ES2285772T3 - Composicion y metodos para tratar la enfermedad de alzheimer y otras amiloidosis. - Google Patents
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Abstract
Uso de materia vegetal de una planta del género Uncaria en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad amiloide.
Description
Composición y métodos para tratar la enfermedad
de Alzheimer y otras amiloidosis.
La invención se refiere al uso de materia
vegetal de una planta del género Uncaria en la fabricación de
un medicamento para tratar la enfermedad de Alzheimer y otras
amiloidosis, y a métodos para aislar agentes farmacológicos a
partir de materia vegetal; más particularmente, se refiere al uso de
materia vegetal de una planta del género Uncaria en la
fabricación de un medicamento para intervención terapéutica en la
enfermedad de Alzheimer y otras amiloidosis y a métodos para el
aislamiento de y la identificación de componentes amiloides en la
materia vegetal.
La enfermedad de Alzheimer se caracteriza por la
acumulación de un péptido de 39-43 aminoácidos
denominado proteína beta-amiloide o A\beta, en
forma fibrilar, que existe como placas de amiloide extracelular y
como amiloide dentro de las paredes de los vasos sanguíneos
cerebrales. Se cree que la deposición de amiloide A\beta fibrilar
en la enfermedad de Alzheimer es perjudicial para el paciente y
finalmente conduce a toxicidad y muerte de células neuronales,
rasgos distintivos característicos de la enfermedad de Alzheimer.
Las pruebas acumuladas implican al amiloide como un factor causante
principal de la patogenia de la enfermedad de Alzheimer.
Una variedad de otras enfermedades humanas
demuestran también la deposición de amiloide y normalmente implican
órganos sistémicos (es decir, órganos o tejidos situados fuera del
sistema nervioso central), conduciendo la acumulación de amiloide a
disfunción o insuficiencia orgánica. En la enfermedad de Alzheimer y
enfermedades amiloides "sistémicas", no hay actualmente cura
ni tratamiento eficaz, y el paciente normalmente muere en el plazo
de 3 a 10 años desde la aparición de la enfermedad.
Se ha efectuado mucho trabajo en la enfermedad
de Alzheimer, pero se conoce poco de manera convencional sobre
compuestos o agentes para regímenes terapéuticos para detener la
formación, deposición, acumulación y/o persistencia de amiloide que
se produce en la enfermedad de Alzheimer y otras amiloidosis.
Por tanto, se necesitan urgentemente nuevos
compuestos o agentes para regímenes terapéuticos para detener o
revertir la formación, deposición, acumulación y/o persistencia de
amiloide que se produce en la enfermedad de Alzheimer y otras
amiloidosis.
En un primer aspecto, la invención proporciona
el uso de materia vegetal de una planta del género Uncaria
en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una
enfermedad amiloide.
En un segundo aspecto, la invención proporciona
un método para aislar constituyentes inhibidores del amiloide en la
materia vegetal de Uncaria tomentosa, comprendiendo el método
las siguientes etapas: a) extraer la materia vegetal con un
disolvente orgánico, b) concentrar el extracto, c) eliminar los
materiales insolubles, d) precipitar los constituyentes inhibidores
del amiloide con disolvente orgánico, e) recuperar y redisolver los
constituyentes inhibidores del amiloide obtenidos en disolvente
orgánico y f) inyectar y separar mediante HPLC.
Se exponen realizaciones particulares de la
invención en las reivindicaciones dependientes.
Un objeto primario de la presente invención es
establecer nuevos medicamentos para el tratamiento de las
enfermedades amiloides. Las enfermedades amiloides incluyen, pero
no se limitan a, el amiloide asociado con la enfermedad de
Alzheimer, síndrome de Down y hemorragia cerebral hereditaria con
amiloidosis de tipo Dutch (en los que el amiloide específico se
denomina proteína beta-amiloide o A\beta), el
amiloide asociado con inflamación crónica, diversas formas de
tumores malignos y fiebre mediterránea familiar (en las que el
amiloide específico se denomina amiloide AA o amiloidosis asociada
con inflamación), el amiloide asociado con mieloma múltiple y otras
discrasias de células B (en los que el amiloide específico se
denomina amiloide AL), el amiloide asociado con diabetes tipo II
(en la que el amiloide específico se denomina amilina o amiloide de
los islotes), el amiloide asociado con las enfermedades priónicas,
incluyendo enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, síndrome
de Gertsmann-Straussler, kuru y tembladera animal
(en los que el amiloide específico se denomina amiloide PrP), el
amiloide asociado con hemodiálisis a largo plazo y síndrome del
túnel carpiano (en los que el amiloide específico se denomina
amiloide beta_{2}-microglobulina), el amiloide
asociado con amiloide cardiaco senil y polineuropatía amiloidótica
familiar (en los que el amiloide específico se denomina
transtiretina o prealbúmina y el amiloide asociado con tumores
endocrinos tales como carcinoma medular del tiroides (en los que el
amiloide específico se denomina variantes de procalcitonina).
Otro objeto de la presente invención es usar la
corteza interna y/o raíces de Uncaria tomentosa (también
denominada uña de gato o cat's claw en inglés) en la fabricación de
un medicamento para el tratamiento de la formación, deposición,
acumulación y/o persistencia de amiloide en la enfermedad de
Alzheimer, diabetes tipo II y otras amiloidosis. Uncaria
tomentosa o uña de gato se denomina también, pero sin limitarse
a, Paraguayo, Garaboto, Garbato casha, Tambor huasca, uña de
gavilán, garra de halcón, uña de gato o uña de gato Schuler.
Otro objeto de la presente invención es usar
materia vegetal de una planta del género Uncaria, en la
fabricación de un medicamento para el tratamiento de la formación,
deposición, acumulación y/o persistencia de amiloide en la
enfermedad de Alzheimer, diabetes tipo II y otras amiloidosis.
Otro objeto de la presente invención es usar
extractos y/o derivados de los mismos de materia vegetal relacionada
con las diversas especies de Uncaria, que pueden incluir
pero sin limitarse a, Uncaria tomentosa, Uncaria
attenuata, Uncaria elliptica, Uncaria guianensis,
Uncaria pteropoda, Uncaria bernaysli, Uncaria
ferra DC, Uncaria kawakamii, Uncaria
rhynocophylla, Uncaria calophylla, Uncaria gambir
y Uncaria orientalis.
Otra realización del primer aspecto de la
presente invención es usar píldoras, comprimidos, comprimidos
oblongos, cápsulas de gelatina dura y blanda, pastillas para
chupar, sobres, sellos para medicamentos, cápsulas Vegicap, gotas
líquidas, elixires, suspensiones, emulsiones, soluciones, jarabes,
bolsitas de té, aerosoles (como un sólido o en medio líquido),
supositorios, soluciones inyectables estériles, polvos envasados
estériles, haces de corteza y/o polvo de corteza disponibles
comercialmente que contienen Uncaria tomentosa en la
fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad
amiloide.
Otra realización del primer aspecto de la
presente invención es usar Uncaria tomentosa y/o los
alcaloides de oxindol, glucósidos de ácido quinóvico,
proantocianidinas, polifenoles, triterpinos, los esteroles
vegetales, betasitosterol, estigmasterol y campesterol, o
fitosteroles contenidos en Uncaria tomentosa en la
fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad
amiloide.
Aún otra realización del primer aspecto de la
presente invención es usar uno o más de los compuestos fitoquímicos
contenidos en Uncaria tomentosa, o sus compuestos
constituyentes, en la fabricación de un medicamento para el
tratamiento de una enfermedad amiloide.
Se cree que estos constituyentes incluyen, pero
no se limitan a, ácido
3-beta,6-beta,19-alfa-trihidroxi-urs-12-en-28-oico,
5 alfa-carboxiestrictosidina, aloisopteropodina,
alopteropodina, angustina, dihidrocorinanteína, n-óxido de
dihidrocorinanteína, hirsutina, n-óxido de hirsutina,
isomitrafilina, isopteropodina, isorincofilina, n-óxido de
isorincofilina, isorotundifolina, mitrafilina, ácido oleanólico,
pteropodina,
3-beta-o-(beta-d-glucopiranosil-(1\rightarrow3)beta-d-fucopiranosil-(27\rightarrow1)-beta-d-glucopiranosil
éster del ácido quinóvico,
3-beta-o-beta-d-fucopiranósido
del acido quinóvico,
3-beta-o-beta-d-fucopiranosil-(27\rightarrow1)-beta-d-glucopiranosil
éster del ácido quinóvico,
3-beta-o-beta-d-quinovopiranósido
del ácido quinóvico, rincofilina, rotundifolina, especiofilina,
uncarina, uncarina F y ácido ursólico.
Aún otra realización del primer aspecto de la
presente invención es usar otros compuestos fitoquímicos conocidos
identificados previamente por Keplinger como posiblemente útiles
para estimular el sistema inmunitario humano. Éstos incluyen los
compuestos basados en alcaloide, fenol, quinona y terpeno descritos
en la patente estadounidense número 4.844.901 y la patente
estadounidense número 4.940.725 concedidas a Keplinger et al,
e incluyen, pero no se limitan a, alcaloides de oxindol tetra y
pentacíclicos, alcaloides tales como aloisopteropodina, isómero A
que tiene la fórmula C_{21}H_{24}O_{4}N_{2},
alo-pteropodina, isómero B que tiene la fórmula
C_{21}H_{24}O_{4}N_{2},
normal-isomitrafilina, isómero A que tiene la
fórmula C_{21}H_{24}O_{4}N_{2},
normal-isoricofilina, isómero A que tiene la fórmula
C_{22}H_{28}O_{4}N_{2}, normal-mitrafilina,
isómero B que tiene la fórmula C_{21}H_{24}O_{4}N_{2},
normal-rincofilina, isómero B que tiene la fórmula
C_{22}H_{28}O_{4}N_{2}, y el alcaloide de oxindol
especiofilina, cefarantina (alcaloide de bisbencilisoquinolina),
berbamina (alcaloide de bisbencilisoquinolina), matrina (alcaloide
de lupina), pilocarpina (alcaloide de imidazol), fenoles y quinonas
tales como ácido 2,3-dihidroxibenzoico, ácido
ferúlico, anetol, cleistantina (lignano), curculogósido y
curculigósido B (fenolglucósidos), urunsiol (derivados de
pirocatequina con cadenas laterales de C_{15}/C_{17},
alfa-tocoferol (vitamina E), ubicona
(principalmente, Q7, Q8), measanina (quinona con cadena lateral de
C_{15}), terpenos tales como zexbrevina A/B (sesquiterpenoacetona
del tipo ceramacrano), 13-acetato de
12-O-tetradecanoil-forbol,,
TPA (diterpeno tetracíclico), saponina con ácido oleónico de
aglicona (triterpeno pentacíclico) y cinoncósido (glucósido de
esteroide).
El segundo aspecto de la presente invención se
refiere a métodos para aislar los principios activos presentes en
Uncaria tomentosa para su uso como agentes potentes que
inhiben la formación de amiloide, deposición de amiloide,
acumulación de amiloide, persistencia de amiloide, interacciones
proteína amiloide-proteína amiloide, y/o provocan
una disolución/ruptura de las fibrillas de amiloide en la enfermedad
de Alzheimer, diabetes tipo II y otras amiloidosis. Los métodos
para aislar los principios activos en Uncaria tomentosa
incluyen la aplicación de algunas técnicas convencionales conocidas
por los expertos en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a,
cromatografía en capa fina usando placas recubiertas con sílice, y
separación y aislamiento usando cromatografía de líquidos de alta
resolución (HPLC). Se identificaron principios activos desconocidos
en Uncaria tomentosa que se encontró que eran potentes
inhibidores de la formación de amiloide, deposición de amiloide,
acumulación de amiloide, persistencia de amiloide, interacciones de
proteína amiloide-proteína amiloide, y/o provocaban
una disolución/ruptura de las fibrillas de amiloide formadas
previamente o depositadas previamente en la enfermedad de
Alzheimer, diabetes tipo II y otras amiloidosis, volviendo a someter
a prueba bandas o fracciones identificadas (separadas mediante
cromatografía en capa fina, cromatografía en columna y/o HPLC)
usando pruebas de ensayo específicas tal como se describe en los
ejemplos de la presente invención. El aislamiento suficiente de
estos principios activos contenidos dentro de bandas y/o fracciones
individuales puede enviarse entonces para análisis específicos que
pueden incluir, pero no se limitan a, microscopio electrónico de
barrido equipado con analizador de rayos x de dispersión de energía
para detectar y mapear espacialmente algunos elementos presentes en
cada muestra, análisis elemental mediante combustión para determinar
el % relativo de carbono, hidrógeno y nitrógeno, espectroscopía de
masas de alta resolución para determinar el peso molecular y la
composición elemental, espectroscopía de infrarrojos con
transformada de Fourier para determinar los grupos funcionales y
hacer comparaciones con los espectros de compuestos conocidos,
calorimetría diferencial de barrido para determinar el punto de
fusión, absorción atómica, cromatografía en gel, cromatografía de
líquidos de alta resolución, espectroscopía de resonancia magnética
nuclear de protón y ^{13}C para la caracterización del material y
para proporcionar información referente a la posición de los átomos
unos con respecto a otros, y espectroscopía de UV/VIS. Se espera
que se desarrollen técnicas adicionales como parte del aislamiento
adicional de principios activos potentes en Uncaria
tomentosa.
Uncaria tomentosa y/o sus componentes
[independientemente de la fuente comercial e independientemente de
la forma final para el consumo por seres humanos, es decir,
píldoras, comprimidos, comprimidos oblongos, cápsulas de gelatina
dura y blanda, pastillas para chupar, sobres, sellos para
medicamentos, cápsulas Vegicap, gotas líquidas, elixires,
suspensiones, emulsiones, soluciones, jarabes, bolsitas de té,
aerosoles (como un sólido o en medio líquido), supositorios,
soluciones inyectables estériles, polvos envasados estériles, haces
de corteza y/o polvo de corteza] pueden usarse para la inhibición de
la formación, deposición, acumulación y/o persistencia de amiloide,
independientemente de su práctica clínica.
Las composiciones y métodos pueden implicar la
administración a un sujeto de una dosis terapéutica de Uncaria
tomentosa (o sus principios activos) que inhibe la deposición de
amiloide. Por consiguiente, las composiciones y métodos son útiles
para inhibir la amiloidosis en trastornos en los que se produce
deposición de amiloide. Los compuestos pueden usarse
terapéuticamente para tratar la amiloidosis o pueden usarse
profilácticamente en un sujeto propenso a la amiloidosis. Los
métodos se basan, al menos en parte, en inhibir directamente la
formación de fibrillas de amiloide, inhibir el crecimiento de
fibrillas de amiloide, y/o provocar una disolución/ruptura de las
fibrillas de amiloide formadas previamente.
También pueden proporcionarse composiciones
farmacéuticas para tratar la amiloidosis. Las composiciones
farmacéuticas incluyen un compuesto terapéutico en una cantidad
eficaz para inhibir la deposición de amiloide y un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
Puede usarse cualquiera y todos los compuestos
sintéticos preparados que son similares funcionalmente a Uncaria
tomentosa en la aplicación terapéutica, y/o componentes
inhibidores del amiloide de Uncaria tomentosa, para su uso
como agentes para inhibir la formación de amiloide, deposición de
amiloide, acumulación de amiloide, persistencia de amiloide,
interacciones de proteína amiloide-proteína
amiloide, y/o provocar una disolución/ruptura de fibrillas de
amiloide formadas previamente o depositadas previamente en la
enfermedad de Alzheimer, diabetes tipo II y otras amiloidosis.
Estos y otros objetos de este tipo de la
invención, tal como resultarán evidentes a partir de la descripción
a continuación, se cumplen mediante la invención descrita en el
presente documento.
La aplicación de la invención a estas
necesidades es especialmente beneficiosa porque la invención es el
único sistema que proporciona eficazmente el uso de extractos de
partes de la corteza interna y la raíz de Uncaria tomentosa,
y el uso de los componentes contenidos dentro de diversas
preparaciones comerciales de Uncaria tomentosa, para
beneficiar a pacientes humanos con la enfermedad de Alzheimer y
otras amiloidosis debido a la capacidad recién descubierta de
Uncaria tomentosa de inhibir la formación de fibrillas de
amiloide, inhibir el crecimiento de fibrillas de amiloide, inhibir
las interacciones amiloide-proteoglucano, las
interacciones amiloide-glucosaminoglucano, y
provocar la disolución y/o ruptura de fibrillas de amiloide formadas
previamente.
La presente invención se refiere a la
identificación y descubrimiento sorprendente de que las partes de la
corteza interna y la raíz de Uncaria tomentosa, conocida de
otra manera como uña de gato (o Cat's claw), actúan como un
inhibidor de la formación y crecimiento del amiloide en la
enfermedad de Alzheimer. Además, Uncaria tomentosa también
tiene la capacidad de inhibir las interacciones proteína
amiloide-proteoglucano (PG)/glucosaminoglucano
(GAG), que se cree que son importantes, para la formación y
persistencia de todos los depósitos de amiloide en los tejidos.
Además, Uncaria tomentosa tiene la capacidad de
disolver/romper las fibrillas de amiloide formadas previamente de
los tipos del Alzheimer y la diabetes tipo II, sugiriendo que este
agente puede ser útil para pacientes en los últimos estadios tanto
de la enfermedad de Alzheimer, diabetes tipo II como otras
amiloidosis. Se encontró que Uncaria tomentosa extraída de
diferentes fuentes comerciales (extractos aislados a partir de
cápsulas recubiertas con gelatina, comprimidos oblongos o forma
líquida) servía como inhibidores potentes de la fibrilogénesis de
amiloide de la enfermedad de Alzheimer.
Aunque los resultados se ponen como ejemplo con
la especie tomentosa, se cree que otras especies de
Uncaria tienen un efecto similar.
