DE69837551T2

DE69837551T2 - Zusammensetzung und verfahren zur behandlung der alzheimer'schen krankheit und anderen amyloidosen

Info

Publication number: DE69837551T2
Application number: DE69837551T
Authority: DE
Inventors: Gerardo Seattle CASTILLO; Alan D. Lynnwood SNOW
Original assignee: University of Washington
Current assignee: University of Washington
Priority date: 1997-05-15
Filing date: 1998-05-15
Publication date: 2007-12-20
Anticipated expiration: 2018-05-16
Also published as: ES2285772T3; CA2289531C; DE69837551D1; JP4386470B2; JP2002508752A; US7029710B2; US20040076698A1; EP1019044B1; EP1019044A1; US20040086585A1; EP1019044A4; US20080206162A1; US20010055630A1; AU7580098A; ATE359071T1; US6939570B1; DK1019044T3; CA2289531A1; US6607758B2; US7754250B2

Description

Technisches Gebiet
Die Erfindung betrifft die Verwendung von Pflanzenmaterial von einer Pflanze der Gattung Uncaria bei der Herstellung eines Medikamentes für das Behandeln der Alzheimer Krankheit und anderen Amyloidosen und Verfahren zum Isolieren von pharmakologischen Wirkstoffen aus Pflanzenmaterial; insbesondere betrifft die Erfindung die Verwendung von Pflanzenmaterial von einer Pflanze der Gattung Uncaria bei der Herstellung eines Medikamentes für die therapeutische Intervention in der Alzheimer Krankheit und anderen Amyloidosen und Verfahren zum Isolieren und Identifizieren von amyloiden Bestandteilen innerhalb von Pflanzenmaterial.
Hintergrund der Erfindung
Die Alzheimer Krankheit ist durch die Akkumulation eines 39-43 Aminosäurepeptids mit der Bezeichnung Beta-Amyloidprotein oder Aβ, in einer fibrillären Form charakterisiert, welches als extrazelluläre Amyloidplaques und als Amyloid innerhalb der Wände von cerebralen Blutgefäßen existiert. Es wird vermutet, dass fibrilläre Aβ Amyloidablagerungen in Alzheimer Krankheit für den Patienten schädlich sind und eventuell zu Toxizität und neuronalem Zelltod führt, charakteristische Kennzeichen der Alzheimer Krankheit. Mehrere Hinweise implizieren, dass Amyloid ein Hauptursachefaktor der Pathogenese der Alzheimer Krankheit ist.
Eine Vielfalt von anderen menschlichen Krankheiten zeigen auch eine Amyloidablagerung und umfassen typischerweise systemische Organe (d.h. Organe oder Gewebe die außerhalb des Zentralnervensystems liegen), wobei die Amyloidakkumulation zur Organfehlfunktion oder Versagen führt. Bei der Alzheimer Krankheit und „systemischen" Amyloiderkrankungen gibt es derzeit keine Heilung oder wirksame Behandlung, und der Patient stirbt üblicherweise innerhalb von 3 bis 10 Jahren nach dem Ausbruch der Krankheit.
Viel Aufwand wurde bei der Alzheimer Krankheit betrieben, jedoch ist wenig über Verbindungen oder Wirkstoffe für therapeutische Behandlungspläne herkömmlich bekannt, um die Amyloidbildung, Ablagerung, Akkumulation und/oder Persistenz aufzuhalten, die in der Alzheimer Krankheit und anderen Amyloidosen auftritt.
Neue Verbindungen oder Wirkstoffe für therapeutische Behandlungspläne, um die Amyloidbildung, Ablagerung, Akkumulation und/oder Persistenz aufzuhalten oder umzukehren, die bei der Alzheimer Krankheit und anderen Amyloidosen auftritt, werden deshalb verzweifelt benötigt.
Offenbarung der Erfindung
In einem ersten Aspekt bietet die Erfindung die Verwendung von Pflanzenmaterial von einer Pflanze der Gattung Uncaria bei der Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung einer Amyloiderkrankung.
In einem zweiten Aspekt bietet die Erfindung ein Verfahren zum Isolieren von Amyloid inhibierenden Bestandteilen innerhalb des Pflanzenmaterials von Uncaria tomentosa, wobei das Verfahren die folgenden Schritte aufweist: a) Extrahieren des Pflanzenmaterials mit einem organischen Lösungsmittel, b) Konzentrieren des Extrakts, c) Entfernen von unlöslichen Materialien, d) Präzipitieren der Amyloid-inhibierenden Bestandteile mit organischen Lösungsmitteln, e) Gewinnung und Wiederauflösen der Amyloid-inhibierenden Bestandteile, die mit dem organischen Lösungsmittel erhalten wurden, und f) Injizieren und Trennen durch HPLC.
Bestimmte Ausführungsformen der Erfindung sind in den abhängigen Ansprüchen dargelegt.
Ein primäres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, neue Medikamente für die Behandlung von Amyloiderkrankungen zu etablieren. Zu Amyloiderkrankungen zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, das Alzheimer-Krankheit assoziierte Amyloid, Down-Syndrom und vererbte cerebrale Hämorrhagie mit Amyloidose-Dutch-Typ (wobei das spezifische Amyloid als beta-Amyloidprotein oder Aβ bezeichnet wird), das mit chronischer Entzündung assoziierte Amyloid, verschiedene Formen von Malignität und familiäres Mittelmeerfieber (wobei das spezifische Amyloid als AA Amyloid oder Entzündungs-assoziierte Amyloidose bezeichnet wird), das mit multiplem Myelom und anderen B-Zell Dyskrasien assoziierte Amyloid (wobei das spezifische Amyloid als AL Amyloid bezeichnet wird), das mit Typ II Diabetes assoziierte Amyloid (wobei das spezifische Amyloid als Amylin oder Insel-Amyloid bezeichnet wird), das mit Prionenerkrankungen assoziierte Amyloid, einschließlich Creutzfeldt-Jakob-Krankheit, Gerstmann-Straussler Syndrom, Kuru und tierischem Scrapie (wobei das spezifische Amyloid als PrP Amyloid bezeichnet wird), das mit Langzeithämodialyse und Karpaltunnelsyndrom assoziierte Amyloid (wobei das spezifische Amyloid als Beta₂-Mikroglobulin-Amyloid bezeichnet wird), das mit senilem Herzamyloid und familiärer amyloidotischer Polyneuropathie assoziierte Amyloid (wobei das spezifische Amyloid als Transthyretin oder Präalbumin bezeichnet wird), und das mit endokrinen Tumoren, wie medullärem Karzinom der Schilddrüse assoziierte Amyloid (wobei das spezifische Amyloid als Varianten von Procalcitonin bezeichnet wird).
Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, die Innenrinde und/oder Wurzeln von Uncaria tomentosa (auch als Una de Gato oder Katzendorn genannt) bei der Herstellung von einem Medikament für die Behandlung von Amyloidbildung, Ablagerung, Akkumulation und/oder Persistenz in Alzheimer Krankheit, Typ II Diabetes und anderen Amyloidosen zu verwenden. Uncaria tomentosa oder Katzendorn wird, ohne darauf beschränkt zu sein, auch als Paraguayo, Garaboto, Garbato casha, Tambor huasca, Una de gavilan, Hawk's claw, Nail of cat und Nail of cat Schuler bezeichnet.
Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von Pflanzenmaterial von einer Pflanze der Gattung Uncaria bei der Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung von Amyloidbildung, Ablagerung, Akkumulation und/oder Persistenz in Alzheimer Krankheit, Typ II Diabetes und anderen Amyloidosen.
Ein anderes Ziel des vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von Extrakten und/oder Derivaten davon von Pflanzenmaterial betreffend die verschiedenen Uncaria Spezies, welche, ohne darauf beschränkt zu sein, Uncaria tomentosa, Uncaria attenuata, Uncaria elliptica, Uncaria guianensis, Uncaria pteropoda, Uncaria bernaysli, Uncaria ferra DC, Uncaria kawakamii, Uncaria rhynocophylla, Uncaria calophylla, Uncaria gambir, und Uncaria orientalis aufweisen können.
Eine andere Ausführungsform des ersten Aspektes der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von kommerziell erhältlichen Pillen, Tabletten, Caplets, Weich- und Hartgelatinekapseln, Pastillen, Päckchen, Kapseln aus Stärkemasse, Vegicaps, flüssige Tropfen, Elixiere, Suspensionen, Emulsionen, Lösungen, Sirupe, Teebeutel, Aerosole (wie ein Feststoff oder in einem flüssigen Medium), Suppositorien, sterile injizierbare Lösungen, steril verpackte Pulver, Rindenbündel und/oder Rindenpulver, welche Uncaria tomentosa enthalten bei der Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung einer Amyloiderkrankung.
Eine andere Ausführungsform des ersten Aspektes der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von Uncaria tomentosa und/oder der Oxindol-Alkaloide, Quinovinsäure-Glycoside, Proanthocyanidine, Polyphenole, Triterpine, pflanzliche Sterole, beta-Sitosterol, Stigmasterol, und Campesterol, oder Phytosterole, die innerhalb Uncaria tomentosa enthalten sind, bei der Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung einer Amyloiderkrankung.
Eine noch andere Ausführungsform des ersten Aspektes der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von einer oder mehreren der Phytochemikalien, die innerhalb Uncaria tomentosa enthalten sind, oder dessen einzelnen Bestandteile bei der Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung einer Amyloiderkrankung.
Es wird angenommen, dass diese Bestandteile ohne darauf beschränkt zu sein, 3-Beta, 6-Beta, 19-Alpha-Trihydroxy-urs-12-en-28-oinsäure, 5-Alphacarboxystrictosidin, Alloisopteropodin, Allopteropodin, Angustin, Dihydrocorynanthein, Dihydrocorynanthein-n-oxid, Hirsutin, Hirsutin-n-oxid, Isomitraphyllin, Isopteropodin, Isorhynchophyllin, Isorhynchophyllin-n-oxid, Isorotundifolin, Mitraphyllin, Oleanolsäure, Pteropodin, Quinovinsäure-3beta-o-(beta-d-glucopyranosyl-(1→3)beta-d-fucopyranosyl-(27→1)-beta-d-glucopyranosylester, Quinovinsäure-3-beta-o-beta-d-fucopyranosid, Quinovinsäure-3 beta-o-beta-d-fucopyranosyl-(27→1)-beta-d-glucopyranosylester, Quinovinsäure-3beta-o-beta-d-quinovopyranosid, Rhynchophyllin, Rotundifolin, Speciophyllin, Uncarin, Uncarin-f, und Ursolsäure enthalten.
Eine noch andere Ausführungsform des ersten Aspektes der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von anderen bekannten Phytochemikalien, die zuvor von Keplinger, für das Stimulieren des menschlichen Immunsystems möglicherweise als nützlich identifiziert wurden. Diese umfassen Alkaloid, Phenol, Chinon und Terpen-basierte Verbindungen, die im US Patent Nr. 4.844.901 und US Patent Nr. 4.940.725 durch Keplinger et al. offenbart sind, und enthalten, ohne darauf beschränkt zu sein, tetra- und pentacyclische Oxindolalkaloide, Alkaloide wie Allosiopteropodin, Isomer A mit der Formel C₂₁H₂₄O₄N₂, Allop-pteropodin, Isomer B mit der Formel C₂₁H₂₄O₄N₂, normales Isomitraphyllin, Isomer A mit der Formel C₂₁H₂₄O₄N₂, normales Isorhychophyllin, Isomer A mit der Formel C₂₂H₂₈O₄N₂, normales Mitraphyllin, Isomer B mit der Formel C₂₁H₂₄O₄N₂, normales Rhynchophyllin Isomer B mit der Formel C₂₂H₂₈O₄N₂ und das Oxindolalkaloid Speciophyllin, Cepharanthin (Bisbenzylisochinolinalkaloid), Berbamin (Bisbenzylisochinolin-alkaloid), Matrin (Lupinalkaloid), Pilocarpin (Imidazolalkaloid), Phenole und Chinone wie 2,3-Dihydroxybenzoesäure, Ferulsäure, Anethol, Cleistanthin (Lignan), Curculigosid und Curculigosid B (Phenolglucoside) Urunshiol (Pyrocatechin-Derivate mit C₁₅/C₁₇-Seitenketten), Alpha-Tocopherol (Vitamin E), Ubichon (hauptsächlich Q7, Q8), Maesanin (Chinon mit C₁₅ Seitenkette), Terpene wie Zexbrevin A/B (Sesquiter-penelaceton des Ceramacran-Typs), 12-O-Tetradeoanoyl-phorbol-13-acetat, TPA (tetracyclisches Diterpen), Saponin mit Aglycon-Oleonsäure (pentacyclisches Triterpen), und Cynonchosid (Steroidglycosid).
Der zweite Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Verfahren zum Isolieren der aktiven Inhaltsstoffe, die innerhalb von Uncaria tomentosa vorhanden sind, für die Verwendung als potente Wirkstoffe, welche die Amyloidbildung, Amyloidablagerung, Amyloidakkumulation, Amyloidpersistenz, Amyloidprotein-Amyloidprotein-Interaktionen inhibieren und/oder eine Auflösung/Auftrennung von vorgeformten oder vorabgelagerten Amyloidfibrillen in Alzheimer Krankheit, Typ II Diabetes und anderen Amyloidosen. Verfahren zum Isolieren der aktiven Inhaltsstoffe innerhalb Uncaria tomentosa umfassen die Anwendung von einigen Standardtechniken, die Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Silica-beschichteten Platten, und Trennung und Isolation unter Verwendung der Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC). Unbekannte aktive Inhaltsstoffe innerhalb von Uncaria tomentosa, von denen gefunden wurde, potente Inhibitoren der Amyloidbildung, Amyloidablagerung, Amyloidakkumulation, Amyloidpersistenz, Amyloidprotein-Amyloidprotein-Interaktionen zu sein und/oder eine Auflösung/Auftrennung von vorgeformten oder vorabgelagerten Amyloidfibrillen in Alzheimer Krankheit, Typ II Diabetes und anderen Amyloidosen bewirken, werden durch erneutes Untersuchen von individuellen Banden oder Fraktionen (getrennt durch Dünnschichtchromatographie, Säulenchromatographie und/oder HPLC) unter Verwendung spezifischer Untersuchungstests, wie in den Beispielen der vorliegenden Erfindung beschrieben ist, identifiziert. Eine ausreichende Isolation dieser aktiven Inhaltsstoffe, die innerhalb individueller Banden und/oder Fraktionen enthalten sind, können dann für spezifische Analyse ausgesendet werden, welche, ohne darauf beschränkt zu sein, Scanningelektronenmikroskop, welches mit einem energiedispersiven Röntgenanalysator ausgestattet ist, um einige Elemente, die in jeder Probe vorhanden sind, zu detektieren und räumlich zu kartieren, Elementaranalyse durch Verbrennung, um den relativen % an Kohlenstoff, Wasserstoff und Stickstoff zu bestimmen, hochauflösende Massenspektroskopie, um das Molekulargewicht und die elementare Zusammensetzung zu bestimmen, Fourier-transformierte Infrarotspektroskopie, um funktionelle Gruppe zu bestimmen und um Vergleiche zu den Spektra der bekannten Verbindungen anzustellen, dynamische Differenzkalorimetrie, um den Schmelzpunkt zu bestimmen, Atomabsorption, Gelchromatographie, Hochdruckflüssigkeitschromatographie, Proton- und C¹³ Kernspinresonanzspektroskopie für Materialcharakterisierung und um Informationen bezüglich der Position der Atome in Bezug zueinander bereitzustellen, und UV/VIS Spektroskopie. Es wird erwartet, dass zusätzliche Techniken als Teil der weiteren Isolation von potenten aktiven Inhaltstoffen innerhalb von Uncaria tomentosa entwickelt werden.
Uncaria tomentosa und/oder ihre Inhaltsstoffe (ungeachtet der kommerziellen Quelle und ungeachtet der Endform für den Konsum durch Menschen, d.h. Pillen, Tabletten, Dragees, Weich- und Hartgelantinekapseln, Pastillen, Päckchen, Kapsel aus Stärkemasse, Vegicaps, flüssige Tröpfchen, Elixiere, Suspensionen, Emulsionen, Lösungen, Sirupe, Teebeutel, Aerosole (als ein Feststoff oder in einem flüssigen Medium), Suppositorien, sterile injizierbare Lösungen, steril verpackte Pulver, Rindenbündel und/oder Rindenpulver) können für die Inhibierung der Amyloidbildung, Ablagerung, Akkumulation und/oder Persistenz verwendet werden, ungeachtet der klinischen Umgebung.
Zusammensetzungen und Verfahren können das Verabreichen einer therapeutischen Dosis von Uncaria tomentosa (oder ihrer aktiven Inhaltsstoffe) an ein Lebewesen einschließen, welche die Amyloidablagerung inhibieren. Dementsprechend sind die Zusammensetzungen und Verfahren für das Inhibieren der Amyloidose in Krankheiten nützlich, in welchen die Amyloidablagerung stattfindet. Die Verbindungen können therapeutisch benutzt werden, um Amyloidose zu behandeln, oder können in einem Lebewesen, welches für die Amyloidose anfällig ist, prophylaktisch verwendet werden. Die Verfahren basieren, zumindest teilweise, auf der direkten Inhibierung der Amyloidfibrillenbildung, Inhibierung des Amyloidfibrillenwachstums, und/oder dem Hervorrufen der Auflösung/Auftrennung der vorgeformten Amyloidfibrillen.
Pharmazeutische Zusammensetzungen können auch für das Behandeln der Amyloidose vorgesehen sein. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen umfassen eine therapeutische Verbindung in einer Menge, die wirksam ist, die Amyloidablagerung zu inhibieren und ein pharmazeutisch akzeptables Vehikel.
Irgendeine und alle synthetisch hergestellten Verbindungen, die funktionell ähnlich zu Uncaria tomentosa sind, können in therapeutischen Anwendungen verwendet werden, und/oder Amyloid inhibierende Inhaltsstoffe von Uncaria tomentosa für die Verwendung als Wirkstoffe, um die Amyloidbildung, Amyloidablagerung, Amyloidakkumulation, Amyloidpersistenz, Amyloidprotein-Amyloidprotein-Interaktionen zu inhibieren, und/oder eine Auflösung/Auftrennung von vorgeformten oder vorabgelagerten Amyloidfibrillen in Alzheimer Krankheit; Typ II Diabetes und anderen Amyloidosen bewirken.
Diese und solche andere Ziele der Erfindung, wie aus der Offenbarung unten offensichtlich werden, werden durch die hierin offenbarte Erfindung erfüllt.
Anwendung der Erfindung auf diese Bedarfe ist besonders vorteilhaft, insofern als die Erfindung das einzige System ist, das effektiv die Verwendung von Extrakten von der Innenrinde und Wurzelteilen von Uncaria tomentosa vorsieht, und die Verwendung der Inhaltsstoffe, die innerhalb der verschiedenen kommerziellen Zubereitungen von Uncaria tomentosa enthalten sind, um menschlichen Patienten mit Alzheimer Krankheit und anderen Amyloidosen zu nutzen, und zwar aufgrund der neu entdeckten Fähigkeit von Uncaria tomentosa, die Amyloidfibrillenbildung zu inhibieren, Amyloidfibrillenwachstum zu inhibieren, Amyloid-Proteoglycan-Interaktionen zu inhibieren, Amyloid-Glycosaminoglycan-Interaktionen zu inhibieren, und die Auflösung und/oder Auftrennung von Amyloidfibrillen zu bewirken.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Identifikation und die überraschende Entdeckung, dass die Innenrinde und Wurzelteile von Uncaria tomentosa, auch als Una de Gato (oder Katzendorn) bekannt, als ein Inhibitor der Amyloidbildung und Wachstum in der Alzheimer Krankheit wirkt. Zusätzlich weist Uncaria tomentosa auch die Fähigkeit auf, die Amyloidprotein-Proteoglycan (PG)/Glycosaminoglycan (GAG) Interaktionen zu inhibieren, von welchen angenommen wird, dass die für die Bildung und Persistenz von allen Amyloidablagerungen in Geweben wichtig sind. Ferner weist Uncaria tomentosa die Fähigkeit auf, die vorgeformten Amyloidfibrillen der Alzheimer und Typ II Diabetes Typen aufzulösen/aufzutrennen, was darauf hindeutet, dass dieser Wirkstoff für Patienten in späteren Stadien von sowohl Alzheimer Krankheit, Typ II Diabetes als auch anderen Amyloidosen nützlich sein kann. Es wurde gefunden, das Uncaria tomentosa, das aus unterschiedlichen Quellen (Extrakte isoliert aus Gelatine-beschichteten Kapseln, Dragees oder flüssige Form) extrahiert sind, als potente Inhibitoren der Amyloidfibrillogenese in der Alzheimer Krankheit dienen.
Während die Ergebnisse mit der Spezies tomentosa beispielhaft erläutert sind, wird vermutet, dass andere Uncaria Spezies ähnliche Wirkungen besitzen.
