer benignen chronischen Phase zu einem rasch tödlich verlaufenden Blastenschub innerhalb von 3 bis 5 Jahren oder noch früher. Die Prognose von CML ist trotz des weiten Fortschritts der klinischen Medizin (1) ebenfalls schlecht. CD33 stellt einen spezifischen und verwendbaren Marker beim Prozess der Knochenmarkdifferenzierung dar (2). Jüngere Berichte legen nahe, dass die Tätigkeit von CD33 durch monoklonale Antikörper Apoptosis induzierte, was zur Wachstumshemmung der Proliferation von AML- und CML-Zellen in vitro führte (2, 3). Unter Nutzung der Knochenmark-spezifischen Expression von CD33 wurde mit einem Antikrebsarzneimittel konjugierter humanisierter Anti-CD33-monoklonaler-Antikörper bei AML-Patienten mit signifikantem Erfolg versucht (4). In ähnlicher Weise wird lymphatische/lymphocytische Leukämie ebenfalls in zwei Gruppen unterteilt: akute lymphocytische Leukämie (ALL) und chronische lymphocytische Leukämie (CLL). Lymphatische/lymphocytische Leukämie kann sowohl T- als auch B-Zelllinien beeinflussen und ist bei Kindern vorherrschend. Bereits beansprucht wurde antimyeloische Aktivität mit den Extrakten von Blättern von Piper betel (eingereichtes Patent PCT/IN00/00118, 12. Dezember 2000) und 3-o-p-Cumarylchinasäure, ein aktiver Faktor zur Behandlung von AML und CML am 30.05.2002, US Provisional Patent Application Nr. 60/384 163 (299/NF/2002).
Daher sind die früheren Erkenntnisse des Anmelders in direkter Übereinstimmung mit der vorliegenden Patenteinreichung über Chlorogensäure (CA), die aus den Fraktionen der Betelblätterextrakte isoliert wurde, zur Behandlung von akuter und chronischer myeloischer Leukämie und lymphatischer/lympho cytischer Leukämie. Es ist bekannt, dass Chlorogensäure antiallergische Aktivität aufweist (5). CA hemmt ferner Glucose-6-phosphatasesysteme in Leber und Niere (6). CA ist ein Inhibitor von epidermaler Lypoxygenaseaktivität und einer TPA-induzierten Ohrenentzündung (7). CA übt ferner Hemmwirkungen auf eine TPA-induzierte Tumorförderung in Maushaut aus (7). Anti-HIV-Aktivität von CA wurde ebenfalls berichtet (8). Obwohl eine Hemmung der Tumorförderung CA zugeschrieben wurde, wurde für CA keine Antitumoraktivität auf etablierte Tumore, die eine Antileukämieaktivität umfasst, berichtet. In der vorliegenden Patentanmeldung werden Antileukämieaktivität und die Antitumoraktivität von CA zum ersten Mal beansprucht.
Piper betel-Blätter weisen einen sehr scharfen aromatischen Geschmack auf und werden in Indien als Mastikatorium in weitem Umfang verwendet. Allgemein werden reife oder überreife Blätter, die das Wachstum eingestellt haben, jedoch noch nicht spröde wurden, zum Kauen verwendet. Die Basiszubereitung für Kauzwecke besteht aus einem Betelblatt, auf das Kalkhydrat und Katechu geschmiert sind, worauf Betelnussraspel gegeben sind; Aromastoffe, wie Kokosspäne, Nelke, Kardamom, Fenchel, pulverförmiges Süßholz, Muskatnuss und auch Tabak, werden nach Geschmack verwendet. In einigen Orten wird eine zubereitete Piper betel-Blattzubereitung mit einem Silber- oder Goldfilm überzogen. Als Mastikatorium werden ihm viele Eigenschaften zugeschrieben: es ist aromatisch, verdauungsfördernd, stimulierend und karminativ. Medizinisch ist es bei katarrhalischen und Lungeninfektionen verwendbar; es wird auch für Kataplasmen verwendet. Die Wirkungen des Kauens von Betelblättern mit Betelnuss und anderen Zusätzen sind die Anregung der Speicheldrüsen und die Reizung der Schleimhautmembran des Mundes. Die produzierte Rotfärbung beruht auf einem Pigment in der Betelnuss, das sich unter der Wirkung des Alkalis in Kalk und des Katechu manifestiert. Ein milder Stimulierungsgrad wird hervorgerufen, was zu einem Gefühl der Wär me und des Wohlgefühls außer dem Verleihen eines angenehmen Geruchs führt. Der wichtigste Faktor, der den Aromawert des Blatts bestimmt, ist die Menge und insbesondere die Natur des vorhandenen ätherischen Öls. Betelblätter von verschiedenen Regionen variieren im Hinblick auf Geruch und Geschmack. Am schärfsten ist der Sanchityp, während die mildesten und süßesten von Varanasi stammen.