Glucosamina (sal de clorhidrato, o la sal de
sulfato) disponible comercialmente que contenía Uncaria
tomentosa, provocó una inhibición significativa marcada de la
formación de fibrillas de amiloide A\beta tal como se determinó
usando un ensayo de fluorometría de tioflavina T. Este efecto
inhibidor se atribuyó a la presencia de Uncaria tomentosa (y
no debido a la presencia de la sal de clorhidrato de glucosamina o a
la sal de sulfato de glucosamina), dado que Uncaria
tomentosa pura (pero no la sal de clorhidrato de glucosamina
pura ni la sal de sulfato de glucosamina) derivada de diferentes
fuentes comerciales era un inhibidor potente de la formación de
fibrillas de amiloide. Uncaria tomentosa (sin otros aditivos)
obtenida de diferentes fuentes comerciales inhibió la
fibrilogénesis de amiloide A\beta de manera dependiente de la
dosis. Uncaria tomentosa también inhibió las interacciones
A\beta-A\beta en la enfermedad de Alzheimer tal
como se determinó usando un ensayo de unión en fase sólida que
demostró que Uncaria tomentosa es adicionalmente un
inhibidor eficaz del crecimiento de fibrillas de amiloide en la
enfermedad de Alzheimer. Además, Uncaria tomentosa fue
eficaz en la inhibición dependiente de la dosis de las interacciones
A\beta-proteoglucano/glucosaminoglucano (PG/GAG)
(una importante diana terapéutica para todas las amiloidosis), tal
como se determinó usando un inmunoensayo de unión en fase sólida.
Uncaria tomentosa derivada de diferentes fuentes comerciales
también era un potente agente de disolución/inhibición de las
fibrillas de amiloide que contienen A\beta (1-40)
o A\beta (1-42) formadas previamente, tal como se
determinó usando ensayos de fluorometría de tioflavina T y tinción
con rojo Congo. Este último efecto se produjo de manera dependiente
de la dosis, provocando un disolución del 70% significativa (p <
0,001) en un periodo de incubación de 2 horas. Además, Uncaria
tomentosa era un potente agente de disolución de fibrillas de
amiloide de los islotes (es decir, amilina), provocando una
disolución del 72% en un periodo de incubación de 2 horas, y una
disolución del 80% en 4 días. La Uncaria tomentosa que fue
eficaz en todos los estudios descritos anteriormente derivaba en su
totalidad de extractos de Uncaria tomentosa obtenidos de
formas de píldora, comprimido o líquidas, y estaban todas
disponibles comercialmente en la actualidad para uso oral en seres
humanos. Por tanto, la presente invención reivindica el uso de
Uncaria tomentosa (en una forma de píldora, comprimido o
líquida) y derivados de la misma a partir de diferentes fuentes
comerciales para el tratamiento de la amiloidosis en la enfermedad
de Alzheimer, diabetes tipo II y otras amiloidosis. También se
describen métodos de aislamiento para identificar y purificar los
componentes inhibidores del amiloide claves en el material vegetal.
Se prevé que la identificación de los principios "activos"
inhibidores del amiloide en los materiales vegetales extraídos
conduce al diseño de nuevos fármacos para productos terapéuticos
anti-amiloide del futuro. Se prevé que el uso actual
de Uncaria tomentosa y sus componentes contenidos en
diferentes preparaciones comerciales beneficia a pacientes humanos
en todos los estadios de la enfermedad de Alzheimer debido a la
capacidad inherente de Uncaria tomentosa de inhibir la
formación de fibrillas de amiloide A\beta (enfermedad de Alzheimer
de estadio temprano a medio), inhibir el crecimiento de fibrillas
de amiloide (enfermedad de Alzheimer de estadio temprano a medio),
inhibir las interacciones de amiloide-PG/GAG (todos
los estadios de las enfermedad de Alzheimer) y provocar la
disolución/ruptura de fibrillas de amiloide formadas previamente
(estadios medios a tardíos de la enfermedad de Alzheimer). De
manera similar, se prevé que Uncaria tomentosa beneficia a
pacientes con diferentes enfermedades amiloides sistémicas tales
como diabetes tipo II, independientemente del estadio de la
acumulación de amiloide y el órgano (o tejido) implicado.
En el segundo aspecto de la invención, existe un
método de aislamiento para purificar e identificar los componentes
inhibidores del amiloide de Uncaria tomentosa y/o extractos
de los mismos. En un método de este tipo, se prepara un extracto a
partir de píldoras, comprimidos, comprimidos oblongos, cápsulas de
gelatina dura y blanda, pastillas para chupar, sobres, sellos para
medicamentos, cápsulas Vegicap, gotas líquidas, elixires,
suspensiones, emulsiones, soluciones, jarabes, bolsitas de té,
aerosoles (como un sólido o en medio líquido), supositorios,
soluciones inyectables estériles, polvos envasados estériles, haces
de corteza y/o polvo de corteza obtenidos comercialmente, usando el
método que emplea alguna o todas de las siguientes etapas:
- a)
- extracción de Uncaria tomentosa independientemente de la forma descrita anteriormente usando un disolvente orgánico tal como propanol, b) concentración del extracto usando un método tal como evaporación rotatoria, liofilización o precipitación, c) centrifugación del extracto para eliminar materiales insolubles, d) nueva centrifugación del sobrenadante para eliminar adicionalmente material insoluble, e) precipitación de los principios activos usando un disolvente orgánico tal como éter de petróleo seguido por centrifugación, f) volver a disolver el sedimento obtenido en un disolvente orgánico tal como propanol, g) aplicar a una columna de sílice equilibrada con propanol/ácido acético al 10% y eluir con el mismo disolvente, h) recoger la fracción de movilidad más rápida (fracciones de color naranja/marrón amarillento) tal como se determina a simple vista o monitorizando a 490 nm, i) precipitación de los componentes activos usando un disolvente orgánico tal como éter de petróleo, seguido por centrifugación, j) volver a disolver el sedimento obtenido en acetonitrilo/agua/ácido acético, y k) inyectar y separar mediante HPLC, l) identificar los componentes inhibidores del amiloide sometiéndolos a prueba en ensayos in vivo e in vitro relevantes, y m) enviarlos para análisis estructural y composición elemental, tal como se describe en el presente documento.
Estas y otras características y ventajas de la
presente invención resultarán completamente evidentes cuando se lea
la siguiente descripción detallada de la invención junto con las
figuras adjuntas.
Se describe un agente farmacéutico para tratar
una enfermedad amiloide en un paciente, en el que el agente
farmacológico comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de
materia vegetal de una planta del género Uncaria. El agente
farmacológico es preferiblemente de una planta del género
Uncaria, especie tomentosa. El agente farmacológico
es preferiblemente un extracto obtenido a partir de Uncaria
tomentosa, derivándose el extracto de la corteza interna o el
tejido de la raíz de Uncaria tomentosa, y tomado
ventajosamente de alguna fuente disponible comercialmente, tal como
píldoras, comprimidos, comprimidos oblongos, cápsulas de gelatina
dura y blanda, pastillas para chupar, sobres, sellos para
medicamentos, cápsulas Vegicap, gotas líquidas, elixires,
suspensiones, emulsiones, soluciones, jarabes, bolsitas de té,
aerosoles (como un sólido o en medio líquido), supositorios,
soluciones inyectables estériles, polvos envasados estériles, haces
de corteza o polvo de corteza.
En realizaciones preferidas, el agente
farmacológico es un componente inhibidor del amiloide seleccionado
del grupo que consiste en alcaloides de oxindol, glucósidos del
ácido quinóvico, proantocianidinas, polifenoles, triterpinos,
esteroles vegetales, beta-sitosterol, estigmasterol,
campesterol, fitosteroles, ácido
3-beta,6-beta,19-alfa-trihidroxi-urs-12-en-28-oico,
5-alfa-carboxiestrictosidina,
aloisopteropodina, alopteropodina, angustina, dihidrocorinanteína,
n-óxido de dihidrocorinanteína, hirsutina, n-óxido de hirsutina,
isomitrafilina, isopteropodina, isorincofilina, n-óxido de
isorincofilina, isorotundifolina, curculogósido, curculigósido B,
fenolglucósidos,
2-[[2,6-dimetoxibenzoil)oxi]-metil-4-hidroxifenil-beta-D-glucopiranósido,
2-[[2-hidroxi-6-metoxibenzoil)oxi]metil-4-hidroxifenil-beta-D-glucopiranósido,
mitrafilina, ácido oleanólico, pteropodina,
3-beta-o-(beta-d-glucopiranosil-(1\rightarrow3)beta-d-fucopiranosil-
(27\rightarrow1)-beta-d-glucopiranosil éster del ácido quinóvico, 3-beta-o-beta-d-fucopiranósido del acido quinóvico, 3-beta-o-beta-d-fucopiranosil-(27\rightarrow1)-beta-d-glucopiranosil éster del ácido quinóvico, 3-beta-o-beta-d-quinovopiranósido del ácido quinóvico, rincofilina, rotundifolina, especiofilina, uncarina, uncarina F, ácido ursólico, cefarantina (alcaloide de bisbencilisoquinolina), berbamina (alcaloide de bisbencilisoquinolina), matrina (alcaloide de lupina), pilocarpina (alcaloide de imidazol), ácido 2,3-dihidrobenzoico, ácido ferúlico, anetol, cleistantina (lignano), fenolglucósidos, urunsiol, alfa-tocoferol (vitamina E), ubicona, maesanina, zexbrevina A/B, 13-acetato de 12-O-tetradecanoil-forbol,, TPA (diterpeno tetracíclico), saponina con ácido oleónico de aglicona (triterpeno pentacíclico) y cinoncósido.
(27\rightarrow1)-beta-d-glucopiranosil éster del ácido quinóvico, 3-beta-o-beta-d-fucopiranósido del acido quinóvico, 3-beta-o-beta-d-fucopiranosil-(27\rightarrow1)-beta-d-glucopiranosil éster del ácido quinóvico, 3-beta-o-beta-d-quinovopiranósido del ácido quinóvico, rincofilina, rotundifolina, especiofilina, uncarina, uncarina F, ácido ursólico, cefarantina (alcaloide de bisbencilisoquinolina), berbamina (alcaloide de bisbencilisoquinolina), matrina (alcaloide de lupina), pilocarpina (alcaloide de imidazol), ácido 2,3-dihidrobenzoico, ácido ferúlico, anetol, cleistantina (lignano), fenolglucósidos, urunsiol, alfa-tocoferol (vitamina E), ubicona, maesanina, zexbrevina A/B, 13-acetato de 12-O-tetradecanoil-forbol,, TPA (diterpeno tetracíclico), saponina con ácido oleónico de aglicona (triterpeno pentacíclico) y cinoncósido.
El agente farmacológico tiene preferiblemente
una cantidad terapéuticamente eficaz de Uncaria tomentosa en
una dosificación en el intervalo de desde aproximadamente 10 hasta
1.000 mg/kg de peso corporal del paciente, y más preferiblemente en
el intervalo de desde aproximadamente 10 hasta 100 mg/kg de peso
corporal del paciente.
La enfermedad amiloide para tratamiento con el
agente farmacológico se selecciona del grupo que consiste en el
amiloide asociado con la enfermedad de Alzheimer, síndrome de Down y
hemorragia cerebral hereditaria con amiloidosis de tipo Dutch (en
los que el amiloide específico se denomina proteína
beta-amiloide o A\beta), el amiloide asociado con
la inflamación crónica, diversas formas de tumores malignos y fiebre
mediterránea familiar (en las que el amiloide específico se
denomina amiloide AA o amiloidosis asociada a inflamación), el
amiloide asociado con mieloma múltiple y otras discrasias de células
B (en los que el amiloide específico se denomina amiloide AL), el
amiloide asociado con diabetes tipo II (en la que el amiloide
específico se denomina amilina o amiloide de los islotes), el
amiloide asociado con las enfermedades priónicas incluyendo la
enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, el síndrome de
Gertsmann-Straussler, kuru y tembladera animal (en
los que el amiloide específico se denomina amiloide PrP), el
amiloide asociado con hemodiálisis a largo plazo y síndrome del
túnel carpiano (en los que el amiloide específico se denomina
amiloide beta_{2}-microglobulina), el amiloide
asociado con amiloide cardiaco senil y polineuropatía amiloidótica
familiar (en los que el amiloide específico se denomina
transtiretina o prealbúmina), y el amiloide asociado con tumores
endocrinos tales como carcinoma medular del tiroides (en los que el
amiloide específico se denomina variantes de procalcitonina).
Los agentes farmacéuticos preferidos tienen un
porcentaje en peso de extracto vegetal en el agente en el intervalo
de desde aproximadamente el 70% hasta aproximadamente el 95%, y
también pueden tener un vehículo, diluyente o excipiente
farmacéuticamente aceptable. El agente farmacéutico tiene
preferiblemente una actividad o eficacia inhibidora del amiloide
superior al 50%.
El segundo aspecto de la invención es un método
para aislar constituyentes inhibidores del amiloide en la materia
vegetal de Uncaria tomentosa, comprendiendo el método las
siguientes etapas: a) extraer la materia vegetal con un disolvente
orgánico, b) concentrar el extracto, c) eliminar materiales
insolubles, d) precipitar constituyentes inhibidores del amiloide
con disolvente orgánico, e) recuperar y redisolver los
constituyentes inhibidores del amiloide obtenidos en disolvente
orgánico, y f) inyectar y separar mediante HPLC.
La materia vegetal está compuesta
preferiblemente por píldoras, comprimidos, comprimidos oblongos,
cápsulas de gelatina dura y blanda, pastillas para chupar, sobres,
sellos para medicamentos, cápsulas Vegicap, gotas líquidas,
elixires, suspensiones, emulsiones, soluciones, jarabes, bolsitas de
té, aerosoles (como un sólido o en medio líquido), supositorios,
soluciones inyectables estériles, polvos envasados estériles, haces
de corteza o polvo de corteza obtenidos comercialmente, que
contienen Uncaria tomentosa, extractos o derivados de la
misma, y pueden tomarse de cápsulas recubiertas con gelatina
disponibles comercialmente que contiene polvo seco de Uncaria
tomentosa, extractos o derivados de la misma.
La etapa de extraer la materia vegetal con un
disolvente orgánico comprende además preferiblemente añadir
propanol inicialmente a los materiales vegetales que están en polvo,
y la mezcla resultante se agita toda la noche. El disolvente usado
en la etapa de extraer los componentes inhibidores del amiloide
tiene preferiblemente una polaridad que oscila desde la del agua
hasta la del pentanol. La etapa de eliminar materiales insolubles
se efectúa preferiblemente centrifugando el extracto y recogiendo el
sobrenadante. La etapa de concentrar el extracto se efectúa
preferiblemente mediante evaporación rotatoria. Tras las etapas de
extracción y centrifugación, el procedimiento de extracción y
centrifugación se repite preferiblemente 1-5 veces
más y se recogen los sobrenadantes.
Tras las etapas repetidas de extracción y
concentración, se combinan y se concentran preferiblemente los
sobrenadantes usando un evaporador rotatorio. Tras la etapa de
concentración, y después de que el volumen sea de aproximadamente
500 ml o menos, se vuelve a centrifugar preferiblemente el extracto
para eliminar adicionalmente materiales insolubles. Tras la etapa
de nueva centrifugación, se obtiene preferiblemente y se precipita
preferiblemente el sobrenadante con éter de petróleo,
preferiblemente 4 volúmenes. Tras la precipitación con éter de
petróleo, se recoge preferiblemente el precipitado en un sedimento
tras la centrifugación adicional. El sedimento se disuelve entonces
preferiblemente en propanol y se aplica a una columna de sílice
equilibrada con propanol que contiene ácido acético. Tras la
aplicación del material a una columna de sílice, se usa propanol que
contiene ácido acético para eluir, y se recogen las fracciones de
color marrón amarillento de movilidad más rápida con un colector de
fracciones. Los eluyentes de la columna se monitorizan
preferiblemente de manera espectroscópica a 490 nm y se recogen las
fracciones en un colector de fracciones. Tras la recogida de las
fracciones de color marrón amarillento de movilidad más rápida, se
precipitan preferiblemente las fracciones con éter de petróleo, y
se recoge el precipitado tras centrifugación. Tras la nueva
precipitación y la nueva centrifugación, se disuelve
preferiblemente el sedimento en acetonitrilo/ácido acético/agua para
la inyección en la cromatografía de líquidos de alta resolución
(HPLC). El sedimento disuelto se divide preferiblemente en partes
iguales y se inyecta en una HPLC. La HPLC usada contiene
preferiblemente una columna C_{18} de 1 X 25 cm, aunque puede
hacerse que sirvan otros tamaños, y se mantiene a 30ºC con una
velocidad de flujo de 2 ml/min. Las partes de la muestra inyectadas
en la HPLC se eluyen con gradientes de A y B, tales como el 0% de B
durante 5 minutos, el 0-15% de B desde
5-10 minutos, el 15-45% de B desde
10-70 minutos y el 45-100% de B
desde 70-85 minutos; en los que B = un 95% de
acetonitrilo con un 0,5% de ácido acético en agua destilada y A = un
5% de acetonitrilo con un 0,5% de ácido acético en agua destilada.
Los eluyentes de la HPLC se monitorizan preferiblemente a 490 nm y
se recogen fracciones de 4 ml en un colector de fracciones y se
obtienen picos combinados a diversos tiempos de retención (desde 0
hasta 85 minutos). Las fracciones obtenidas pueden concentrarse
mediante liofilización después de que se elimine la mayor parte del
acetonitrilo mediante evaporación rotatoria.
Las fracciones concentradas obtenidas se someten
entonces a prueba en ensayos in vitro relevantes para
identificar inhibidores potentes de la formación de fibrillas de
amiloide, el crecimiento de fibrillas de amiloide o la
disolución/ruptura de las fibrillas de amiloide formadas
previamente. Los componentes inhibidores del amiloide en Uncaria
tomentosa se retiran preferiblemente de la HPLC a tiempos de
retención de HPLC aproximados de 13-45 minutos, y
más preferiblemente de 26 minutos.
También se describe un método que no está dentro
del alcance de la invención para tratar una enfermedad amiloide en
un paciente, que comprende la etapa de administrar al paciente una
cantidad terapéuticamente eficaz de materia vegetal de una planta
del género Uncaria, especie tomentosa. La materia
vegetal se administra preferiblemente por vía oral o mediante
pulverizador de aerosol o en una forma inyectable o que se pude
infundir por vía parenteral.