Kommerziell erhältliches Glucosamin (Hydrochlorid-Salz oder das Sulfatsalz), welches Uncaria tomentosa enthielt, bewirkte eine markant signifikante Inhibierung der Aβ Amyloidfibrillenbildung, wie durch eine Thioflavin T Fluorometrie-Untersuchung bestimmt wurde. Diese inhibierende Wirkung wurde der Gegenwart von Uncaria tomentosa (und nicht infolge der Gegenwart von Glucosaminhydrochlorid Salz oder dem Glucosaminsulfatsalz) zugeschrieben, da reines Uncaria tomentosa (nicht jedoch reines Glucosaminhydrochloridsalz oder Glucosaminsulfatsalz), das von unterschiedlichen kommerziellen Quellen stammt, potente Inhibitoren der Amyloidfibrillenbildung waren. Uncaria tomentosa (ohne andere Zusätze), das von unterschiedlichen kommerziellen Quellen erhalten wurde, inhibierte Aβ Amyloidfibrillogenese in einer dosisabhängigen Art und Weise. Uncaria tomentosa inhibierte ebenfalls Aβ-Aβ-Interaktionen in Alzheimer, wie unter Verwendung einer Festphasen-Bindungsuntersuchung bestimmt wurde, was demonstriert, dass Uncaria tomentosa zusätzlich ein effektiver Inhibitor des Amyloidfibrillenwachstums in der Alzheimer-Krankheit ist. Ferner war Uncaria tomentosa in der dosisabhängigen Inhibierung von Aβ-Proteoglycan/Glycosaminoglycan (PG/GAG) Interaktionen (ein wichtiges therapeutisches Ziel für alle Amyloidosen) wirksam, wie unter Verwendung einer Festphasen Bindungsimmununtersuchung bestimmt wurde. Uncaria tomentosa, das von unterschiedlichen kommerziellen Quellen stammt, war ebenfalls ein potenter auflösender/inhibierender Wirkstoff von vorgeformten Aβ (1-40) oder Aβ (1-42) enthaltende Amyloidfibrillen, wie unter Verwendung von Thioflavin T Fluorometrie und Kongorot-Färbungsuntersuchung bestimmt wurde. Dieser letztere Effekt fand in einer dosisabhängigen Art und Weise statt, und bewirkte eine signifikante (p < 0,001) 70% Auflösung innerhalb einer Inkubationsperiode von 2 Stunden. Zusätzlich war Uncaria tomentosa ein potentes Auflösungsmittel von Insel-Amyloidfibrillen (d.h. Amylin), und bewirkte eine 72% Auflösung innerhalb einer von Inkubationsperiode von 2 Stunden und eine 80% Auflösung nach 4 Tagen. Uncaria tomentosa, welches in allen der oben beschriebenen Studien wirksam war, wurde von dem Uncaria tomentosa Extrakt abgeleitet, der von Pillen, Tabletten, oder flüssiger Form erhalten wurde, und alle waren zurzeit für die orale Verwendung in Menschen erhältlich. Deshalb beansprucht die vorliegende Erfindung die Verwendung von Uncaria tomentosa (in einer Pille, Tablette oder flüssigen Form) und Derivate davon von unterschiedlichen kommerziellen Quellen für die Behanldung von Amyloidose in Alzheimer Krankheit, Typ II Diabetes und anderen Amyloidosen. Ebenfalls offenbart sind Verfahren zum Isolieren, um die Schlüssel Amyloid inhibierenden Inhaltsstoffe innerhalb des Pflanzenmaterials zu identifizieren und zu reinigen. Es wird erwartet, dass die Identifikation der „aktiven" Amyloid inhibierenden Bestandteile innerhalb des extrahierten Pflanzenmaterials zu einem neuen Arzneimitteldesign für Anti-Amyloidtherapeutika der Zukunft führt. Es wird erwartet, dass die derzeitige Verwendung von Uncaria tomentosa und ihren Inhaltsstoffen, die innerhalb unterschiedlichen kommerziellen Zubereitungen enthalten sind, menschlichen Patienten in allen Stadien der Alzheimer Krankheit nutzen, und zwar aufgrund der inhärenten Fähigkeit von Uncaria tomentosa, die Aβ Amyloidfibrillenbildung (frühes bis mittleres Stadium der Alzheimer Krankheit) zu inhibieren, Amyloidfibrillenwachstum (frühes bis mittleres Stadium der Alzheimer Krankheit) zu inhibieren, Amyloid-PG/GAG-Interaktionen (alle Stadien der Alzheimer Krankheit) zu inhibieren und die Auflösung/Zersetzung von vorgeformten Amyloidfibrillen (mittlere bis späte Stadien der Alzheimer Krankheit) zu bewirken. Ähnlicheweise wird erwartet, dass Uncaria tomentosa Patienten mit unterschiedlichen systemischen Amyloiderkrankungen wie Typ II Diabetes nutzt, ungeachtet des Stadiums der Amyloidakkumulation und des eingebundenen Organs (oder Gewebes).
In dem zweiten Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zum Isolieren vorgesehen, um die Amyloid inhibierenden Inhaltsstoffe aus Uncaria tomentosa und/oder Extrakte davon zu reinigen und identifizieren. In einem solchen Verfahren wird ein Extrakt aus kommerziell erhältlichen Pillen, Tabletten, Dragees, Weich- und Hartgelatinekapseln, Pastillen, Päckchen, Kapseln aus Stärkemasse, Vegicaps, flüssige Tropfen, Elixiere, Suspensionen, Emulsionen, Lösungen, Sirupe, Teebeutel, Aerosole (als ein Feststoff oder in einem flüssigen Medium), Suppositorien, sterile injizierbare Lösungen, steril verpackte Pulver, Rindenbündel und/oder Rindenpulver unter Verwendung des Verfahrens erhalten, welches einige oder alle der folgenden Schritte umfasst:
a) Extraktion aus Uncaria tomentosa ungeachtet der Form, wie oben beschrieben, unter Verwendung eines organischen Lösungsmittels wie Propanol, b) Konzentration des Extraktes unter Verwendung eines Verfahrens wie Rotationsverdampfung, Lyophilisation oder Präzipitation, c) Zentrifugation des Extraktes, um unlösliche Materialien zu entfernen, d) Rezentrifugation des Überstandes, um weiteres unlösliches Material zu entfernen, e) Präzipitation der aktiven Inhaltsstoffe unter Verwendung eines organischen Lösungsmittel wie Petrolether gefolgt von Zentrifugation, f) erneutes Auflösen des Pellets, welches in einem organischen Lösungsmittel wie Propanol erhalten wurde, g) Auftragen auf eine Silica-Säule, die mit Propanol/10% Essigsäure äquilibriert ist und Eluieren mit demgleichen Lösungsmittel, h) Sammlen der sich am schnellsten bewegenden Fraktion (orange/braun-gelb gefärbte Fraktion) wie durch Sicht oder durch Überwachen bei 490 nm bestimmt wurde, i) Präzipitation der aktiven Verbindungen unter Verwendung eines organischen Lösungsmittels wie Petrolether, gefolgt von Zentrifugation, j) erneutes Auflösen des Pellets, das in Acetonitril/Wasser/Essigsäure erhalten wurde, und k) Injizieren und Trennung durch HPLC, l) Identifzieren der Amyloid inhibierenden Inhaltsstoffe durch Untersuchen in relevanten in vitro und in vivo Untersuchungen, und m) Aussenden für Strukturanalyse und elementare Zusammensetzung, wie hierin beschrieben ist.
Diese und andere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden besser verstanden, wenn die folgende detaillierte Beschreibung der Erfindung im Zusammenhang mit den beigefügten Figuren gelesen wird.
Ein pharmazeutischer Wirkstoff ist für das Behandeln einer Amyloiderkrankung in einem Patienten offenbart, wobei der pharmakologische Wirkstoff eine therapeutisch wirksame Menge an Pflanzenmaterial von einer Pflanze der Gattung Uncaria aufweist. Der pharmakologische Wirkstoff ist vorzugsweise von einer Pflanze der Gattung Uncaria, Spezies tomentosa. Der pharmakologische Wirkstoff ist vorzugsweise ein Extrakt, der aus Uncaria tomentosa erhalten wird, der Extrakt stammt von der Innenrinde oder dem Wurzelgewebe von Uncaria tomentosa, und wird vorteilhafterweise von einigen kommerziell erhältlichen Quellen genommen, wie Pillen, Tabletten, Dragees, Weich- und Hartgelatinekapseln, Pastillen, Päckchen, Kapseln aus Stärkemasse, Vegicaps, flüssige Tröpfchen, Elixiere, Suspensionen, Emulsionen, Lösungen, Sirupe, Teebeutel, Aerosole (als ein Feststoff oder in einem flüssigen Medium), Suppositorien, sterile injizierbare Lösungen, steril verpackte Pulver, Rindenbündel oder Rindenpulver.
In bevorzugten Ausführungsformen ist der pharmakologische Wirkstoff ein Amyloid inhibierender Inhaltsstoff, der aus der Gruppe bestehend aus aus Oxindol-Alkaloide, Quinovinsäure-Glycoside, Proanthocyanidine, Polyphenole, Triterpine, pflanzliche Sterole, beta-Sitosterol, Stigmasterol, Campesterol, Phytosterole, 3-Beta, 6-Beta, 19-Alpha-Trihydroxy-urs-12-en-28-oinsäure, 5-Alpha-Carboxystrictosidin, Alloisopteropodin, Allopteropodin, Angustin, Dihydrocorynanthein, Dihydrocorynanthein-n-oxid, Hirsutin, Hirsutin-n-oxid, Isomitraphyllin, Isopteropodin, Isorhynchophyllin, Isorhynchophyllin-n-oxid, Isorotundifolin, Curculogosid, Curculigosid B, Phenolglucoside, 2-[[2,6-Dimethoxybenzoyl)oxy]methyl-4-hydroxyphenyl-beta-D-glucopyranosid, 2-[[2-Hydroxy-6-methoxybenzoyl)oxy]methyl-4-hydroxyphenyl-beta-D-glucopyranosid, Mitraphyllin, Oleanolsäure, Pteropodin, Quinovinsäure-3beta-o-(beta-dglucopyranosyl-(1→3)beta-d-fucopyranosyl-(27→1)-beta-d-glucopyranosylester, Quinovinsäure-3-beta-o-beta-d-fucopyranosid, Quinovinsäure-3 beta-o-beta-d-fucopyranosyl-(27→1)-beta-d-glucopyranosylester, Quinovinsäure-3beta-o-beta-d-quinovopyranosid, Rhynchophyllin, Rotundifolin, Speciophyllin, Uncarin, Uncarin-f, Ursolsäure, Cepharanthin (Bisbenzylisochinolinalkaloid), Berbamin (Bisbenzylisochinolin-Alkaloid), Matrin (Lupinalkaloid), Pilocarpin (Imidazolalkaloid), 2,3-Dihydroxybenzoesäure, Ferulsäure, Anethol, Cleistanthin (Lignan), Phenolglucoside, Urunshiol, Alpha-Tocopherol (Vitamin E), Ubichon, Maesanin, Zexbrevin A/B, 12-O-Tetradeoanoyl-phorbol-13-acetat, TPA (tetracyclisches Diterpen), Saponin mit Aglycon-Oleonsäure (pentacyclisches Triterpen), und Cynonchosid.
Der pharmakologische Wirkstoff weist vorzugsweise eine therapeutisch wirksame Menge an Uncaria tomentosa in einer Dosierung im Bereich von etwa 10 bis 1000 mg/kg Körpergewicht des Patienten, und mehr bevorzugt im Bereich von etwa 10 bis 100 mg/kg Körpergewicht des Patienten auf.
Die Amyloiderkrankung für die Behandlung mit dem pharmakologischen Wirkstoff ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus dem Alzheimer-Krankheit assoziierten Amyloid, Down-Syndrom und vererbte cerebrale Hämorrhagie mit Amyloidose-Dutch-Typ (wobei das spezifische Amyloid als beta-Amyloidprotein oder Aβ bezeichnet wird), dem mit chronischer Entzündung assoziierten Amyloid, verschiedenen Formen von Malignität und familiärem Mittelmeerfieber (wobei das spezifische Amyloid als AA Amolid oder Inflammation-assoziierte Amyloidose bezeichnet wird), dem mit multiplen Myelom und anderen B-Zell Dyskrasien assoziierten Amyloid (wobei das spezifische Amyloid als AL Amyloid bezeichnet wird), dem mit Typ II Diabetes assoziierten Amyloid (wobei das spezifische Amyloid als Amylin oder Insel-Amyloid bezeichnet wird), dem mit Prionenerkrankungen assoziierten Amyloid, einschließlich Creutzfeldt-Jakob-Krankheit, Gerstmann-Straussler Syndrom, Kuru und tierischem Scrapie (wobei das spezifische Amyloid als PrP Amyloid bezeichnet wird), dem mit Langzeithämodialyse und Karpaltunnelsyndrom assoziierten Amyloid (wobei das spezifische Amyloid als Beta₂-Mikroglobulin-Amyloid bezeichnet wird), dem mit senilen Herzamyloid und familiären amyloidotischen Polyneuropathie assoziierten Amyloid (wobei das spezifische Amyloid als Transthyretin oder Präalbumin bezeichnet wird), und dem mit endokrinen Tumoren, wie medullärem Karzinom der Schilddrüse assoziierten Amyloid (wobei das spezifische Amyloid als Varianten von Procalcitonin bezeichnet wird).
Bevorzugte pharmazeutische Wirkstoffe weisen einen Gewichtsanteil an Pflanzenmaterial in dem Wirkstoff im Bereich von etwa 70% bis etwa 95% auf, und können auch einen pharmazeutisch akzeptablen Träger, Verdünnungsmittel oder Exzipienten aufweisen. Der pharmazeutische Wirkstoff weist vorzugsweise eine Amyloid inhibierende Aktivität oder Wirksamkeit von mehr als 50% auf.
Der zweite Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zum Isolieren von Amyloid inhibierenden Inhaltsstoffen innerhalb von Uncaria tomentosa Pflanzenmaterial, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: a) Extrahieren des Pflanzenmaterials mit einem organischen Lösungsmittel, b) Konzentrieren des Extrakts, c) Entfernen von unlöslichen Materialien, d) Präzipitieren der Amyloid-inhibierenden Bestandteile mit organischen Lösungsmitteln, e) Gewinnung und Wiederauflösen der Amyloid-inhibierenden Bestandteile, die mit dem organischen Lösungsmittel erhalten wurden, und f) Injizieren und Trennen durch HPLC.
Das Pflanzenmaterial besteht vorzugsweise aus kommerziell erhaltenen Pillen, Tabletten, Caplets, Weich- und Hartgelatine Kapseln, Pastillen, Päckchen, Kapseln aus Stärkemasse, Vegicaps, flüssige Tropfen, Elixiere, Suspensionen, Emulsionen, Lösungen, Sirupe, Teebeutel, Aerosole (als ein Feststoff oder in einem flüssigen Medium), Zäpfchen, sterile injizierbare Lösungen, sterile verpackte Pulver, Rindenbündel und/oder Rindenpulver, die Uncaria tomentosa, Extrakte oder Derivate davon enthalten, und kann aus kommerziell erhältlichen Gelatine-überzogenen Kapseln entnommen werden, welche Trockenpulver von Uncaria tomentosa, Extrakte oder Derivaten davon, enthalten.
Der Schritt des Extrahierens des Pflanzenmaterials mit einem organischen Lösungsmittel weist vorzugsweise das Hinzufügen von Propanol, und zwar anfangs zu den Pflanzenmaterialien, die gepulvert sind, auf, und die resultierende Mischung wird über Nacht gerührt. Das Lösungsmittel, welches in dem Schritt des Extrahierens der Amyloid inhibierenden Inhaltsstoffe verwendet wird, besitzt vorzugsweise eine Polarität im Bereich von jener von Wasser und jener von Pentanol. Der Schritt des Entfernens von unlöslichen Materialien wird vorzugsweise durch Zentrifugieren des Extraktes und Sammeln des Überstandes durchgeführt. Der Schritt des Konzentrierens des Extraktes wird vorzugsweise durch Rotationsverdampfung durchgeführt. Im Anschluss an die Extraktions- und Zentrifugationsschritte wird die Extraktions- und Zentrifugationsprozedur vorzugsweise 1-5 weitere Male wiederholt und die Überstände werden gesammelt.
Im Anschluss an die wiederholten Schritte von Extraktion und Konzentration werden die Überstände vorzugsweise zusammengefasst und mittels eines Rotationsverdampfers konzentriert. Im Anschluss an den Konzentrationsschritt und nachdem das Volumen etwa 500 ml oder weniger ist, wird der Extrakt vorzugsweise erneut zentrifugiert, um weitere unlösliche Materialien zu entfernen. Im Anschluss an den Rezentrifugationsschritt wird der Überstand vorzugsweise erhalten und mit Petrolether, vorzugsweise 4 Volumina, präzipitiert. Im Anschluss an die Präzipitation mit Petrolether wird das Präzipitat vorzugsweise in einem Pellet im Anschluss an eine weitere Zentrifugation gesammelt. Das Pellet wird dann vorzugsweise in Propanol aufgelöst und auf eine Silicasäule, die mit Essigsäure enthaltendem Propanol äquilibriert wurde, aufgetragen. Im Anschluss an die Auftragung des Materials auf die Silicasäule wird Essigsäure enthaltender Propanol verwendet, um zu eluieren, und die sich am schnellsten bewegenden, gelblich-braun gefärbten Fraktionen werden mit einem Fraktionensammler gesammelt. Die Eluente von der Säule werden vorzugsweise spektroskopisch bei 490 nm überwacht und Fraktionen werden in einem Fraktionensammler gesammelt. Im Anschluss an die Sammlung der am schnellsten wandernden gelblich-braun gefärbten Fraktionen werden die Fraktionen vorzugsweise mit Petrolether präzipitiert und das Präzipitat wird nachfolgend an die Zentrifugation gesammelt. Im Anschluss an die Repräzipitation und Rezentrifugation wird das Pellet vorzugsweise in Acetonitril/Essigsäure/Wasser für die Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) Injektion aufgelöst. Das aufgelöste Pellet wird vorzugsweise in gleiche Portionen aufgeteilt und in eine HPLC injiziert. Die verwendete HPLC enthält vorzugsweise eine 1 × 25 cm C₁₈ Säule, obwohl andere Größen verwendet werden können, und wird bei 30°C bei einer Flussrate von 2 ml/min gehalten. Die in die HPLC injizierten Probenportionen werden mit Gradienten von A und B eluiert, wie beispielsweise 0% B für 5 Minuten, 0-15% B von 5-10 Minuten, 15-45% B von 10-70 Minuten, und 45-100% von 70-85 Minuten ist, wobei B = 95% Acetonitril mit 0,5% Essigsäure in destilliertem Wasser und A = 5% Acetonitril mit 0,5% Essigsäure in destilliertem Wasser. Die Eluente von der HPLC werden vorzugsweise bei 490 nm und 4 ml Fraktionen werden in einem Fraktionensammler gesammelt und gepoolte Peaks werden bei verschiedenen Retentionszeiten erhalten (von 0 bis 85 Minuten). Die erhaltenen Fraktionen können durch Lyophilisation konzentriert werden, nachdem der Großteil des Acetonitrils durch Rotationsverdampfung entfernt ist.
Die erhaltenden konzentrierten Fraktionen werden dann in relevanten in vitro Untersuchungen getestet, um potente Inhibitoren der Amyloidfibrillenbildung, Amyloidfibrillenwachstum oder der Auflösung/Auftrennung von vorgeformten Amyloidfibrillen zu identifzieren. Die Amyloid inhibierenden Inhaltsstoffe innerhalb Uncaria tomentosa werden vorzugsweise von der HPLC abgezogen, etwa bei HPLC Retentionszeiten von 13-45 Minuten, und mehr bevorzugt nach 26 Minuten.
Ein Verfahren, welches nicht innerhalb des Umfangs der Erfindung fällt, ist ebenfalls für das Behandeln einer Amyloiderkrankung in einem Patienten offenbart, welches den Schritt des Verabreichens einer therapeutisch wirksamen Menge an Pflanzenmaterial von einer Pflanze der Gattung Uncaria, Spezies tomentosa, an einen Patienten aufweist. Das Pflanzenmaterial wird vorzugsweise oral oder durch Aerosolspray oder in einer parenteral injizierbaren oder infundierbaren Form verabreicht.