Die Betelblätter enthalten ätherische Öle, wobei der Ölgehalt von 0,7 bis 2,6 % in Abhängigkeit von den Blattsorten variiert. Das Öl besteht aus Phenolen und Terpenen. Je höher der Anteil an Phenolöl ist, desto besser ist die Qualität. Ein Isomer von Eugenol der Bezeichnung Chavibetol (Betelphenol; 4-Alkyl-2-hydroxy-1-methoxy-benzol) wird als charakteristischer Bestandteil von Betelöl betrachtet. Betelöl indischer Arten enthält als vorherrschenden Bestandteil einen Phenolbestandteil und es wird bei der Behandlung verschiedener Atemwegsprobleme entweder als lokale Applikation oder durch Gurgeln verwendet. Es besitzt karminative Eigenschaften. Es zeigt verschiedene Wirkungen auf das Zentralnervensystem von Säugern. Das ätherische Öl und Extrakte der Blätter besitzen Aktivität gegenüber grampositiven und gramnegativen Bakterien, wie Micrococcus pyogenes var. Albus, Bacillus subtilis und B. Megaterium, Diplococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Escherichia coli, Salmonella typhosa, Vibrio comma, Shigella dysenteriae, Proteus vulgaris, Pseudomonas solanacaerum, Sarcina lutea und Erwinia carotorora. Das ätherische Öl und Blattextrakte zeigten ferner antimykotische Aktivität gegen Aspergillus niger und A. Oryzae, Curvularia lunata und Fusarium oxysporum. Das Öl erwies sich als letal in etwa 5 min gegenüber dem Protozoon Paramaeceum caudatum (5). Ein Wasserdampfdestillat der Blätter zeigte Aktivität gegen Mycobacterium tyberculosis.
Literaturstellen

1. CL Sawyers, The New England Journal of Medicine, 340 (17): 1330–1340, 1999.
2. C. Vitale, C. Romagnani et al., Proc. Natl. Acd. Sci. USA, 96(26): 15091–15096, 1999.
3. C. Vitale et al., Proc. Natl. Acd. Sci, USA, 98(10): 5764–5769, 2001.
4. EL Sievers, FR Appelbaum et al., Blood, 93: 3678–3684, 1999.
5. H. Ito, T. Miyazaki, M. Ono und H. Sakurai, Bioorg. Med. Chem. 6(7): 1051–1056, 1998.
6. WJ Arion et al., Biochem. Biophys. 351(2): 279–285, 1998.
7. AH Conney et al., Adv. Enyme Regul. 31: 385–396, 1991.
8. G. Supriyatna et al., Phytomedicine, 7 (Suppl. II): 87, 2000.

Aufgaben der Erfindung
Die Hauptaufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung einer neuen Verwendung der Verbindung Chlorogensäure, die aus dem Piper betel-Blattextrakt oder beliebigen anderen Quellen isoliert wurde, zur Behandlung von akuter und chronischer myeloischer Leukämie und lyphatischer/lymphocytischer Leukämie.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung einer neuen pharmazeutischen Zusammensetzung, die einen Träger zusammen mit der Verbindung Chlorogensäure umfasst, zur Behandlung von akuter und chronischer myeloischer Leukämie und lyphatischer/lymphocytischer Leukämie.
Eine noch weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Isolierung einer aktiven Fraktion aus Blättern oder beliebigen anderen Pflanzenteilen von Piper betel zur Behandlung von AML, CML und lymphatischer/lymphocytischer Leukämie.
Eine noch weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines vereinfachten Verfahrens zur Isolierung von aktiven Komponenten aus allen Pflanzen von Piper betel, die zur Behandlung von AML, CML und lymphatischer/lymphocytischer Leukämie relevante biologische Eigenschaften besitzen.
Eine noch weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Pflanzenprodukts aus Blättern oder beliebigen anderen Pflanzenteilen von Piper betel zur Behandlung von AML, CML und lymphatischer/lymphocytischer Leukämie.
Eine noch weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung einer Pflanzen-Chlorogensäure, die aus Blättern von Piper betel gereinigt wurde, zur Behandlung von AML, CML und lymphatischer/lymphocytischer Leukämie.
Eine noch weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung eines Extrakts aus Blättern oder beliebigen anderen Pflanzenteilen von Piper betel zur Behandlung von AML, CML und lymphatischer/lymphocytischer Leukämie.
Eine noch weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines vereinfachten Verfahrens einer Extraktzubereitung aus Blättern oder beliebigen anderen Pflanzenteilen von Piper betel zur Behandlung von AML, CML und lymphatischer/lymphocytischer Leukämie.
Eine noch weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Präparierung von Chlorogensäure aus Blättern von Piper betel zur Behandlung von AML, CML und lymphatischer/lymphocytischer Leukämie.
Eine noch weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung von Pflanzen-Chlorogensäure, die aus Blättern oder beliebigen anderen Pflanzteilen von Piper betel gereinigt wurde, zur Behandlung von soliden Tumoren einschließlich Lymphomen.