La cantidad terapéuticamente eficaz de materia
vegetal es preferiblemente un componente inhibidor del amiloide
seleccionado del grupo que consiste en alcaloides de oxindol,
glucósidos del ácido quinóvico, proantocianidinas, polifenoles,
triterpinos, esteroles vegetales, beta-sitosterol,
estigmasterol, campesterol, fitosteroles, ácido
3-beta,6-beta,19-alfa-trihidroxi-urs-12-en-28-oico,
5-alfa-carboxiestrictosidina,
aloisopteropodina, alopteropodina, angustina, dihidrocorinanteína,
n-óxido de dihidrocorinanteína, hirsutina, n-óxido de hirsutina,
isomitrafilina, isopteropodina, isorincofilina, n-óxido de
isorincofilina, isorotundifolina, curculogósido, curculigósido B,
fenolglucósidos,
2-[[2,6-dimetoxibenzoil)oxi]-metil-4-hidroxifenil-beta-D-glucopiranósido,
2'-[[2-hidroxi-6-metoxibenzoil)oxi]metil-4-hidroxifenil-beta-D-glucopiranósido,
mitrafilina, ácido oleanólico, pteropodina,
3-beta-o-(beta-d-glucopiranosil-(1\rightarrow3)beta-d-fucopiranosil-(27\rightarrow1)-beta-d-glucopiranosil
éster del ácido quinóvico,
3-beta-o-beta-d-fucopiranósido
del acido quinóvico,
3-beta-o-beta-d-fucopiranosil-(27\rightarrow1)-beta-d-glucopiranosil
éster del ácido quinóvico,
3-beta-o-beta-d-quinovopiranósido
del ácido quinóvico, rincofilina, rotundifolina, especiofilina,
uncarina, uncarina F, ácido ursólico, cefarantina (alcaloide de
bisbencilisoquinolina), berbamina (alcaloide de
bisbencilisoquinolina), matrina (alcaloide de lupina), pilocarpina
(alcaloide de imidazol), ácido
2,3-dihidroxibenzoico, ácido ferúlico, anetol,
cleistantina (lignano), fenolglucósidos, urunsiol,
alfa-tocoferol (vitamina E), ubicona, maesanina,
zexbrevina A/B, 13-acetato de
12-O-tetradecanoil-forbol,,
TPA (diterpeno tetracíclico), saponina con ácido oleónico de
aglicona (triterpeno pentacíclico) y cinoncósido.
La figura 1 es un gráfico en blanco y negro de
un ensayo de fluorometría de tioflavina T de 1 semana utilizado
para identificar inhibidores de la formación de fibrillas de
amiloide A\beta (1-40) de la enfermedad de
Alzheimer. Se muestra que la glucosamina (sal de sulfato) que
contiene Uncaria tomentosa es un potente inhibidor de la
formación de fibrillas de amiloide A\beta
(1-40).
La figura 2 es un gráfico en blanco y negro de
un ensayo de fluorometría de tioflavina T de 1 semana utilizado
para identificar inhibidores de la formación de fibrillas de
amiloide A\beta (1-40) de la enfermedad de
Alzheimer. Se muestra que la glucosamina (sal de sulfato) que
contiene Uncaria tomentosa (PTI-00700), la
glucosamina (sal de sulfato) que contiene Uncaria tomentosa
(PTI-00700 < 30 kDa) que se ha hecho pasar a
través de un filtro con un punto de corte del peso molecular de 30
kDa (PTI-00700 < 30 kDa), la glucosamina (sal de
sulfato) que contiene Uncaria tomentosa
(PTI-00701), y la Uncaria tomentosa pura
(PTI-00703) son todas inhibidores eficaces de la
formación de fibrillas de amiloide A\beta de la enfermedad de
Alzheimer.
La figura 3 es un gráfico en blanco y negro de
un ensayo de unión en fase sólida utilizado para identificar
compuestos líder que inhiben las interacciones
A\beta-A\beta de la enfermedad de Alzheimer (es
decir, el crecimiento de fibrillas de amiloide de la enfermedad de
Alzheimer). La glucosamina (sal de sulfato) que contiene Uncaria
tomentosa (PTI-00700) se identifica como un
inhibidor potente del crecimiento de fibrillas de amiloide de la
enfermedad de Alzheimer.
La figura 4 es un gráfico en blanco y negro de
un inmunoensayo de unión en fase sólida utilizado para determinar
los posibles efectos dependientes de la dosis de la glucosamina (sal
de sulfato) que contiene Uncaria tomentosa
(PTI-00700) sobre la inhibición de las interacciones
A\beta-proteoglucano/glucosaminoglucano (PG/GAG).
Se observa una inhibición dependiente de la dosis significativa de
las interacciones A\beta-PG/GAG con tratamiento
de glucosamina (sal de sulfato) que contiene Uncaria
tomentosa.
La figura 5 es un gráfico en blanco y negro de
un ensayo de fluorometría de tioflavina T utilizado para determinar
los posibles efectos dependientes de la dosis del extracto de
Uncaria tomentosa (PTI-00703) sobre la
disolución/ruptura de las fibrillas de amiloide A\beta
(1-40) de la enfermedad de Alzheimer en un periodo
de incubación de 2 horas. El extracto de Uncaria tomentosa
provoca la disolución de las fibrillas de amiloide A\beta de la
enfermedad de Alzheimer formadas previamente de una manera
dependiente de la dosis.
La figura 6 es un gráfico en blanco y negro de
un ensayo de fluorometría de tioflavina T utilizado para mostrar
que el extracto de Uncaria tomentosa obtenido de otra fuente
comercial (denominado PTI-00703-02),
y de Uncaria tomentosa en forma líquida, también puede
provocar una disolución/ruptura significativa de las fibrillas de
amiloide A\beta (1-40) de la enfermedad de
Alzheimer formadas previamente en un periodo de incubación de 2
horas.
La figura 7 es un gráfico en blanco y negro de
un ensayo de fluorometría de tioflavina T utilizado para mostrar
que el extracto de Uncaria tomentosa obtenido de aún otra
fuente comercial (denominado
PTI-00703-R) puede provocar
disolución/ruptura dependiente de la dosis significativa de las
fibrillas de amiloide A\beta (1-40) de la
enfermedad de Alzheimer formadas previamente en un periodo de
incubación de 2 horas. 1/10.000 del extracto de Uncaria
tomentosa contenido dentro de una única píldora recubierta con
gelatina provocó una disolución del 58% significativa (p <
0,001), mientras que 1/1.000 de un extracto de Uncaria
tomentosa de una única píldora provocó una disolución del 81%
significativa (p > 0,001), 1/500 de un extracto de Uncaria
tomentosa de una única píldora provocó una disolución del 93%
significativa (p < 0,001), y 1/250 de un extracto de Uncaria
tomentosa de una única píldora provocó una disolución del 97%
significativa (p < 0,001).
La figura 8 es un gráfico en blanco y negro de
un ensayo de fluorometría de tioflavina T utilizado para mostrar
que un extracto de Uncaria tomentosa
(PTI-00703) también puede provocar una disolución
significativa (p < 0,001) de las fibrillas de amiloide A\beta
(1-42) de la enfermedad de Alzheimer formadas
previamente (es decir, la forma más larga y más fibrilogénica de
amiloide de la enfermedad de Alzheimer) en todos los puntos del
tiempo, con una disolución/inhibición observada del 63% en tan sólo
2 horas de incubación.
La figura 9 es un gráfico en blanco y negro de
un ensayo de fluorometría de tioflavina T utilizado para mostrar
que un extracto de Uncaria tomentosa
(PTI-00703) también puede provocar una disolución
significativa (p < 0,001) de las fibrillas de amiloide de los
islotes (es decir, amilina) formadas previamente en todos los
puntos del tiempo, con una disolución/inhibición del 72% observada
en tan sólo 2 horas de incubación.
La figura 10 son gráficos en blanco y negro que
demuestran la separación del extracto de Uncaria tomentosa
mediante cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) y
purificación inicial de los componentes inhibidores del amiloide.
El panel A representa una HPLC monitorizada a 490 nm y eluida con un
gradiente de acetonitrilo/agua, que demuestra que el extracto de
Uncaria tomentosa contenía múltiples componentes que eluyeron
de la columna, con un pico ancho observado a los
13-45 minutos, y un pico observado a los 80 minutos.
El panel B demuestra una fracción a los 26 minutos que se volvió a
inyectar y se obtuvo un pico simétrico, indicando que la
polidispersidad del cromatograma del panel A no se debe a un
artefacto de la columna, sino que se debe a la presencia de
componentes individuales en el extracto de Uncaria
tomentosa. En el panel C, se incubaron 60 \mul de A\beta
1-40 fibrilizado previamente 25 \muM durante 2
horas en presencia o ausencia de 0,0005 unidades de DO de la
fracción 26 y la fracción 80. La fracción 26 (pero no la fracción
80) mostró una potente actividad inhibidora del amiloide provocando
una disolución/ruptura del 85% del amiloide de la enfermedad de
Alzheimer en un periodo de incubación de 2 horas.
Volviendo ahora a los dibujos, la invención se
describirá en una realización preferida en referencia a los números
de las figuras del dibujo en las que números similares indican
partes similares.
Amiloide es un término genérico que se refiere a
un grupo de diversos depósitos de proteína extracelular pero
específicos que tienen todos propiedades morfológicas,
características de tinción y espectros de difracción de rayos x
comunes. Independientemente de la naturaleza de la proteína amiloide
depositada, todos los amiloide tienen las siguientes
características: 1) un aspecto amorfo al nivel del microscopio
óptico y aspecto eosinófilo usando tinciones de hematoxilina y
eosina; 2) todos se tiñen con rojo Congo y demuestran una
birrefringencia roja/verde cuando se observa bajo luz polarizada
(Puchtler et al., J. Histochem. Cytochem.
10:355-364, 1962), 3), todos contienen una
estructura secundaria de lámina plegada beta predominante, y 4) de
manera ultraestructural, el amiloide consiste normalmente en
fibrillas que no se ramifican de longitud indefinida y con un
diámetro de 7-10 nm.
El amiloide se clasifica actualmente según la
proteína amiloide específica depositada. Las enfermedades amiloides
incluyen, pero no se limitan a, el amiloide asociado con la
enfermedad de Alzheimer, síndrome de Down y hemorragia cerebral
hereditaria con amiloidosis de tipo Dutch (en los que el amiloide
específico se denomina proteína beta-amiloide o
A\beta), el amiloide asociado con la inflamación crónica, diversas
formas de tumores malignos y fiebre mediterránea familiar (en las
que el amiloide específico se denomina amiloide AA o amiloidosis
asociada a inflamación), el amiloide asociado con el mieloma
múltiple y otras discrasias de células B (en los que el amiloide
específico se denomina amiloide AL), el amiloide asociado con
diabetes tipo II (en la que el amiloide específico se denomina
amilina o amiloide de los islotes), el amiloide asociado con las
enfermedades priónicas incluyendo la enfermedad de
Creutzfeldt-Jakob, el síndrome de
Gertsmann-Straussler, kuru y tembladera animal (en
los que el amiloide específico se denomina amiloide PrP), el
amiloide asociado con hemodiálisis a largo plazo y síndrome del
túnel carpiano (en los que el amiloide específico se denomina
amiloide beta_{2}-microglobulina), el amiloide
asociado con amiloide cardiaco senil y polineuropatía amiloidótica
familiar (en los que el amiloide específico se denomina
transtiretina o prealbúmina), y el amiloide asociado con tumores
endocrinos tales como carcinoma medular del tiroides (en los que el
amiloide específico se denomina variantes de procalcitonina).
Aunque los depósitos de amiloide en estados
clínicos comparten propiedades físicas comunes que se refieren a la
presencia de una conformación de lámina plegada beta, está claro
ahora que existen muchos tipos químicos diferentes y es probable
que se describan otros adicionales en el futuro. Se cree actualmente
que existen varios mecanismos patogénicos comunes que pueden estar
funcionando en las amiloidosis en general. En muchos casos, una
proteína precursora circulante puede resultar de la sobreproducción
de o bien moléculas intactas o bien aberrantes (por ejemplo,
discrasias de células plasmáticas), degradación o excreción
reducidas (amiloide A sérico en algunos síndromes amiloides
secundarios y beta_{2}-microglobulina en
hemodiálisis a largo plazo), o anomalías genéticas asociadas con
proteínas variantes (por ejemplo, polineuropatía amiloidótica
familiar). Se produce en muchos tipos de amiloidosis la proteolisis
de una molécula precursora proteica más grande, dando como
resultado la producción de fragmentos de peso molecular inferior que
polimerizan y adoptan una conformación de lámina plegada beta como
depósitos en el tejido, normalmente en una ubicación extracelular.
En la mayoría de los amiloides, no se conocen cuáles son los
mecanismos exactos implicados, y las causas aberrantes que conducen
a cambios en el procesamiento proteolítico y/o modificaciones
traduccionales.
Los amiloides sistémicos que incluyen el
amiloide asociado con la inflamación crónica, diversas formas de
tumores malignos y fiebre mediterránea familiar (es decir, amiloide
AA o amiloidosis asociada a inflamación) (Benson y Cohen, Arth.
Rheum. 22:36-42, 1979; Kamei et al, Acta
Path. Jpn. 32:123-133, 1982; McAdam et al,
Lancet 2:572-573, 1975; Metaxas, Kidney Int.
20:676-685, 1981), y el amiloide asociado con el
mieloma múltiple y otras discrasias de células B (es decir,
amiloide AL) (Harada et al, J. Histochem. Cytochem.
19:1-15, 1971), como ejemplos, se sabe que están
implicados en la deposición de amiloide en una variedad de órganos
y tejidos diferentes que se encuentran normalmente fuera del sistema
nervioso central. La deposición de amiloide en estas enfermedades
puede producirse, por ejemplo, en el hígado, corazón, bazo, tracto
gastrointestinal, riñón, piel y/o pulmones (Johnson et al,
N. Engl. J. Med. 321:513-518, 1989). Para la mayoría
de estas amiloidosis, no existe cura evidente ni tratamiento eficaz
y las consecuencias de la deposición de amiloide pueden ser
perjudiciales para el paciente. Por ejemplo, la deposición de
amiloide en el riñón puede conducir a insuficiencia renal, mientras
que la deposición de amiloide en el corazón puede conducir a
insuficiencia cardiaca. Para estos pacientes, la acumulación de
amiloide en órganos sistémicos conduce finalmente a la muerte en
general en un plazo de 3-5 años. Otras amiloidosis
pueden afectar a órganos o tejidos únicos tal como se observa con
los depósitos de amiloide A\beta encontrados en los cerebros de
pacientes con la enfermedad de Alzheimer y síndrome de Down: los
depósitos de amiloide PrP encontrados en los cerebros de pacientes
con la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, síndrome de
Gerstmann-Straussler y kuru; los depósitos de
amiloide de los islotes (amilina) encontrados en los islotes de
Langerhans en el páncreas del 90% de los pacientes con diabetes
tipo II (Johnson et al, N. Engl, J. Med.
321:513-518, 1989; Lab. Invest.
66:522-535, 1992); los depósitos de amiloide
beta_{2}-microglobulina en el nervio medial que
conducen al síndrome del túnel carpiano tal como se observa en
pacientes que se someten a hemodiálisis a largo plazo (Geyjo et
al, Biochem. Biophys. Res. Comm. 129:701-706,
1985; Kidney Int. 30:385-390, 1986); el amiloide de
prealbúmina/transtiretina observado en los corazones de pacientes
con amiloide cardiaco senil; y el amiloide de
prealbúmina/transtiretina observado en los nervios periféricos de
pacientes que tienen polineuropatía amiloidótica familiar (Skinner y
Cohen, Biochem. Biophys. Res. Comm.99:1326-1332,
1981; Saraiva et al, J. Lab.
Clin. Med.102:590-603, 1983; J. Clin. Invest. 74:104-119, 1984; Tawara et al, J. Lab. Clin. Med. 98:811-822, 1989).
Clin. Med.102:590-603, 1983; J. Clin. Invest. 74:104-119, 1984; Tawara et al, J. Lab. Clin. Med. 98:811-822, 1989).
La enfermedad de Alzheimer es una causa
principal de demencia en los ancianos, que afecta al
5-10% de la población con más de 65 años de edad (A
Guide to Understanding Alzheimer's Disease and Related Disorders,
editado por Jorm, New York University Press, Nueva York, 1987). En
la enfermedad de Alzheimer, las partes del cerebro esenciales para
procesos cognitivos tales como memoria, atención, lenguaje y
razonamiento degeneran, privándoles a las víctimas de mucho de lo
que nos hace humanos, incluyendo la independencia. En algunas formas
heredadas de la enfermedad de Alzheimer, la aparición es a mediada
edad, pero más comúnmente, los síntomas aparecen desde mediados los
60 años hacia delante. La enfermedad de Alzheimer afecta actualmente
a 4-5 millones de americanos, recibiendo
ligeramente más de la mitad de estas personas cuidados en sus
hogares, mientras que los demás están en muchas instituciones de
atención sanitaria diferentes. La prevalencia de la enfermedad de
Alzheimer y otras demencias se dobla cada 5 años más allá de la edad
de 65 años, y estudios recientes indican que casi el 50% de todas
las personas de 85 años de edad y más ancianas tienen síntomas de la
enfermedad de Alzheimer (1997 Progress Report on Alzheimer's
Disease, National Institute on Aging/National Institute of Health).
El 13% (33 millones de personas) de la población total de los
Estados Unidos tiene 65 años de edad o más, y este % ascenderá al
20% en el año 2025 (1997 Progress Report on Alzheimer's Disease,
National Institute on Aging/National Institute of Health).
La enfermedad de Alzheimer también conlleva una
carga económica pesada a la sociedad. Un estudio reciente estimó
que el coste de los cuidados de un paciente con la enfermedad de
Alzheimer con insuficiencias cognitivas graves en su hogar o en un
asilo, es superior a 47.000 dólares al año (A Guide to Understanding
Alzheimer's Disease and Related Disorders, editado por Jorm, New
York University Press, Nueva York, 1987). Para una enfermedad que
puede abarcar desde 2 hasta 20 años, el coste global de la
enfermedad de Alzheimer para las familias y la sociedad es
asombroso. El coste económico anual de la enfermedad de Alzheimer en
los Estados Unidos en cuanto a gastos de cuidados sanitarios y
salarios perdidos tanto de los pacientes como de sus cuidadores se
estima en de 80 a 100 mil millones de dólares (1997 Progress Report
on Alzheimer's Disease, National Institute on Aging/National
Institute of Health).