Die therapeutisch wirksame Menge an Pflanzenmaterial ist vorzugsweise ein Amyloid inhibierender Inhaltsstoff, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus aus Oxindol-Alkaloide, Quinovinsäure-Glycoside, Proanthocyanidine, Polyphenole, Triterpine, pflanzliche Sterole, beta-Sitosterol, Stigmasterol, Campesterol, Phytosterole, 3-Beta, 6-Beta, 19-Alpha-Trihydroxy-urs-12-en-28-oinsäure, 5-Alpha-Carboxystrictosidin, Alloisopteropodin, Allopteropodine, Angustin, Dihydrocorynanthein, Dihydrocorynanthein-n-oxid, Hirsutin, Hirsutin-n-oxid, Isomitraphyllin, Isopteropodin, Isorhynchophyllin, Isorhynchophyllin-n-oxid, Isorotundifolin, Curculogosid, Curculigosid B, Phenolglucoside, 2-[[2,6-Dimethoxybenzoyl)oxy]methyl-4-hydroxyphenyl-beta-D-glucopyranosid, 2-[[2-Hydroxy-6-methoxybenzoyl)oxy]methyl-4-hydroxyphenyl-beta-D-glucopyranosid, Mitraphyllin, Oleanolsäure, Pteropodin, Quinovinsäure-3beta-o-(beta-dglucopyranosyl-(1→3)beta-d-fucopyranosyl-(27→1)-beta-d-glucopyranosylester, Quinovinsäure-3-beta-o-beta-d-fucopyranosid, Quinovinsäure-3 beta-o-beta-d-fucopyranosyl-(27→1)-beta-d-glucopyranosylester, Quinovinsäure-3beta-o-beta-d-quinovopyranosid, Rhynchophyllin, Rotundifolin, Speciophyllin, Uncarin, Uncarin-f, Ursolsäure, Cepharanthin (Bisbenzylisochinolinalkaloid), Berbamin (Bisbenzylisochinolin-Alkaloid), Matrin (Lupinalkaloid), Pilocarpin (Imidazolalkaloid), 2,3-Dihydroxybenzoesäure, Ferulsäure, Anethol, Cleistanthin (Lignan), Phenolglucoside, Urunshiol, Alpha-Tocopherol (Vitamin E), Ubichon, Maesanin, Zexbrevin A/B, 12-O-Tetradeoanoyl-phorbol-13-acetat, TPA (tetracyclisches Diterpen), Saponin mit Aglycon-Oleonsäure (pentacyclisches Triterpen), und Cynonchosid.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist ein schwarzweiß Diagramm einer 1 Wochen Thioflavin T Fluorometrie-Untersuchung, die benutzt wurde, um Inhibitoren der Alzheimer Aβ (1-40) Amyloidfibrillenbildung zu identifizieren. Es wurde von Glucosamin (Sulfatsalz) enthaltender Uncaria tomentosa (PTI-00700) gezeigt, ein potenter Inhibitor der Aβ (1-40) Amyloidfibrillenbildung zu sein.
2 ist ein schwarzweiß Diagramm einer 1 Wochen Thioflavin T Fluorometrie-Untersuchung, die benutzt wurde, um Inhibitoren der Alzheimer Aβ (1-40) Amyloidfibrillenbildung zu identifizieren. Es wurde von Glucosamin (Sulfatsalz) enthaltende Uncaria tomentosa (PTI-00700), Glucosamin (Sulfatsalz) enthaltende Uncaria tomentosa (PI-00700 < 30 kDa), welches durch einen Filter mit einer Molekulargewichts-Auschlussgrenze von 30 kDa (PTI-00700 < 30 kDa) ging, Glucosamin (Hydrochlorid Salz) enthaltende Uncaria tomentosa (PTI-00701), und reines Uncaria tomentosa (PTI-00703) gezeigt, wirksame Inhibitoren der Aβ (1-40) Amyloidfibrillenbildung zu sein.
3 ist ein schwarzweiß Diagramm einer Festphasen-Bindungsuntersuchung, die verwendet wurde, um Führungsverbindungen zu identifizieren, welche Alzheimer Aβ-Aβ-Interaktionen inhibieren (d.h. Alzheimer Amyloidfibrillenwachstum). Glucosamin (Sulfatsalz) enthaltendes Uncaria tomentosa (PTI-00700) ist als ein potenter Inhibitor des Alzheimer Amyloidfibrillenwachstums identifiziert worden.
4 ist ein schwarzweiß Diagramm einer Festphasen-Bindungsuntersuchung, die verwendet wurde, die potentiellen dosisabhängigen Wirkungen von Glucosamin (Sulfatsalz) enthaltender Uncaria tomentosa (PTI-00700) auf die Inhibierung von Aβ-Proteoglycan/Glycosaminoglycan (PG/GAG) Interaktionen zu bestimmen. Signifikante dosisabhängige Inhibierung von Aβ-PG/GAG Interaktionen wird bei der Behandlung von Glucosamin (Sulfatsalz) enthaltender Uncaria tomentosa beobachtet.
5 ist ein schwarzweiß Diagramm einer Thioflavin T Fluorometrie Untersuchung, die benutzt wurde, um die potentiellen dosisabhängigen Wirkung von Uncaria tomentosa Extrakt (PTI-00703) auf die Auflösung/Auftrennung von vorgeformten Alzheimer Aβ (1-40) Amyloidfibrillen innerhalb einer Inkubationsperiode von 2 Stunden zu bestimmen. Uncaria tomentosa Extrakt bewirkt die Auflösung von vorgeformten Alzheimer Aβ-Amyloidfibrillen in einer dosisabhängigen Weise.
6 ist ein schwarzweiß Diagramm einer Thioflavin T Fluorometrie-Untersuchung, die benutzt wird, um zu zeigen, dass Uncaria tomentosa Extrakt, der von einer anderen kommerziellen Quelle (auch als PTI-00703-02 bezeichnet) und von Uncaria tomentosa in flüssiger Form erhalten wurde, ebenfalls in der Lage ist, eine signifikante Auflösung/Auftrennung von vorgeformten Alzheimer Aβ(1-40) Amyloidfibrillinen innerhalb einer Inkubationsperiode von 2 Stunden hervorzurufen.
7 ist ein schwarzweiß Diagramm einer Thioflavin T Fluorometrie-Untersuchung, die benutzt wird, um zu zeigen, dass Uncaria tomentosa Extrakt, der von einer noch anderen kommerziellen Quelle (auch als PTI-00703-R bezeichnet) erhalten wurde, ebenfalls in der Lage ist, eine signifikante dosisabhängige Auflösung/Auftrennung von vorgeformten Alzheimer Aβ(1-40) Amyloidfibrillinen innerhalb einer Inkubationsperiode von 2 Stunden hervorzurufen. 1/10.000tel des Extraktes von Uncaria tomentosa, das innerhalb einer einzigen Gelatine-überzogenen Pille enthalten ist, bewirkte eine signifikante (p < 0,001) 58% Auflösung, wohingegen 1/1.000tel eines Extraktes einer einzigen Pille von Uncaria tomentosa eine signifikante (p < 0,001) 81% Auflösung bewirkte, 1/500tel eines Extraktes einer einzigen Uncaria tomentosa Pille bewirkte eine signifikante (p < 0,001) 93% Auflösung, und 1/250el eines Extraktes einer einzigen Uncaria tomentosa Pille bewirkte eine signifikante (p < 0,001) 97% Auflösung.
8 ist ein schwarzweiß Diagramm einer Thioflavin T Fluorometrie Untersuchung, die benutzt wurde, um zu zeigen, dass ein Uncaria tomentosa Extrakt (PTI-00703) ebenfalls in der Lage ist, eine signifikante (p < 0,001) Auflösung von vorgeformten Alzheimer Aβ (1-42) Amyloidfibrillen (d.h. die längere und fibrillogenere Form von Alzheimer Amyloid) zu allen Zeitpunkten zu bewirken, wobei eine 63% Auflösung/Auftrennung nach bereits 2 Stunden Inkubation beobachtet wird.
9 ist ein schwarzweiß Diagramm einer Thioflavin T Fluorometrie Untersuchung, die benutzt wurde, um zu zeigen, das ein Uncaria tomentosa Extrakt (PTI-00703) ebenfalls in der Lage ist, eine signifikante (p < 0,001) Auflösung von vorgeformten Insel-Amyloidfibrillen (d.h. Amylin) zu allen Zeitpunkten zu bewirken, wobei eine 72% Auflösung/Auftrennung nach bereits 2 Stunden Inkubation beobachtet wird.
10 sind schwarzweiß Diagramme, die die Trennung von Uncaria tomentosa Extrakt durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) und Erstreinigung von Amyloid inhibierenden Inhaltsstoffen zeigen. Feld A zeigt die HPLC, die bei 490 nm überwacht und mit einem Acetonitril/Wasser Gradient eluiert wurde, was zeigt, dass der Uncaria tomentosa Extrakt mehrere Inhaltsstoffe enthielt, die von der Säule mit einem breiten Peak, der bei 13-45 Minuten beobachtet wurde, und einen Peak, der bei 80 Minuten beobachtet wird, eluierten. Feld B zeigt eine Fraktion bei 26 Minuten, die erneut injiziert wurde und ein symmetrischer Peak wurde beobachtet, was darauf hinweist, dass die Polydiversität des Feld A Chromatogramms nicht aufgrund eines Säulenartifakts ist, jedoch aufgrund der Gegenwart von individuellen Komponenten innerhalb des Uncaria tomentosa Extraktes. In Feld C wurden 60 μl 25 μM von vorfibrillisiertes Aβ1-40 für 2 Stunden in der Gegenwart oder Abwesenheit von 0,0005 OD Einheiten von Fraktion 26 und Fraktion 80 inkubiert. Fraktion 26 (nicht jedoch Fraktion 80) zeigte potente Amyloid inhibierende Aktivität, die eine 85% Auflösung/Auftrennung von Alzheimer Krankheit Amyloid innerhalb einer Inkubationsperiode von 2 Stunden bewirkt.
Unter jetziger Bezugnahme auf die Zeichnungen wird die Erfindung in einer bevorzugten Ausführungsform unter Bezugnahme auf die Bezugszeichen der Zeichnungen beschrieben, wobei ähnliche Bezugszeichen ähnliche Teile andeuten.
Amyloid und Amyloidose
Amyloid ist ein allgemeiner Begriff, der eine Gruppe von diversen, jedoch spezifischen extrazellulären Proteinablagerungen betrifft, welche alle gemeinsame morphologische Eigenschaften, Färbungscharakteristika, und Röntgenbeugungsspektra besitzen. Ungeachtet der Natur des abgelagerten Amyloidproteins haben alle Amyloide die folgenden Eigenschaften: 1) eine amorphe Erscheinung unter dem Lichtmikroskop und erscheinen unter Verwendung von Hämatoxylin und Eosinfarbstoffen eosinophil; 2) alle lassen sich mit Kongorot färben und zeigen eine rot/grüne Doppelbrechung, wenn unter polarisiertem Licht betrachtet (Puchtler et al., J. Histochem. Cytochem. 10:355-364, 1962), 3) alle enthalten eine prädominante Beta-Faltblattsekundärstruktur, und 4) ultrastrukturelles Amyloid besteht üblicherweise aus nicht-verzweigten Fibrillen von unbestimmter Länge mit einem Durchmesser von 7-10 nm.
Heutzutage wird Amyloid gemäß dem spezifisch abgelagerten Amyloidprotein klassifiziert. Die Amyloiderkrankungen umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, das mit Alzheimer-Krankheit assoziierte Amyloid, Down-Syndrom und vererbte cerebrale Hämorrhagie mit Amyloidose-Dutch-Typ (wobei das spezifische Amyloid als beta-Amyloidprotein oder Aβ bezeichnet wird), das mit chronischer Entzündung assoziierte Amyloid, verschiedenen Formen von Malignität und familiäres Mittelmeerfieber (wobei das spezifische Amyloid als AA Amyloid oder Inflammation-assoziierte Amyloidose bezeichnet wird), das mit multiplen Myelom und anderen B-Zell Dyskrasien assoziierte Amyloid (wobei das spezifische Amyloid als AL Amyloid bezeichnet wird), das mit Typ II Diabetes assoziierte Amyloid (wobei das spezifische Amyloid als Amylin oder Insel-Amyloid bezeichnet wird), das mit Prionenerkrankungen assoziierte Amyloid, einschließlich Creutzfeldt-Jakob-Krankheit, Gerstmann-Straussler Syndrom, Kuru und tierischem Scrapie (wobei das spezifische Amyloid als PrP Amyloid bezeichnet wird), das mit Langzeithämodialyse und Karpaltunnelsyndrom assoziierte Amyloid (wobei das spezifische Amyloid als Beta₂-Mikroglobulin-Amyloid bezeichnet wird), das mit senilen Herzamyloid und familiärer amyloidotischen Polyneuropathie assoziierte Amyloid (wobei das spezifische Amyloid als Präalbumin-Amyloid oder Transthyretin bezeichnet wird), und das mit endokrinen Tumoren, wie medullärem Karzinom der Schilddrüse assoziierte Amyloid (wobei das spezifische Amyloid als Varianten von Procalcitonin bezeichnet wird).
Obwohl Amyloidablagerungen in klinischen Zuständen gemeinsame physische Eigenschaften in Bezug auf das Vorhandensein einer Beta-Flattblattkonformation teilen, ist es nun klar, dass viele unterschiedliche chemische Arten existieren und es wahrscheinlich ist, dass zusätzliche in der Zukunft beschrieben werden. Es wird derzeit vermutet, dass es mehrere gemeinsame pathogenetische Mechanismen gibt, die in der Amyloidose im Allgemeinen wirken. In vielen Fällen kann ein zirkulierendes Vorläuferprotein von der Überproduktion von entweder intakten oder anormalen Molekülen (ex. Plasmazelldyskrasien), reduziertem Abbau oder Exkretion (Serum Amyloid A in einigen sekundären Amyloidsyndromen und Beta₂-Mikroglobulin in Langzeithämodialyse), oder genetischen Anormalitäten, die mit varianten Proteinen assoziiert sind (ex. familiäre amyloidotische Polyneuropathie) resultieren. Proteolyse eines größeren Proteinvorläufermoleküls tritt in vielen Arten von Amyloidose auf, was zu der Herstellung von Fragmenten mit niederem Molekulargewicht führt, die polymerisieren und eine Beta-Faltblattkonformation als Gewebeablagerungen annehmen, üblicherweise an einer extrazellulären Stelle. Was sind die genauen involvierten Mechanismen und die anormalen Ursachen, die zu einer Änderung der proteolytischen Bearbeitung und/oder translationalen Modifikationen führen, ist in den meisten Amyloiden nicht bekannt.
Systemische Amyloide, welche das mit chronischer Entzündung assoziierte Amyloid, verschiedene Formen von Malignität und familiärem Mittelmeerfieber (d.h. AA Amyloid oder Entzündungs-assoziierte Amyloidose) (Benson und Cohen, Arth. Rheum. 22:36-42, 1979; Kamei et al. Acta Path. Jpn. 32:123-133, 1982; Mc Adam et al. Lancet 2:572-573, 1975; Metaxas, Kidney Int. 20:676-685, 1981) und Amyloid, das mit multiplem Myelom und anderen B-Zell Dyskrasien assoziiert ist (d.h. AL Amyloid) (Harada et al., J. Histochem. Cytochem. 29:1-15, 1971) beispielsweise umfassen, sind bekannt, die Amyloidablagerung in einer Vielzahl von unterschiedlichen Organen und Geweben, die im Allgemeinen außerhalb des Zentralnervensystems liegen, einzuschließen. Die Amyloidablagerung in diesen Krankheiten kann beispielsweise in der Leber, Herz, Milz, Gastrointestinaltrakt, Niere, Haut, und/oder Lungen auftreten (Johnson et al., N. Engl. J. Med. 321:513-518, 1989). Für die meisten dieser Amyloidosen gibt es keine offensichtliche Heilung oder wirksame Behandlung und die Konsequenzen der Amyloidablagerung können für den Patienten schädlich sein. Beispielsweise kann die Amyloidablagerung in der Niere zu Nierenversagen führen, wohingegen die Amyloidablagerung im Herzen zu Herzversagen führen kann. Für diese Patienten führt die Amyloidakkumulation in systemischen Organen letztendlich zum Tod innerhalb von 3-5 Jahren. Andere Amyloidosen können ein einziges Organ oder Gewebe angreifen, so wie bei Aβ Amyloidablagerungen beobachtet wird, die in den Hirnen von Patienten mit Alzheimer Krankheit und Down's Syndrom gefunden wird; die PrP Amyloidablagerungen, die in den Hirnen von Patienten mit Creutzfeldt-Jakob-Krankheit gefunden wird, Gerstmann-Straussler Syndrom, und Kuru; die Insel-Amyloid (Amylin) Ablagerungen, die in den Langerhansinseln der Bauchspeichelsdrüse von 90% der Patienten mit Typ II Diabetes gefunden werden (Johnson et al, N. Engl. J. Med, 321:513-518, 1989; Lab. Invest. 66:522-535, 1992); die Beta₂-Mikroglobulin-Amyloid-Ablagerungen in dem Medialnerv, die zu dem Karpaltunnelsyndrom führen, wie in Patienten beobachtet wird, die eine Langzeithämodialyse durchmachen (Geyjo et al, Biochem. Biophys. Res. Comm. 129:701-706, 1985; Kidney Int. 30:385-390, 1986); das Präalbumin/Transthyretin Amyloid, das in den Herzen von Patienten mit senilem Herzamyloid beobachtet wird; und das Präalbumin/Transthyretin-Amyloid, das in peripheren Nerven von Patienten beobachtet wird, welche familiäre amyloidotische Polyneuropathie aufweisen (Skinner und Cohen, Biochem. Biophys. Res. Comm. 99:1326-1332, 1981; Saraiva et al. J. Lab. Clin. Med. 102:590-603, 1983; J. Clin. Invest. 74:104-119, 1984; Tawara et al., J. Lab. Clin. Med. 98:811-822, 1989).
Alzheimer Krankheit und die alternde Population
Alzheimer Krankheit ist eine Hauptursache von Demenz in der älteren Bevölkerung, die 5-10% der Population im Alter über 65 Jahre betrifft (A Guide to Understanding Alzheimer Disease und Related Disorder, herausgegeben von Jorm, New York University Press, New York, 1987). In der Alzheimer Krankheit bauen sich die Teile des Hirns, die für kognitive Prozesse, wie Gedächtnis, Aufmerksamkeit, Sprache und Argumentation essentiell sind, ab, wodurch die Opfer von dem beraubt werden, das sie zu Menschen macht, einschließlich der Unabhängigkeit. In einigen vererbten Formen der Alzheimer Krankheit ist der Ausbruch in dem mittleren Alter, jedoch häufiger treten die Symptome in der Mitte der 60iger und später auf. Die Alzheimer Krankheit betrifft heutzutage 4-5 Millionen Amerikaner, wobei etwas mehr als die Hälfte dieser Personen die Pflege zuhause erhalten, während die anderen in vielen unterschiedlichen Gesundheitsinstitutionen sind. Die Prävalenz der Alzheimer Krankheit und anderen Demenzen verdoppelt sich alle 5 Jahre jenseits des Alters von 65 und jüngste Studien weisen darauf hin, dass beinahe 50% aller Personen im Alter von 85 und älter Symptome der Alzheimer Krankheit ausweisen (1997 Progress Report an Alzheimer's Disease, National Institute an Aging/National Institute of Health). 13% (33 Millionen Personen) der Gesamtpopulation der Vereinigten Staaten sind 65 Jahre alt oder älter, und dieser % wird auf bis zu 20% im Jahr 2025 ansteigen (1997 Progress Report an Alzheimer's Disease, National Institute an Aging/National Institute of Health).
Alzheimer Krankheit bedingt auch eine schwere ökonomische Last für die Gesellschaft. Eine kürzliche Studie schätzte, dass die Kosten für das Pflegen eines Patienten mit Alzheimer Krankheit mit schweren kognitiven Beeinträchtigungen, zuhause oder in einem Pflegeheim, höher als $47.000 pro Jahr sind (A Guide to Understanding Alzheimer's Disease und Related Disorders, herausgegeben von Jorm, New York University Press, New York, 1987). Für eine Krankheit, die sich von 2 bis 20 Jahren erstrecken kann, sind die Gesamtkosten für die Alzheimer Krankheit für Familien und die Gesellschaft erschütternd. Die jährlichen ökonomischen Kosten der Alzheimer Krankheit in den Vereinigten Staaten in Bezug auf Gesundheitskosten und Verdienstentgang von sowohl Patienten als auch deren Pfleger wird mit $80 bis $100 Milliarden geschätzt (1997 Progress Report an Alzheimer's Disease, National Institute an Aging/National Institute of Health).
Tacrinhydrochlorid („Cognex"), das erste FDA zugelassene Arzneimittel für Alzheimer Krankheit ist ein Acetylcholinesterase-Inhibitor (Cutler und Sramek, N. Engl. J. Med. 328:808-810, 1993). Jedoch zeigte dieses Arzneimittel einen beschränkten Erfolg in der kognitiven Verbesserung in Patienten mit Alzheimer Krankheit und hatte anfänglich bedeutende Nebenwirkungen wie Lebertoxizität. Das zweite, erst kürzlich, FDA zugelassene Arzneimittel, Donepezil (auch als „Aricept" bekannt), welches ebenfalls ein Acetylcholinesterase-Inhibitor ist, ist wirksamer als Tacrin, indem es einen leichte kognitive Verbesserung in Patienten mit Alzheimer Krankheit zeigt (Barner und Gray, Ann. Pharmacotherapy 32:70-77, 1998; Rogers und Friedhoff, Eur. Neuropsych. 8:67-75, 1998), jedoch wird nicht angenommen, eine Heilung zu sein. Es ist deshalb offensichtlich, dass ein Bedarf an effektiveren Behandlungen für Patienten mit Alzheimer Krankheit besteht.