Eine noch weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung neuer Verwendungsmöglichkeiten von Chlorogensäure (die aus einer beliebigen Quelle isoliert oder synthetisch hergestellt wurde) zur Behandlung von akuter und chronischer myeloischer Leukämie, lymphatischer/lymphocytischer Leukämie und soliden Tumoren einschließlich Lymphomen.
Zusammenfassung der Erfindung
Daher stellt die vorliegende Erfindung eine neue Verwendungsmöglichkeit der Verbindung Chlorogensäure, die aus dem Piper betel-Blattextrakt oder beliebigen anderen Quellen isoliert wurde, zur Behandlung von akuter und chronischer myeloischer Leukämie und lymphatischer/lymphocytischer Leukämie bereit. Ferner stellt die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung für akute und chronische myeloische Leukämie bei Tieren und Menschen bereit, wobei die Zusammensetzung eine wirksame Menge von Chlorogensäure (CA) und 3-o-p-Cumarylchinasäure (PCQ), die aus beliebigen Pflanzenteilen von Piper betel oder einer beliebigen anderen natürlichen oder synthetischen Quelle isoliert wurden, und pharmazeutisch akzeptable Additive umfasst, bereit.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Daher stellt die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung für akute und chronische myeloische Leukämie bei Tieren und Menschen bereit, wobei die Zusammensetzung eine wirksame Menge von Chlorogensäure (CA) und/oder 3-o-p- Cumarylchinasäure (PCQ), die aus beliebigen Pflanzenteilen von Piper betel oder einer beliebigen anderen natürlichen oder synthetischen Quelle isoliert wurden, und pharmazeutisch akzeptable Additive umfasst.
In einer Ausführungsform der Erfindung ist das Additiv aus der Gruppe von Nährstoffen, wie Proteine, Kohlenhydrate, Zucker, Talkum, Magnesiumstearat, Cellulose, Calciumcarbonat, Stärke-Gelatinepaste, und/oder pharmazeutisch akzeptablen Trägern, Streckmitteln, Verdünnungsmitteln oder Lösemitteln ausgewählt.
In einer weiteren Ausführungsform liegt das Verhältnis von CA und PCQ, die in der Zusammensetzung vorhanden sind, im Bereich von 1:0 bis 1:10, was zur Behandlung von soliden Tumoren einschließlich Lymphomen wirksam ist.
In einer weiteren Ausführungsform wird die Zusammensetzung auf oralem, intravenösem, intramuskulärem oder subkutanem Weg verabreicht.
In einer noch weiteren Ausführungsform wird die Zusammensetzung in einer Dosishöhe im Bereich zwischen 1 und 50 mg pro kg Körpergewicht/Tag während mindestens eines Zeitraums von 4 Wochen zu verabreicht.
In einer noch weiteren Ausführungsform wird die Zusammensetzung während eines Zeitraums im Bereich zwischen 4 Wochen und 12 Wochen zu verabreicht.
In einer noch weiteren Ausführungsform beträgt die Wachstumshemmung von Leukämiezelllinien bei 2 × 10⁶/ml/Vertiefung des Zelltyps K562 bis zu 20 % bei einer Dosismenge von 25 μg/ml CA.
In einer noch weiteren Ausführungsform beträgt die Wachstumshemmung von Leukämiezelllinien bei 2 × 10⁶/ml/Vertiefung des Zelltyps K562 bis zu 4 % bei einer Dosismenge von 25 μg/ml PCQ.
In einer noch weiteren Ausführungsform beträgt die Wachstumshemmung von Leukämiezelllinien bei 2 × 10⁶/ml/Vertiefung des Zelltyps K562 bis zu 44 % bei einer Dosismenge, die 25 μg/ml von jeweils CA und PCQ enthält.
In einer noch weiteren Ausführungsform beträgt die Wachstumshemmung von Leukämiezelllinien bei 2 × 10⁶/ml/Vertiefung des Zelltyps U937 bis zu 16,67 % bei einer Dosismenge von 25 μg/ml CA.
In einer noch weiteren Ausführungsform beträgt die Wachstumshemmung von Leukämiezelllinien bei 2 × 10⁶/ml/Vertiefung des Zelltyps U937 bis zu 2,08 % bei einer Dosismenge von 25 μg/ml PCQ.
In einer noch weiteren Ausführungsform beträgt die Wachstumshemmung von Leukämiezelllinien bei 2 × 10⁶/ml/Vertiefung des Zelltyps U937 bis zu 50 % bei einer Dosismenge, die 25 μg/ml von jeweils CA und PCQ enthält.
In einer noch weiteren Ausführungsform beträgt die Wachstumshemmung von Leukämiezelllinien bei 2 × 10⁶/ml/Vertiefung des Zelltyps CML-Leukämiezellen bis zu 2,38 % bei einer Dosismenge von 25 μg/ml CA.
In einer noch weiteren Ausführungsform beträgt die Wachstumshemmung von Leukämiezelllinien bei 2 × 10⁶/ml/Vertiefung des Zelltyps CML-Leukämiezellen bis zu 2,38 % bei einer Dosismenge von 25 μg/ml PCQ.