El clorhidrato de tacrina ("Cognex"), el
primer fármaco aprobado por la FDA para la enfermedad de Alzheimer
es un inhibidor de la acetilcolinesterasa (Cutler y Sramek, N. Engl.
J. Med. 328:808-810, 1993). Sin embargo, se ha
mostrado que este fármaco tiene un éxito limitado en la mejora
cognitiva en pacientes con la enfermedad de Alzheimer e
inicialmente tenía efectos secundarios importantes tales como
toxicidad hepática. El segundo fármaco aprobado más recientemente
por la FDA, donepezilo (también conocido como "Aricept"), que
es también un inhibidor de la acetilcolinesterasa, es más eficaz
que la tacrina, demostrando una ligera mejora cognitiva en
pacientes con la enfermedad de Alzheimer (Barner y Gray, Ann.
Pharmacotherapy 32:70-77, 1998; Rogers y Friedhoff,
Eur. Neuropsych. 8:67-75, 1998), pero no se cree que
sea una cura. Por lo tanto, está claro que existe una necesidad de
tratamientos más eficaces para los pacientes con la enfermedad de
Alzheimer.
La enfermedad de Alzheimer se caracteriza por la
deposición y acumulación de un péptido de 39-43
aminoácidos denominado la proteína beta-amiloide,
A\beta o \beta/A4 (Glenner y Wong, Biochem. Biophys. Res. Comm.
120:885-890, 1984; Masters et al, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 82:4245-4249, 1985; Husby et
al, Bull WHO 71:105-108, 1993). A\beta deriva
de proteínas precursoras más grandes denominadas proteínas
precursoras del beta-amiloide (o \betaPP) de las
cuales existen varias variantes de corte y empalme alternativo. Las
formas más abundantes de las \betaPP incluyen proteínas que
consisten en 695, 751 y 770 aminoácidos (Tanzi et al, Nature
331:528-530, 1988; Kitaguchi et al, Nature
331:530-532, 1988; Ponte et al, Nature
331:525-527, 1988).
El péptido A\beta pequeño es un componente
principal que compone los depósitos de amiloide de las "placas"
en los cerebros de los pacientes con la enfermedad de Alzheimer.
Además, la enfermedad de Alzheimer se caracteriza por la presencia
de numerosas "marañas" neurofibrilares, que consisten en
filamentos helicoidales apareados que se acumulan de manera anómala
en el citoplasma neuronal (Grundke-Iqbal et
al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:4913-4917,
1986; Kosik et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
83:4044-4048, 1986; Lee et al, Science
251:675-678, 1991). Por tanto, los rasgos
distintivos patológicos de la enfermedad de Alzheimer son la
presencia de "placas" y "marañas", depositándose amiloide
en el núcleo central de las placas. El otro tipo principal de
lesión encontrado en el cerebro con enfermedad de Alzheimer es la
acumulación de amiloide en las paredes de los vasos sanguíneos,
tanto dentro del parénquima cerebral como en las paredes de los
vasos meníngeos que se encuentran fuera del cerebro. Los depósitos
de amiloide ubicados en las paredes de los vasos sanguíneos se
denominan amiloide cerebrovascular o angiopatía congofílica
(Mandybur, J. Neuropath. Exp. Neurol. 45:79-90,
1986; Pardridge et al, J. Neurochem.
49:1394-1401, 1987).
Durante muchos años ha existido un debate
científico en curso respecto a la importancia del "amiloide" en
la enfermedad de Alzheimer y si las "placas" y "marañas"
características de esta enfermedad, eran una causa o simplemente
las consecuencias de la enfermedad. En los últimos años, los
estudios indican ahora que el amiloide es de hecho un factor
causante de la enfermedad de Alzheimer y no debe considerarse
simplemente un testigo inocente. Se ha mostrado que la proteína
A\beta de la enfermedad de Alzheimer en cultivo celular provoca
la degeneración de células nerviosas en cortos periodos de tiempo
(Pike et al, Br. Res. 563:311-314, 1991; J.
Neurochem. 64:253-265, 1995). Los estudios sugieren
que es la estructura fibrilar (que consiste en una estructura
secundaria de lámina plegada \beta predominante), característica
de todos los amiloides, la que es responsable de los efectos
neurotóxicos. Se ha encontrado también que A\beta es neurotóxico
en cultivos de cortes de hipocampo (Harrigan et al,
Neurobiol.Aging 16:779-789, 1995) e induce la muerte
de células nerviosas en ratones transgénicos (Games et al,
Nature 373:523-527, 1995; Hsiao et al,
Science 274:99-102, 1996). La inyección de A\beta
de la enfermedad de Alzheimer en el cerebro de ratas también provoca
deterioro de la memoria y disfunción neuronal (Flood et al,
Proc. Natl. Acad. Sci. 88:3363-3366, 1991; Br. Res.
663:271-276, 1994).
Probablemente, la prueba más convincente de que
el amiloide A\beta está implicado en la patogenia de la
enfermedad de Alzheimer proviene de estudios genéticos. Se ha
descubierto que la producción de A\beta puede resultar de
mutaciones en el gen que codifica para su precursor, la proteína
precursora del beta-amiloide (Van Broeckhoven et
al, Science 248:1120-1122, 1990; Murrell et
al, Science 254:97-99, 1991; Haass et
al, Nature Med. 1:1291-1296, 1995). La
identificación de mutaciones en el gen de la proteína precursora
del beta-amiloide que provocan una enfermedad de
Alzheimer familiar de aparición temprana es el argumento más fuerte
de que el amiloide es fundamental en el proceso patogenético que
subyace a esta enfermedad. Se han descubierto ahora cuatro
mutaciones que provocan la enfermedad notificadas que demuestran la
importancia de A\beta para provocar la enfermedad de Alzheimer
familiar (tratado en Hardy, Nature Genet. 1:233-234,
1992). Todos estos estudios sugieren que proporcionar un fármaco
para reducir, eliminar o prevenir la formación, deposición,
acumulación y/o persistencia de A\beta fibrilar en los cerebros de
pacientes humanos se cree que sirve como un agente terapéutico
eficaz.
La planta Uncaria tomentosa, también
conocida como "uña de gato" (en español) o "Cat's claw"
(en inglés) se refiere a una parra leñosa que crece en la selva
tropical del Amazonas peruano. Esta parra de crecimiento lento
tarda 20 años en alcanzar la madurez, y puede crecer más de 100 pies
de longitud a medida que se une y se enrolla por sí misma alrededor
de árboles nativos. Se encuentra abundantemente a pie de monte, a
altitudes de dos a ocho mil pies. La parra se denomina "uña de
gato" debido a sus espinas similares a uñas curvadas distintivas
que la protegen a partir de la base de sus hojas. Tradicionalmente,
las tribus indias nativas han hervido la corteza interna y la raíz
de la hierba para preparar una decocción de té y consideraban a
Uncaria tomentosa como una planta medicinal sagrada. Se cree
que las propiedades altamente eficaces contenidas dentro de la
corteza interna de esta planta tienen una influencia profunda y
positiva sobre el cuerpo, aunque se carece generalmente de datos
médicos científicos sobre sus posibles beneficios en seres humanos.
Los alcaloides y compuestos fitoquímicos de la corteza interna de
Uncaria tomentosa son casi idénticos a los encontrados en la
raíz, y la cosecha de esta forma conserva a la planta y mantiene el
futuro de la selva tropical.
Algunas de las sustancias activas presentes en
Uncaria tomentosa son alcaloides (véanse las patentes de
Keplinger a las que se hizo referencia anteriormente), que se
producen en la planta y su extracto acuoso como un complejo unido a
taninos. De esta forma, pocos de ellos pueden activarse. Los
complejos se separan por el medio ácido del estómago; los
alcaloides se transforman en su forma de clorhidrato, y de esta
manera, se absorben bien. Un extracto de Uncaria tomentosa
más oscuro significa que está presente más tanino y los alcaloides
beneficiosos están bloqueados con los taninos, que han formado un
complejo no biodisponible y que se absorbe escasamente. Un color
dorado claro de Uncaria tomentosa sugiere que hay menos
taninos, y están disponibles más alcaloides en el extracto.
Además de la presencia de alcaloides, se cree
que Uncaria tomentosa contiene también otros compuestos
fitoquímicos beneficiosos incluyendo glucósidos de ácido quinóvico,
proantocianidinas, polifenoles, triterpinos y los esteroles
vegetales beta-sitosterol, estigmasterol y
campesterol (P. Steinberg "Uncaria tomentosa (Cat's Claw)
a wondrous herb from the Peruvian rain forest", Townsend Letter
for Doctors, mayo, 1994; P. Steinberg, "Cat's claw
update-Uncaria tomentosa: that wondrous herb from the
Peruvian rain forest", Townstead Letter for Doctors,
agosto/septiembre de 1995, "Cat's Claw Miracle Herb from the Rain
Forest of Peru", Woodland Publ. Inc., Pleasant Grove, VT,
EE.UU.).
Uncaria tomentosa es una de las plantas
más importantes de la selva tropical peruana de América del sur. Se
han aislado ya varios alcaloides de oxindol a partir de la corteza
interna de esta planta. Dos patentes estadounidenses (patente
estadounidense número 4.844.901 y patente estadounidense número
4.940.725 concedidas a Keplinger) describen el aislamiento y uso de
seis alcaloides de oxindol de Uncaria tomentosa, que se cree
que son "adecuados para la estimulación no específica del sistema
inmunológico". Se cree que estos alcaloides de oxindol
proporcionan un refuerzo general al sistema inmunitario así como que
tienen un profundo efecto sobre la capacidad de los glóbulos
blancos y los macrófagos para fagocitar microorganismos nocivos y
materia extraña. El alcaloide más activo inmunológicamente parece
ser la aloisopteropodina, isómero A, un alcaloide de oxindol
pentacíclico (patente estadounidense 4.940.725).
Aunque algunos profesionales sanitarios han
sugerido que Uncaria tomentosa puede usarse para tratar una
variedad de dolencias, en ningún lugar se ha usado, o se ha sugerido
el uso de este compuesto para el tratamiento de la formación,
deposición, acumulación y/o persistencia de amiloide, tal como el
que se produce en las amiloidosis, incluyendo la enfermedad de
Alzheimer. La presente invención demuestra claramente la eficacia de
Uncaria tomentosa y sus extractos y derivados obtenidos de
diferentes fuentes comerciales para la 1) inhibición de la
formación de fibrillas de amiloide A\beta de la enfermedad de
Alzheimer (importante para pacientes con enfermedad de Alzheimer en
estadio temprana a medio), 2) inhibición del crecimiento de
fibrillas de amiloide de la enfermedad de Alzheimer (importante
para pacientes con enfermedad de Alzheimer en estadio temprano a
medio), 3) inhibición de las interacciones
amiloide-PG/GAG (importante para pacientes en todos
los estadios de la enfermedad de Alzheimer) y 4) provocar la
disolución/ruptura de las fibrillas de amiloide de la enfermedad de
Alzheimer formadas previamente. Además, la presente invención
demuestra que Uncaria tomentosa es eficaz para provocar la
disolución de las fibrillas de amiloide de los islotes (es decir,
amilina) y por lo tanto sirve como un tratamiento eficaz para ~ el
90% de los pacientes diabéticos tipo II que tienen acumulación de
amiloide de los islotes en el páncreas.
Se exponen los siguientes ejemplos de modo que
proporcionen a los expertos en la técnica la divulgación y
descripción de la identificación y uso Uncaria tomentosa
comercialmente disponible para inhibir la formación de fibrillas de
amiloide, inhibir el crecimiento de fibrillas de amiloide, inhibir
las interacciones amiloide-PG/GAG, y provocar la
disolución/ruptura de fibrillas de amiloide formadas previamente.
Sin embargo, no debe interpretarse que la invención se limita a
estos ejemplos específicos.
Se empleó inicialmente un método descrito
previamente para medir la formación de fibrillas de amiloide
utilizando fluorometría de tioflavina T (H Naiki et al, Lab,
Invest. 65:104-110, 1991; H Levine III, Protein Sci.
2:404-410, 1993; H Levine III, Amyloid: Int. J.
Exp. Clin. Invest. 2:1-6, 1995; H Naiki y K.
Nakakuki, Lab. Invest. 74:374-383, 1996) para
identificar compuestos terapéuticos potenciales que pudiesen inhibir
la formación de fibrillas de amiloide A\beta de la enfermedad de
Alzheimer. Usando este ensayo sensible, se demostró previamente que
cualquier descenso o aumento en la fluorescencia se correlacionaba
con un descenso o aumento en la cantidad de fibrillas de amiloide
(H Naiki et al, Lab. Invest. 65:104-110,
1991; H Levine III, Protein Sci. 2:404-410, 1993; H
Levine III, Amyloid: Int. J. Exp. Clin. Invest.
2:1-6, 1995; H Naiki y K. Nakakuki, Lab. Invest.
74:374-383, 1996), permitiendo determinar la
identificación y grado de los posibles inhibidores y/o
potenciadores de la formación de fibrillas de amiloide.
Nuestros estudios de selección sugirieron en
primer lugar la detección de un potente agente inhibidor del
amiloide de la enfermedad de Alzheimer que estaba presente como un
componente añadido en uno de los compuestos que se sometió a prueba
inicialmente. En un estudio, se evaluaron los efectos de diversos
compuestos sobre la formación de fibrillas de A\beta
(1-40) de la enfermedad de Alzheimer mediante
fluorometría de tioflavina T. Se conoce que la tioflavina T se une
a proteínas amiloides fibrilares, y un aumento en la fluorescencia
se correlaciona con un aumento en la formación de fibrillas de
amiloide, mientras que un descenso en la fluorescencia se
correlaciona con un descenso en la formación de fibrillas de
amiloide. La proteína A\beta (1-40) de la
enfermedad de Alzheimer, cuando se incuba a 37ºC, tiende a formar
espontáneamente fibrillas de amiloide que aumentan en cantidad con
el tiempo. En este estudio, se realizaron pruebas para detectar
compuestos que tenían el potencial de inhibir la formación de
fibrillas a partir de proteína amiloide A\beta de la enfermedad
de Alzheimer durante un periodo de 1 semana. Por tanto, los
compuestos identificados tienen la capacidad de inhibir la
formación de fibrillas de amiloide de la enfermedad de Alzheimer.
Para estos estudios, se incubaron 25 \muM de A\beta
(1-40) (Bachem Inc., Torrance, CA, EE.UU.; lote
número WM365) en tubos de microcentrífuga a 37ºC durante 1 semana
(por triplicado), o bien solos, o bien en presencia de 1,25 mM (es
decir, razón 1:50 de A\beta:compuesto de prueba) (excepto
PTI-00700, que se aisló y se usó tal como se
describe a continuación) de diversos componentes en Tris HCl 150
mM, NaCl 10 mM, pH 7,0 (TBS). Los compuestos sometidos a prueba
incluían PTI-07499 (pentasulfato de manosa, sal de
potasio), PTI-20049
(2,3,4,6-tetrasulfato de
metil-alfa-D-glucopiranósido,
sal de potasio), PTI-20814
(2,3,4,6-tetrasulfato de
metil-alfa-D-mannopiranósido,
sal de potasio), PTI-70936 (heptasulfato de
sacarosa, sal de potasio), PTI-70946 (hexasulfato de
sacarosa, sal de potasio), PTI-70011 (octasulfato
de sacarosa, sal de potasio) PTI-00800 (glucosamina,
sal de sulfato, de Enzymatic Therapy, Green Bay, Wisconsin y
conocida comercialmente como "sulfato de glucosamina"),
PTI-00900 (glucosamina, sal de sulfato, de Jarrows
Formulas, Los Angeles, CA y conocida comercialmente como "sulfato
de glucosamina 500") y PTI-00700, (glucosamina,
sal de sulfato, con Uncaria tomentosa).
PTI-00700 se derivó de cápsulas libres de
conservante que contenían 400 mg de combinación de glucosamina (sal
de sulfato) y 50 mg de corteza interna de Uncaria tomentosa.
Para estos estudios, se extrajo el polvo del interior de una cápsula
de PTI-00700 en 5 ml de agua destilada y se
sedimentó por gravedad. Se obtuvo entonces la fracción soluble y se
usó en estos estudios a una dilución final de 1:227 en solución
salina tamponada con Tris (TBS) (comparable a la concentración de
los otros compuestos sometidos a prueba en cuanto a la
glucosamina).
Para evaluar los efectos de cada compuesto sobre
la formación de fibrillas de A\beta (1-40), se
tomaron alícuotas de 50 \mul de cada tubo para el análisis a 1 h,
1 día, 3 días y 1 semana. Para cada determinación descrita
anteriormente, tras cada periodo de incubación, se añadieron 50
\mul de compuestos de prueba A\beta +/- a 1,2 ml de tioflavina
T 100 \muM (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) en NaPO_{4} 50 mM
(pH 6,0). Los estudios indicaron que el aumento de las
concentraciones de A\beta dio un aumento proporcional en
fluorescencia en presencia de tioflavina T 100 \muM, descartando
la presencia de cualquier efecto de filtro interno desproporcionado
en estos estudios. Se midió la emisión de fluorescencia a 482 nm en
un fluorómetro Turner instrument modelo 450 a una longitud de onda
de excitación de 450 nm. Para cada determinación, se calibró el
fluorómetro poniéndolo a cero en presencia del reactivo tioflavina
T solo, y ajustando la riboflavina 50 ng/ml (Sigma Chemical Co.,
St. Louis, Mo) en el reactivo tioflavina T a 1800 unidades de
fluorescencia. Todas las determinaciones de la fluorescencia se
basaron en estas referencias y se restó siempre cualquier
fluorescencia emitida por cualquiera de los compuestos en presencia
de reactivo tioflavina T de todas las lecturas pertinentes.
Para todos los estudios de fibrilogénesis que
utilizan fluorometría de tioflavina T, tal como se describe en el
presente documento, las comparaciones de proteína amiloide en
presencia o ausencia de compuestos de prueba se basaron en pruebas
de la t de Student para datos emparejados mostrando los datos la
media +/- la desviación estándar. Se notificó una significación en
los niveles de confianza del 95% (p < 0,05), del 99% (p <
0,01) y 99,999% (p < 0,001).