Amyloid als ein therapeutisches Ziel für Alzheimer Krankheit
Die Alzheimer Krankheit ist durch die Ablagerung und Akkumulation eines 39-43 Aminosäurepeptids mit der Bezeichnung Beta-Amyloidprotein, Aβ oder β/A4 gekennzeichnet (Glenner und Wong, Biochem. Biophys. Res. Comm. 120:885-890, 1984; Masters et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA 82:4245-4249, 1985; Husby et al. Bull WHO 71:105-108, 1993). Aβ wird von größeren Vorläuferproteinen mit der Bezeichung Beta-Amyloidvorläuferproteine (oder βPPs) abgeleitet, von welchen mehere alternativ-gespleißte Varianten existieren. Die am reichlichsten vorhandenen Formen der βPPs umfassen Proteine, die aus 695, 751 und 770 Aminosäuren bestehen (Tanzi et al, Nature 331:528-530, 1988; Kitaguchi et al. Nature 331:530-532, 1988; ponte et al, Nature 331:525-527, 1988).
Das kleine Aβ Peptid ist eine Hauptkomponente, welche die Amyloidablagerungen von „Plaques" in den Hirnen von Patienten mit Alzheimer Krankheit ausmachen. Zusätzlich ist die Alzheimer Krankheit durch die Gegenwart von zahlreichen neurofibrillären „Bündeln" charakterisiert, die aus gepaarten helikalen Filamenten bestehen, welche anormal in dem neuronalen Cytoplasma akkumulieren (Grundke-lqbal et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:4913-4917, 1986; Kosik et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:4044-4048, 1986; Lee et al. Science 251: 675-678, 1991). Die pathologischen Merkmale der Alzheimer Krankheit sind deshalb die Gegenwart von „Plaques" und „Bündel", wobei das Amyloid in dem zentralen Kern der Plaques abgelagert wird. Die andere Haupart von Läsion, die im Hirn von Alzheimer Krankheit gefunden wird, ist die Akkumulation von Amyloid in den Wänden von Blutgefäßen, sowohl innerhalb des Hirnparenchyms als auch in den Wänden von Hirnhautgefäßen, welche außerhalb des Gehirns liegen. Die Amyloidablagerungen, die an den Wänden von Blutgefäßen lokalisiert sind, werden als cerebrovaskuläres Amyloid oder kongophile Angiopathie bezeichnet (Mandybur, J. Neuropath. Exp. Neurol. 45:79-90, 1986; Pardridge et al. J. Neurochem. 49:1394-1401, 1987).
Für viele Jahre hat es eine anhaltende wissenschaftliche Debatte über die Wichtigkeit von „Amyloid" in Alzheimer Krankheit gegeben und ob die „Plaques" und „Bündel", die für diese Krankheit charakteristisch sind, eine Ursache oder lediglich die Konsequenzen der Krankheit waren. Innerhalb der letzten paar Jahre weisen Studien nun darauf hin, dass Amyloid tatsächlich ein ursächlicher Faktor für Alzheimer Krankheit ist und sollte nicht bloß als unbeteiligter Zuschauer angesehen werden. Es wurde gezeigt, dass das Alzheimer Aβ Protein in Zellkultur, den Abbau von Nervenzellen innerhalb kurzer Zeitperioden bewirkt (Pike et al. Br. Res. 563:311-314, 1991; J. Neurochem. 64:253-265, 1995). Studien weisen darauf hin, dass es die fibrilläre Struktur ist (bestehend aus einer prädominanten B-Flattblattsekundärstruktur), die für alle Amyloide charakteristisch ist, welche für die neurotoxischen Wirkungen verantwortlich ist. Es wurde auch gefunden, dass Aβ in Objektträgerkulturen von Hippokampus neurotoxisch ist (Harrigan et al. Neurobiol. Aging 16:779-789, 1995) und umfasst den Tod von Nervenzellen in transgenen Mäusen (Games et al, Nature 373:523-527, 1995; Hsiao et al, Science 274:99-102, 1996). Injektion des Alzheimers Aβs in Rattenhirn ruft auch eine Gedächtnisbeeinträchtigung und neuronale Störung hervor (Flood et al, Proc. Natl. Acad. Sci. 88:3363-3366, 1991; Br. Res. 663:271-276, 1994).
Möglicherweise der überzeugendste Beweis, dass Aβ direkt in die Pathogenese von Alzheimer Krankheit eingebunden ist, kommt von genetischen Studien. Es wurde entdeckt, dass die Herstellung von Aβ von Mutationen in dem Gen, welches seinen Vorläufer, Beta-Amyloidvorläuferprotein, kodiert, herrührt (Van Broeckhoven et al, Science 248:1120-1122, 1990; Murrell et al, Science 254:97-99, 1991; Haass et al, Nature Med, 1:1291-1296, 1995). Die Identifikation von Mutationen in dem Beta-Amyloidvorläuferproteingen, welches einen frühen Ausbruch von familiärer Alzheimer Krankheit hervorruft, ist ein starkes Argument, dass Amyloid für den pathogenetischen Vorgang, der dieser Krankheit zugrunde liegt, zentral ist. Vier berichtete Krankheits-hervorrufende Mutationen wurden entdeckt, welche die Wichtigkeit von Aβ beim Hervorrufen der familiären Alzheimer Krankheit demonstrieren (besprochen in Hardy, Nature Genet. 1:233-234, 1992). Alle diese Studien weisen darauf hin, dass angenommen wird, dass das Bereitstellen eines Arzneimittels, um die fibrilläre Aβ Bildung, Ablagerung, Akkumulation und/oder Persistenz in den Gehirnen von menschlichen Patienten zu reduzieren, eliminieren oder verhindern, als ein wirksames Therapeutikum dient.
Uncaria tomentosa
Die Pflanze Uncaria tomentosa, auch als „Una de Gato" (in Spanisch) oder „Cat claw" (Katzendorn) (in Englisch) betrifft eine holzartige Kletterpflanze, die innerhalb des peruanischen Regenwaldes wächst. Diese langsam wachsende Kletterpflanze benötigt 20 Jahre, um die Reife zu erlangen, und kann bis zu einer Länge von über 30,5 m (100 feet) wachsen, während sie sich an native Bäume anheftet und sich um diese wickelt. Sie wird reichlich in den Vorbergen bei Höhen von 609 m (2000 feet) bis 2438 m (8000 feet) gefunden. Diese Kletterpflanze wird aufgrund ihrer charakteristischen gebogenen klauenartigen Dornen als „Katzendorn" bezeichnet, welche von der Basis ihrer Blätter nach vorne wegstehen. Die nativen Indianerstämme haben traditionell die Innenrinde und Wurzel des Krautes gekocht, um einen Teesud herzustellen und betrachten Uncaria tomentosa als eine heilige Heilpflanze. Es wird vermutet, dass die äußerst wirksamen Eigenschaften, die innerhalb der Innenrinde dieser Pflanze vorhanden sind, einen profunden und positiven Einfluss auf den Körper haben, obwohl wissenschaftliche, medizinische Daten hinsichtlich ihrer potentiellen Nutzen in Menschen im Allgemeinen fehlen. Die Alkaloide und Phytochemikalien in der Innenrinde von Uncaria tomentosa sind beinahe identisch zu jenen, die in der Wurzel gefunden werden, und das Ernten auf dieser Art bewahrt die Pflanze und sorgt für die Zukunft des Regenwaldes.
Einige der in Uncaria tomentosa vorhandenen aktiven Inhaltsstoffe sind Alkaloide (siehe das oben zitierte Keplinger Patent), welche in der Pflanze und ihrem Wasserextrakt als ein an Tannine gebundener Komplex auftreten. Die Komplexe werden durch das saure Milieu des Magens aufgetrennt; die Alkaloide werden in ihre Hydrochloridform transferiert und werden auf diese Art gut absorbiert. Ein dunklerer Uncaria tomentosa Extrakt bedeutet, dass mehr Tannin vorhanden ist und nützliche Alkaloide sind innerhalb der Tannine eingesperrt, welche einen nicht-bioverfügbaren und schlecht absorbierbaren Komplex bildeten. Eine leicht goldene Farbe von Uncaria tomentosa bedeutet, dass wenige Tannine vorhanden sind, und mehr Alkaloide in dem Extrakt verfügbar sind.
Abgesehen von der Gegenwart von Alkaloiden wird vermutet, dass Uncaria tomentosa auch andere nützliche Phytochemikalien enthält, einschließlich Quinovinsäure-Glycoside, Proanthocyanidine, Polyphenole, Triterpine und die Pflanzensterole Beta-Sitosterol, Stigmasterol und Campesterol (P. Steinberg „Uncaria tomentosa (Cat's Claw) a wondrous herb from the Peruvian rain forest", Townsend Letter für Doctors, Mai, 1994; P. Steinberg, „Cat's claw update-Uncaria tomentosa: that wondrous herb from the Peruvian rain forest", Townstead Letter for Doctors, Aug/Sept 1995, „Cat's Claw Miracle Herb from the Rain Forest of Peru", Woodland Publ. Inc., Pleasant Grove, VT, USA).
Uncaria tomentosa ist eine der wichtigsten Pflanzen des südamerikanischen, peruanischen Regenwaldes. Eine Reihe von Oxindol-Alkaloiden wurde bereits aus der Innenrinde dieser Pflanze isoliert. Zwei US Patente (US Patent Nr. 4.844.901 und US Patent Nr. 4.940.725 an Keplinger) beschreiben die Isolation und Verwendung von sechs Oxindol-Alkaloiden aus Uncaria tomentosa, von welchen angenommen wird, „dass sie für die unspezifische Stimulation des Immunsystems geeignet sind". Von diesen Oxindol-Alkaloiden wird vermutet, dass sie einen Allgemeinen Aufschwung für das Immunsystem darstellen, sowie eine profunde Wirkung auf die Fähigkeit der weißen Blutzellen und Markophagen haben, schädliche Mikroorganismen und fremdes Material zu phagozytieren. Das am meisten immunologisch aktive Alkaloid scheint Alloisopteropodin, Isomer A, ein pentazyklisches Oxindol-Alkaloid zu sein (US Patent 4.940.725).
Obwohl einige Gesundheitsvorsorgeanbieter darauf hingewiesen haben, dass Uncaria tomentosa verwendet werden kann, um eine Vielzahl von Beschwerden zu behandeln, hat es nirgendwo irgendeine Verwendung, oder Hinweis auf eine Verwendung, dieser Verbindung für die Behandlung der Amyloidbildung, Ablagerung, Akkumulation und/oder Persistenz gegeben, so wie jene, die in den Amyloidosen, einschließlich Alzheimer Krankheit auftritt. Die vorliegende Erfindung demonstriert eindeutig die Wirksamkeit von Uncaria tomentosa und ihrer Extrakte und Derivate, die von unterschiedlichen kommerziellen Quellen erhalten wurden, für die 1) Inhibierung der Alzheimer Aβ Amyloidfibrillenbildung (wichtig für Patienten mit Alzheimer Krankheit im frühen bis mittleren Stadium), 2) Inhibierung des Alzheimer Amyloidfibrillenwachstums (wichtig für Patienten mit Alzheimer Krankheit in dem frühen bis mittleren Stadium), 3) Inhibierung der Alzheimer Amyloid-PG/GAG Interaktionen (wichtig für Patienten in allen Stadien der Alzheimer Krankheit) und 4) Bewirken der Auflösung/Auftrennung von vorgeformten Alzheimer Krankheit Amyloidfibrillen. Zusätzlich demonstriert die vorliegende Erfindung, dass Uncaria tomentosa beim Hervorrufen der Auflösung von Insel-Amyloidfibrillen (d.h. Amylin) wirksam ist und kann deshalb als eine wirksame Behandlung von ~90% von Typ II Diabetes Patienten dienen, welche eine Insel-Amyloidakkumulation in der Bauchspeicheldrüse aufweisen.
Beispiele
Die folgenden Beispiel sind dargelegt, um den Durchschnittsfachmann mit der Offenbarung und Beschreibung der Identifikation und Verwendung von kommerziell verfügbarem Uncaria tomentosa bereitzustellen, um die Amyloidfibrillenbildung zu inhibieren, das Amyloidfibrillenwachstum zu inhibieren, die Amyloid-PG/GAG Interaktionen zu inhibieren und die Auflösung/Auftrennung von vorgeformten Amyloidfibrillen zu bewirken. Es sollte jedoch nicht so verstanden werden, dass die Erfindung auf diese spezifischen Beispiele beschränkt ist.
Beispiel 1
Glucosamin (Sulfatsalz) enthaltende Uncaria tomentosa ist ein potenter Inhibitor der Alzheimer Aβ(1-40) Amyloidfibrillenbildung
Ein zuvor beschriebenes Verfahren zum Messen der Amyloidfibrillenbildung, welches die Thioflavin T Fluorometrie (H Naiki et al. Lab. Invest. 65:104-110, 1991; H Levine III, Protein Sci 2:404-410, 1993; H Levine III, Amyloid: Int. J. Exp. Clin. Invest. 2:1-6, 1995; H Naiki und K. Nakakuki, Lab. Invest. 74:374-383, 1996) benutzt, wurde ursprünglich verwendet, um potentielle therapeutische Verbindungen zu identifzieren, die in der Lage sind, die Alzheimer Aβ Amyloidfibrillenbildung zu inhibieren. Unter Verwendung dieser sensitiven Untersuchung, wurde von jeglicher Verringerung bzw. jeglichem Anstieg der Fluoreszenz gezeigt, mit einer Abnahme oder Zunahme der Menge an Amyloidfibrillen zu korrelieren (H Naiki et al. Lab. Invest. 65:104-110, 1991; H Levine III, Protein Sci, 2:404-410, 1993; H Levine III; Amyloid: Int. J. Exp. Clin. Invest. 2:1-6, 1995; H Naiki und K. Nakakuki, Lab. Invest. 74:374-383, 1996), wodurch ermöglicht wird, um die Identifikation und den Gehalt an potentiellen Inhibitoren und/oder Verstärkern der Amyloidfibrillenbildung zu bestimmen.
Unsere Screening-Studien haben zuerst auf die Detektion eines potenten Alzheimer Krankheit Amyloid inhibierenden Wirkstoffs hingewiesen, welcher als ein hinzugefügter Bestandteil in einer der Verbindungen vorhanden war, die ursprünglich gestestet wurden. In einer Studie wurden die Wirkungen von verschiedenen Verbindungen der Alzheimer Aβ (1-40) Fibrillenbildung durch die Thioflavin T Fluorometrie gemessen. Thioflavin T ist bekannt, an fibrilläre Amyloidproteine zu binden und ein Anstieg in der Fluoreszenz korreliert mit einer Zunahme in Amyloidfibrillenbildung, während eine Abnahme in der Fluoreszenz mit einer Senkung in der Amyloidbildung korreliert. Das Alzheimer Aβ Protein (1-40), wenn bei 37°C inkubiert, tendiert dazu, spontan Amyloidfibrillen zu bilden, welche sich in der Menge mit der Zeit erhöhen. In dieser Studie testeten wir Verbindungen, welche das Potential besaßen, das Alzheimer Amyloid Aβ Protein an der Bildung von Fibrillen über eine Zeitperiode von 1 Woche zu inhibieren. Folglich haben die identifizierten Verbindungen die Fähigkeit, die Alzheimer Amyloidfibrillenbildung zu inhibieren. Für diese Studien wurden 25 μm Aβ (1-40) (Bachem Inc., Torrance, CA, USA; Los Nr. WM365) in Mikrozentrifugenröhrchen bei 37°C für 1 Woche (in dreifacher Ausführung), entweder allein oder in der Gegenwart von 1,25 mM (d.h. 1:50 M Verhältnis von Aβ:Testverbindung) (im Ausnahme von PTI-00700, welches wie später beschreiben isoliert und verwendet wurde) von verschiedenen Verbindungen in 150 mM Tris HCl, 10 mM NaCl, pH 7,0 (TBS) inkubiert. Zu den getesteten Verbindungen zählen PTI-07499 (Mannosepentasulfat, Kaliumsalz), PTI-20049 (Methyl-alpha-d-Glucopyranosid 2,3,4,6-tetrasulfat, Kaliumsalz), PTI-20814 (Methyl alpha-D-mannopyranosid 2,3,4,6-tetrasulfat, Kaliumsalz), PTI-70936 (Saccharoseheptasulfat, Kaliumsalz), PTI-70946 (Saccharosehexasulfat, Kaliumsalz), PTI-70011 (Saccharoseoctasulfat, Kaliumsalz), PTI-00800 (Glucosamin, Sulfatsalz, von enzymatischer Therapie, Green Bay, Wisconsin und kommerziell bekannt als „Glucosaminsulfat"), PTI00900 (Glucosamin, Sulfatsalz, von Jarrows Formulas, Los Angeles, CA, und kommerziell als „Glucosaminsulfat 500" bekannt), und PTI-00700, (Glucosamin, Sulfatsalz, mit Uncaria tomentosa). PTI-00700 wurde aus konservierungsmittelfreien Kapseln, die 400 mg Gemisch aus Glucosamin (Sulfatsalz) und 50 mg Uncaria tomentosa Innenrinde enthält, abgeleitet. Für diese Studien wurde das Pulver innerhalb einer Kapsel von PTI-00700 in 5 ml destilliertem Wasser extrahiert und durch Schwerkraft pelletiert. Die lösliche Fraktion wurde dann erhalten und in diesen Studien bei einer Endverdünnung von 1:227 in Tris-gepufferter Salzlösung (TBS) (vergleichbar zu der Konzentration von anderen Verbindungen, die bezüglich Glucosamin getestet wurden) verwendet.
Um die Wirkung von jeder Verbindung auf die Aβ (1-40) Fibrillenbildung zu beurteilen, wurden 50 μl Aliquote von jedem Röhrchen für die Analyse bei 1 Stunde, 1 Tag, 3 Tage und 1 Woche entnommen. Für jede oben beschriebene Bestimmung wurde, im Anschluss an jede Inkubationsperiode, 50 μl Aβ +/– Testverbindungen zu 1,2 ml 100 μM Thioflavin T (Sigma Chemicals Co. St. Louis, MO) in 50 mM NaPO₄ (pH 6,0) hinzugefügt. Die Studien wiesen darauf hin, dass zunehmende Konzentrationen von Aβ eine proportionale Zunahme in der Fluoreszenz in der Gegenwart von 100 μM Thioflavin T ergaben, was die Gegenwart von jeglichen übertriebenen innerer Filterwirkungen in diesen Studien ausschließt. Die Fluoreszenzemission bei 482 nm auf einem Turner Instrument Modell 450 Fluorometer bei einer Anregungswellenlänge von 450 nm gemessen. Für jede Bestimmung wurde das Fluorometer durch Nullpunktstellen in der Gegenwart des Thioflavin T Reagenzes allein und durch Einstellen von 50 ng/ml Riboflavin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) in dem Thioflavin T Reagenz auf 1800 Fluorezenzeinheiten kalibriert. Alle Fluoreszenzbestimmungen basierten auf diesen Referenzen und jede Fluoreszenz, die von irgendeiner der Verbindungen in der Gegenwart des Thioflavin T Reagenzes abgegeben wurde, wurde immer von allen entsprechenden Messwerten abgezogen.
Für alle Fibrillogenesestudien, die die Thioflavin T Fluorometrie benutzen, wie hierin offenbart, basierten alle Vergleiche von Amyloidprotein in der Gegenwart oder Abwesenheit von Testverbindungen auf den gepaarten Student t-Tests, wobei die Daten als Mittelwert +/– Standardabweichung gezeigt sind. Die Signifikanz wurde bei den 95% (p < 0,05), 99% (p < 0,01) und 99,999% (p < 0,001) Konfidenzintervallen berichtet.
Wie in 1 gezeigt, wurden die Wirkungen dieser verschiedenen Testverbindungen auf die Alzheimer Aβ (1-40) Amyloidfibrillenbildung über eine Inkubationsperiode von 1 Woche evaluiert. Firsch suspendiertes Aβ (1-40) allein, im Anschluss an eine einstündige Inkubation bei 37°C, demonstrierte eine anfängliche Fluroeszenz von 75 +/– 9 Fluoreszenzeinheiten. Während der einwöchigen Inkubationsperiode gab es eine graduelle Zunahme in der Fluoreszenz von Aβ(1-40) allein, und zwar eine 6,1-fache Zunahme von 1 Stunde zu 1 Woche, mit einer Spitzenfluoreszenz von 459 +/– 18 Fluoreszenzeinheiten, die bei 1 Woche beobachtet wurde (1), was mit frühren Studien übereinstimmt (Castillo et al. J. Neurochem. 69:2452-2465, 1997). Von allen getesteten Verbindungen inhibierte nur Glucosamin (Sulfatsalz) enthaltende Uncaria tomentosa (d.h. PTI-00700) die Aβ (1-40) Amyloidfibrillbildung signifikant. Glucosamin (Sulfatsalz), das von zwei unterschiedlichen Quellen (d.h. PTI-00800 und PTI-00900) abgeleitet ist, welche Uncaria tomentosa nicht enthielten, inhibierten die Aβ (1-40) Amyloidfibrillenbildung nicht signifikant (1). Dies weist darauf hin, dass der aktive Amyloid inhibierende Wirkstoff am wahrscheinlichsten Uncaria tomentosa war. Die signifikante Inhibierung von Aβ Amyloidfibrillenbildung durch Glucosamin (Sulfatsalz) enthaltende Uncaria tomentosa (d.h. PTI-00700) wurde schon nach 1 Stunde detektiert. Signifikante Inhibierung (p < 0,001) durch Glucosamin (Sulfatsalz) enthaltende Uncaria tomentosa auf die Aβ Amyloidfibrillenbildung wurde zu allen Zeitpunkten einschließlich 1 Stunde, 1 Tag, 3 Tage und 1 Woche beobachtet. Nach 1 Woche war Glucosamin (Sulfatsalz) enthaltendes Uncaria tomentosa beim signifikanten (p < 0,001) Inhibieren der Amyloidfibrillenbildung um 78% wirksam. Diese anfänglichen Daten deuteten an, dass Glucosamin (Sulfatsalz) enthaltendes Uncaria tomentosa ein potenter Inhibitor der Alzheimer Amyloidfibrillenbildung war.