In einer noch weiteren Ausführungsform beträgt die Wachstumshemmung von Leukämiezelllinien bei 2 × 10⁶/ml/Vertiefung des Zelltyps CML-Leukämiezellen bis zu 20,3 % bei einer Dosismenge, die 25 μg/ml von jeweils CA und PCQ enthält.
In einer weiteren Ausführungsform erfolgt die Bereitstellung der Verwendung einer Zusammensetzung zur Behandlung von akuter und chronischer myeloischer Leukämie (AML & CML) und lymphatischer/lymphocytischer Leukämie durch Verabreichung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die eine wirksame Menge von Chlorogensäure (CA) und/oder 3-o-p-Cumarylchinasäure (PCQ), die aus beliebigen Pflanzenteilen von Piper betel oder einer beliebigen anderen Quelle isoliert wurden, und/oder in Kombination mit pharmazeutisch akzeptablen Additiven umfasst.
Die Erfindung wird hier im folgenden unter Bezug auf Beispiele, die nur zur Erläuterung sind und in keinster Weise als den Umfang der vorliegenden Erfindung beschränkend betrachtet werden sollen, beschrieben.
Kurze Beschreibung der beigefügten Zeichnungen
1 zeigt die HPLC der Fraktion E, wobei die Retentionszeit (Re) verschiedener Peaks, die in drei Zonen, Z_A, Z_B und Z_C, eingeteilt sind, angegeben ist.
1a. Die Peaks wurden numeriert. (Z_A hatte vier Hauptpeaks, während Z_B zehn sehr kleine bis mäßig große Peaks hatte und Z_C zwei unterschiedliche Peaks hatte.
3 zeigt die Struktur von Chlorogensäure (CA) oder 3-Coffeoylchinasäure.
4 zeigt Photomikrographien von Leukämiezelllinien, PBMC von einem CML-Patienten und einem normalen Spender nach einer Behandlung mit CA.
Beispiel 1
Gewinnung von Pflanzenmaterial
Die Blätter und alle anderen Pflanzenteile von Piper betel wurden vom Kletterer in verschiedenen Gebieten und Westbengalen, Indien, gesammelt. Eine Belegprobe wurde am Deptt. of Medicinal Chemistry am Indian Inst. of Chemical Biology, 4 Raja S.C. Mullick Road, Kokata-700 032, hinterlegt.
Beispiel 2
Isolierung der Verbindung Chlorogensäure
4,7 kg von frisch gesammelten Piper betel-Blättern wurden mit destilliertem Wasser gewaschen und dann in kleine Stücke zerschnitten. Kleine Blattstücke wurden zusammengegeben, mit 1,0 1 destilliertem Wasser gemischt und in einer Mischungsmischvorrichtung sorgfältig homogenisiert. Das Homogenat wurde durch ein feines Käsetuch gegeben, um die großen Teilchen herauszufiltern, und das Filtrat wurde gewonnen. Das Verfahren wurde für eine maximale Ausbeute 2- bis 3-mal wiederholt. Das vereinigte Filtrat wurde dann zentrifugiert, das Aliquot, eine klare Lösung, wurde gewonnen und zu einer halbfesten Masse, die etwa 110 g betrug, lyophilisiert.
Das gewonnene Material wurde auf biologische Aktivität, d.h. die Zerstörung von Leukämiezellen, untersucht. Bei der Beobachtung einer positiven Aktivität desselben wurde die Reinigung begonnen. 10 g des oben genannten Materials wurden auf eine Sephadex LH-20-Säule geladen und mit Wasser, Wasser-Methanol (1:1) und Methanol als Elutionsmittel chromatographiert. Drei auf diese Weise aus drei verschiedenen Lösemit telsystemen erhaltene verschiedene Fraktionen wurden getrennt auf biologische Aktivität überprüft.
Aktivität befand sich nur in Fraktion 2, d.h. Methanol-Wasser (1:1), und diese wurde als Fraktion E bezeichnet. Die Fraktion E wurde dann einer HPLC-Analyse unter Verwendung einer analytischen Säule Intersil ODS-3 unterzogen. Die Säule wurde mit Methanol-Wasser-Essigsäure (23:76:1) äquilibriert, die Durchflussrate wurde bei 1,0 ml pro min gehalten und Peaks wurden bei 280 nm identifiziert. Entsprechend der Retentionszeit (RE) konnten verschiedene Peaks in drei Zonen, Z_A, Z_B und Z_C, eingeteilt werden (1). Z_A hatte 4 Hauptpeaks, während Z_B 10 sehr kleine bis mäßig große Peaks hatte und Z_C zwei unterschiedliche Peaks hatte. Es war angebracht, die biologische Aktivität der drei Zonen Z_A, Z_B und Z_C zu beobachten, wobei diese getrennt an Leukämiezellen auf zerstörende Aktivität getestet wurden. Alle drei zeigten biologische Aktivität.