Tal como se muestra en la figura 1, se evaluaron
los efectos de estos diversos compuestos de prueba sobre la
formación de fibrillas de amiloide A\beta (1-40)
de la enfermedad de Alzheimer durante un periodo de incubación de 1
semana. A\beta (1-40) recién suspendido solo, tras
una incubación de 1 hora a 37ºC, mostró una fluorescencia inicial
de 75 +/- 9 unidades de fluorescencia. Durante el periodo de
incubación de 1 semana, hubo un aumento gradual en la fluorescencia
de A\beta (1-40) solo, aumentando 6,1 veces desde
1 hora hasta 1 semana, con una fluorescencia máxima de 459 +/- 18
unidades de fluorescencia observada en la semana 1 (figura 1), que
concuerda con estudios previos (Castillo et al, J. Neurochem.
69:2452-2465, 1997). De todos los compuestos
sometidos a prueba, solo la glucosamina (sal de sulfato) que
contenía Uncaria tomentosa (es decir,
PTI-00700) inhibió de manera significativa la
formación de fibrillas de amiloide A\beta (1-40).
La glucosamina (sal de sulfato) derivada de dos fuentes diferentes
(es decir, PTI-00800 y PTI-00900)
que no contenía Uncaria tomentosa no inhibió de manera
significativa la formación de fibrillas de amiloide A\beta
(1-40) (figura 1). Esto indicó que el agente
inhibidor del amiloide activo era lo más probablemente Uncaria
tomentosa. Se detecto la inhibición significativa de la
formación de fibrillas de amiloide A\beta por glucosamina (sal de
sulfato) que contenía Uncaria tomentosa (es decir,
PTI-00700) con tan sólo 1 hora de incubación. Se
observó una inhibición significativa (p < 0,001) por glucosamina
(sal de sulfato) que contenía Uncaria tomentosa sobre la
formación de fibrillas de amiloide A\beta en todos los puntos del
tiempo incluyendo 1 hora, 1 día, 3 días y 1 semana. Tras 1 semana,
la glucosamina (sal de sulfato) que contenía Uncaria
tomentosa era eficaz para inhibir de manera significativa
(p<0,001) la formación de fibrillas de amiloide en un 78%. Estos
datos iniciales indicaron que la glucosamina (sal de sulfato) que
contenía Uncaria tomentosa era un potente inhibidor de la
formación de fibrillas de amiloide de la enfermedad de
Alzheimer.
Se diseñaron los siguientes estudios para
reproducir algunos de los datos adquiridos inicialmente y para
determinar si el principio activo que inhibía la formación de
fibrillas de amiloide A\beta era en realidad Uncaria
tomentosa. En estos estudios, se evaluaron de nuevo los efectos
de diversos compuestos sobre la fibrilogénesis de A\beta
(1-40) de la enfermedad de Alzheimer usando
fluorometría de tioflavina T. Para estos estudios, se incubaron 25
\muM de A\beta (1-40) (Bachem Inc., Torrance,
CA, EE.UU.; lote número WM365) en tubos de microcentrífuga a 37ºC
durante una semana (por triplicado), o bien solos, o bien en
presencia de 1,25 mM (es decir, una razón 1:50 de
A\beta:compuesto de prueba) de diversos compuestos (excepto
PTI-00700, PTI-00701 y
PTI-00703 que se aislaron y se usaron tal como se
describe a continuación) en Tris HCl 150 mM, NaCl 10 mM, pH 7,0
(TBS). Los compuestos sometidos a prueba incluían glucosamina (sal
de sulfato) que contenía Uncaria tomentosa
(PTI-00700), glucosamina (sal de sulfato) que
contenía Uncaria tomentosa que se filtró a través de un
filtro que contenía un punto de corte de 30 kilodalton
(PTI-00700 < 30 kDa), glucosamina (sal de
clorhidrato) que contenía Uncaria tomentosa
(PTI-00701), glucosamina pura
(PTI-00712; peso molecular = 216; obtenida de Sigma
Chemical Company, St. Louis, MO, EE.UU.), galactosamina pura
(PTI-00713; peso molecular = 216; obtenida de Sigma
Chemical Company, St. Louis, MO, EE.UU.), sulfato de sodio
(PTI-00725; peso molecular = 142; obtenida de Sigma
Chemical Company, St.Louis, MO, EE.UU.), y Uncaria tomentosa
(PTI-00703; obtenida de una fuente comercial). Para
estos estudios, se extrajo el polvo del interior de una cápsula
recubierta con gelatina de sulfato de glucosamina que contenía
Uncaria tomentosa (PTI-00700) en 5 ml de agua
destilada y se usó para las pruebas tal como se describe en el
ejemplo 1. Se extrajo el polvo del interior de una cápsula
recubierta con gelatina de glucosamina (sal de clorhidrato) que
contenía Uncaria tomentosa (PTI-00701) en 5
ml de agua destilada y se usó a una dilución final de 1:40 en TBS
(que representaba el extracto total derivado de 250 \mug de
Uncaria tomentosa por ml), mientras que se extrajo el polvo
del interior de una cápsula recubierta con gelatina de Uncaria
tomentosa (PTI-00703) en 5 ml de agua destilada
y se usó a una dilución final de 1:250 en TBS (que representaba el
extracto total derivado de 350 \mug de Uncaria tomentosa
por ml).
Para evaluar los efectos de cada compuesto sobre
la formación de fibrillas de A\beta (1-40) de la
enfermedad de Alzheimer, se tomaron alícuotas de 50 \mul de cada
tubo para analizar a 1 hora, 1 día, 3 días y 1 semana usando
fluorometría de tioflavina T tal como se describió anteriormente.
Tal como se muestra en la figura 2, se evaluaron los efectos de
estos diversos compuestos de prueba sobre la formación de fibrillas
de amiloide A\beta (1-40) durante un periodo de
incubación de 1 semana. A\beta (1-40) recién
suspendido solo, tras una incubación de 1 hora a 37ºC, mostró una
fluorescencia inicial de 113 +/- 7 unidades de fluorescencia.
Durante el periodo de incubación de 1 semana, hubo un aumento
gradual en la fluorescencia de A\beta (1-40)
solo, aumentando 2,2 veces desde 1 hora hasta 1 semana, con una
fluorescencia máxima de 250 +/- 50 unidades de fluorescencia
observada en 1 semana. La glucosamina (sal de sulfato) que contenía
Uncaria tomentosa (PTI-00700), y glucosamina
(sal de sulfato) que contenía Uncaria tomentosa que se filtró
a través de un filtro que contenía un punto de corte de 30
kilodalton (PTI-00700 < 30 kDa), eran ambas
potentes inhibidores de la formación de fibrillas de amiloide
A\beta provocando una inhibición del 68% y del 72% en 1 semana,
respectivamente (figura 2). Se observó una inhibición incluso más
potente de la formación de fibrillas de amiloide con glucosamina
(sal de clorhidrato) que contenía Uncaria tomentosa
(PTI-00701), que provocó una inhibición del 90% de
la formación de fibrillas de amiloide A\beta en 1 semana. Cada uno
de estos potentes compuestos inhibió de manera significativa la
formación de fibrillas de amiloide tan sólo 1 hora tras la
incubación. El principio activo que se consideró que provocaba este
potente efecto inhibidor sobre la formación de fibrillas de
amiloide era Uncaria tomentosa contenida dentro de estas
preparaciones comerciales. Esto se debía al hecho de que la
glucosamina (PTI-00712) que no contenía Uncaria
tomentosa no tenía absolutamente nada de efecto inhibidor sobre
la formación de fibrillas de amiloide. Además, la Uncaria
tomentosa pura (PTI-00703) provocó un efecto
inhibidor similar (inhibición del 73% en 1 semana; y una inhibición
del 93% en 1 hora) sobre la formación de fibrillas de amiloide a la
observada con glucosamina (sal de sulfato) que contenía Uncaria
tomentosa. Estos datos indicaron que el principio activo que era
un potente inhibidor de la formación de fibrillas de amiloide de la
enfermedad de Alzheimer era la Uncaria tomentosa.
En la enfermedad de Alzheimer y otras
amiloidosis, se cree que el crecimiento de fibrillas de amiloide
implica autointeracciones de la proteína amiloide (es decir,
interacciones A\beta-A\beta). Cualquier posible
agente terapéutico eficaz para la deposición, acumulación y/o
persistencia amiloide también debe poder provocar una inhibición de
las autointeracciones de la proteína amiloide. Esto es importante
para prevenir cualquier nueva formación de fibrillas de amiloide
cuando se trata a pacientes de la enfermedad de Alzheimer en
estadios tempranos de la enfermedad. Por tanto, se usaron
metodologías de ELISA (es decir, ensayos de unión en fase sólida)
para identificar compuestos que podían inhibir las interacciones
A\beta-A\beta (es decir, el crecimiento de
fibrillas de amiloide de la enfermedad de Alzheimer).
En primer lugar, se marcó A\beta
(1-40) con biotina según el siguiente protocolo. Se
disolvió 1 mg de A\beta (1-40) (Bachem Inc.,
Torrance, CA, EE.UU.; lote número WL934) en 200 \mul de PBS (pH
8,0) y se incubó durante 1 semana a 37ºC. Se añadió entonces la
solución de A\beta fibrilar a 0,2 mg de agente de biotinilación
[(hexanoato (sulfosuccinimidil-6-(biotinamido)]
(sulfo-NHS-LC-biotina)
y se incubó durante 45 minutos a temperatura ambiente (según el
protocolo del fabricante; Pierce). Para eliminar la
sulfo-NHS-LC-biotina
en exceso no incorporada a A\beta, se añadieron a la solución 25
\mul de acetato de sodio 3 M y 1 ml de etanol, se agitó en vórtex
y se centrifugó después a 14.000 Xg durante 20 minutos. Se descartó
entonces el sobrenadante y volvió a suspenderse el sedimento en 200
\mul de agua destilada, y volvió a precipitarse con etanol que
contenía el 2,5% de acetato de sodio 3 M. Se repitieron entonces
las etapas de centrifugación (descritas anteriormente). Entonces
volvió a suspenderse el sedimento que contenía A\beta fibrilado
que se biotiniló (en la región de A\beta que no autointeracciona)
en 1 ml de agua desionizada destilada. Se determinó entonces la
cantidad de biotina incorporada usando el método HABA (ácido
2-(4'-hidroxiazo-benceno)benzoico)
(según el protocolo del fabricante, Pierce).
Se dejó que se unieran durante la noche 2 \mug
de A\beta no marcado en 40 \mul de solución salina tamponada
con Tris que contenía Tris-HCl 100 mM, NaCl 50 mM,
NaN_{3} 3 mM, pH 7,0 (TBS) a 4ºC a pocillos de microtitulación
(placas Nunc, Maxisorb). Al día siguiente, se boquearon todos los
pocillos de microtitulación durante 2 horas incubando con 300
\mul de TBS con Tween-20 al 0,05% (TTBS) más
albúmina de suero bovino al 2% (BSA) obtenida de Sigma Chemical
Company, St. Louis, MO, EE.UU.). Entonces, se colocaron (por
triplicado) 100 \mul de A\beta 1-40 biotinilada
en TTBS, en presencia o ausencia de 1,25 mM de compuestos de prueba
(descritos a continuación), en pocillos que contenían A\beta no
marcada unida al sustrato o el blanco, y se dejó que se unieran
durante la noche a 4ºC. Al día siguiente, se aclararon los pocillos
3 veces con TTBS, y entonces se exploraron con sondas durante 2
horas con 100 \mul de estreptavidina-peroxidasa o
anticuerpo anti-biotinperoxidasa (dilución 1:500 de
una solución de 2 \mug/ml) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) en
TBS que contenía BSA al 0,1%. Se aclararon entonces los pocillos 3
veces con TTBS y se añadieron 100 \mul de una solución de sustrato
(OPD-Sigma Fast de Sigma Chemical Co., St. Louis,
MO) a cada pocillo y se dejó que se desarrollara durante 5 minutos
o hasta que se observó un cambio de color significativo. Se paró la
reacción con 50 \mul de H_{2}SO_{4} 4 N y se leyó en un
lector de microplacas modelo 450 (Biorad, Hercules, CA, EE.UU.)
a
490 nm.
490 nm.
Los compuestos sometidos a prueba incluían
octasulfato de sacarosa (PTI-70011), hexasulfato de
sacarosa (sal de potasio) (PTI-70946), heptasulfato
de sacarosa (sal de potasio) (PTI-70936),
2,3,4,6-tetrasulfato de
metil-alfa-D-mannopiranósido
(sal de potasio) (PTI-20814),
2,3,4,6-tetrasulfato de
metil-alfa-D-glucopiranósido
(sal de potasio) (PTI-20049), glucosamina (sal de
sulfato) (Enzymatic Therapy, Green Bay, Wisconsin)
(PTI-00800), glucosamina (sal de sulfato de Jarrows
Formulas, Los Angeles, CA, conocida comercialmente como "sulfato
de glucosamina 500") (PTI-00900), glucosamina
(sal de sulfato) que contiene Uncaria tomentosa
(PTI-00700), heparina (PTI-H98546),
condroitin-4-sulfato
(PTI-C45770), y dermatán sulfato (PTID58901). Se
aisló glucosamina (sal de sulfato) que contiene Uncaria
tomentosa (PTI-00700) y se usó a una dilución de
1:227 en solución salina tamponada con Tris que contenía
Tween-20 al 0,05% (TTBS), tal como se describió en
el ejemplo 2.
Tal como se muestra en la figura 3, sólo la
glucosamina (sal de sulfato) que contenía Uncaria tomentosa
(PTI-00700) fue eficaz para provocar una reducción
del 70% significativa (p < 0,001) en las interacciones
A\beta-A\beta. El principio activo que provocó
esta inhibición fue la Uncaria tomentosa, dado que la
glucosamina pura (sal de sulfato) obtenida de dos fuentes diferentes
(es decir, PTI-00800 y PTI-00900)
no tuvieron absolutamente nada de efecto inhibidor sobre el
crecimiento de fibrillas de amiloide (figura 3). Estos datos
demuestran que la glucosamina (sal de sulfato) que contenía
Uncaria tomentosa era un inhibidor eficaz de las
interacciones A\beta-A\beta, y que el principio
activo que era un potente inhibidor del crecimiento de fibrillas de
amiloide de la enfermedad de Alzheimer era la Uncaria
tomentosa.
Se puso en práctica un estudio para determinar
si la glucosamina (sal de sulfato) que contiene Uncaria
tomentosa era un inhibidor eficaz de las interacciones
A\beta-proteoglucano/glucosaminoglucano (PG/GAG).
Dado que se ha encontrado que PG/GAG se acumula en depósitos de
amiloide y se cree que impiden la capacidad natural del cuerpo para
eliminar el "amiloide" no deseado (tratado en Snow y Wight,
Neurobiology Aging 10:481-497, 1989), un inhibidor
de las interacciones A\beta-PG/GAG es una diana
adicional deseable para un agente terapéutico amiloide. En este
estudio, se utilizó un inmunoensayo de unión en fase sólida para
determinar si la glucosamina (sal de sulfato) que contiene
Uncaria tomentosa (PTI-00700) era un
inhibidor eficaz de las interacciones
A\beta-PG/GAG y si esta inhibición se producía de
una manera dependiente de la dosis.
Se dejó que se unieran 12 mg de perlecano
(aislado del sarcoma de
Engelbreth-Holm-Swarm) (Castillo
et al, J. Biochemistry 120:433-444, 1996),
heparina (peso molecular = 5 kDa; obtenida de Sigma Chemical
Company, St. Louis, MO, EE.UU.) o heparán sulfato (peso molecular
=\sim70 kDa; obtenido de Seikagaku America, Rockville, Maryland)
en 80 \mul de solución salina tamponada con Tris que contenía
Tris-HCl 100 mM, NaCl 50 mM, NaN_{3} 3 mM, pH 9,0
(TBS) durante toda la noche a 4ºC a pocillos de microtitulación
(placas Nunc, Maxisorb). Al día siguiente, se bloquearon todos los
pocillos de microtitulación durante 2 horas incubando con 300 \mul
de TBS con Tween-20 (TTBS) al 0,05% más albúmina de
suero bovino al 1% (BSA) (obtenida de Sigma Chemical Company, St.
Louis, MO, EE.UU.). Entonces, se colocaron (por triplicado) 100
\mul de A\beta 1-40 (5 \muM) (Bachem Inc.,
Torrance, CA, EE.UU.; lote número WM365) en TTBS que contenía
albúmina al 0,05% en presencia o ausencia de 5 \mul de
glucosamina (sal de sulfato) que contiene Uncaria tomentosa
(PTI-00700) en pocillos que contenían PG/GAG unido
al sustrato o el blanco, y se dejó que se unieran durante la noche a
4ºC. Para el estudio, se derivó un extracto acuoso de glucosamina
(sal de sulfato) que contenía Uncaria tomentosa (es decir,
PTI-00700) tomando el polvo de una cápsula/píldora
recubierta con gelatina (que contiene 50 mg de Uncaria
tomentosa) y se extrajo dos veces don 2,5 ml de agua destilada
doble y entonces se reunieron los dos extractos acuosos juntos
(denominados la "solución PTI-00700"). Se usó
entonces la solución PTI-00700 sin diluir (que
representaba un 1/1000 de una píldora única) o se diluyó a razones
de 1:3 (es decir, un 1/3.000 de una píldora única), 1:9 (es decir,
un 1/9.000 de una píldora única) o 1:27 (un 1/27.000 de una píldora
única), con agua destilada. Al día siguiente, se aclararon los
pocillos una vez con TTBS, y entonces se exploraron con sondas
durante 45 minutos con 100 \mul de anticuerpo
anti-6E10 (Senetek, Maryland Heights, Missouri) (que
reconoce a A\beta 1-17) diluido 1:1000 con TTBS.
A esto le siguió un aclarado con TTBS y se exploró con sondas
durante 45 minutos con anticuerpo de cabra
anti-ratón biotinilado (diluido 1:1000) que contenía
estreptavidina-peroxidasa o anticuerpo
anti-biotinperoxidasa (dilución 1:500 de una
solución de 2 \mug/ml) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) en
TTBS que contenía BSA al 0,1%. Se aclararon entonces los pocillos 3
veces con TTBS y se añadieron 100 \mul de una solución de
sustrato (OPD-Sigma Fast de Sigma Chemical Co., St.