Beispiel 2
Uncaria tomentosa in der aktive Wirkstoff und ein potenter Inhibitor der Alzheimer Aβ (1-40) Amyloidfibrillenbildung
Die nächsten Studien wurden ausgeführt, um einige der ursprünglich erfassten Daten zu reproduzieren und um zu bestimmen, ob der aktive Wirkstoff, welcher Aβ Amyloidfibrillenbildung inhibiert, tatsächlich Uncaria tomentosa war. In diesen Studien wurden die Wirkungen von verschiedenen Verbindungen auf die Alzheimer Aβ (1-40) Fibrillogenese wiederum mittels Thioflavin T Fluorometrie beurteilt. Für diese Studien wurde 25 μM Aβ (1-40) (Bachem Inc. Torrance, CA, USA; Los Nr. WM365) in Mikrozentrifugenröhrchen bei 37°C für 1 Woche (in dreifacher Ausführung), entweder allein oder in der Gegenwart von 1,25 mM (d.h. 1:50 M Verhältnis von Aβ:Testverbindung) von verschiedenen Verbindungen (mit Ausnahme von PTI-00700, PTI-00701 und PTI-00703, welche wie später beschrieben isoliert und verwendet wurden) in 150 mM Tris HCl, 10 mM NaCl, pH 7,0 (TBS) inkubiert. Die getesteten Verbindungen umfassten Glucosamin (Sulfatsalz) enthaltende Uncaria tomentosa (PTI-00700), Glucosamin (Sulfatsalz) enthaltende Uncaria tomentosa, welches durch einen Filter filtriert wurde, welcher eine 30 Kilodalton Ausschlussgrenze enthielt (PTI-00700 < 30 kDa), Glucosamin (Hydrochloridsalz) enthaltende Uncaria tomentosa (PTI-00700), reines Glucosamin (PTI-00712; Molekulargewicht = 216; erhalten von der Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA), reines Galactosamin (PTI-00713, Molekulargewicht) 216, erhalten von der Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA), Natriumsulfat (PTI-00725, Molekulargewicht = 142, erhalten von der Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA), und Uncaria tomentosa (PTI-00703, erhalten aus einer kommerziellen Quelle). Für diese Studien wurde das Pulver innerhalb einer Gelatine-überzogenen Kapsel von Glucosaminsulfat enthaltender Uncaria tomentosa (PTI-00700) in 5 ml destilliertem Wasser extrahiert und für das Testen, wie in Beispiel 1 beschrieben, verwendet. Das Pulver innerhalb einer Gelatine-überzogenen Kapsel von Glucosamin (Hydrochloridsalz) enthaltender Uncaria tomentosa (PTI-00701) wurde in 5 ml destilliertem Wasser extrahiert und bei einer Endverdünnung von 1:40 in TBS verwendet (welches den Gesamtextrakt darstellt, der von 250 μg Uncaria tomentosa pro ml erhalten wurde), wohingegen das Pulver innerhalb einer Gelatine-überzogenen Kapsel von Uncaria tomentosa (PTI-00703) wurde in 5 ml destilliertem Wasser extrahiert und bei einer Endverdünnung von 1:250 in TBS verwendet wurde (welches den Gesamtextrakt darstellt, der von 350 μg Uncaria tomentosa pro ml stammt).
Um die Wirkungen von jeder Verbindung auf die Alzheimer Aβ (1-40) Fibrillenbildung zu beurteilen, wurden 50 μl Aliquote von jedem Röhrchen für die Analyse nach 1 Stunde, 1 Tag, 3 Tagen und 1 Woche unter Verwendung der Thioflavin T Fluorometrie, wie oben beschrieben, entnommen. Wie in 2 gezeigt, wurden die Wirkungen dieser verschiedenen Testverbindungen auf die Aβ (1-40) Amyloidfibrillenbildung über eine Inkubationsperiode von 1 Woche evaluiert. Frisch zubereitetes Aβ (1-40) allein, im Anschluss an eine einstündige Inkubation bei 37°C, demonstrierte eine anfängliche Fluoreszenz von 113 +/– 7 Fluoreszenzeinheiten. Während der einwöchigen Inkubationsperiode gab es einen graduellen Anstieg in der Fluoreszenz von Aβ (1-40) allein, wobei sie sich um das 2,2-fache von 1 Stunde zu 1 Woche erhöht, mit einer bei 1 Woche beobachteten Spitzenfluoreszenz von 250 +/– 50 Fluoreszenzeinheiten. Glucosamin (Sulfatsalz) enthaltende Uncaria tomentosa (PTI-00700) und Glucosamin (Sulfatsalz) enthaltende Uncaria tomentosa, welches durch einen Filter, der eine 30 Kilodalton Ausschlussgrenze besaß (PTI-00700 < 30 kDa) filtriert wurde, waren beide potente Inhibitoren von Aβ Amyloidfibrillenbildung, die eine 68% bzw. 72% Inhibierung nach 1 Woche bewirkten (2). Eine sogar noch potentere Inhibierung der Amyloidfibrillenwirkung wurde mit Glucosamin (Hydrochloridsalz) enthaltendem Uncaria tomentosa (PTI-00701) beobachtet, die eine 90% Inhibierung der Aβ Amyloidfibrillenbildung nach 1 Woche hervorruft. Jede dieser potenten Verbindungen inhibierte die Amyloidfibrillenbildung so früh wie 1 Stunde nach der Inkubation signifikant. Dieser aktive Inhaltsstoff, von welchem erachtet wurde, diese potente inhibierende Wirkung auf die Amyloidfibrillenbildung auszuüben, war Uncaria tomentosa, das innerhalb dieser kommerziellen Zubereitungen enthalten ist. Dies war aufgrund der Tatsache, dass Glucosamin (PTI-00712), welches Uncaria tomentosa nicht enthielt, keinerlei inhibierende Wirkung auf die Amyloidfibrillenbildung hatte. Zusätzlich bewirkte reines Uncaria tomentosa (PTI-00703) eine ähnliche inhibierende Wirkung (73% Inhibierung nach 1 Woche, und eine 93% Inhibierung nach 1 Stunde) auf die Amyloidfibrillenbildung zu jener, die mit Glucosamin (Sulfatsalz) enthaltendem Uncaria tomentosa beobachtet wurde. Diese Daten deuteten an, dass der aktive Inhaltsstoff, welcher ein potenter Inhibitor der Alzheimer Krankheit Amyloidfibrillenbildlung war, Uncaria tomentosa war.
Beispiel 3
Glucosamin (Sulfatsalz) enthaltende Uncaria tomentosa (PTI-00700) inhibiert das alzheimersche Amyloidfibrillenwachstum
Bei der Alzheimer Krankheit und anderen Amyloidosen wird angenommen, dass das Amyloidfibrillenwachstum Amyloidprotein-Selbstinteraktionen (d.h. Aβ-Aβ-Interaktionen) einschließt. Irgendein potentiell wirksamer therapeutischer Wirkstoff für Amyloidablagerung, Akkumulation und/oder Persistenz sollte ebenfalls in der Lage sein, eine Inhibierung der Amyloidprotein-Selbstinteraktion zu inhibieren. Dies ist für das Verhindern jeglicher neuen Amyloidfibrillenbildung wichtig, wenn Patienten mit Alzheimer Krankheit in frühen Stadien der Krankheit behandelt werden. ELISA Methodologien (d.h. Festphasenbindungsuntersuchungen) wurden deshalb verwendet, um Verbindungen zu identifizieren, welche zum Inhibieren von Aβ-Aβ Interaktionen fähig sind (d.h. Alzheimer Amyloidfibrillenwachstum).
Aβ (1-40) wurde zuerst mit Biotin gemäß dem folgenden Protokoll markiert. 1 mg Aβ(1-40) (Bachem Inc., Torrance, CA, USA; Los Nr. WL934) wurde in 200 μl PBS (pH 8,0) aufgelöst und für 1 Woche bei 37°C inkubiert. Die fibrilläre Aβ Lösung wurde dann zu 0,2 mg Biotinylierungsagens [(Sulfosuccinimidyl-6-(biotinamido)hexanoat)](sulfo-NHS-LC-Biotin) hinzugefügt und für 45 Minuten bei Raumtemperatur (gemäß dem Herstellerprotokoll, Pierce) inkubiert. Um überschüssiges Sulfo-NHS-LC-Biotin, welches nicht in Aβ eingebaut ist, zu entfernen, wurde 25 μl 3M Natriumacetat und 1 ml Ethanol zu der Lösung hinzugefügt, vorgetext und dann bei 14.000 × g für 20 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde dann verworfen und das Pellet wurde in 200 μl destilliertem Wasser resuspendiert und mit Ethanol, welcher 2,5% 3M Natriumacetat enthält, repräzipitiert. Die Zentrifugationsschritte (oben beschrieben) wurde dann wiederholt. Das Pellet, welches fibrillisiertes Aβ enthält, welches biotinyliert war (an der nicht selbst-interagierenden Region von Aβ), wurde dann in 1 ml destilliertem, deionisiertem Wasser resuspendiert. Die Menge an eingebautem Biotin wurde dann unter Verwendung des HABA (2-(4'-Hydroxyazobenzen)benzoesäure) Verfahrens (gemäß dem Herstellenprotokoll; Pierce) bestimmt.
2 μg unmarkiertem Aβ in 40 μl Tris-gepufferter Salzlösung, welche 100 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 3 mM NaN₃, pH 7,0 (TBS) enthält, wurde ermöglicht, über Nacht bei 4°C an Mikrotiterkammern (Nunc plates, Maxisorb) zu binden. Am nächsten Tag wurden alle der Mikrotiterkammern für 2 Stunden durch Inkubieren mit 300 μl TBS mit 0,05% Tween-20 (TTBS) plus 2% Rinderserumalbumin (BSA) (erhalten von der Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA) blockiert. Dann wurden 100 μl biotinyliertes Aβ 1-40 in TTBS, in der Gegenwart oder Abwesenheit von 1,25 mM Testverbindungen (später beschrieben) in Kammern (in dreifacher Ausführung), die Substrat, welches an unmarkiertes Aβ oder Blank gebunden ist, enthält, eingebracht und ermöglicht, über Nacht bei 4°C zu binden. Am nächsten Tag wurden die Kammern 3 Mal mit TTBS gespült und dann für 2 Stunden mit 100 μl Streptavidin-Peroxidase oder Anti-Biotinperoxidase (1:500 Verdünnung einer 2 μg/ml Lösung) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) in 0,1% BSA enthaltender TTBS sondiert. Die Kammern wurden dann 3 Mal mit TTBS gespült und 100 μl Substratlösung (OPD-Sigma Fast von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) wurde zu jeder Kammer hinzugefügt und ermöglicht, für 5 Minuten oder bis eine signifikante Farbänderung beobachtet wurde zu entwickeln. Die Reaktion wurde mit 50 μl 4N H₂SO₄ gestoppt und auf einem Modell 450 Mikroplattenleser (Biorad, Hercules, CA, USA) bei 490 nm gemessen.
Zu den getesteten Verbindungen zählen Saccharoseoctasulfat (PTI-70011), Saccharosehexasulfat (Kaliumsalz) (PTI-70946), Saccharoseheptasulfat (Kaliumsalz) (PTI-70936), Methyl-Alpha-D-Mannopyranosid 2,3,4,6-tetrasulfat (Kaliumsalz) (PTI-20814), Methyl alpha-D-glucopyranosid 2,3,4,6-tetrasulfat (Kaliumsalz) (PTI-20049), Glucosamin (Sulfatsalz) (enzymatische Therapie, Green Bay, Wisconsin) (PTI-00800), Glucosamin (Sulfatsalz von Jarrows Formulas, Los Angeles, CA, kommerziell als „Glucosaminsulfat 500" bekannt) (PTI-00900), Glucosamin (Sulfatsalz) enthaltende Uncaria tomentosa (PTI-00700), Heparin (PTI-H98546), Chondroitin-4-sulfat (PTI-C45770) und Dermatansulfat (PTI-D58901). Glucosamin (Sulfatsalz) enthaltende Uncaria tomentosa (PTI-00700) wurde isoliert und bei einer Verdünnung von 1:227 in 0,05% Tween-20 enthaltender Tris-gepufferter Salzlösung (TTBS) verwendet, wie in Beispiel 2 beschrieben.
Wie in 3 gezeigt, war nur Glucosamin (Sulfatsalz) enthaltende Uncaria tomentosa (PTI-00700) beim Hervorrufen einer signifikanten (p < 0,001) 70% Reduktion der Aβ-Aβ-Interaktionen wirksam. Der aktive Inhaltsstoff, welcher diese Inhibierung hervorrufte, war Uncaria tomentosa, da reines Glucosamin (Sulfatsalz), welches aus zwei unterschiedlichen Quellen (d.h. PTI-00800 und PTI-00900) erhalten wurde, keinerlei inhibierende Wirkungen auf das Amyloidfibrillenwachstum hatte (3). Diese Daten demonstrierten, dass Glucosamin (Sulfatsalz) enthaltend Uncaria tomentosa ein wirksamer Inhibitor von Aβ-Aβ-Interaktionen war, und dass der aktive Inhaltsstoff, welcher ein wirksamer Inhibitor des Alzheimer Krankheit Amyloidfibrillenwachstums war, Uncaria tomentosa war.
Beispiel 4
Glucosamin (Sulfatsalz) enthaltende Uncaria tomentosa inhibiert Aβ-Proteoglycan/Glycosaminglycan Interaktionen in einer dosisabhängigen Art und Weise
Eine Studie wurde eingeschlossen, um zu bestimmen, ob Glucosamin (Sulfatsalz) enthaltende Uncaria tomentosa ein wirksamer Inhibitor von Aβ-Proteoglycan/Glycosaminoglycan (PG/GAG) Interaktionen war. Da gefunden wurde, dass PGs/GAGs in Amyloidablagerungen akkumulieren, und von diesen angenommen wird, die natürliche Fähigkeit des Körpers zu unterbinden, um ungewünschtes „Amyloid" zu entfernen (besprochen in Snow and Wight, Neurobiology Aging 10:481-497, 1989), ist ein Inhibitor der Aβ-PG/GAG Interaktionen ein wünschenswertes zusätzliches Ziel für ein Amyloidtherapeutikum. In dieser Studie wurde eine Festphasenbindungsimmununtersuchung benutzt, um zu bestimmen, ob Glucosamin (Sulfatsalz) enthaltende Uncaria tomentosa (PTI-00700) ein wirksamer Inhibitor von Aβ-PG/GAG Interaktionen war und ob diese Inhibierung in einer dosisabhängigen Art und Weise stattfand.
12 μg Perlecan (isoliert aus dem Engelbreth-Holm-Swarm Sarkom) (Castillo et al. J. Biochemistry 120:433-444, 1996), Heparin (Molekulargewicht = 5 kDa; erhalten von der Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA) oder Hepara Insulfat (Molekulargewicht = ~70 kDa, erhalten von Seikagaku America, Rockville, Maryland) in 80 μl Tris-gepufferter Salzlösung enthaltend 100 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 3 mM NaN₃, pH 9,0 (TBS) wurde ermöglicht, über Nacht bei 4°C an Mikrotiterkammern (Nunc Plates, Maxisorb) zu binden. Am nächsten Tag wurden alle Mikrotiterplatten für 2 Stunden durch Inkubieren mit 300 μl TBS mit 0,05% Tween-20 (TTBS) plus 1% Rinderserumalbumin (BSA) (erhalten von der Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA) blockiert. Dann wurden 100 μl Aβ 1-40 (5 μM) (Bachem Inc., Torrance, CA, USA; Los Nr. WM365) in TTBS enthaltend 0,05% Albumin in der Gegenwart oder Abwesenheit von 5 μl Glucosamin (Sulfatsalz) enthaltendem Uncaria tomentosa (PTI-00700) in Kammern (in dreifacher Ausführung), die an PG/GAG oder Blank gebundenes Substrat enthalten, eingebracht und ermöglicht, über Nacht bei 4°C zu binden. Für die Studie wurde ein Wasserextrakt von Glucosamin (Sulfatsalz) enthaltendem Uncaria tomentosa (d.h. PTI-00700) durch Entnahme des Pulvers von 1 Gelatine-überzogenen Kapsel/Pille (welche 50 mg Uncaria tomentosa enthält) und zweimaliges Extrahieren mit 2,5 ml doppeldestilliertem Wasser und dann Zusammenführen der zwei Wasserextrakte abgeleitet (als „PTI-00700 Lösung" bezeichnet). Die PTI-00700 Lösung wurde dann unverdünnt (welches 1/1.000tel einer einzelnen Pille darstellt) oder mit destilliertem Wasser bei einem Verhältnis von 1:3 (d.h. 1/3.000tel einer einzelnen Pille), 1:9 (d.h. 1/9000tel einer einzelnen Pille) oder 1:27 (1/27.000tel einer einzelnen Pille) verdünnt verwendet. Am nächsten Tag wurden die Kammern einmal mit TTBS gespült und dann für 45 Minuten mit 100 μl Anti-6E10 (Senetek, Maryland Heights, Missouri) (welches Aβ 1-17 erkennt), mit TTBS 1:1000 verdünnt, sondiert. Diesem folgte ein einmaliges Spülen mit TTBS und Sondieren für 45 Minuten mit biotinylierter Ziege-Anti-Maus (verdünnt 1:1000) enthaltender Streptravidin-Peroxidase oder Anti-Biotinperoxidase (1:500 Verdünnung einer 2 μg/ml Lösung) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) in 0,1% BSA enthaltendem TTBS. Die Kammern wurden dann 3 mal mit TTBS gespült und 100 μl einer Substratlösung (OPD-Sigma Fast von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) wurde zu jeder Kammer hinzugefügt und ermöglicht, sich für 5 Minuten oder bis eine signifikante Farbänderung beobachtet wurde zu entwickeln. Die Reaktion wurde mit 50 μl 4 N H₂SO₄ gestoppt und auf einem Modell 450 Mikroplattenleser (Biorad, Hercules, CA, USA) bei 490 nm gemessen.
Wie in 4 gezeigt, war das unverdünnte Glucosamin (Sulfatsalz) enthaltende Uncaria tomentosa (PTI-00700) (welches 1/1.000tel einer einzelnen Pille darstellt) sehr wirksam (um 64%) beim Inhibieren von Aβ-Heparin/Heparansulfat-Interaktionen. Eine signifikante (p < 0,001) 49% Inhibierung wurde auch mit einer 1:3 Verdünnung (d.h. 1/3.000tel einer einzelnen Pille) von PTI-00700 beobachtet, während eine 1:9 Verdünnung (1/19.000tel einer einzelnen Pille) von PTI00700 nach wie vor eine signifikante (p < 0,01) 35% Inhibierung bewirkte. Es wurde herausgefunden, dass eine 1:27 Verdünnung (d.h. 1/27.000tel einer einzelnen Pille) von PTI-00700 eine signifikante Inhibierung von Aβ-Heparin/Heparansulfatbindung nicht bewirkte. Diese Daten demonstrierten, dass Glucosamin (Sulfatsalz) enthaltende Uncaria tomentosa ebenfalls in der Lage war, Aβ-PG/GAG Interaktionen in einer dosisabhängigen Art und Weise zu inhibieren.
Beispiel 5
Uncaria tomentosa bewirkt eine Auflösung von vorgeformten Alzheimer Krankheit Amyloidfibrillen in einer dosisabhängigen Art und Weise und innerhalb einer 2-Stunden Periode
Eine Studie wurde implementiert, um zu bestimmen, ob ein relativ reiner Uncaria tomentosa Extrakt in der Lage war, eine „Auflösung" oder „Auftrennung" von vorgeformten Alzheimer Krankheit Amyloidfibrillen zu bewirken. Diese Art von Aktivität würde für jedes potentielle Anti-Amyloid-Arzneimittel wichtig sein, welches in Patienten verwendet werden kann, die bereits wesentliche Amyloidablagerungen in Organen und/oder Geweben aufweisen. Beispielsweise weisen Alzheimer Krankheit Patienten im mittleren bis späteren Stadium reichliche Amyloidablagerungen in ihren Hirnen als Teil von sowohl neuritischen Plaques als auch cerebrovaskulären Amyloidablagerungen auf. Ein natürliches therapeutisches Mittel, welches zum Bewirken einer Auflösung von vorexistierendem Amyloid fähig ist, wäre für die Verwendung in diesen Patienten vorteilhaft, die in späteren Stadien des Krankheitsprozesses sind.