Es kann hier angemerkt werden, dass Z_C zwei unterschiedliche Peaks mit einer Retentionszeit (R_t) von 17,77 und 26,66 min aufwies. Der Peak mit R_t von 17,77 min zeigte eine beträchtliche Aktivität und daher wurde dessen Struktur bestimmt und als Patent eingereicht (299/NF/2002; 30.05.2002). Der letztere Peak, d.h. mit R_t 26,66 min, zeigte keine Aktivität.
Die Zone Z_B enthielt 10 Peaks (1 bis 10) variierender Größe. Die gepoolte Fraktion der Peaks 1–10 zeigte Leukämiezellenabtötungsaktivität. Aus diesem Grund wurden alle unterschiedlichen Peaks getrennt auf biologische Aktivität überwacht. Die Hauptpeaks von diesen waren 2, 3, 4 und 8, die R_t 6,58, 7,14, 7,56 bzw. 11,97 entsprachen und keiner von diesen zeigte Aktivität. Daher wurden die Nebenpeaks getrennt untersucht, indem wiederholte Fraktionen für die einzelnen Peaks gesammelt wurden, um die Menge dort vorhandener aktiver Moleküle zu er höhen. Bei der Suche nach Aktivität dieser Peaks, d.h. Peak 1, 5, 6, 7, 9 und 10, die R_t 5,16, 8,34, 9,16, 9,86, 13,94 bzw. 14,68 entsprechen, zeigten mit Ausnahme von Peak Nr. 6 (R_t 9,16 min) keine anderen Peaks eine detektierbare Aktivität. Gepoolte Fraktionen von Peak 6 (R_t 9,16 min) wurden lyophilisiert und erneut HPLC unterzogen, wobei der scharfe Einzelpeak dessen Reinheit anzeigt (2).

Dieser wurde dann IR, NMR und Massenspektralanalyse zur Bestimmung der Struktur unterzogen.

IR (KBr) ν_max cm^–1:	3355 (OH), 1689 (CO), 1637, 1604, 1522,
	1443, 1286, 1189, 1121, 1082, 1039, 975
	und 854.
¹H-NMR (CD₃OD):	7,57 (1H), 7,06 (1H), 6,96 (1H), 6,79
	(1H), 6,27 (1H), 5,34 (1H), 4,17 (1H),
	3,73 (1H) und 2,13 (4H).
¹³C-NMR (CD₃OD):	176,00, 167,65, 148,56, 146,08, 145,79,
	126,78, 121,98, 115,46, 114,24, 75,11,
	72,45, 70,96, 70,26, 37,75 und 37,19.
FABMS m/z:	355 (M⁺ + H) und 377 (M⁺ + Na).

Die auf diese Weise bestimmte Struktur zeigt, dass dies Chlorogensäure oder 3-Coffeoylchinasäure ist, Fp 205–206 °C, [α]_D –33,25 (H₂O) (3). Die Chlorogensäure ist auf dem Markt in reiner Form erhältlich. Diese wurde gekauft und mit der aus Piper betel-Blättern isolierten Chlorogensäure verglichen, was klar bestätigte, dass das verfügbare Material Chlorogensäure war.
Eine früher für ein Patent eingereichte Struktur war 3-p-Cumarylchinasäure, die die Zerstörung von CD33⁺-Knochen markzellen, jedoch nicht von CD33^–-Zellen zeigte, und diese ist Chlorogensäure sehr ähnlich. Mit Ausnahme der zusätzlichen Hydroxylgruppe an der C-3-Position des aromatischen Rings in Chlorogensäure sind die anderen Strukturen sehr ähnlich. Daher kann angenommen werden, dass die zusätzliche Aktivität von Chlorogensäure gegenüber der 3-p-Cumarylchinasäure auf dem Vorhandensein einer Hydroxylgruppe an der C-3-Position des aromatischen Rings beruht. Dieser spezifische Unterschied gibt der Chlorogensäure eine breitere und stärkere Aktivität zur Zerstörung von sowohl CD33^–- als auch CD33⁺-Zellen und auch lymphatischen/lymphocytischen Leukämiezellen.
Die Zone Z_A zeigte biologische Aktivität. Sie enthielt vier Peaks, 1, 2, 3 und 4, die R_t 0,65, 1,32, 18 bzw. 2,55 entsprechen. Da die Trennung individueller Peaks in Z_A schwierig wird, konnte die Lage von einem Peak entsprechender Aktivität nicht bestimmt werden.
Beispiel 3
Präparation mononukleärer Zellen von peripherem Blut (PBMC) von Patienten mit myeloischer Leukämie.
Vollblut (jeweils 10 ml) wurde Patienten, bei denen zuvor die Diagnose von myeloischer Leukämie gestellt wurde, entnommen, wobei bei einem Patienten die Diagnose von AML und bei dem anderen die Diagnose von CML bestand. Mononukleäre Zellen wurden durch Ficoll/Hypaque-Dichtegradientenzentrifugation abgetrennt.