Louis, MO) a cada pocillo y se dejó desarrollar durante 5 minutos o
hasta que se observó un cambio de color significativo. Se paró la
reacción con 50 \mul de H_{2}SO_{4} 4 N y se leyó en un lector
de microplacas modelo 450 (Biorad, Hercules, CA, EE.UU.) a 490
nm.
Tal como se muestra en la figura 4, la
glucosamina (sal de sulfato) que contenía Uncaria tomentosa
(PTI-00700) no diluida (que representaba un 1/1.000
de una píldora única) fue muy eficaz (el 64%) en la inhibición de
las interacciones A\beta-heparina/heparán sulfato.
También se observó una inhibición del 49% significativa
(p<0,001) con una dilución 1:3 (es decir, un 1/3.000 de una
píldora única) de PTI-00700, mientras que una
dilución 1:9 (un 1/19.000 de una píldora única) de
PTI-00700 todavía provocó una inhibición del 35%
(p<0,01) significativa. Se encontró que una dilución 1:27 (es
decir, un 1/27.000 de una píldora única) de
PTI-00700 no provocaba una inhibición significativa
de la unión de A\beta-heparina/heparán sulfato.
Estos datos demuestran que la glucosamina (sal de sulfato) que
contiene Uncaria tomentosa también podía inhibir las
interacciones A\beta-PG/GAG de una manera
dependiente de la dosis.
Se puso en práctica un estudio para determinar
si un extracto de Uncaria tomentosa relativamente puro era
capaz de provocar una "disolución" o "ruptura" de las
fibrillas de amiloide de la enfermedad de Alzheimer formadas
previamente. Este tipo de actividad sería importante para cualquier
posible fármaco anti-amiloide que puede usarse en
pacientes que ya tienen deposición de amiloide sustancial en órganos
y/o tejidos. Por ejemplo, los pacientes con enfermedad de Alzheimer
en un estadio de la enfermedad de medio a tardío tienen abundantes
depósitos de amiloide en sus cerebros como parte tanto de las placas
neuríticas como de los depósitos de amiloide cerebrovasculares. Un
agente terapéutico natural que pueda provocar una disolución del
amiloide preexistente sería ventajoso para su uso en estos
pacientes que están en estadios tardíos del proceso de la
enfermedad.
Para este estudio, se disolvió 1 mg de A\beta
(1-40) (Bachem Inc.,Torrance, CA, EE.UU.; lote
número WM365) en 1,0 ml de agua destilada doble (solución de 1
mg/ml) y se incubó entonces a 37ºC durante 1 semana para provocar
una abundante formación de fibrillas de amiloide de la enfermedad de
Alzheimer. Entonces se incubaron 6 \mul (25 \muM) de A\beta
fibrilado durante 2 horas a 37ºC, en presencia o ausencia de 1,5
\mul de Uncaria tomentosa (PTI-00703)
(descrito a continuación) disueltos en 37,5 \mul de agua destilada
doble, y 15 \mul que contenían Tris HCl 150 mM, NaCl 10 mM, pH
7,0. Tras una incubación de 2 horas, se añadieron alícuotas de 50
\mul a 1,2 ml de tioflavina T 100 \muM (Sigma Chemical Co., St.
Louis, MO) en NaPO_{4} 50 mM (pH 6,0) para lecturas de
fluorometría tal como se describió en el ejemplo 1 anterior.
Para este estudio, los compuestos sometidos a
prueba incluían un extracto acuoso de Uncaria tomentosa que
se derivó tomando el polvo de 10 cápsulas recubiertas con gelatina
de Uncaria tomentosa (que contenían \sim350 mg de
Uncaria tomentosa por cápsula) y extrayendo dos veces con 25
ml de agua destilada doble, y reuniendo entonces los dos extractos
acuosos juntos (denominados "solución de Uncaria
tomentosa"). Entonces se usó la solución de Uncaria
tomentosa o bien sin diluir (que representa un 1/3.333 de una
píldora única), o bien diluida adicionalmente en agua destilada a
razones de 1:3 (es decir, un 1/10.000 de una píldora única), 1:9
(es decir, un 1/30.000 de una píldora única) o 1:27 (un 1/90.000 de
una píldora única).
Tal como se muestra en la figura 4, la
Uncaria tomentosa sin diluir (es decir, un 1/3.333 de una
píldora única) (PTI-00703) fue extremadamente
eficaz, y provocó una disolución del 70% de fibrillas de amiloide
A\beta de la enfermedad de Alzheimer formadas previamente en el
plazo de incubación de 2 horas. También se observó una disolución
del 63% (p<0,001) significativa de fibrillas de amiloide A\beta
de la enfermedad de Alzheimer formadas previamente con una dilución
1:3 (es decir, un 1/10.000 de una píldora única) de toda la solución
de Uncaria tomentosa, mientras que una dilución 1:9 (es
decir, un 1/30.000 de una píldora única) de una solución de
Uncaria tomentosa provocó todavía una disolución del 60%
(p<0,01) significativa. Por otra parte, una dilución 1:27 (es
decir, un 1/90.000 de una píldora única) de una solución de
Uncaria tomentosa no provocó una disolución significativa de
las fibrillas de amiloide A\beta formadas previamente. Estos
datos demuestran que Uncaria tomentosa provoca la disolución
de las fibrillas de amiloide de la enfermedad de Alzheimer formadas
previamente de una manera dependiente de la dosis. Se demostró la
confirmación del "efecto de disolución" de Uncaria
tomentosa sobre las fibrillas de amiloide de la enfermedad de
Alzheimer mediante ensayos de tinción con rojo Congo, mediante los
cuales se observó una reducción marcada de la congofilia (es decir,
birrefringencia rojo/verde cuando se observó a la luz polarizada, y
que representa una disolución/ruptura de la estructura fibrilar del
amiloide) cuando se trataron las fibrillas de amiloide A\beta con
Uncaria tomentosa durante 2 horas (no mostrado).
El siguiente estudio determinó si la Uncaria
tomentosa derivada de otra fuente comercial (denominada
PTI-00703-2) también era eficaz
para provocar la disolución/ruptura de las fibrillas de amiloide
A\beta (1-40) de la enfermedad de Alzheimer
formadas previamente. Este estudio también abordó si un extracto
derivado de Uncaria tomentosa en forma líquida (disponible
comercialmente para su consumo oral por seres humanos) provocaba
una disolución similar de las fibrillas de amiloide A\beta
formadas previamente tal como se observó usando Uncaria
tomentosa derivada de formas de cápsula recubierta con gelatina.
Para este estudio, se usó el protocolo descrito en el ejemplo 5 tal
como se describió anteriormente. En resumen, se disolvió 1 mg de
A\beta (1-40) (Bachem Inc., Torrance, CA, EE.UU.;
lote número WM365) en 1,0 ml de agua destilada doble (solución de 1
mg/ml) y entonces se incubó a 37ºC durante 1 semana. Se incubaron
entonces 6 \mul (25 \muM) de A\beta fibrilado durante 2 horas
a 37ºC, en presencia o ausencia de 1,5 \mul de Uncaria
tomentosa derivada de líquido
(PTI-00703-2) disueltos en 37,5
\mul de agua destilada doble, y 15 \mul que Tris HCl 150 mM,
NaCl 10 mM, pH 7,0. Tras una incubación de 2 horas, se añadieron
alícuotas de 50 \mul a 1,2 ml de tioflavina T 100 \muM (Sigma
Chemical Co., St. Louis, MO) en NaPO_{4} 50 mM (pH 6,0) para
lecturas de fluorometría tal como se describió en el ejemplo 1.
Tal como se muestra en la figura 6, la
Uncaria tomentosa derivada de líquido fue extremadamente
eficaz para provocar una disolución/ruptura de las fibrillas de
amiloide A\beta formadas previamente. Se observó una disolución
del 70% significativa (p < 0,001) de las fibrillas de amiloide
A\beta formadas previamente usando Uncaria tomentosa
derivada de líquido en un periodo de incubación de 2 horas. Este
estudió demostró que Uncaria tomentosa era un disolvente
eficaz de las fibrillas de amiloide de la enfermedad de Alzheimer
formadas previamente independientemente de la fuente de Uncaria
tomentosa, e independientemente de si Uncaria tomentosa
se usaba en forma líquida o sólida (es decir, cápsula).
El siguiente estudio determinó si Uncaria
tomentosa obtenida de aún otra fuente comercial también era
eficaz para provocar la disolución/ruptura de las fibrillas de
amiloide de la enfermedad de Alzheimer formadas previamente. Para
este estudio, se obtuvo Uncaria tomentosa del polvo del
interior de cápsulas recubiertas con gelatina de una tercera fuente
comercial (denominada PTI-00703-R) y
se usó tal como se describe a continuación. Para este estudio, se
abrió una única cápsula recubierta con gelatina que contenía
Uncaria tomentosa pura y se extrajo el contenido de polvo
marrón con 1 ml de propanol seguido por centrifugación (14.000 Xg
durante 15 minutos). Se midieron 0,1 \mul del extracto de
propanol a 490 nm y se encontró que mostraban 0,0004 unidades de
DO. Se usó el ensayo de disolución de fibrillas tal como se
describió en el ejemplo 5 usando 0,1 \mul (es decir, se diluyó 1
\mul con agua destilada doble a una dilución 1:10 y se usó 1
\mul), 1 \mul, 2 \mul y 4 \mul del extracto
PTI-00703-R. Estas cantidades
representaban un 1/10.000, 1/1.000, 1/500, y 1/250 del extracto
total de una píldora única, respectivamente.
Tal como se muestra en la figura 7, la
Uncaria tomentosa obtenida de una única cápsula o píldora
recubierta con gelatina provocó una disolución/ruptura dependiente
de la dosis de las fibrillas de amiloide A\beta de la enfermedad
de Alzheimer y en un periodo de incubación de 2 horas. Una parte de
1/10.000 obtenida de una cápsula única provocó una disolución del
58% significativa (p<0,001), mientras que una parte de 1/1.000
obtenida de una cápsula única provocó una disolución del 81%
significativa (p < 0,001). Una parte de 1/500 de una cápsula
única provocó una disolución del 93% significativa (p < 0,001),
mientras que una parte de 1/250 de una píldora única provocó una
disolución del 97% significativa (p < 0,001). Este estudio
demostró que la Uncaria tomentosa obtenida de aún otra
fuente era un potente agente que provocaba una disolución
dependiente de la dosis de las fibrillas de amiloide de la
enfermedad de Alzheimer formadas previamente. Además, los
contenidos diluidos de una única cápsula/píldora recubierta con
gelatina de Uncaria tomentosa (que actualmente se consume
por vía oral por seres humanos) eran todavía extremadamente eficaces
para provocar una disolución/ruptura de las fibrillas de amiloide
formadas previamente de la enfermedad de Alzheimer.
Las fibrillas de amiloide de la enfermedad de
Alzheimer consisten principalmente en A\beta en una forma que
contiene los residuos 1-40 o 1-42.
La variante más larga de A\beta contiene dos residuos hidrófobos
que provocan la formación de fibrillas sustancial casi
inmediatamente (Castillo et al, J. Neurochem.
69:2452-2465, 1997). También se cree que A\beta
1-42 es la forma predominante de A\beta que existe
en las placas de amiloide de la enfermedad de Alzheimer, mientras
que se cree que A\beta 1-40 es la forma
predominante de A\beta que existe en los depósitos de amiloide
cerebrovasculares de la enfermedad de Alzheimer (Tamaoka et
al, Br. Res. 679:151-156,1995; Biochem.
Biophys. Res. Comm. 205:834-842, 1994). Por tanto,
se puso en práctica el siguiente estudio para determinar si la
Uncaria tomentosa también provoca la disolución/ruptura de
las fibrillas de amiloide A\beta (1-42) y si este
efecto era duradero.
Para este estudio, se usó el método de
fluorometría de tioflavina T tal como se describió en el ejemplo 5.
En resumen, se mezclaron 30 \mul de A\beta
(1-42) 250 \muM) (Bachem Biosciences, King of
Prussia, PA, EE.UU.; lote número 508780) con 7,5 \mul de una
solución madre de Uncaria tomentosa (tal como se describe a
continuación), 75 \mul de 4X TBS y 187,5 \mul de agua destilada
doble (pH 7,0) y se incubaron en tubos de microcentrífuga a 37ºC
durante 4 días (por triplicado), o bien solos, o bien en presencia
de Uncaria tomentosa. Se derivó el extracto acuoso de
Uncaria tomentosa (PTI-00703) tomando los
contenidos en polvo de 10 cápsulas recubiertas con gelatina de
Uncaria tomentosa y extrayendo dos veces con 25 ml de agua
destilada doble. Se diluyó entonces el extracto a 1:250 en agua
destilada doble (1 ml de solución madre representaba el extracto
total derivado de 350 \mug de Uncaria tomentosa) para
generar una solución madre de Uncaria tomentosa.
Tal como se muestra en la figura 8, A\beta
(1-42) de la enfermedad de Alzheimer recién
suspendido solo, tras una incubación de 2 horas a 37ºC, mostró una
fluorescencia inicial de 409 +/- 46 unidades de fluorescencia.
Durante el periodo de incubación de 4 días, los niveles de fibrillas
de amiloide A\beta (1-42) determinados mediante
fluorescencia de tioflavina T se mantuvieron aproximadamente iguales
(figura 10). La Uncaria tomentosa provocó una
disolución/ruptura significativa de la formación de fibrillas de
amiloide A\beta (1-42) en todos los puntos de
tiempo durante el experimento de 4 días. Dado que A\beta
(1-42) puede formar espontáneamente abundantes
fibrillas de amiloide en solución, la inhibición inicial mediante
Uncaria tomentosa sobre las fibrillas de A\beta
(1-42) a las 2 horas, reflejaba realmente la
capacidad de Uncaria tomentosa de disolver fibrillas de
amiloide formadas previamente. A las 2 horas de incubación, la
Uncaria tomentosa provocó una disolución del 63%
significativa (p < 0,001) de las fibrillas de amiloide A\beta
(1-42). Se observó una inhibición similar en todos
los puntos de tiempo (figura 8). A los 4 días, se observó todavía
una disolución del 69% significativa (p<0,001) de las fibrillas
de amiloide A\beta (1-42), indicando que la
capacidad de disolución de Uncaria tomentosa sobre las
fibrillas de amiloide A\beta (1-42) era
duradera.
Se determinó la confirmación del efecto
inhibidor del extracto de Uncaria tomentosa sobre las
fibrillas de amiloide A\beta (1-42) mediante
tinción con rojo Congo de alícuotas tomadas de las soluciones de
ensayo anteriores. Se observó una reducción marcada de la
congofilia (es decir, birrefringencia rojo/verde a la luz
polarizada) cuando las fibrillas de amiloide A\beta se trataron
con Uncaria tomentosa durante 2 horas (no mostrado).
El 90% de los pacientes con diabetes tipo II
muestran la deposición y acumulación de fibrillas de amiloide en
los islotes de Langerhans en el páncreas (Cooper et al, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 84:8628-8632, 1987). Esta
proteína amiloide implicada consiste en una proteína de 37
aminoácidos conocida como polipéptido de amiloide de los islotes o
amilina. Se cree que el amiloide de los islotes contribuye a la
destrucción de las células beta del páncreas, conduciendo así
finalmente a que muchos pacientes sean dependientes de insulina (es
decir, diabetes tipo I). La amilina tiene la capacidad de formar
también fibrillas de amiloide sustanciales inmediatamente cuando se
pone en solución. Por tanto, se puso en práctica el siguiente
estudio para determinar si la Uncaria tomentosa provoca
también la disolución/ruptura de otro tipo de amiloidosis, y si este
efecto también era duradero.
Para este estudio, se usó el método de
fluorometría de tioflavina T tal como se describió en el ejemplo 5.
En resumen, se incubaron 30 \mul de amilina humana 250 \muM
(Bachem Inc, Torrance, CA, EE.UU.; lote número WL934) en tubos de
microcentrífuga a 37ºC durante 4 días (por triplicado), o bien
solos, o bien en presencia de 1,5 \mul de Uncaria
tomentosa (PTI-00703) (tal como se describió en
el ejemplo 8).
Tal como se muestra en la figura 9, amilina
recién suspendida sola, tras una incubación de 2 horas a 37ºC,
mostró una fluorescencia inicial de 1115 +/- 171 unidades de
fluorescencia. Durante el periodo de incubación de 4 días, se
encontró que los niveles de fibrillas de amiloide de los islotes
determinados mediante fluorescencia de tioflavina T disminuían
alcanzando niveles de 660 +/- 123 unidades de fluorescencia a los 4
días (figura 9), lo que concuerda con estudios previos (Castillo
et al, Diabetes 47: 612-620, 1998). Se
encontró que Uncaria tomentosa (PTI-00703)
provocó una inhibición de la formación de fibrillas de amilina en
todos los puntos de tiempo durante el experimento de 4 días. Dado
que la amilina puede formar espontáneamente abundantes fibrillas de
amiloide en solución, la inhibición inicial mediante Uncaria
tomentosa sobre las fibrillas de amilina a las 2 horas,
reflejaba de nuevo la capacidad de Uncaria tomentosa de
disolver/romper las fibrillas de amiloide formadas previamente. A
las 2 horas de incubación, la Uncaria tomentosa
(PTI-00703) provocó una disolución del 72%
significativa (p < 0,001) de las fibrillas de amilina, mientras
que a los 4 días, se observó todavía una disolución del 80%
significativa (p < 0,001) de las fibrillas de amilina (figura 9).
Este estudio demostró que la Uncaria tomentosa puede
provocar una disolución significativa de otras formas de amiloide
(tales como amiloidosis de los islotes) y que este efecto era de
nuevo duradero.