Für dieser Studie wurde 1 mg Aβ (1-40) (Bachem Inc., Torrance, CA, USA; Los Nr. WM 365) in 1,0 ml doppeldestilliertem Wasser (1 mg/ml Lösung) aufgelöst und dann bei 37°C für 1 Woche inkubiert, um eine reichliche alzheimersches Aymloidfibrillenbildung hervorzurufen. 6 μl (25 μM) von fibrillisiertem Aβ wurde dann für 2 Stunden bei 37°C in der Gegenwart oder Abwesenheit von 1,5 μl Uncaria tomentosa (PTI-00703) (später beschrieben), welches in 37,5 μl doppeldestilliertem Wasser aufgelöst wurde, und 15 μl enthaltend 150 mM Tris HCl, 10 mM NaCl, pH 7,0 inkubiert. Nach der Inkubation für 2 Stunden wurden 50 μl Aliquote zu 1,2 ml 100 μM Thioflavin T (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) in 50 mM NaPO₄ (pH 6,0) für Fluorometrie-Messungen hinzugefügt, wie in Beispiel 1 oben beschrieben ist.
Für diese Studie umfassten die getesteten Verbindungen einen Wasserextrakt von Uncaria tomentosa, welches durch Entnahme des Pulvers von 10 Gelantine-überzogenen Kapseln von Uncaria tomentosa (welche ~350 mg Uncaria tomentosa pro Kapsel enthalten) und zweimaliges Extrahieren mit 25 ml doppeldestilliertem Wasser und dann Zusammenführen der zwei Wasserextrakte abgeleitet (als „Uncaria tomentosa Lösung" bezeichnet). Die Uncaria tomentosa Lösung wurde dann entweder unverdünnt (welches 1/3.333tel einer einzelnen Pille darstellt) oder in destilliertem Wasser weiter verdünnt bei Verhältnissen von 1:3 (d.h. 1/10.000tel einer einzelnen Pille), 1:9 (d.h 1/30.000tel einer einzelnen Pille) oder 1:27 (1/90.000tel einer einzelnen Pille) verwendet.
Wie in 4 gezeigt ist, war unverdünntes (d.h. 1/3.333 einer einzelnen Pille) Uncaria tomentosa (PTI-00703) äußerst wirksam und bewirkte eine 70% Auflösung von vorgeformten Alzheimer Aβ Amyloidfibrillen innerhalb der Inkubationsperiode von 2 Stunden. Eine signifikante (p < 0,001) 63% Auflösung von vorgeformten Alzheimer Aβ Amyloidfibrillen wurde auch mit einer 1:3 Verdünnung (d.h. 1/10.000tel einer einzelnen Pille) einer Uncaria tomentosa Lösung beobachtet, wohingegen eine 1:9 Verdünnung (d.h. 1/30.000tel einer einzelnen Pille) einer Uncaria tomentosa Lösung nach wie vor eine signifikante (p < 0,01 60% Auflösung bewirkte. Andererseits bewirkte eine 1:27 Verdünnung (d.h. 1/90.000tel einer einzelnen Pille) einer Uncaria tomentosa Lösung keine signifikante Auflösung von vorgeformten Aβ Amyloidfibrillen. Diese Daten demonstrierten, dass Uncaria tomentosa eine Auflösung von vorgeformten Alzheimer Krankheit Amyloidfibrillen in einer dosisabhängigen Art und Weise bewirken. Bestätigung der „Auflösungswirkung" von Uncaria tomentosa auf die Alzheimer Krankheit Amyloidfibrillen wurde durch Kongorot-Färbungsuntersuchungen demonstriert, wobei eine markante Reduktion von Congophilia (d.h. rot/grüne Doppelbrechung, wenn unter polarisiertem Licht betrachtet, und welche eine Auflösung/Auftrennung der Amyloidfibrillenstruktur darstellt) beobachtet wurde, wenn Aβ Amyloidfibrillen mit Uncaria tomentosa für 2 Stunden behandelt wurden (nicht gezeigt).
Beispiel 6
Uncaria tomentosa in flüssiger Form und von anderen kommerziellen Quellen bewirkt ebenfalls eine Auflösung von vorgeformten Alzheimer Krankheit Amyloidfibrillen
Die nächste Studie bestimmte, ob Uncaria tomentosa, welches von einer anderen kommerziellen Quelle (auch als PTI-00703-2 bezeichnet) stammt, ebenfalls beim Hervorrufen einer Auflösung/Zerstörung von vorgeformten Alzheimer Krankheit Aβ (1-40) Amyloidfibrillen wirksam war. Diese Studie adressiert auch, ob ein Extrakt, der von Uncaria tomentosa in flüssiger Form (kommerziell verfügbar für den oralen Konsum durch Menschen) abgeleitet ist, eine ähnliche Auflösung von vorgeformten Aβ Amyloidfibrillen bewirkte, wie unter Verwendung von Uncaria tomentosa beobachtet wurde, welches von einer Gelatine-überzogenen Kapselform stammt. Für diese Studie wurde das oben in Beispiel 5 beschriebene Protokoll verwendet. In Kürze, 1 mg Aβ (1-40) (Bachem Inc. Torrance, CA, USA; Los Nr. WM365) wurde in 1,0 doppeldestilliertem Wasser (1 mg/ml Lösung) aufgelöst und dann bei 37°C für 1 Woche inkubiert. 6 μl (25 μM) fibrillisiertes Aβ wurde dann für 2 Stunden bei 37°C in der Gegenwart oder Abwesenheit von 1,5 μl von Flüssigkeit stammendem Uncaria tomentosa (PTI-00703-2), welches in 37,5 μl doppeldestilliertem Wasser aufgelöst ist, und 15 μl enthaltend 150 mM Tris HCl, 10 mM NaCl, pH 7,0 inkubiert. Im Anschluss an eine 2 Stunden Inkubation wurden 50 μl Aliquote zu 1,2 ml 100 μM Thioflavin T (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) in 50 mM NaPO₄ (pH 6,0) für Fluorometrie-Messungen hinzugefügt, wie in Beispiel 1 beschrieben.
Wie in 6 gezeigt, war Flüssigkeits-abgeleitetes Uncaria tomentosa beim Bewirken einer Auflösung/Auftrennung von vorgeformten Aβ Amyloidfibrillen äußerst wirksam. Eine signifikante (p < 0,001) 70% Auflösung von vorgeformten Aβ Amyloidfibrillen wurde unter Verwendung von Flüssigkeits-abgeleitetem Uncaria tomentosa innerhalb einer zweistündigen Inkubationsperiode beobachtet. Diese Studie demonstrierte, dass Uncaria tomentosa ein wirksames Auflösungsmittel von vorgeformten Alzheimer Krankheit Amyloidfibrillen war, ungeachtet der Quelle von Uncaria tomentosa, und ungeachtet, ob das verwendete Uncaria tomentosa in fester (d.h. Kapsel) oder flüssiger Form vorliegt.
Beispiel 7
Dosisabhängige Auflösung von vorgeformten Alzheimer Krankheit Amyloidfibrillen durch Uncaria tomentosa Extrakt, der von einer dritten kommerziellen Quelle erhalten wurde.
Die nächste Studie bestimmte, ob Uncaria tomentosa, das von einer noch anderen kommerziellen Quelle erhalten wurde, ebenfalls beim Bewirken einer Auflösung/Auftrennung von vorgeformten Alzheimer Krankheit Amyloidfibrillen wirksam war. Für diese Studie wurde Uncaria tomentosa von dem Pulver innerhalb von Gelatine-überzogenen Kapseln von einer dritten kommerziellen Quelle (auch als PTI-00703-R bekannt) erhalten und wie unten beschrieben verwendet. Für diese Studie wurde eine einzelne Gelatine-überzogene Kapsel, welche reines Uncaria tomentosa enthielt, geöffnet und der braune Pulverinhalt wurde mit 1 ml Propanol extrahiert, gefolgt von Zentrifugation (14.000 × g für 15 Minuten). 0,1 μl des Propanolextraktes wurde bei 490 nm gemessen und es wurde gefunden, dass es 0,0004 OD Einheiten entspricht. Die Fibrillenauflösungsuntersuchung wurde, wie in Beispiel 5 beschrieben, unter Verwendung von 0,1 μl (d.h. 1 μl wurde mit doppeldestilliertem Wasser bei einer 1:10 Verdünnung verdünnt und 1 μl wurde verwendet), 1 μl, 2 μl und 4 μl des PTI-00703-R Extraktes verwendet. Diese Mengen repräsentieren 1/10.000tel, 1/1.000tel, 1/500tel bzw. 1/250tel des Gesamextraktes von einer einzelnen Pille.
Wie in 7 gezeigt, bewirkte Uncaria tomentosa, das von einer einzelnen Gelatine-überzogenen Kapsel oder Pille erhalten wurde, eine dosisabhängige Auflösung/Auftrennung von Alzheimer Aβ Amyloidfibrillen und innerhalb einer Inkubationsperiode von 2 Stunden. Eine 1/10.000tel Portion, die von einer einzelnen Kapsel erhalten wurde, bewirkte eine signifikante (p < 0,001) 58% Auflösung, wohingegen eine 1/1.000 Portion, die von einer einzelnen Kapsel erhalten wurde, eine signifikante (p < 0,001) 81% Auflösung bewirkte. Eine 1/500 Protein von einer einzelnen Kapsel bewirkte eine signifikante (p < 0,001) 93% Auflösung, wohingegen eine 1/250tel Portion von einer einzelnen Pille eine signifikante (p < 0,001) 97% Auflösung bewirkte. Diese Studie bewirkte, dass Uncaria tomentosa, das von noch einer anderen Quelle erhalten wurde, ein potentes Mittel war, welches eine dosisabhängige Auflösung von vorgeformten Alzheimer Krankheit Amyloidfibrillen bewirkt. Zusätzlich war der verdünnte Inhalt von einer einzelnen Gelatine-überzogenen Kapsel/Pille von Uncaria tomentosa (welches derzeit von Menschen oral konsumiert wird) äußerst effektiv beim Bewirken einer Auflösung/Auftrennung von vorgeformten alzheimerschen Amyloidfibrillen.
Beispiel 8
Uncaria tomentosa Extrakt bewirkt eine Auflösung von Aβ (1-42) Alzheimer Amyloidfibrillen
Die Amyloidfibrillen der Alzheimer Krankheit bestehen hauptsächlich aus Aβ in einer Form, die die Reste 1-40 oder 1-42 enthält. Die längere Variante von Aβ enthält zwei hydrophobe Reste, welche beinahe unmittelbar eine beachtliche Fibrillenbildung bewirken (Castillo et al, J. Neurochem. 69:2452-2465, 1997). Es wird auch angenommen, dass Aβ 1-42 die vorherrschende Form Aβ ist, die in Alzheimer Amyloidplaques existiert, wohingegen angenommen wird, dass Aβ 1-40 die vorherrschende Form von Aβ ist, die in den Alzheimer cerebrovaskulären Amyloidablagerungen existiert (Tamaoka et al. Br. Res. 679:151-156, 1995; Biochem. Biophys. Res. Comm. 205:834-842, 1994). Die nächste Studie wurde deshalb implementiert, um zu bestimmen, ob Uncaria tomentosa ebenfalls eine Auflösung/Auftrennung von vorgeformten Aβ(1-42) Amyloidfibrillen bewirkt und ob dieser Effekt dauerhaft war.
Für diese Studie wurde das Verfahren der Thioflavin T Fluorometrie verwendet, welches in Beispiel 5 beschrieben ist. In Kürze, 30 μl von 250 μM Aβ (1-42) (Bachem Biosciences, King of Prussia, PA, USA; Los Nr. 508780) wurde mit 7,5 μl Uncaria tomentosa Stammlösung (wie später beschrieben), 75 μl 4 × TBS und 187,5 μl doppeldestilliertem Wasser (pH 7,0) gemischt und in Mikrozentrifugenröhrchen bei 37°C für 4 Tage (in dreifacher Ausführung), entweder allein oder in der Gegenwart von Uncaria tomentosa inkubiert. Der Wasserextrakt von Uncaria tomentosa (PTI-00703) wurde durch Entnahme des Pulverinhaltes von 10 Gelantine-überzogenen Kapseln von Uncaria tomentosa und zweimaliges Extrahieren mit 25 ml doppeldestilliertem Wasser abgeleitet. Der Extrakt wurde dann 1:250 in doppeldestilliertem Wasser (1 ml Stammlösung repräsentierte den Gesamtextrakt, der von 350 μg Uncaria tomentosa stammt) verdünnt, um eine Uncaria tomentosa Stammlösung zu erzeugen.
Wie in 8 gezeigt, demonstrierte frisch suspendiertes Alzheimer Aβ (1-42) allein, im Anschluss an eine zweistündige Inkubation bei 37°C, eine anfängliche Fluoreszenz von 409 +/– 46 Fluoreszenzeinheiten. Während der 4 Tage Inkubationsperiode blieben die Konzentrationen von Aβ (1-42) Amyloidfibrillen, wie durch die Thioflavin T Fluoreszenz bestimmt, etwa gleich (10). Uncaria tomentosa bewirkte eine signifikante Auflösung/Auftrennung von Aβ (1-42) Amyloidfibrillbildung zu allen Zeitpunkten während des viertägigen Experimentes. Da Aβ (1-42) in der Lage ist, reichlich Amyloidfibrillen in Lösung spontan zu bilden, widerspiegelt die anfängliche Inhibierung von Aβ (1-42) Fibrillen durch Uncaria tomentosa nach 2 Stunden tatsächlich die Fähigkeit von Uncaria tomentosa, vorgeformte Amyloidfibrillen aufzulösen. Nach 2 Stunden der Inkubation bewirkte Uncaria tomentosa eine signifikante (p < 0,001) 63% Auflösung von Aβ (1-42) Amyloidfibrillen. Eine ähnliche Inhibierung wurde zu allen Zeitpunkten beobachtet (8). Nach 4 Tagen wurde nach wie vor eine signifikante (p < 0,001) 69% Auflösung von Aβ (1-42) Amyloidfibrillen beobachtet, was darauf hindeutet, dass die Auflösungsfähigkeit von Uncaria tomentosa auf Aβ (1-42) Amyloidfibrillen dauerhaft war.
Bestätigung der inhibierenden Wirkung von Uncaria tomentosa Extrakt auf Aβ (1-42) Amyloidfibrillen wurde durch Kongorot-Färbung von Aliquoten bestimmt, die von den obigen Untersuchungslösungen genommen wurden. Eine markante Reduktion von Congophilia (i.e. rot/grüne Doppelbrechung, wenn unter polarisiertem Licht betrachtet) wurde beobachtet, wenn Aβ Amyloidfibrillen mit Uncaria tomentosa für 2 Stunden behandelt wurden (nicht gezeigt).
Beispiel 9
Uncaria tomentosa bewirkt Auflösung von Insel-Amyloidfibrillen (Amylin)
90% von Patienten mit Typ II Diabetes zeigen die Ablagerung und Akkumulation von Amyloidfibrillen in den Lagerhansinseln in der Bauchspeicheldrüse (Cooper et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:8628-8632, 1987). Dieses involvierte Amyloidprotein besteht aus einem 37 Aminosäureprotein, das als Insel Amyloidpolypeptid oder Amylin bekannt ist. Es wird vermutet, dass Inselamyloid zu der Zerstörung der Beta-Zellen des Pankreas beiträgt, was letztendlich dazu führt, dass viele Patienteninsulinabhängig werden (d.h. Typ I Diabetes). Amylin besitzt die Fähigkeit, ebenfalls substantielle Amyloidfibrillen zu bilden, unmittelbar wenn es in Lösung eingebracht wird. Die nächste Studie wurde deshalb implementiert, um zu bestimmen, ob Uncaria tomentosa ebenfalls eine Auflösung/Auftrennung von einer anderen Art von Amyloidose bewirkt und ob diese Wirkung auch dauerhaft war.
Für diese Studie wurde das Verfahren der Thioflavin T Fluorometrie verwendet, wie in Beispiel 5 beschrieben. In Kürze, 30 μl 250 μM menschliches Amylin (Bachem Inc. Torrance CA, USA; Los Nr. WL934) wurde in Mikrozentrifugenröhrchen bei 37°C für 4 Tage (in dreifacher Ausführung), entweder allein oder in der Gegenwart von 1,5 μl Uncaria tomentosa (PTI-00703) inkubiert (wie in Beispiel 8 beschrieben).
Wie in 9 gezeigt, zeigte frisch suspendiertes Amylin allein, im Anschluss an eine zweistündige Inkubation bei 37°C, eine anfängliche Fluoreszenz von 1115 +/– 171 Fluoreszenzeinheiten. Während der viertägigen Inkubationsperiode wurde gefunden, dass sich die Konzentration von Insel Amyloidfibrillen, wie durch Thioflavin T Fluoreszenz bestimmt, verringert, und zwar auf Niveaus von 660 +/– 123 Fluoreszenzeinheit am 4. Tag (9), was mit früheren Studien übereinstimmt (Castillo et al, Diabetes 47:612-620, 1998). Es wurde gefunden, dass Uncaria tomentosa (PTI-00703) eine Inhibierung von Amylinfibrillenbildung zu allen Zeitpunkten während des viertägigen Experimentes bewirkt. Da Amylin in der Lage ist, reichlich Amyloidfibrillen in Lösung spontan zu formen, widerspiegelt die anfängliche Inhibierung durch Uncaria tomentosa auf die Amylinfibrillen nach 2 Stunden wiederum die Fähigkeit von Uncaria tomentosa, vorgeformte Amyloidfibrillen aufzulösen/aufzutrennen. Nach 2 Stunden Inkubation bewirkte Uncaria tomentosa (PTI-00703) eine signifikante (p < 0,001) 72% Auflösung von Amylinfibrillen, wohingegen nach 4 Tagen eine signifikante (p < 0,001) 80% Auflösung von Amylinfibrillen nach wie vor beobachtet wurde (9). Diese Studie demonstrierte, dass Uncaria tomentosa in der Lage ist, eine signifikante Auflösung von anderen Formen von Amyloid (wie Insel Amyloidosen) zu bewirken und dass diese Wirkung wiederum dauerhaft ist.
Beispiel 10
Verfahren zum Isolieren der Amyloid-inhibierenden Inhaltsstoffe innerhalb von Uncaria tomentosa
Ebenfalls offenbart sind Verfahren zum Isolieren und Identifizieren der aktiven Amyloid-inhibierenden Inhaltsstoffe innerhalb von Uncaria tomentosa, welches von mehreren unterschiedlichen kommerziellen Quellen erhalten wurde. Für die Isolierung der aktiven Amyloid-inhibierenden Inhaltsstoffe aus Gelatine-überzogenen Kapseln von Uncaria tomentosa wurden 400 Kapseln (pro Durchgang), die getrocknete Pflanzenmaterialien enthalten, in einem Liter Polypropylenbehälter gesammelt, zu welchem 800 ml Propanol (Fisher, Fair Lawn, NJ, USA) hinzugefügt wird und über Nacht bei 4°C mittels Magnetrührer gerührt wird. Für die Isolierung der aktiven Amyloid-inhibierenden Inhaltsstoffe von Uncaria tomentosa aus festen Tabletten wird das Material in 400 Tabletten (pro Durchgang) mittels Mörser und Stößel zerkleinert und mit Propanol, wie oben beschrieben, extrahiert. Der Extrakt wird dann bei 17.000 × g (Sorvall) für 20 Minuten zentrifugiert und der Überstand wird gesammelt. Die Extraktion und Zentrifugationsprozedur wird 5 weitere Male wiederholt und die Überstände werden gesammelt, und mittels eines Rotationsverdampfers (Rotavapor-R, Brinkman, Westbury, NJ, USA) bei 60°C konzentriert. Wenn das Volumen klein genug ist (d.h. 500 ml) wird der Extrakt bei 17.000 × g erneut zentrifugiert, um jegliche unlöslichen Materialien zu entfernen. Der erhaltende Überstand wird dann mit 4 Volumina Petrolether (Fisher) präzipitiert und das Präzipitat wird im Anschluss an die Zentrifugation bei 3.000 × g für 20 Minuten mittels Tischzentrifuge gesammelt. Das erhaltende Pellet wird zweimal durch Resuspension in 100 ml destilliertem Wasser gewaschen und dann erneut bei 3.000 × g für 20 Minuten zentrifugiert. Das resultierende Pellet wird dann in 50-100 ml (abhängig von der Größe des Pellets) Propanol aufgelöst und auf eine 300 ml Silica-Säule, die mit Propanol, das 0,5% (Gew./Gew.) Essigsäure enthält, äquilibriert wurde, aufgetragen. Dasselbe Lösungsmittel wird dann verwendet, um zu eluieren, und die am schnellsten wandernden, gelblich-braunen und/oder Orange farbenen Fraktionen werden mit einem Fraktionensammler gesammelt, und mit 4 Volumina Petrolether, wie oben beschrieben, präzipitiert. Das Pellet wird dann in Acetonitril/Essigsäure/Wasser (50:0,5:49,5; v/v/v) für die HPLC Injektion aufgelöst.