Beispiel 4
Kultur der Erythroleukämiezelllinie K562. Diese Zelllinie wurde von der American Type Culture Collection (ATCC), VA, USA, erhalten. Diese Zelllinie ist CD33^–. K562-Zellen wurden in vitro in Medium RPMI-1640, das 10 % hitzeinaktiviertes fetales Kälberserum enthielt, gezüchtet.
Beispiel 5
Kultur der Promonocytenzelllinie U937.
Diese Zelllinie wurde von der American Type Culture Collection (ATCC), VA, USA, erhalten und in vitro wie für die Zelllinie K562 beschrieben gezüchtet. Diese Zelllinie ist CD33⁺.
Beispiel 6
Inkubation von PBMC von Patienten mit myeloischer Leukämie mit Chlorogensäure (CA) in vitro.
PBMC (1 × 10⁵ – 2 × 10⁶/ml) von Patienten mit myeloischer Leukämie wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen von CA 48 h bei 37 °C in 5 % CO₂ inkubiert. Die Zellen wurden dann gewaschen und auf Lebensfähigkeit gezählt.
Beispiel 7
Inkubation der CD33⁺-Zelllinie U937 mit CA.
U937-Zellen (1 × 10⁵ – 2 × 10⁶/ml) wurden mit variierenden Konzentrationen von CA 48 h bei 37 °C in 5 % CO₂ inkubiert. Die Zellen wurden dann gewaschen und auf Lebensfähigkeit gezählt.
Beispiel 8
Inkubation der CD33^–-Zelllinie K562 mit CA.
K562-Zellen (1 × 10⁵ – 2 × 10⁶/ml) wurden mit variierenden Konzentrationen von CA 48 h bei 37 °C in 5 % CO₂ inkubiert. Die Zellen wurden dann gewaschen und auf Lebensfähigkeit gezählt.
Beispiel 9
Kultur der T-Lymphocytenzelllinie Molt-4.
Diese Zelllinie wurde von der American Type Culture Collection (ATCC), VA, USA, erhalten und in vitro wie für die Zelllinie K562 beschrieben gezüchtet.
Beispiel 10
Präparation mononukleärer Zellen von peripherem Blut (PBMC) von normalen Individuen.
Vollblut wurde gewonnen und mononukleäre Zellen wurden durch Ficoll/Hypaque-Dichtegradientenzentrifugation abgetrennt.
Beispiel 11
Analyse der Zellzyklusprogression und Apoptose durch Durchflusscytometrie.
PBMC eines CML-Patienten wurden in RPMI-1640-Medium, das mit 10 % hitzeaktiviertem fetalem Rinderserum ergänzt war, in Gegenwart oder Abwesenheit von CA (100,0 μg/ml) 48 h bei 37 °C in 5 % CO₂ kultiviert. Die Zellen wurden mit 40 % Ethanol fixiert, mit 500 μg/ml Rnase A und dann mit 69 μM Propidiumiodid zu einer Analyse des DNA-Gehalts durch Durchflusscytometrie gemäß der Beschreibung (Mitra et al., Molecular Medicine, 6:527–541, 2000) behandelt.
Ergebnisse der Beispiele 6, 7 und 8
Wie in Tabelle 1 angegeben, wurden PBMC von Patienten mit myeloischer Leukämie, die CD33⁺-Promonocytenzelllinie U937 und die CD33^–-Erythroleukämiezelllinie K562 durch Chlorogensäure zerstört.
Ergebnisse von Beispiel 9 und 10
Wie in Tabelle 2 angegeben, werden die Erythroleukämiezelllinie K562, die Promonocytenzelllinie U937 und Leukämiezellen eines CML-Patienten durch Chlorogensäure zerstört. Die T-Lymphocytenzelllinie Molt-4 erfordert eine höhere Dosis. Im Gegensatz dazu sind die PBMC normaler Spender durch CA tatsächlich unbeeinflusst. Photomikrographien von U937, K562, PBMC eines CML-Patienten, Molt-4 und normalen PBMC nach Kultivieren während 48 h in Gegenwart oder Abwesenheit von DA sind in 4 angegeben. Wir beanspruchten früher, dass 3-o-p-Cumarylchinasäure (PCQ) Anti-myeloische-Leukämieaktivität aufweist (299/NF/2002; 30.05.2002). Wir zeigen hier, dass eine Kombination von Chlorogensäure (CA) und 3-o-p-Cumarylchinasäure mit einem Verhältnis von 1:1 wirksamer als CA oder PCQ allein zur Zerstörung von Leukämiezelllinien oder Leukämiezellen eines Patienten mit myeloischer Leukämie ist, jedoch keine Wirkungen auf PBMC eines normalen Spenders hat (Tabelle 3).