También se describen métodos para el aislamiento
e identificación de los principios activos inhibidores del amiloide
en Uncaria tomentosa obtenida de varias fuentes comerciales
diferentes. Para el aislamiento de los principios activos
inhibidores del amiloide a partir de cápsulas de Uncaria
tomentosa recubiertas con gelatina, se recogen 400 cápsulas
(por serie) que contienen materiales vegetales secos en un
recipiente de polipropileno de 1 litro, al que se le añaden 800 ml
de propanol (Fisher, Fair Lawn, NJ, EE.UU.) y se agita durante toda
la noche a 4ºC usando un agitador magnético. Para el aislamiento de
los principios activos inhibidores del amiloide de Uncaria
tomentosa a partir de comprimidos sólidos, se muele el material
en 400 comprimidos (por serie) usando un mortero y una mano de
mortero, y se extrae con propanol tal como se describió
anteriormente. Entonces se centrifuga entonces el extracto a 17.000
Xg (Sorvall) durante 20 minutos y se recoge el sobrenadante. Se
repite el procedimiento de extracción y centrifugación 5 veces más y
se recogen los sobrenadantes, y se concentran entonces usando un
evaporador rotatorio (Rotavapor-R, Brinkman,
Westbury, NJ, EE.UU.) a 60ºC. Cuando el volumen es suficientemente
pequeño (es decir, 500 ml), vuelve a centrifugarse el extracto a
17.000 Xg para eliminar cualquier material insoluble. Entonces se
precipita el sobrenadante obtenido con 4 volúmenes de éter de
petróleo (Fischer) y se recoge el precipitado tras la centrifugación
a 3.000 Xg durante 20 minutos usando una centrífuga Benchtop. Se
lava entonces el sedimento obtenido mediante nueva suspensión en 100
ml de agua destilada, y entonces se centrifuga de nuevo a 3.000 Xg
durante 20 minutos. Entonces se disuelve el sedimento resultante en
50-100 ml (dependiendo del tamaño del sedimento) de
propanol y se aplica a una columna de sílice de 300 ml equilibrada
con propanol que contiene ácido acético al 0,5% (v/v). Entonces se
usa el mismo disolvente para eluir, y se recogen las fracciones de
color marrón amarillento y/o naranja de movilidad más rápida con un
colector de fracciones, y se precipitan con 4 volúmenes de éter de
petróleo tal como se describió anteriormente. Entonces se disuelve
el sedimento en acetonitrilo/ácido acético/agua (50:0,5:49,5; v/v/v)
para la inyección para HPLC.
Entonces se divide el sedimento disuelto en
aproximadamente 30 partes iguales para la inyección en una HPLC
(serie Hewlett-Packard 1050 con detector de
múltiples longitudes de onda e integrador serie HP 3396,
Hewlett-Packard, Wilmington, DE) con una columna
C_{18} de 1 x 25 cm (218TP1010, Vydac, Hesperia, CA), mantenida a
30ºC con una velocidad de flujo de 2 ml/min. También pueden usarse
otras columnas para la aplicación de HPLC, y las velocidades de
flujo y los eluyentes usados para eluir y purificar los materiales
inyectados pueden ajustarse en consecuencia. Usando la columna y
las velocidades de flujo tal como se describió anteriormente, tras
la inyección, se eluye la muestra con gradientes de A y B, tales
como el 0% de B durante 5 minutos, el 0-15% de B
desde 5-10 min., el 15-45% desde
10-70 min., y el 45-100% de B desde
70-85 min.; en los que B = un 95% de acetonitrilo
con un 0,5% de ácido acético en agua destilada y A = un 5% de
acetonitrilo con un 0,5% de ácido acético en agua destilada. Se
monitorizan los efluentes a 490 nm y se recogen fracciones de 4 ml
en un colector de fracciones y se obtienen picos combinados a
diversos tiempos de retención, desde 0 hasta 85 minutos. Entonces
se concentran las fracciones mediante liofilización tras eliminar la
mayor parte del acetonitrilo mediante evaporación rotatoria. Se
requieren 20-30 inyecciones para obtener suficiente
material (50-100 mg a partir de 4 botellas de
píldoras) para las pruebas en ensayos relevantes, o para la
identificación de la muestra.
Otro modo de aislamiento de los principios
activos inhibidores del amiloide en Uncaria tomentosa
obtenida de diferentes fuentes comerciales, es similar al descrito
anteriormente, excepto que se omite el uso de la etapa de columna
de sílice. Éste es un método más rápido que también permite un
rendimiento mucho mayor (es decir, 300-400 mg por
preparación, en lugar de 50-100 mg por preparación).
Para este método, tras la extracción con propanol, precipitación y
lavado tal como se describió anteriormente, se disuelven entonces
los sedimentos lavados en acetonitrilo/ácido acético/agua
(50:0,5:49.5; v/v/v) para la inyección para HPLC.
Entonces se divide el sedimento disuelto en
aproximadamente 40 partes iguales para la inyección en la HPLC
(serie Hewlett-Packard 1050 con detector de
múltiples longitudes de onda e integrador serie HP 3396,
Hewlett-Packard, Wilmington, DE) con una columna
C_{18} de 1 x 25 cm (218TP1010, Vydac, Hesperia, CA), mantenida a
30ºC con una velocidad de flujo de 2 ml/min. Tras la inyección, se
eluye la muestra con gradientes de A y B, tales como el 0% de B
durante 5 minutos, el 0-15% de B desde
5-10 min., el 15-45% desde
10-70 min., y el 45-100% de B desde
70-85 min.; en los que B = un 95% de acetonitrilo
con un 0,5% de ácido acético en agua destilada y A = un 5% de
acetonitrilo con un 0,5% de ácido acético en agua destilada. Se
monitorizan los efluentes a 490 nm y se recogen fracciones de 4 ml
en un recolector de fracciones y se obtienen picos combinados a
diversos tiempos de retención, desde 0 hasta 85 minutos. Entonces
se concentran las fracciones mediante liofilización tras eliminar
la mayor parte del acetonitrilo mediante evaporación rotatoria. Se
requieren 40-50 inyecciones para obtener suficiente
material (300-400 mg a partir de 4 botellas de
píldoras) para las pruebas en ensayos relevantes, o para la
identificación de la muestra.
La figura 10 muestra que este método es eficaz
para la separación, purificación e identificación de los principios
activos inhibidores del amiloide en Uncaria tomentosa. Tal
como se muestra en la figura 10A, la HPLC en fase inversa
monitorizada a 490 nm (debido a la actividad que se correlaciona con
el color marrón amarillento y/o naranja) y eluida con un gradiente
tal como se describió anteriormente demostró que el extracto de
Uncaria tomentosa contenía múltiples componentes que eluían
de la columna con un pico ancho observado a los
13-45 minutos, y un pico observado a los 80
minutos. Volvió a inyectarse la fracción 26, como ejemplo, en la
HPLC y se obtuvo un pico simétrico (figura 10B), indicando que la
polidispersidad del pico ancho observado en la figura 10A no se
debe a un artefacto de la columna, sino que se debe a la presencia
de componentes individuales en el extracto de Uncaria
tomentosa. Entonces se sometieron a prueba los picos a los 26
minutos y a los 80 minutos, para detectar la posible
disolución/ruptura de las fibrillas de amiloide A\beta de la
enfermedad de Alzheimer formadas previamente (tal como se describió
en el ejemplo 5) para determinar si estos picos contenían
principios activos inhibidores del amiloide (figura 10C). La
fracción a los 26 minutos (pero no a los 80 minutos) mostró una
potente actividad inhibidora que provocó una disolución/ruptura del
85% de las fibrillas de amiloide de la enfermedad de Alzheimer
formadas previamente en un periodo de 2 horas. También se obtuvieron
y se sometieron a prueba otros picos (desde 13 hasta 45 minutos de
tiempo de retención) tal como se describió anteriormente, y también
se encontró que contenían componentes inhibidores del amiloide (no
mostrado), sugiriendo que estaban presentes componentes inhibidores
del amiloide en el pico ancho desde 13 hasta 45 minutos de tiempo de
retención. Este estudio indica que este método de aislamiento y
pruebas puede usarse para purificar y aislar principios activos
inhibidores del amiloide en extractos de Uncaria
tomentosa.
Para identificar las estructuras químicas y la
composición elemental de los principios activos inhibidores del
amiloide en Uncaria tomentosa, pueden ponerse en práctica
diversos análisis, conocidos por los expertos en la técnica. Estos
incluyen, pero no se limitan a: a) uso de un microscopio electrónico
de barrido equipado con un analizador de rayos x de energía
dispersiva para detectar y mapear espacialmente algunos elementos
presentes en cada muestra, b) espectroscopía de masas de alta
resolución para determinar el peso molecular y la composición
elemental, 3) calorimetría diferencial de barrido para determinar el
punto de fusión, 4) espectroscopia FTIR para determinar los grupos
funcionales, y se realizan comparaciones con bibliotecas de
espectros, 5) espectroscopia de RMN de C^{13} y de protón para la
caracterización adicional del material proporcionando información
con respecto a la posición de los átomos entre sí, y 6) análisis
elemental mediante combustión para determinar el % relativo de
carbono, hidrógeno y nitrógeno.
Una realización de la presente invención es
formular antes de la administración a un paciente, una formulación
farmacéutica que comprende Uncaria tomentosa (y/o sus
principios activos) en uno o más vehículos, diluyentes o
excipientes farmacéuticamente aceptables. En una realización
preferida, un paciente que tiene enfermedad de Alzheimer, diabetes
tipo II o cualquier otra amiloidosis, consumiría por vía oral
Uncaria tomentosa comercialmente disponible en forma de
píldora, comprimido, comprimido oblongo, cápsula de gelatina dura y
blanda, pastilla para chupar, cápsulas Vegicap, gotas líquidas,
solución, jarabe, bolsita de té, y/o polvo de corteza.
En otra realización preferida, Uncaria
tomentosa obtenida comercialmente de cualquier forma, podría
modularse adicionalmente usando vehículos, excipientes y diluyentes
adecuados que incluyen lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbitol,
manitol, almidones, goma arábiga, fosfato de calcio, alginatos, goma
tragacanto, gelatina, silicato de calcio, celulosa microcristalina,
polivinilpirrolidona, celulosa, jarabe acuoso, metilcelulosa,
hidroxibenzoatos de metilo y propilo, talco, estearato de magnesio
y aceite mineral. Las formulaciones pueden incluir adicionalmente
agentes lubricantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y de
suspensión, agentes conservantes, agentes edulcorantes o agentes
aromatizantes. Las composiciones de la invención pueden formularse
de modo que proporcionen una respuesta rápida, sostenida o
retrasada del principio activo tras la administración al paciente.
Las composiciones se formulan preferiblemente en una forma
farmacéutica unitaria, conteniendo cada dosis desde aproximadamente
1 hasta aproximadamente 10.000 mg de Uncaria tomentosa (o sus
principios activos), de manera más normal de aproximadamente 500
hasta aproximadamente 2.000 mg de Uncaria tomentosa (o sus
principios activos). Sin embargo, se entenderá que la dosificación
terapéutica administrada se determinará por el médico a la luz de
las circunstancias relevantes incluyendo el estado clínico que va a
tratarse, el órgano o tejidos afectados o que se sospecha que están
afectados por la acumulación de amiloide, y la vía de administración
elegida. Por tanto, no se pretende que los intervalos de
dosificación anteriores limiten el alcance de la invención de
ninguna manera. El término "forma farmacéutica unitaria" se
refiere a unidades físicamente diferenciadas adecuadas como dosis
unitarias para sujetos humanos y otros mamíferos, conteniendo cada
unidad una cantidad predeterminada de material activo calculada
para producir el efecto terapéutico deseado, en asociación con un
vehículo farmacéuticamente adecuado.
Los siguientes ejemplos de formulación son sólo
ilustrativos y no se pretende que limiten el alcance de la
invención de ninguna manera. Para cada formulación proporcionada
como ejemplo, la disminución o aumento de la concentración de
Uncaria tomentosa (o sus principios activos) provocará una
disminución o aumento proporcional de los otros componentes tal
como se indica. Pueden prepararse cápsulas de gelatina dura usando
500 mg de Uncaria tomentosa (o sus principios activos), 400
mg de almidón, y 20 mg de estearato de magnesio. Los componentes
anteriores se mezclan y se cargan en cápsulas de gelatina dura en
cantidades de 920 mg.
Se prepara un comprimido usando 500 mg de
Uncaria tomentosa (o sus principios activos), 800 mg de
celulosa microcristalina, 20 mg de dióxido de silicio pirogénico y
10 mg de ácido esteárico. Se combinan los componentes y se
comprimen para formar comprimidos que pesan cada uno 1230 mg.
Se prepara una solución de aerosol usando 0,25
de principio activo, 29,75 de etanol, y 70 de propelente 22
(clorodifluorometano). Se mezcla la Uncaria tomentosa (o sus
principios activos) con etanol. Se añade la muestra a una parte de
propelente 22 enfriado hasta -30ºC y se transfiere a un dispositivo
de carga. Entonces se alimenta la cantidad requerida a un
recipiente de acero inoxidable y se diluye con el resto del
propelente. Entonces se ajustan al recipiente las unidades de valor
(enumeradas anteriormente). Una forma de aerosol de este tipo de
Uncaria tomentosa (o sus principios activos) puede ser útil
para el tratamiento de amiloides que implican al cerebro (tales
como la enfermedad de Alzheimer, síndrome de Down, enfermedades
priónicas, etc) usando un aerosol o pulverizador nasal. Los
estudios previos han sugerido que en estas amiloidosis del sistema
nervioso central la forma de entrada inicial de un posible agente
ambiental que puede desempeñar un papel en la patogénesis puede
derivar del entorno exterior a través de las fosas nasales.
Se preparan comprimidos usando 240 mg de
Uncaria tomentosa (o sus principios activos), 180 mg de
almidón, 140 mg de celulosa microcristalina, 16 mg de
polivinilpirrolidona (al 10% en agua), 18 mg de carboximetilalmidón
de sodio, 2 mg de estearato de magnesio y 2 mg de talco (total = 600
mg). Se hace pasar la Uncaria tomentosa (o sus principios
activos), almidón y celulosa a través de un tamiz U.S. de malla
número 45 y se mezclan a fondo. Se mezcla la solución de
polivinilpirrolidona con los polvos resultantes y entonces se hace
pasar a través de un tamiz U.S. de malla número 14. Se secan los
gránulos así producidos a 50ºC y se hacen pasar a través de un
tamiz U.S. de malla número 18. El carboximetilalmidón de sodio,
estearato de magnesio y talco, que se han hecho pasar previamente a
través de un tamiz U.S. de malla número 60, se añaden entonces a los
gránulos que, tras mezclar, se comprimen en una máquina de
comprimidos para proporcionar comprimidos que pesan cada uno 600
mg.
Se preparan cápsulas que contienen cada una 160
mg de medicamento usando 160 mg de Uncaria tomentosa (o sus
principios activos), 118 mg de almidón, 118 mg de celulosa
microcristalina, y 4 mg de estearato de magnesio (total = 400 mg).
Se combinan la Uncaria tomentosa (o sus principios activos),
celulosa, almidón y estearato de magnesio, se hacen pasar a través
de un tamiz U.S. de malla número 45, y se cargan en cápsulas de
gelatina dura en cantidades de 400 mg.
Se preparan supositorios que contienen cada uno
225 mg de Uncaria tomentosa (o sus principios activos)
usando 225 mg de Uncaria tomentosa (o sus principios
activos), 2.000 mg de glicéridos de ácidos grasos saturados (total
= 2,225 mg). Se hace pasar la Uncaria tomentosa (o sus
principios activos) a través de un tamiz U.S. de malla número 60 y
se suspende en los glicéridos de ácidos grasos saturados previamente
fundidos usando el mínimo calor necesario. Entonces se vierte la
mezcla en un molde de supositorio de 2 g de capacidad nominal y se
deja enfriar.
Se preparan suspensiones que contienen cada una
50 mg de medicamento por 5 ml de dosis usando 50 mg de Uncaria
tomentosa (o sus principios activos), 50 mg de
carboximetilcelulosa de sodio, 1,25 ml de jarabe, 0,10 ml de
solución de ácido benzoico, aromatizante, color y agua purificada
hasta un total de 5 ml. Se hace pasar el medicamento a través de un
tamiz U.S. de malla número 45 y se mezcla con la
carboximetilcelulosa de sodio y el jarabe para formar una pasta
lisa. Se diluyen la solución de ácido benzoico, el aromatizante y el
color con algo del agua y se añaden con agitación. Se añade
entonces agua suficiente para producir el volumen requerido.
Se prepara una formulación intravenosa usando
250 mg de Uncaria tomentosa (o sus principios activos) y
1000 mg de solución salina isotónica. Se administra la solución de
los componentes anteriores por vía intravenosa a una velocidad de 1
ml por minuto a un sujeto que necesita tratamiento.
En una realización preferida, puede
administrarse el compuesto terapéutico de la invención en cualquier
vehículo farmacéuticamente aceptable. Tal como se usa en el
presente documento, "vehículo farmacéuticamente aceptable"
incluye, pero no se limita a, cualquiera y todos los disolventes,
líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluyendo los de
origen del petróleo, animal, vegetal o sintético, tales como aceite
de cacahuete, aceite de semilla de soja, aceite mineral, aceite de
sésamo y similares, medios de dispersión, recubrimientos, agentes
antifúngicos y antibacterianos, agentes isotónicos y que retrasan la
adsorción, y similares que son compatibles con la actividad del
compuesto y que son fisiológicamente aceptables para el sujeto. Un
ejemplo de un vehículo farmacéuticamente aceptable es solución
salina normal tamponada (NaCl 0:15 molar). El uso de tales medios y
agentes para sustancias farmacéuticamente activas se conoce bien en
la técnica. También pueden incorporarse principios activos
complementarios en las composiciones. Los excipientes farmacéuticos
aceptables incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina,
malta, arroz, harina, caliza, gel de sílice, carbonato de magnesio,
estearato de magnesio, estearato de sodio, monoestearato de
glicerol, talco, cloruro de sodio, leche desnatada en polvo,
glicerol, propileno, glicol; agua, etanol y similares. Estas
composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones,
comprimidos, píldoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación
sostenida y similares.
La formación, deposición, acumulación y/o
persistencia de amiloide en un sujeto puede inhibirse administrando
Uncaria tomentosa (o sus principios activos) en una
dosificación terapéutica al sujeto. Se pretende que el término
incluya organismos vivos en los que puede producirse amiloidosis.