Das aufgelöste Pellet wird dann in etwa 30 gleiche Portionen für die Injektion in eine HPLC (Hewlett-Packard 1050 Serie mit Multiwellenlängen-Detektor und HP3396 Serie Integrator, Hewlett-Packard, Wilmington, DE) mit einer 1 × 25 cm C₁₈ Säule (218TP1010, Vydac, Hesperia, CA), gehalten bei 30°C mit einer Flussrate von 2 ml/min, geteilt. Andere Säulen kann auch für die HPLC Anwendung verwendet werden, und die verwendeten Flussraten und Eluate, um die injizierten Materialien zu eluieren und reinigen, können entsprechend angepasst werden. Unter Verwendung der Säule und Flussraten, wie oben beschrieben, wird die Probe nach der Injektion mit Gradienten von A und B, wie 0% B für 5 Minuten, 0-15% B von 5-10 Minuten, 15-45% B von 10-70 Minuten, und 45-100% B von 70-85 Minuten; wobei B = 95% Acetonitril mit 0,5% Essigsäure in destilliertem Wasser und A = 5% Acetonitril mit 0,5% Essigsäure in destilliertem Wasser ist, eluiert. Die Effluente werden bei 490 nm überwacht und 4 ml Fraktionen werden in einem Fraktionensammler gesammelt und gepoolte Peaks werden zu verschiedenen Retentionszeiten, von 0 bis 85 Minuten, erhalten. Die Fraktionen werden dann durch Lyophilisation, nachdem der Großteil des Acetonitrils durch Rotationsverdampfung entfernt wurde, konzentriert. 20-30 Injektionen sind erforderlich, um ausreichend Material (50-100 mg von 4 Flaschen von Pillen) für das Untersuchen in relevanten Untersuchungen, oder für die Probenidentifikation zu erhalten.
Eine andere Art der Isolation der Amyloid inhibierenden aktiven Inhaltsstoffe innerhalb Uncaria tomentosa, das von unterschiedlichen kommerziellen Quellen erhalten wurde, ist ähnlich zu jener, die oben beschrieben ist, mit der Ausnahme, dass die Verwendung des Silica-Säulenschrittes weggelassen wird. Dies ist ein schnelleres Verfahren, welches auch eine viel höhere Ausbeute (d.h. 300-400 mg pro Zubereitung anstelle von 50-100 mg pro Zubereitung) erlaubt. Bei diesem Verfahren werden im Anschluss an die Extraktion mit Propanol, Präzipitation und Waschung, wie oben beschrieben, die gewaschenen Pellets dann in Acetonitril/Essigsäure/Wasser (50:0,5:49,5; v/v/v) für die HPLC Injektion aufgelöst.
Das aufgelöste Pellet wird dann in etwa 40 gleiche Portionen für die Injektion in eine HPLC (Hewlett Packard 1050 Serie mit Multiwellenlängen Detektor und HP 3396 Serie Integrator, Hewlett-Packard, Wilmington, DE) mit einer 1 × 25 cm C₁₈ Säule (218TP1010, Vydac, Hesperia, CA), gehalten bei 30°C mit einer Flussrate von 2 ml/min geteilt. Nach der Injektion wird die Probe mit Gradienten von A und B eluiert, wie 0% B für 5 Minuten, 0-15% B von 5-10 Minuten, 15-45% B von 10-70 Minuten, und 45-100% B von 70-85 Minuten; wobei B = 95% Acetonitril mit 0,5% Essigsäure in destilliertem Wasser und A = 5% Acetonitril mit 0,5% Essigsäure in destilliertem Wasser ist. Die Effluente werden bei 490 nm überwacht und 4 ml Fraktionen werden in einem Fraktionensammler gesammelt und gepoolte Peaks werden zu verschiedenen Retentionszeiten, von 0 bis 85 Minuten, erhalten. Die Fraktionen werden dann durch Lyophilisation, nachdem der Großteil des Acetonitrils durch Rotationsverdampfung entfernt wurde, konzentriert. 40-50 Injektionen sind erforderlich, um ausreichend Material (300-400 mg von 4 Flaschen von Pillen) für das Untersuchen in relevanten Untersuchungen oder für die Probenidentifikation zu erhalten.
10 demonstriert, dass dieses Verfahren für die Trennung, Reinigung und Identifikation der aktiven Amyloid-inhibierenden Inhaltsstoffe innerhalb Uncaria tomentosa wirksam ist. Wie in 10A gezeigt, zeigt die Umkehrphasen HPLC, die bei 490 nm überwacht (aufgrund der Aktivität, die mit der gelblich-braunen und/oder orangen Farbe korreliert) und mit einem Gradient, wie oben beschrieben, eluiert wurde, dass der Uncaria tomentosa Extrakt mehrere Inhaltsstoffe enthielt, die von der Säule mit einem breiten Peak, der bei 13-45 Minuten beobachtet wurde, und einem Peak, der bei 80 Minuten beobachtet wurde, eluierten. Fraktion 26 beispielsweise wurde auf die HPLC erneut aufgetragen und ein symmetrischer Peak wurde erhalten (10B), was darauf hinweist, dass die Polydiversität des in 10A beobachteten breiten Peaks nicht aufgrund eines Säulenartifakts ist, sondern aufgrund der Gegenwart von individuellen Komponenten innerhalb des Uncaria tomentosa Extrakts. Peaks nach 26 Minuten und 80 Minuten wurden dann auf potentielle Auflösung/Auftrennung von vorgeformten Alzheimer Aβ Amyloidfibrillen (wie in Beispiel 5 beschrieben) getestet, um zu bestimmen, ob diese Peaks aktive Amyloid inhibierende Inhaltsstoffe enthielten (10C). Fraktion nach 26 Minuten (nicht jedoch nach 80 Minuten) zeigte eine potente Amyloid inhibierende Aktivität, die eine 85% Auflösung/Auftrennung von vorgeformten Alzheimer Krankheit Amyloidfibrillen innerhalb einer zweistündigen Periode bewirken. Andere Peaks (von 13 bis 45 Minuten Retentionszeit) wurden ebenfalls erhalten und, wie oben beschrieben, getestet und es wurde festgestellt, dass diese Amyloid inhibierende Inhaltsstoffe (nicht gezeigt) enthalten, was darauf hinweist, dass die Amyloid inhibierenden Inhaltsstoffe innerhalb des breiten Peaks von 13 bis 45 Minuten Retentionszeit enthalten sind. Diese Studie weist darauf hin, dass unser Verfahren zur Isolation und zum Testen verwendet werden kann, um die aktiven Amyloid inhibierenden Inhaltsstoffe innerhalb von Uncaria tomentosa Extrakten zu reinigen und isolieren.
Um die chemischen Strukturen und elementare Zusammensetzung der aktiven Amyloid inhibierenden Inhaltsstoffe innerhalb Uncaria tomentosa zu identifizieren, wurden verschiedene Analysen implementiert, die Fachleuten bekannt sind. Zu diesen zählen, ohne darauf beschränkt zu sein: a) die Verwendung von Scanningelektronenmikroskop, welches mit einem energiedispersiven Röntgenanalysator ausgestattet ist, um einige Elemente, die in jeder Probe vorhanden sind, zu detektieren und räumlich zu kartieren, b) hochauflösende Massenspektroskopie, um das Molekulargewicht und die elementare Zusammensetzung zu bestimmen, 3) dynamische Differenzkalorimetrie, um den Schmelzpunkt zu bestimmen, 4) FTIR Spektroskopie, um funktionelle Gruppen zu bestimmen und Vergleiche mit Spektralbibliotheken werden gemacht; 5) Proton und C¹³ NMR Spektroskopie für Materialcharakterisierung, indem Informationen bezüglich der Position der Atome in Bezug zueinander bereitgestellt werden, und 6) Elementaranalyse durch Verbrennung, um den relativen % an Kohlenstoff, Wasserstoff und Stickstoff zu bestimmen.
Weitere Aspekte und Anwendungen der Erfindung
Therapeutische Anwendungen
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Formulieren, vor der Verabreichung an einen Patienten, einer pharmazeutischen Formulierung, welcher Uncaria tomentosa (und/oder ihre aktiven Inhaltsstoffe) in einem oder mehreren pharmazeutisch akzeptablen Träger, Verdünnungsmittel oder Exzipienten aufweist. In einer bevorzugten Ausführungsform würde ein Patient, welcher an Alzheimer Krankheit, Typ II Diabetes oder irgendeiner anderen Amyloidose leidet, kommerziell erhältliches Uncaria tomentosa in einer Pille, Tablette, Caplet, Weich- und Hartgelatinekapsel, Pastillen, Vegicap, flüssige Tröpfchen, Lösung, Sirup, Teebeutel, und/oder Rindenpulverform oral konsumieren.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform könnte Uncaria tomentosa, welches in irgendeiner Form kommerziell erhalten wurde, weiters unter Verwendung von geeigneten Trägern, Exzipienten und Verdünnungsmitteln einschließlich Lactose, Dextrose, Saccharose, Sorbitol, Mannitol, Stärken, Akaziengummi, Kalziumphosphat, Alginate, Tragant, Gelatine, Kalziumsilicat, mikrokristalline Zellulose, Polyvinylpyrrolidon, Zellulose, Wassersirup, Methylzellulose, Methyl und Propylhydroxybenzoate, Talkum, Magnesiumstearat und Mineralöl moduliert werden. Die Formulierungen können zusätzlich Gleitmittel, Benetzungsmittel, Emgulatoren und Suspendiermittel, Konservierungsmittel, Süßstoffe oder Geschmacksstoffe umfassen. Die Zusammensetzungen der Erfindung können formuliert sein, so dass sie eine schnelle, anhaltende oder verzögerte Reaktion des aktiven Inhaltsstoffs nach der Verabreichung an den Patienten bereitstellen. Die Zusammensetzungen werden vorzugsweise in einer Einheitsdosierungsform formuliert, wobei jede Dosierung von etwa 1 bis etwa 10.000 mg Uncaria tomentosa (oder ihre aktiven Inhaltsstoffe), üblicherweise etwa 500 bis etwa 2.000 mg Uncaria tomentosa (oder ihre aktiven Inhaltsstoffe) enthält. Es ist jedoch verständlich, dass die verabreichte, therapeutische Dosierung durch den Arzt in Anbetracht der relevanten Umstände, einschließlich des zu behandelnden klinischen Zustandes, des betroffenen Organs oder Gewebes oder verdächtigt wird, von einer Amyloidakkumulation betroffen zu sein, und dem gewählten Verabreichungsweg bestimmt wird. Deshalb sind die obigen Dosierungsbereiche nicht beabsichtigt, den Umfang der Erfindung auf irgendeine Weise zu beschränken. Der Begriff „Einheitsdosierungsform" betrifft physisch diskrete Einheiten, die als einheitliche Dosierung für menschliche Lebewesen und andere Säugetiere geeignet sind, wobei jede Einheit eine vorbestimmte Menge an aktivem Material enthält, die berechnet ist, um die gewünschte therapeutische Wirkung in Verbindung mit einem geeigneten pharmazeutischen Träger zu erzeugen.
Die folgenden Formulierungsbeispiele sind nur illustrativ und nicht beabsichtigt, den Umfang der Erfindung auf irgendeine Art zu beschränken. Für jede als ein Beispiel bereitgestellte Formulierung wird das Senken oder Erhöhen der Uncaria tomentosa (oder ihrer aktiven Inhaltstoffe) Konzentration ein proportionales Senken oder Erhöhen der anderen Inhaltsstoffe, wie angegeben, bewirken. Hartgelatinekapseln können unter Verwendung von 500 mg Uncaria tomentosa (oder ihrer aktiven Inhaltsstoffe), 400 mg Stärke, und 20 mg Magnesiumstearat hergestellt werden. Die obigen Bestandteile werden gemischt und in Hartgelatinekapseln in Mengen von 920 mg eingefüllt.
Eine Tablette wird unter Verwendung von 500 mg Uncaria tomentosa (oder ihrer aktiven Inhaltsstoffe), 800 mg mikrokristalline Zellulose, 20 mg gycogene Kieselsäure und 10 mg Stearinsäure. Die Komponenten werden gemischt und komprimiert, um Tabletten mit jeweils einem Gewicht von 1230 mg zu bilden.
Eine Aerosollösung wird durch Verwendung von 0,25 aktivem Inhaltstoff, 29,75 Ethanol und 70 Treibmittel 22 (Chlordifluormethan) hergestellt. Das Uncaria tomentosa (oder ihre aktiven Inhaltsstoffe) werden mit Ethanol gemischt. Die Mischung wird zu einer Portion des Treibmittels 22 hinzugefügt, auf –30°C gekühlt, und in eine Füllvorrichtung überführt. Die erforderliche Menge wird dann einem rostfreien Behälter zugeführt und mit dem Rest des Treibmittels verdünnt. Die Werteinheiten (oben angegeben) werden dann an dem Container angepasst. Eine solche Aerosolform von Uncaria tomentosa (oder ihre aktiven Inhaltsstoffe) kann für die Behandlung von Amyloide, die das Hirn (wie Alzheimer Krankheit, Down Syndrom, Prionenerkrankungen) einschließen, durch die Verwendung eines Aerosol oder nasalen Sprays nützlich sein. Frühere Studien haben darauf hingewiesen, dass in diesen Zentralnervensystem-Amyloidosen die anfängliche Eintrittsform eines möglichen Umweltagens, welches in der Pathogenese eine Rolle spielen kann, von der Außenwelt durch den Nasengang hergeleitet werden kann.
Tabletten werden unter Verwendung von 240 mg Uncaria tomentosa (oder ihrer aktiven Inhaltsstoffe), 180 mg Stärke, 140 mg mikrokristalline Zellulose, 16 mg Polyvinylpyrrolidon (als 10% in Wasser), 18 mg Natriumcarboxymethylstärke, 2 mg Magnesiumstearat und 2 mg Talkum (Gesamt = 600 mg) hergestellt werden. Uncaria tomentosa (oder ihrer aktiven Inhaltsstoffe), Stärke und Zellulose werden durch ein Nr. 45 Mesh U.S. Sieb hindurchgeleitet und gründlich gemischt. Die Lösung von Polyvinylpyrrolidon wird mit den resultierenden Pulvern vermischt, welche dann durch ein Nr. 14 Mesh U.S. Sieb hindurchgeleitet werden. Die so erzeugten Granulate werden bei 50°C getrocknet und durch ein Nr. 18 Mesh U.S. Sieb hindurchgeleitet. Die Natriumcarboxymethylstärke, Magnesiumstearat und Talkum, die zuvor durch ein Nr. 60 Mesh U.S. Sieb hindurchgeleitet wurden, werden dann zu den Granulaten hinzugefügt, welche, nach dem Mischen, auf einer Tablettenmaschine komprimiert werden, um Tabletten mit einem Gewicht von jeweils 600 mg zu ergeben.
Kapseln, die jeweils 160 mg Medikament enthalten, werden unter Verwendung von 160 mg Uncaria tomentosa (oder ihrer aktiven Inhaltsstoffe), 118 mg Stärke, 118 mg mikrokristalline Zellulose, und 4 mg Magnesiumstearat (Gesamt = 400 mg) hergestellt. Das Uncaria tomentosa (oder ihrer aktiven Inhaltsstoffe), Zellulose, Stärke und Magnesiumstearat werden gemischt, durch ein Nr. 45 Mesh U.S. Sieb hindurchgeleitet, und in Hartgelatinekapseln in Mengen von 400 mg gefüllt.
Suppositorien, die jeweils 225 mg Uncaria tomentosa (oder ihrer aktiven Inhaltsstoffe) enthalten, werden unter Verwendung von 225 mg Uncaria tomentosa (oder ihrer aktiven Inhaltsstoffe), 2.000 mg gesättigte Fettsäureglyceride (Gesamt = 2.225 mg) hergestellt. Das Uncaria tomentosa (oder ihrer Inhaltstoffe) werden durch ein Nr. 60 Mesh U.S. Sieb hindurchgeleitet und in den gesättigten Fettsäureglyceriden suspendiert, welche zuvor mittels der minimal notwendigen Wärme geschmolzen wurden. Die Mischung wird dann in eine Zäpfchenform von nominal 2 g Kapazität geschüttet und ermöglicht, abzukühlen.
Suspensionen, die jeweils 50 mg Medikament pro 5 ml Dosis enthalten, werden unter Verwendung von 50 mg Uncaria tomentosa (oder ihrer aktiven Inhaltsstoffe), 50 mg Natriumcarboxymethylzellulose, 1,25 ml Sirup, 0,10 ml Benzoesäure-Lösung, Geschmack, Farbe und gereinigtes Wasser, auf ein Gesamtvolumen von 5 ml, hergestellt. Das Medikament wird durch ein Nr. 45 Mesh U.S. Sieb hindurchgeleitet und mit der Natriumcarboxyzellulose und Sirup gemischt, um eine feine Paste zu bilden. Die Benzoesäure-Lösung, Geschmack und Farbe werden mit einem Teil des Wassers verdünnt und unter Rühren hinzugefügt. Ausreichend Wasser wird dann hinzugefügt, um das benötigte Volumen zu erzeugen.
Eine intravenöse Formulierung wird durch Verwendung von 250 mg Uncaria tomentosa (oder ihrer aktiven Inhaltsstoffe) und 1000 mg isotoner Salzlösung zubereitet. Die Lösung der obigen Inhaltsstoffe wird intravenös bei einer Rate von 1 ml pro Minute an ein Lebewesen verabreicht, welches in Bedarf einer Behandlung ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann die therapeutische Verbindung der Erfindung in irgendeinem pharmazeutisch akzeptablen Vehikel verabreicht werden. So wie hierin verwendet, umfasst „pharmazeutisch akzeptables Vehikel", ohne darauf beschränkt zu sein, jedes oder alle Lösungsmittel, sterile Flüssigkeiten, wie Wasser und Öle, einschließlich jene von Petroleum, tierischen, pflanzlichen oder synthetischen Ursprungs wie Erdnussöl, Sojabohnenöl, Mineralöl, Sesamöl und der gleichen, Dispersionsmedien, Überzüge, antibakterielle und antifungale Wirkstoffe, isotone und absorptionsverzögernde Mittel, und dergleichen, welche mit der Aktivität der Verbindung kompatibel sind und für das Lebewesen physiologisch akzeptabel sind. Ein Beispiel eines pharmazeutisch akzeptablen Vehikels ist gepufferte normale Salzlösung (0,15 molares NaCl). Die Verwendung von solchen Medien und Agenzien für pharmazeutisch aktive Substanzen ist im Fachgebiet bekannt. Supplementäre aktive Verbindungen können auch in die Zusammensetzung eingebunden werden. Geeignete pharmazeutische Exzipienten umfassen Stärke, Glucose, Laktose, Saccharose, Gelatine, Malz, Reis, Fluor, Kalk, Silicagel, Magnesiumcarbonat, Magnesiumstearat, Natriumstearat, Glycerolmonostearat, Talkum, Natriumchlorid, getrocknete Magermilch, Glycerol, Propylen, Glykol, Wasser, Ethanol und dergleichen. Diese Zusammensetzungen können in Form von Lösungen, Suspensionen, Tabletten, Pillen, Kapseln, Pulvern, Formulierungen mit verzögerter Freisetzung und dergleichen vorliegen.
Amyloidbildung, Ablagerung, Akkumulation und/oder Persistenz in einem Lebewesen kann durch Verabreichen von Uncaria tomentosa (oder ihrer aktiven Inhaltsstoffe) in einer therapeutischen Dosierung an ein Lebewesen inhibiert werden. Der Ausdruck Lebewesen ist beabsichtigt, lebende Organismen einzuschließen, in welchen Amyloidose auftreten kann. Zu Beispielen von Lebewesen zählen Menschen, Affen, Kühe, Hunde, Schafe, Katzen, Mäuse, Ratten und transgene Spezies davon. Verabreichung der Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung an ein zu behandelndes Lebewesen kann unter Verwendung bekannter Prozeduren, bei Dosierungen und für Zeitperioden, die wirksam sind, Amyloidosen in dem Lebewesen zu inhibieren, ausgeführt werden. Eine wirksame Menge der therapeutischen Verbindung, die notwendig ist, um eine therapeutische Wirkung zu erzielen, kann gemäß Faktoren variieren, wie der Menge an der Organ- oder Gewebestelle in einem Lebewesen bereits abgelagertem Amyloid, dem Alter, dem Geschlecht und Gewicht des Lebewesens, und der Fähigkeit der therapeutischen Verbindung, die Amyloidbildung, Ablagerung, Akkumulation, Persistenz zu inhibieren und/oder eine Auflösung von vorgeformtem Amyloid in einem Lebewesen zu bewirken. Dosierungspläne können deshalb angepasst werden, um die optimale therapeutische Reaktion bereitzustellen. Beispielsweise können mehrere geteilte Dosen täglich verabreicht werden oder die Dosis kann proportional reduziert werden, wie durch die Anforderungen der therapeutischen Situation angezeigt ist. Ein nicht-limitierendes Beispiel eines wirksamen Dosisbereichs für Uncaria tomentosa (oder ihrer aktiven Inhaltsstoffe) ist zwischen 10 und 1000 mg/kg Körpergewicht/pro Tag, jedoch vorzugsweise 10 bis 100 mg/kg Körpergewicht.