Ergebnisse von Beispiel 11
Eine Zellzyklusanalyse zeigt auf, dass Chlorogensäure mit einer Konzentration von 100,0 μg/ml nach 2-tägiger Kultur Apoptose in Leukämiezellen von CML-Patienten in vitro wegen deren Ansammlung in der S-, G₂- oder M-Phase im Vergleich zu den nur in Medium kultivierten Zellen verursachte (Tabelle 4).
TABELLE 1: Chlorogensäure zerstört Leukämiezellen von Patienten und Leukämiezelllinien in vitro
Anmerkung:

1. PBMC*, mononukleäre Zellen von peripherem Blut
2. Die Zahl der verwendeten Zellen betrug 1 × 10⁵/ml/Vertiefung

TABELLE 2: Wachstumshemmung von Leukämiezelllinien und Leukämiezellen eines CML-Patienten durch CA in vitro
Es ist anzumerken, dass die Zahl der verwendeten Zellen 1× 10⁵ pro ml pro Vertiefung betrug.
TABELLE 3. Eine Kombination von Chlorogensäure (CA) und 3-o-p-Cumarylchinasäure (PCQ) ist ziemlich wirksam zur Zerstörung von Leukämiezelllinien und Leukämiezellen von AML- und CML-Patienten in vitro
Die Zahl der verwendeten Zellen betrug 2 × 10⁵ pro ml pro Vertiefung. Der Prozentsatz der Abtötung von Zellen durch diese Verbindungen ist von der Zahl der pro ml vorhandenen Zellen abhängig.
TABELLE 4. Prozentsatz von Zellen in verschiedenen Phasen des Zellzyklus nach einer Behandlung mit CA während 2 Tagen

Claims

Synergistische pharmazeutische Zusammensetzung für akute und chronische myeloische Leukämie bei Tieren und Menschen, wobei die Zusammensetzung eine wirksame Menge von Chlorogensäure (CA) und 3-o-p-Cumarylchinasäure (PCQ), die aus beliebigen Pflanzenteilen von Piper betel oder einer beliebigen anderen natürlichen oder synthetischen Quelle isoliert wurden, und pharmazeutisch akzeptable Additive umfasst.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei das Additiv aus einer Gruppe, die aus Nährstoffen, wie Proteinen, Kohlenhydraten, Zuckern, Talkum, Magnesiumstearat, Cellulose, Calciumcarbonat, Stärke-Gelatinepaste, und/oder pharmazeutisch akzeptablen Trägern, Streckmitteln, Verdünnungsmitteln oder Lösemitteln besteht, ausgewählt ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei das Verhältnis der in der Zusammensetzung vorhandenen CA und PCQ im Bereich von 1:0 bis 1:10 liegt, was zur Behandlung von soliden Tumoren einschließlich Lymphomen wirksam ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung auf oralem, intravenösem, intramuskulärem oder subkutanem Weg zu verabreichen ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, die in einer Dosishöhe im Bereich zwischen 1 und 50 mg pro kg Körpergewicht/Tag während mindestens eines Zeitraums von 4 Wochen zu verabreichen ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, die während eines Zeitraums im Bereich zwischen 4 Wochen und 12 Wochen zu verabreichen ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die Wachstumshemmung von Leukämiezelllinien bei 2 × 10⁶/ml/Vertiefung des Zelltyps K562 bis zu 20 % bei einer Dosismenge von 25 μg/ml CA beträgt.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die Wachstumshemmung von Leukämiezelllinien bei 2 × 10⁶/ml/Vertiefung des Zelltyps K562 bis zu 4 % bei einer Dosismenge von 25 μg/ml PCQ beträgt.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die Wachstumshemmung von Leukämiezelllinien bei 2 × 10⁶/ml/Vertiefung des Zelltyps K562 bis zu 44 % bei einer Dosismenge, die 25 μg/ml von jeweils CA und PCQ enthält, beträgt.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die Wachstumshemmung von Leukämiezelllinien bei 2 × 10⁶/ml/Vertiefung des Zelltyps U937 bis zu 16,67 % bei einer Dosismenge von 25 μg/ml CA beträgt.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die Wachstumshemmung von Leukämiezelllinien bei 2 × 10⁶/ml/Vertiefung des Zelltyps U937 bis zu 2,08 % bei einer Dosismenge von 25 μg/ml PCQ beträgt.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die Wachstumshemmung von Leukämiezelllinien bei 2 × 10⁶/ml/Vertiefung des Zelltyps U937 bis zu 50 % bei einer Dosismenge, die 25 μg/ml von jeweils CA und PCQ enthält, beträgt.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die Wachstumshemmung von Leukämiezelllinien bei 2 × 10⁶/ml/Vertiefung des Zelltyps CML-Leukämiezellen bis zu 2,38 % bei einer Dosismenge von 25 μg/ml CA beträgt.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die Wachstumshemmung von Leukämiezelllinien bei 2 × 10⁶/ml/Vertiefung des Zelltyps CML-Leukämiezellen bis zu 2,38 % bei einer Dosismenge von 25 μg/ml PCQ beträgt.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die Wachstumshemmung von Leukämiezelllinien bei 2 × 10⁶/ml/Vertiefung des Zelltyps CML-Leukämiezellen bis zu 20,3 % bei einer Dosismenge, die 25 μg/ml von jeweils CA und PCQ enthält, beträgt.