Los ejemplos de sujetos incluyen seres humanos, monos, vacas,
perros, ovejas, gatos, ratones, ratas y especies transgénicas de los
mismos. La administración de las composiciones de la presente
invención a un sujeto que va a tratarse puede llevarse a cabo
usando procedimientos conocidos, a dosificaciones y durante periodos
de tiempo eficaces para inhibir la amiloidosis en el sujeto. Una
cantidad eficaz del compuesto terapéutico necesaria para lograr un
efecto terapéutico puede variar según factores tales como la
cantidad de amiloide ya depositado en el sitio del órgano o tejido
en el sujeto, la edad, sexo y peso del sujeto, y la capacidad del
compuesto terapéutico para inhibir la formación, deposición,
acumulación, persistencia de amiloide, y/o provocar la disolución
del amiloide formado previamente en el sujeto. Por tanto, los
regímenes de dosificación pueden ajustarse para proporcionar la
respuesta terapéutica óptima. Por ejemplo, pueden administrarse
varias dosis divididas diariamente o puede reducirse
proporcionalmente la dosis tal como se indica según las necesidades
de la situación terapéutica. Un ejemplo no limitativo de un
intervalo de dosis eficaz para Uncaria tomentosa (o sus
principios activos) está entre 10 y 1000 mg/kg de peso corporal/por
día, pero preferiblemente de 10 a 100 mg/kg de peso corporal.
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Pueden usarse diferentes modos de administración
de Uncaria tomentosa (o sus principios activos. Por
consiguiente, una vía de administración preferida es la
administración oral. Alternativamente, puede administrarse
Uncaria tomentosa (o sus principios activos) mediante otras
vías adecuadas tales como la subcutánea, intravenosa,
intraperitoneal, todas las vías administradas mediante inyección.
Dependiendo de la vía de administración, el principio activo puede
recubrirse con un material para proteger el compuesto de la acción
de ácidos y otras condiciones naturales que pueden inactivar el
compuesto.
Para administrar Uncaria tomentosa (o sus
principios activos), puede ser necesario recubrir el compuesto, o
administrar conjuntamente el compuesto con un material para evitar
su activación, Por ejemplo, el compuesto terapéutico puede
administrarse a un sujeto en un vehículo apropiado, por ejemplo,
liposomas o un diluyentes. Los diluyentes farmacéuticamente
aceptables incluyen soluciones de tampón acuosa y salina. Los
liposomas incluyen emulsiones CGF de agua en aceite en agua así
como liposomas convencionales.
La Uncaria tomentosa (o sus principios
activos) también puede administrarse por vía parenteral o
intraperitoneal. Pueden prepararse dispersiones en glicerol,
polietilenglicoles líquidos, y mezclas de los mismos en aceites. En
condiciones ordinarias de almacenamiento y uso, estas preparaciones
pueden contener un conservante para evitar el crecimiento de
microorganismos.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para
uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles
y polvos estériles para la preparación de soluciones o dispersiones
inyectables estériles. En todos los casos, la composición debe ser
estéril y debe se fluida hasta el grado de que exista un fácil uso
en la jeringuilla. Debe ser estable en las condiciones de
fabricación y almacenamiento y debe conservarse frente a la acción
contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El
vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que
contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol,
propilenglicol, y polietilenglicol líquido y similares), mezclas
adecuadas de los mismos, y aceites vegetales. Puede mantenerse la
fluidez apropiada, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento
tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de
partícula requerido en el caso de la dispersión y mediante el uso de
tensioactivos. Puede lograrse la prevención de la acción de
microorganismos mediante diversos agentes antibacterianos y
antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido
ascórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, es preferible
incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, cloruro de sodio
o polialcoholes tales como manitol y sorbitol, en la composición.
Puede provocarse la absorción prolongada de las composiciones
inyectables incluyendo en la composición un agente que retrasa la
absorción, por ejemplo monoestearato de aluminio o gelatina.
Pueden prepararse soluciones inyectables
estériles incorporando el compuesto terapéutico en la cantidad
requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de
componentes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido
por esterilización por filtración. Generalmente, se preparan
dispersiones incorporando el compuesto terapéutico en un vehículo
estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros
componentes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso
de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables
estériles, los métodos de preparación preferidos son secado a vacío
y liofilización que proporciona un polvo del agente terapéutico más
cualquier componente deseado de una solución del mismo previamente
filtrada hasta la esterilidad.
La Uncaria tomentosa (o sus principios
activos) para la enfermedad de Alzheimer y otras amiloidosis del
sistema nervioso central puede optimizarse para que cruce la barrera
hematoencefálica. Los métodos de introducción incluyen, pero no se
limitan a, la administración sistémica, administración parenteral,
es decir, mediante las vías intraperitoneal, intravenosa, perioral,
subcutánea, intramuscular, intraarterial, intradérmica,
intramuscular, intranasal, epidural y oral.
Puede administrarse directamente Uncaria
tomentosa (o sus principios activos) al líquido cefalorraquídeo
mediante inyección intraventricular. Puede ser deseable administrar
Uncaria tomentosa (o sus principios activos) localmente en
la zona o tejido que necesita tratamiento; esto puede lograrse
mediante, por ejemplo, y no a modo de limitación, infusión local
durante la cirugía, aplicación tópica, mediante inyección, mediante
infusión usando una cánula con una bomba osmótica, mediante un
catéter, mediante un supositorio, mediante un implante.
Puede administrarse Uncaria tomentosa (o
sus principios activos) en un sistema de liberación controlada, tal
como una bomba osmótica. Puede colocarse un sistema de liberación
controlada en las proximidades de la diana terapéutica, es decir,
el cerebro, requiriendo así sólo una fracción de la dosis
sistémica.
Con respecto a los sistemas y componentes a los
que se hizo referencia anteriormente, pero no se especificaron o
describieron de otra manera en detalle en el presente documento, se
cree que el funcionamiento y especificaciones de tales sistemas y
componentes y la manera en la que pueden fabricarse o montarse o
usarse, tanto de manera cooperativa entre si como con los otros
elementos de la invención descritos en el presente documento para
realizar los fines descritos en el presente documento, están todos
muy dentro del conocimiento de los expertos en la técnica. No se ha
hecho por tanto ningún intento coordinado de repetir en el presente
documento lo que conoce generalmente el experto.
El uso de los extractos de las partes de la
corteza interna y la raíz de Uncaria tomentosa, y el uso de
los componentes contenidos en diversas preparaciones comerciales de
Uncaria tomentosa, benefician a pacientes humanos con
enfermedad de Alzheimer y otras amiloidosis debido a la capacidad
recién descubierta de Uncaria tomentosa de inhibir la
formación de fibrillas de amiloide, inhibir el crecimiento de
fibrillas de amiloide, inhibir las interacciones
amiloide-proteoglucano, inhibir las interacciones
amiloide-glucosaminoglucano, y provocar la
disolución y/o ruptura de las fibrillas de amiloide formadas
previamente.
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Claims (37)
1. Uso de materia vegetal de una planta del
género Uncaria en la fabricación de un medicamento para el
tratamiento de una enfermedad amiloide.
2. Uso según la reivindicación 1, en el que la
materia vegetal es de una planta del género Uncaria, especie
tomentosa.
3. Uso según la reivindicación 2, en el que la
materia vegetal tiene una actividad o eficacia inhibidora del
amiloide superior al 50%.
4. Uso según la reivindicación 2 o la
reivindicación 3, en el que la materia vegetal se obtiene a partir
de una fuente disponible comercialmente.
5. Uso según la reivindicación 4, en el que la
fuente disponible comercialmente de Uncaria tomentosa se
selecciona de grupo que consiste en píldoras, comprimidos,
comprimidos oblongos, cápsulas de gelatina dura y blanda, pastillas
para chupar, sobres, sellos para medicamentos, cápsulas Vegicap,
gotas líquidas, elixires, suspensiones, emulsiones, soluciones,
jarabes, bolsitas de té, aerosoles (como un sólido o en medio
líquido), supositorios, soluciones inyectables estériles, polvos
envasados estériles, haces de corteza y polvo de corteza.
6. Uso según la reivindicación 2 o la
reivindicación 3, en el que la materia vegetal comprende un extracto
obtenido a partir de Uncaria tomentosa, derivándose el
extracto de la corteza interna o tejido de la raíz de Uncaria
tomentosa.
7. Uso según la reivindicación 6, en el que el
porcentaje en peso de extracto vegetal en el medicamento está en el
intervalo de desde el 70% hasta el 95%.
8. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1, 2, 6 o 7, en el que la materia vegetal comprende
un componente inhibidor del amiloide seleccionado del grupo que
consiste en alcaloides de oxindol, glucósidos del ácido quinóvico,
proantocianidinas, polifenoles, triterpinos, esteroles vegetales,
beta-sitosterol, estigmasterol, campesterol,
fitosteroles, ácido
3-beta,6-beta,19-alfa-trihidroxi-urs-12-en-28-oico,
5-alfa-carboxiestrictosidina,
aloisopteropodina, alopteropodina, angustina, dihidrocorinanteína,
n-óxido de dihidrocorinanteína, hirsutina, n-óxido de hirsutina,
isomitrafilina, isopteropodina, isorincofilina, n-óxido de
isorincofilina, isorotundifolina, curculogósido, curculigósido B,
fenolglucósidos,
2-[[2,6-dimetoxibenzoil)oxi]-metil-4-hidroxifenil-beta-D-glucopiranósido,
2-[[2-hidroxi-6-metoxibenzoil)oxi]metil-4-hidroxifenil-beta-D-glucopiranósido,
mitrafilina, ácido oleanólico, pteropodina,
3-beta-o-(beta-d-glucopiranosil-(1\rightarrow3)beta-d-fucopiranosil-(27\rightarrow1)-beta-d-glucopiranosil
éster del ácido quinóvico,
3-beta-o-beta-d-fucopiranósido
del acido quinóvico,
3-beta-o-beta-d-fucopiranosil-(27\rightarrow1)-beta-d-glucopiranosil
éster del ácido quinóvico,
3-beta-o-beta-d-quinovopiranósido
del ácido quinóvico, rincofilina, rotundifolina, especiofilina,
uncarina, uncarina F, ácido ursólico, cefarantina (alcaloide de
bisbencilisoquinolina), berbamina (alcaloide de
bisbencilisoquinolina), matrina (alcaloide de lupina), pilocarpina
(alcaloide de imidazol), ácido 2,3-dihidrobenzoico,
ácido ferúlico, anetol, cleistantina (lignano), fenolglucósidos,
urunsiol, alfa-tocoferol (vitamina E), ubicona,
maesanina, zexbrevina A/B, 13-acetato de
12-O-tetradecanoil-forbol,
TPA (diterpeno tetracíclico), saponina con ácido oleónico de
aglicona (triterpeno pentacíclico) y cinoncósido.
9. Uso según la reivindicación 2 o la
reivindicación 8, en el que el medicamento es para la administración
por vía oral, mediante pulverizador de aerosol, o en una forma
inyectable o que se puede infundir por vía parenteral.
10. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 8, en el que el medicamento comprende una
dosificación en el intervalo de desde 10 hasta 1.000 mg/kg de peso
corporal de un paciente.
11. Uso según la reivindicación 10, en el que el
medicamento comprende una dosificación en el intervalo de desde 10
hasta 100 mg/kg de peso corporal del paciente.
12. Uso según cualquier reivindicación
precedente, en el que dicha enfermedad amiloide para tratamiento se
selecciona del grupo que consiste en el amiloide asociado con la
enfermedad de Alzheimer, síndrome de Down y hemorragia cerebral
hereditaria con amiloidosis de tipo Dutch (en los que el amiloide
específico se denomina proteína beta-amiloide o
A\beta), el amiloide asociado con la inflamación crónica, diversas
formas de tumores malignos y fiebre mediterránea familiar (en las
que el amiloide específico se denomina amiloide AA o amiloidosis
asociada a inflamación), el amiloide asociado con el mieloma
múltiple y otras discrasias de células B (en los que el amiloide
específico se denomina amiloide AL), el amiloide asociado con
diabetes tipo II (en la que el amiloide específico se denomina
amilina o amiloide del islote), el amiloide asociado con las
enfermedades priónicas incluyendo la enfermedad de
Creutzfeldt-Jakob, el síndrome de
Gertsmann-Straussler, kuru y tembladera animal (en
los que el amiloide específico se denomina amiloide PrP), el
amiloide asociado con hemodiálisis a largo plazo y síndrome del
túnel carpiano (en los que el amiloide específico se denomina
amiloide beta_{2}-microglobulina), el amiloide
asociado con amiloide cardiaco senil y polineuropatía amiloidótica
familiar (en los que el amiloide específico se denomina
transtiretina o prealbúmina), y el amiloide asociado con tumores
endocrinos tales como carcinoma medular del tiroides (en los que el
amiloide específico se denomina variante de procalcitonina).
13. Método para aislar constituyentes
inhibidores del amiloide en la materia vegetal de Uncaria
tomentosa, comprendiendo el método las siguientes etapas: a)
extraer la materia vegetal con un disolvente orgánico, b)
concentrar el extracto, c) eliminar los materiales insolubles, d)
precipitar los constituyentes inhibidores del amiloide con
disolvente orgánico, e) recuperar y redisolver los constituyentes
inhibidores del amiloide obtenidos en el disolvente orgánico, y f)
inyectar y separar mediante HPLC.
14. Método según la reivindicación 13, en el que
la materia vegetal está comprendida de píldoras, comprimidos,
comprimidos oblongos, cápsulas de gelatina dura y blanda, pastillas
para chupar, sobres, sellos para medicamentos, cápsulas Vegicap,
gotas líquidas, elixires, suspensiones, emulsiones, soluciones,
jarabes, bolsitas de té, aerosoles (como un sólido o en medio
líquido), supositorios, soluciones inyectables estériles, polvos
envasados estériles, haces de corteza y/o polvo de corteza
obtenidos comercialmente, que contienen Uncaria tomentosa,
extractos o derivados de la misma.
15. Método según la reivindicación 13, en el que
la materia vegetal se toma de cápsulas recubiertas con gelatina
disponibles comercialmente que contiene polvo seco de Uncaria
tomentosa, extractos o derivados de la misma.
16. Método según la reivindicación 13, 14 o 15,
en el que la etapa de extraer la materia vegetal con un disolvente
orgánico comprende además añadir propanol inicialmente a los
materiales vegetales que están en polvo, y la mezcla resultante se
agita toda la noche.
17. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 16, en el que el disolvente usado en la etapa
de extraer los componentes inhibidores del amiloide tiene una
polaridad que oscila desde la del agua hasta la del pentanol.
18. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 17, en el que la etapa de eliminar los
materiales insolubles se efectúa centrifugando el extracto y
recogiendo el sobrenadante.
19. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 18, en el que la etapa de concentrar el
extracto se efectúa mediante evaporación rotatoria.
20. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 19, en el que, tras las etapas de extracción
y centrifugación, se repite el procedimiento de extracción y
centrifugación 5 veces más y se recogen los sobrenadantes.
21. Método según la reivindicación 20, en el
que, tras las etapas repetidas de extracción y concentración, se
combinan y concentran los sobrenadantes usando un evaporador
rotatorio.
22. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 21, en el que, tras la etapa de concentración,
y después de que el volumen sea de 500 ml o menos, se vuelve a
centrifugar el extracto para eliminar adicionalmente materiales
insolubles.
23. Método según la reivindicación 22, en el
que, tras la etapa nueva centrifugación, se obtiene el sobrenadante
y se precipita con 4 volúmenes de éter de petróleo.
24. Método según la reivindicación 23, en el
que, tras la precipitación con éter de petróleo, se recoge el
precipitado en un sedimento tras la centrifugación adicional.
25. Método según la reivindicación 24, en el que
el sedimento se disuelve en propanol y se aplica a una columna de
sílice equilibrada con propanol que contiene ácido acético.
26. Método según la reivindicación 25, en el que
tras la aplicación del material a la columna de sílice, se usa
propanol que contiene ácido acético para eluir, y se recogen las
fracciones de color marrón amarillento de movilidad más rápida con
un colector de fracciones.
27. Método según la reivindicación 26, en el que
los eluyentes de la columna se monitorizan espectroscópicamente a
490 nm y se recogen fracciones en un colector de fracciones.
28. Método según la reivindicación 26 o la
reivindicación 27, en el que, tras la recogida de las fracciones de
color marrón amarillento de movilidad más rápida, se precipitan las
fracciones con éter de petróleo, y se recoge el precipitado tras
centrifugación.
29. Método según la reivindicación 28, en el
que, tras la nueva precipitación y la nueva centrifugación, se
disuelve el sedimento en acetonitrilo/ácido acético/agua para la
inyección en cromatografía de líquidos de alta resolución
(HPLC).
30. Método según la reivindicación 29, en el que
el sedimento disuelto se divide en partes iguales y se inyecta en
una HPLC.
31. Método según la reivindicación 30, en el que
la HPLC usada contiene una columna C_{18} de 1 x 25 cm, y se
mantiene a 30ºC con una velocidad de flujo de 2 ml/min.
32. Método según la reivindicación 30, en el que
las partes de la muestra inyectadas en la HPLC se eluyen con
gradientes de A y B, tales como el 0% de B durante 5 minutos, el
0-15% de B desde 5-10 minutos, el
15-45% de B desde 10-70 minutos y
el 45-100% de B desde 70-85 minutos;
en el que B = 95% de acetonitrilo con el 0,5% de ácido acético en
agua destilada y A = 5% de acetonitrilo con el 0,5% de ácido acético
en agua destilada.
33. Método según la reivindicación 32, en el que
los eluyentes de la HPLC se monitorizan a 490 nm y se recogen
fracciones de 4 ml en un colector de fracciones y se obtiene picos
combinados a diversos tiempos de retención (desde 0 hasta 85
minutos).
34. Método según la reivindicación 33, en el que
las fracciones obtenidas se concentran mediante liofilización
después de que se haya eliminado la mayor parte del acetonitrilo
mediante evaporación rotatoria.
35. Método según la reivindicación 34, en el que
las fracciones concentradas obtenidas se someten a prueba en
ensayos in vitro relevantes para identificar inhibidores de
la formación de fracciones de fibrillas de amiloide, el crecimiento
de fibrillas de amiloide o agentes que provoquen la
disolución/ruptura de las fibrillas de amiloide formadas
previamente.
36. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 35, en el que los componentes inhibidores del
amiloide en Uncaria tomentosa se identifican por estar
contenidos dentro de tiempos de retención de HPLC aproximados de
13-45 minutos.
37. Método según la reivindicación 36, en el que
los componentes inhibidores del amiloide en Uncaria tomentosa
se identifican por estar contenidos con un tiempo de retención de
HPLC aproximado de 26 minutos.
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