Unterschiedliche Abgabemodi von Uncaria tomentosa (oder ihrer aktiven Inhaltsstoffe) können verwendet werden. Dementsprechend ist ein bevorzugter Verabreichungsweg die orale Verabreichung. Alternativ kann Uncaria tomentosa (oder ihrer aktiven Inhaltsstoffe) durch andere geeignete Wege wie subkutan, intravenös, intraperitoneal verabreicht werden, wobei alle Wege durch Injektion verabreicht werden, verabreicht werden. In Abhängigkeit von dem Verabreichungsweg kann die aktive Verbindung mit einem Material überzogen sein, um die Verbindung von der Wirkung von Säuren oder anderen natürlichen Bedingungen, welche die Verbindung inaktivieren können, zu schützen.
Um Uncaria tomentosa (oder ihre aktiven Inhaltsstoffe) zu verabreichen, kann es notwendig sein, die Verbindung mit einem Material zu überziehen, oder die Verbindung mit einem Material gleichzeitig zu verabreichen, um seine Aktivierung zu verhindern. Beispielsweise kann die therapeutische Verbindung an ein Lebewesen in einem geeigneten Träger, wie beispielsweise Liposomen oder einem Verdünnungsmittel, verabreicht werden. Pharmazeutisch akzeptable Verdünnungsmittel umfassen Salzlösung und wässrige Pufferlösungen. Liposomen umfassen Wasser-in-Öl-in-Wasser CGF Emulsionen sowie konventionelle Liposomen.
Das Uncaria tomentosa (oder ihre aktiven Inhaltsstoffe) kann auch parenteral oder intraperitoneal verabreicht werden. Dispersionen können in Glycerol, flüssige Polyethylenglycole, und Mischungen davon und in Ölen zubereitet werden. Unter gewöhnlichen Lager- und Verwendungsbedingungen können diese Zubereitungen ein Konservierungsmittel enthalten, um das Wachstum von Mikroorganismen zu verhindern.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die für die injizierbare Verwendung geeignet sind, umfassen sterile wässrige Lösungen oder Dispersionen und sterile Pulver für die Zubereitung von sterilen injizierbaren Lösungen oder Dispersionen. In allen Fällen muss die Zusammensetzung steril sein und muss zu dem Ausmaß flüssig sein, dass eine leichte Verwendung in der Spritze existiert. Sie muss unter den Herstellungs- und Lagerbedingungen stabil sein und muss gegen die kontaminierende Wirkung von Mikroorganismen wie Bakterien und Fungi bewahrt werden. Das Vehikel kann ein Lösungsmittel oder Dispersionsmedium sein, welches beispielsweise Wasser, Ethanol, Polyol (z.B. Glycerol, Propylenglycol und flüssiges Polyethylenglycol und dergleichen), geeignete Mischungen davon und pflanzliche öle enthält. Die richtige Fluidität kann beispielsweise durch die Verwendung eines Überzugs wie Lecithin, durch die Bewahrung der benötigten Partikelgröße im Fall einer Dispersion und durch die Verwendung von oberflächenaktiven Substanzen beibehalten werden. Die Verhinderung der Wirkung von Mikroorganismen kann durch verschiedene antibakterielle und antifungale Wirkstoffe wie beispielsweise Prabene, Chlorbutanol, Phenol, Ascorbinsäure, Thimerosal, und dergleichen erreicht werden. In vielen Fällen wird es bevorzugt, isotone Agenzien wie beispielsweise Zucker, Natriumchlorid oder Polyalkohole wie Mannitol und Sorbitol in der Zusammensetzungen einzuschließen. Eine verlängerte Absorption der injizierbaren Zusammensetzung kann durch Einbringen eines Agens in die Zusammensetzung erreicht werden, welches die Absorption verzögert, wie beispielsweise Aluminiummonostearat oder Gelatine.
Sterile injizierbare Lösungen können durch Einschluss der therapeutischen Verbindung in der benötigten Menge in ein geeignetes Lösungsmittel mit einem oder einer Kombination von Inhaltsstoffen, die oben aufgezählt sind, wie benötigt, gefolgt von Filtrationsterilisation, hergestellt werden. Im Allgemeinen werden Dispersionen durch Einschluss der therapeutischen Verbindung in einem sterilen Vehikel hergestellt, welches ein basisches Dispersionsmedium und die benötigten anderen Inhaltsstoffe von den oben aufgelisteten enthält. Im Fall von sterilen Pulvern für die Zubereitung von sterilen injizierbaren Lösungen sind die bevorzugten Zubereitungsverfahren Vakuumtrocknung und Gefriertrocknung, welche ein Pulver des therapeutischen Wirkstoffes plus allen gewünschten Inhaltstoffen aus einer zuvor sterilfiltrierten Lösung davon ergeben.
Das Uncaria tomentosa (oder ihre aktiven Inhaltsstoffe) für Alzheimer Krankheit und anderen Zentralnervensystem-Amyloidosen kann optimiert werden, um die Blut-Hirn Barriere zu durchqueren. Verfahren zum Einführen umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, die systemische Verabreichung, parenterale Verabreichung, d.h. über intraperitoneale, intravenöse, periorale, subkutane, intramuskuläre, intraarteriale, intradermale, intramuskuläre, intranasale, epidurale und orale Wege.
Uncaria tomentosa (oder ihre aktiven Inhaltsstoffe) kann direkt an die Cerebrospinalflüssigkeit durch intraventriculäre Injektion verabreicht werden. Es kann wünschenswert sein, Uncaria tomentosa (oder ihre aktiven Inhaltsstoffe) lokal an den Bereich oder das Gewebe, welcher(s) ein Bedarf an einer Behandlung hat, zu verabreichen; dies kann beispielsweise und nicht als Einschränkung durch lokale Infusion während der Operation, durch topische Auftragung, durch Injektion, durch Infusion mittels einer Kannüle mit osmotischer Pumpe, mittels Katheter, mittels Zäpfchen oder mittels Implantat erreicht werden.
Uncaria tomentosa (oder ihre aktiven Inhaltsstoffe) kann in einem System mit gesteuerter Freisetzung, wie einer osmotischen Pumpe abgegeben werden. Ein gesteuertes Freisetzungssystem kann in Nähe des therapeutischen Ziels, d.h. das Hirn, platziert werden, wodurch nur einen Teil der systemischen Dosis erfordert wird
In Bezug auf Systeme und Komponenten, auf die oben Bezug genommen wird, jedoch nicht an anderer Stelle spezifiziert oder hierin in Detail beschrieben sind, wird angenommen, dass die Funktion und Spezifikationen von solchen Systemen und Komponenten und die Art, in welcher sie hergestellt oder zusammengebaut oder verwendet werden, sowohl kooperativ miteinander als auch mit anderen Elementen der Erfindung, die hierin beschrieben sind, um die hierin offenbarten Zwecke auszuführen, alle innerhalb der Kenntnis des Fachmannes sind. Kein gemeinsamer Versuch wurde deshalb unternommen, um zu wiederholen, was allgemein dem Fachmann bekannt ist.
Die Verwendung von Extrakten von der Innenrinde und Wurzelteilen von Uncaria tomentosa und die Verwendung der Inhaltsstoffe, die innerhalb der verschiedenen kommerziellen Zubereitungen von Uncaria tomentosa enthalten sind, nutzen menschlichen Patienten mit Alzheimer Krankheit und anderen Amyloidosen aufgrund der neu entdeckten Fähigkeit von Uncaria tomentosa, die Amyloidfibrillenbildung zu inhibieren, das Amyloidfibrillenwachstum zu inhibieren, die Amyloid-Proteoglycan-Interaktionen zu inhibieren, Amyloid-Glycosaminoglycan-Interaktionen zu inhibieren, und eine Auflösung und/oder Auftrennung von vorgeformten Amyloidfibrillen zu bewirken.

Claims

Verwendung von Pflanzenmaterial von einer Pflanze der Gattung Uncaria bei der Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung einer Amyloiderkrankung.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Pflanzenmaterial von einer Pflanze der Gattung Uncaria, Spezies Tomentosa stammt.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei das Pflanzenmaterial eine Amyloid Inhibierungsaktivität oder Wirksamkeit von mehr als 50% aufweist.
Verwendung nach Anspruch 2 oder Anspruch 3, wobei das Pflanzenmaterial von einer kommerziell erhältlichen Quelle erhalten wird.
Verwendung nach Anspruch 4, wobei die kommerziell erhältliche Quelle von Uncaria tomentosa ausgewählt ist aus der Gruppe bestehen aus Pillen, Tabletten, Caplets, Weich- und Hartgelatine Kapseln, Pastillen, Päckchen, Kapseln aus Stärkemasse Vegicaps, flüssige Tropfen, Elixiere, Suspensionen, Emulsionen, Lösungen, Sirupe, Teebeutel, Aerosole (als ein Feststoff oder in einem flüssigen Medium), Zäpfchen, sterile injizierbare Lösungen, steril verpackte Pulver, Rindenbündel und Rindenpulver.
Verwendung nach Anspruch 2 oder Anspruch 3, wobei das Pflanzenmaterial einen Extrakt aufweist, der von Uncaria tomentosa erhalten wird, wobei der Extrakt von der inneren Rinde oder Wurzelgewebe von Uncaria tomentosa stammt.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei der Pflanzenextrakt im Medikament mit einem Gewichtsanteil im Bereich von 70 bis 95% vorhanden ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1, 2, 6 oder 7, wobei das Pflanzenmaterial einen Amyloid inhibierenden Bestandteil aufweist, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Oxindol-Alkaloide, Quinovinsäure-Glycoside, Proanthocyanidine, Polyphenole, Triterpine, pflanzliche Sterole, beta-Sitosterol, Stigmasterol, Campesterol, Phytosterole, 3-Beta, 6-Beta, 19-Alpha-Trihydroxy-urs-12-en-28-oinsäure, 5-Alphacarboxystrictosidin, Alloisopteropodin, Allopteropodine, Angustin, Dihydrocorynanthein, Dihydrocorynanthein-n-oxid, Hirsutin, Hirsutin-n-oxid, Isomitraphyllin, Isopteropodin, Isorhynchophyllin, Isorhynchophyllin-n-oxid, Isorotundifolin, Curculogosid, Curculigosid B, Phenolglucoside, 2-[[2,6-Dimethoxybenzoyl)oxy]methyl-4-hydroxyphenyl-beta-D-glucopyranosid, 2-[[2-Hydroxy-6-methoxybenzoyl)oxy]methyl-4-hydroxyphenyl-beta-D-glucopyranosid, Mitraphyllin, Oleanolsäure, Pteropodin, Quinovinsäure-3beta-o-(beta-dglucopyranosyl-(1→3)beta-d-fucopyranosyl-(27→1)-beta-d-glucopyranosylester, Quinovinsäure-3-beta-o-beta-d-fucopyranosid, Quinovinsäure-3 beta-o-beta-d-fucopyranosyl-(27→1)-beta-d-glucopyranosylester, Quinovinsäure-3beta-o-beta-d-quinovopyranosid, Rhynchophyllin, Rotundifolin, Speciophyllin, Uncarin, Uncarin-f, Ursolsäure, Cepharanthin (Bisbenzylisochinolinalkaloid), Berbamin (Bisbenzylisochinolin-alkaloid), Matrin (Lupinalkaloid), Pilocarpin (Imidazolalkaloid), 2,3-Dihydroxybenzoesäure, Ferulsäure, Anethol, Cleistanthin (Lignan), Phenolglucoside, Urunshiol, Alpha-Tocopherol (Vitamin E), Ubichon, Maesanin, Zexbrevin A/B, 12-O-Tetradeoanoyl-phorbol-13-acetat, TPA (tetracyclisches Diterpen), Saponin mit Aglycon-Oleonsäure (pentacyclisches Triterpen), und Cynonchosid.
Verwendung nach Anspruch 2 oder Anspruch 8, wobei das Medikament für die orale Verabreichung durch Aerosolspray oder in einer parenteral injizierbaren oder infundierbaren Form vorliegt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 2 bis 8, wobei das Medikament eine Dosierung im Bereich von 10 bis 1000 mg/kg des Körpergewichts eines Patienten aufweist.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei das Medikament eine Dosierung im Bereich von 10 bis 100 mg/kg des Körpergewichts des Patienten aufweist.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei besagte Amyloiderkrankung für die Behandlung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus dem mit der Alzheimer-Krankheit assoziierten Amyloid, Down-Syndrom und vererbte cerebrale Hämorrhagie mit Amyloidose-Dutch-Typ (wobei das spezifische Amyloid als beta-Amyloidprotein oder Aβ bezeichnet wird), dem mit chronischer Entzündung assoziierten Amyloid, verschiedenen Formen von Malignität und familiärem Mittelmeerfieber (wobei das spezifische Amyloid als AA Amolid oder Inflammation-assoziierte Amyloidose bezeichnet wird), dem mit multiplen Myelom und anderen B-Zell Dyskrasien assoziierten Amyloid (wobei das spezifische Amyloid als AL Amyloid bezeichnet wird), dem mit Typ II Diabetes assoziierten Amyloid (wobei das spezifische Amyloid als Amylin oder Insel-Amyloid bezeichnet wird), dem mit Prionenerkrankungen assoziierten Amyloid, einschließlich Kreutzfeldt-Jakob-Krankheit, Gerstmann-Straussler Syndrom, Kuru und tierischem Scrapie (wobei das spezifische Amyloid als PrP Amyloid bezeichnet wird), dem mit langzeitiger Hämodialyse und Karpaltunnelsyndrom assoziierten Amyloid (wobei das spezifische Amyloid als Beta₂-Mikroglobulin-Amyloid bezeichnet wird), dem mit senilen Herzamyloid und familiären amyloidotischen Polyneuropathie assoziierten Amyloid (wobei das spezifische Amyloid als Transthyretin oder Präalbumin bezeichnet wird), und dem mit endokrinen Tumoren, wie medullärem Karzinom der Schilddrüse assoziierten Amyloid (wobei das spezifische Amyloid als Varianten von Procalcitonin bezeichnet wird).
Verfahren zum Isolieren von Amyloid-inhibierenden Bestandteilen innerhalb des Pflanzenmaterials von Uncaria tomentosa, wobei das Verfahren die folgenden Schritte aufweist: a) Extrahieren des Pflanzenmaterials mit einem organischen Lösungsmittel, b) Konzentrieren des Extrakts, c) Entfernen von unlöslichen Materialien, d) Präzipitieren der Amyloid-inhibierenden Bestandteile mit organischen Lösungsmitteln, e) Gewinnung und Wiederauflösen der Amyloid-inhibierenden Bestandteile, die mit dem organischen Lösungsmittel erhalten wurden, und f) Injizieren und Trennen durch HPLC.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Pflanzenmaterial aus kommerziell erhaltenen Pillen, Tabletten, Caplets, Weich- und Hartgelatine Kapseln, Pastillen, Päckchen, Kapseln aus Stärkemasse, Vegicaps, flüssige Tropfen, Elixiere, Suspensionen, Emulsionen, Lösungen, Sirupe, Teebeutel, Aerosole (als ein Feststoff oder in einem flüssigen Medium), Zäpfchen, sterile injizierbare Lösungen, sterile verpackte Pulver, Rindenbündel und Rindenpulver besteht, die Uncaria tomentosa, Extrakte oder Derivate davon enthalten.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Pflanzenmaterial von kommerziell erhältlichen Gelatine-beschichteten Kapseln entnommen wird, die getrocknetes Pulver von Uncaria tomentosa, Extrakten oder Derivaten davon enthalten.
Verfahren nach 13, 14 oder 15, wobei der Extraktionsschritt des Pflanzenmaterials mit einem organischen Lösungsmittel weiters zuerst das Hinzufügen von Propanol zu den Pflanzenmaterialen, die gepulvert sind, und das Rühren der resultierenden Mischung über Nacht aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 16, wobei das im Schritt des Extrahierens der Amyloid-inhibierenden Bestandteile verwendete Lösungsmittel eine Polarität im Bereich zwischen jener von Wasser und jener von Pentanol aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 17, wobei der Schritt des Entfernens des unlöslichen Materials durch Zentrifugieren des Extraktes und Sammeln des Überstandes ausgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 18, wobei der Schritt des Konzentrierens des Extraktes durch Rotationsverdampfung ausgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 19 wobei, im Anschluss an den Extraktions- und Zentrifugationsschritt, die Extraktions- und Zentrifugationsprozedur 5 weitere Male wiederholt wird und die Überstände gesammelt werden.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei im Anschluss an die wiederholten Extraktions- und Konzentrationsschritte, die Überstände zusammengeführt und mittels eines Rotationsverdampfers konzentriert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 21, wobei, im Anschluss an den Konzentrationsschritt, und nachdem das Volumen 500 ml oder weniger ist, der Extrakt erneut zentrifugiert wird, um weiter unlösliches Material zu entfernen.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei, im Anschluss an den erneuten Zentrifugationsschritt, der Überstand erhalten wird und mit 4 Volumina Petrolether präzipitiert wird.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei im Anschluss an die Präzipitation mit Petrolether, das Präzipitat im Anschluss an eine weitere Zentrifugation in einem Pellet gesammelt wird.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei das Pellet in Propanol aufgelöst wird und auf eine Silica-Säule, die mit Essigsäure enthaltendem Propanol äquilibriert ist, aufgetragen wird.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei im Anschluss an die Auftragung des Materials auf die Silica-Säule, Essigsäure enthaltendes Propanol verwendet wird, um zu eluieren, und die sich schneller bewegenden gelblich-braun gefärbten Fraktionen mit einem Fraktionensammler gesammelt werden.
Verfahren nach Anspruch 26, wobei die Eluente von der Säue spektroskopisch bei 490 nm überwacht werden und die Fraktionen in einem Fraktionensammler gesammelt werden.
Verfahren nach Anspruch 26 oder Anspruch 27, wobei, im Anschluss an die Sammlung der sich am schnellsten bewegenden gelblich-braun gefärbten Fraktionen, die Fraktionen mit Petrolether präzipitiert werden und das Präzipitat im Anschluss an die Zentrifugation gesammelt wird.
Verfahren nach Anspruch 28, wobei, im Anschluss an die erneute Präzipitation und erneute Zentrifugation, das Pellet in Acetonitril/Essigsäure/Wasser für die Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC)-Injektion aufgelöst wird.
Verfahren nach Anspruch 29, wobei das aufgelöste Pellet in gleiche Portionen aufgeteilt wird und in eine HPLC injiziert wird.
Verfahren nach Anspruch 30, wobei die verwendete HPLC eine 1 × 25 cm C₁₈ Säule enthält und bei 30°C mit einer Flussrate von 2 ml/min gehalten wird.
Verfahren nach Anspruch 30, wobei die Probenprotionen, die in die HPLC injiziert werden, mit Gradienten von A und B eluiert werden, so dass 0% B für 5 Minuten, 0-15% B von 5-10 Minuten, 15-45% B von 10-70 Minuten, und 45-100% B von 70-85 Minuten ist; wobei B = 95% Acetonitril mit 0,5% Essigsäure in destilliertem Wasser und A = 5% Acetonitril mit 0,5% Essigsäure in destilliertem Wasser ist.
Verfahren nach Anspruch 32, wobei die Eluente von der HPLC bei 490 nm überwacht werden und 4 ml Fraktionen in einem Fraktionensammler gesammelt werden und zusammengeführte Peaks bei verschiedenen Retentionszeiten (von 0 bis 85 Minuten) erhalten werden.
Verfahren nach Anspruch 33, wobei die erhaltenen Fraktionen durch Lyophilisation, nachdem das meiste Acetonitril durch Rotationsverdampfung entfernt ist, konzentriert werden.
Verfahren nach Anspruch 34, wobei die erhaltenen, konzentrierten Fraktionen in relevanten in vitro Untersuchungen getestet werden, um Inhibitoren von Amyloidfibrillae-Fraktionenbildung, Amyloidfibrillenwachstum oder Wirkstoffe zu identifizieren, die die Auflösung/Zerstörung von vorgebildeten Aymloidfibrillen verursachen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 35, wobei die Amyloid-inhibierenden Bestandteile innerhalb Uncaria tomentosa identifiziert werden, um innerhalb der ungefähren HPLC Retentionszeiten von 13-45 Minuten enthalten zu sein.
Verfahren nach Anspruch 36, wobei die Amyloid-inhibierenden Bestandteile innerhalb Uncaria tomentosa identifiziert werden, um innerhalb der ungefähren HPLC Retentionszeit von 26 Minuten enthalten zu sein.