Verwendung einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von akuter und chronischer myeloischer Leukämie (AML & CML) und lymphatischer/lympocytischer Leukämie durch Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die eine wirksame Menge von Chlorogensäure (CA) und/oder 3-o-p-Cumarylchinasäure (PCQ), die aus beliebigen Pflanzenteilen von Piper betel oder einer beliebigen anderen Quelle isoliert wurden, und/oder in Kombination mit pharmazeutisch akzeptablen Additiven umfasst.
Verwendung gemäß Anspruch 16, wobei CA und PCQ beide aus beliebigen Pflanzenteilen von Piper betel isoliert oder synthetisch hergestellt sind.
Verwendung gemäß Anspruch 16, wobei das Subjekt aus einem Säuger ausgewählt und vorzugsweise ein Mensch ist.
Verwendung gemäß Anspruch 16, wobei das Additiv aus einer Gruppe, die aus Nährstoffen, wie Proteinen, Kohlenhydraten, Zuckern, Talkum, Magnesiumstearat, Cellulose, Calciumcarbonat, Stärke-Gelatinepaste, und/oder pharmazeutisch akzeptablen Trägern, Streckmitteln, Verdünnungsmitteln oder Lösemitteln besteht, ausgewählt ist.
Verwendung gemäß Anspruch 16, wobei das Verhältnis der in der Zusammensetzung vorhandenen CA und PCQ, das im Bereich von 1:0 bis 1:10 liegt, zur Behandlung solider Tumore einschließlich Lymphomen wirksam ist.
Verwendung gemäß Anspruch 16, wobei die Zusammensetzung auf oralem, intravenösem, intramuskulärem oder subkutanem Weg zu verabreichen ist.
Verwendung gemäß Anspruch 16, wobei die Zusammensetzung in Dosismengen zwischen 1 und 50 mg pro kg Körpergewicht mindestens einmal täglich über einen Zeitraum von 4 Wochen zu verabreichen ist.
Verwendung gemäß Anspruch 16, wobei die Zusammensetzung über einen Zeitraum von 4 Wochen und bis zu 3 Monaten zu verabreichen ist.
Verwendung gemäß Anspruch 16, wobei die Wachstumshemmung von Leukämiezelllinien bei 2 × 10⁶/ml/Vertiefung des Zelltyps K562 bis zu 20 % bei einer Dosismenge von 25 μg/ml CA beträgt.
Verwendung gemäß Anspruch 16, wobei die Wachstumshemmung von Leukämiezelllinien bei 2 × 10⁶/ml/Vertiefung des Zelltyps K562 bis zu 4 % bei einer Dosismenge von 25 μg/ml PCQ beträgt.
Verwendung gemäß Anspruch 16, wobei die Wachstumshemmung von Leukämiezelllinien bei 2 × 10⁶/ml/Vertiefung des Zelltyps K562 bis zu 44 % bei einer Dosismenge, die 25 μg/ml von jeweils CA und PCQ enthält, beträgt.
Verwendung gemäß Anspruch 16, wobei die Wachstumshemmung von Leukämiezelllinien bei 2 × 10⁶/ml/Vertiefung des Zelltyps U937 bis zu 16,67 % bei einer Dosismenge von 25 μg/ml CA beträgt.
Verwendung gemäß Anspruch 16, wobei die Wachstumshemmung von Leukämiezelllinien bei 2 × 10⁶/ml/Vertiefung des Zelltyps U937 bis zu 2,08 % bei einer Dosismenge von 25 μg/ml PCQ beträgt.
Verwendung gemäß Anspruch 16, wobei die Wachstumshemmung von Leukämiezelllinien bei 2 × 10⁶/ml/Vertiefung des Zelltyps U937 bis zu 50 % bei einer Dosismenge, die 25 μg/ml von jeweils CA und PCQ enthält, beträgt.
Verwendung gemäß Anspruch 16, wobei die Wachstumshemmung von Leukämiezelllinien bei 2 × 10⁶/ml/Vertiefung des Zelltyps CML-Leukämiezellen bis zu 2,38 % bei einer Dosismenge von 25 μg/ml CA beträgt.
Verwendung gemäß Anspruch 16, wobei die Wachstumshemmung von Leukämiezelllinien bei 2 × 10⁶/ml/Vertiefung des Zelltyps CML-Leukämiezellen bis zu 2,38 % bei einer Dosismenge von 25 μg/ml PCQ beträgt.
Verwendung gemäß Anspruch 17, wobei die Wachstumshemmung von Leukämiezelllinien bei 2 × 10⁶/ml/Vertiefung des Zelltyps CML-Leukämiezellen bis zu 20,3 % bei einer Dosismenge, die 25 μg/ml von jeweils CA und PCQ enthält, beträgt.