ES2341232T3 - Extracto soluble en agua de una planta del genero solanum y procedimiento de preparacion del mismo, y composicion farmaceutica que contiene el extracto soluble en agua. - Google Patents
Extracto soluble en agua de una planta del genero solanum y procedimiento de preparacion del mismo, y composicion farmaceutica que contiene el extracto soluble en agua. Download PDFInfo
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Abstract
Un extracto soluble en agua de una planta del género Solanum que comprende al menos 60% de solamargina y de solasonina.
Description
Extracto soluble en agua de una planta del
género Solanum y procedimiento de preparación del mismo, y
composición farmacéutica que contiene el extracto soluble en
agua.
Esta invención se refiere a extractos solubles
en agua de una planta del género Solanum, sus procesos de
preparación y las composiciones farmacéuticas que los contienen.
El cáncer es globalmente una de las principales
causas de muerte y el cáncer de pulmón, el cáncer de hígado y el
cáncer de mama son los más comunes. Aunque el mecanismo de
desarrollo del cáncer todavía no ha sido totalmente comprendido, se
cree que el inicio del cáncer en un sujeto puede ser producido por
una división celular anormal e incontrolable que se produce en
dicho sujeto (Chen. P. L. et al. (1990), Science, 250,
1576-1580; Finlay, C. A. et al. (1989),
Cell, 57, 1083-1093, y Baker, S. J. et
al. (1990) Science, 249, 912-915).
Generalmente, el crecimiento y la diferenciación
de las células en un cuerpo humano o animal están controlados
estrictamente por las hormonas del crecimiento presentes en el
cuerpo humano o animal. Cuando las células acumulan en ellas
mutaciones genéticas producidas por factores intrínsecos y/o
extrínsecos, dichas células generarán transmisiones de señal
incorrectas que, a su vez, conducen al crecimiento y división
incontrolables de las células, produciendo de este modo
gradualmente la formación de células cancerosas (Kerr, J. F. R.
(1971), J. Pathol., 105, 13-20).
En los últimos años, investigadores en todo el
mundo se han esforzado en trabajos de investigación sobre cánceres.
Sin embargo, las terapias desarrolladas y usadas habitualmente no
proporcionan efectos terapéuticos satisfactorios. Además de los
factores personales de los pacientes, los importantes efectos
secundarios de los fármacos anticancerosos y la resistencia de las
células cancerosas a dichos fármacos son los problemas principales
encontrados en la terapia clínica.
En vista del hecho de que las medicinas
occidentales conocidas empleadas en la terapia clínica no logran
mejorar de forma efectiva las terapias habituales para las
enfermedades cancerosas, algunos investigadores, basándose en los
resultados de la investigación en el mecanismo de inicio de la
enfermedad cancerosa, han intentado encontrar ingredientes activos
de las medicinas tradicionales chinas (abreviadas generalmente como
TCM por sus iniciales en inglés: traditional Chinese
medicines) o de hierbas que se pueden usar para curar o
aliviar los síntomas de los cánce-
res.
res.
Se considera que la apóptosis es un mecanismo
natural que regula el crecimiento celular animal (Martin, S. J. y
Green, D. R. (1995), Crit. Rev. Oncol. Hemat., 18,
137-153), y que tiene un papel importante en la
regulación de la muerte celular natural, tal como la contracción
natural de los tejidos y la absorción que se producen durante el
proceso de crecimiento de los animales. Además, cuando se dañan las
células humanas y no se pueden reparar se iniciará la apóptosis de
forma que se evita la formación de células cancerosas.
Las principales características morfológicas de
la apóptosis incluyen: formación de cuerpos apoptóticos,
condensación de la cromatina y fragmentación del ADN (Arends, M. J.
y Willye, A. H. (1991), Int. Rev. Exp. Pathol., 32,
223-254; Dive, C. et al., (1992) Biochim.
Biophys. Acta 1133, 275-285; y Darzynkiewicz, Z.
et al., (1992) Cytometry, 13,
795-808). Durante la apóptosis, los residuos de las
células muertas serán rápidamente ingeridos por las células y los
macrófagos vecinos por fagocitosis sin inducir una respuesta
inflamatoria (Sarraf, F. E. y Bowen, I. D. (1988) Cell Tissue
Res. 21, 45-49). Además, cuando se detecta la
variación del ciclo celular por citometría de flujo se puede
observar la presencia de un pico sub-G1 (Alzerreca,
A. y Hart, G. (1982) Toxicology Lett. 12,
151-155; y Lin, C. N. et al., (1986) J.
Taiwan Pharm. Assoc. 38, 166). Por lo tanto, se considera que
el pico sub-G1 es un marcador típico para
identificar células que están sufriendo apóptosis.
En la bibliografía se ha informado de que las
células se vuelven células cancerosas si su mecanismo apoptótico
está fuera de control (Carson, D. A. y Ribeiro, J. M. (1993)
Lancet 341, 1251-1254; y Kaufmann, S. H.
(1989) Cancer Res. 49, 5870-5878). Por lo
tanto, la apóptosis se ha convertido en un sujeto de estudio en
oncología. Además, se ha publicado que la apóptosis puede ser
inducida por algunos fármacos anticancerosos (Wyllie, A. H. et
al. (1980) Int. Rev. Cytol. 68, 251-306;
Wyllie, A. H. et al. (1984) J. Pathol. 142,
67-77; Barry, M. A. et al. (1990) Biochem.
Pharmacol. 40, 2353-2362; y Hickman, J. A.
(1992) Cancer Metaest. Rev. 11, 121-139).
Por lo tanto, la apóptosis señala una dirección principal en el
desarrollo global de fármacos anticancerosos.
El uso de medicinas chinas tradicionales o de
medicinas de hierbas para tratar enfermedades tiene una larga
historia. Hasta el presente, no pocos investigadores están
intentando encontrar fármacos anticancerosos útiles a partir de
medicinas chinas tradicionales o medicinas de hierbas. Sin embargo,
la aplicación de las medicinas chinas tradicionales o de las
medicinas de hierbas se basa todavía en datos empíricos y no está
soportada por una evidencia científica suficiente. Además, debido a
que la extracción de los ingredientes activos y la dosificación y
el control de calidad de las medicinas chinas tradicionales o de las
medicinas de hierbas no se hacen de forma científica, los efectos
terapéuticos presentados por las medicinas no son consistentes.
Además, la mayoría de los ingredientes activos
de las medicinas chinas tradicionales o de las medicinas de hierbas
son insolubles en agua. Cuando se administra oralmente o se inyecta
un material insoluble en agua en cuerpos animales, pueden no
alcanzarse sus efectos terapéuticos pretendidos debido a la
dificultad de absorción. Estas son las principales limitaciones que
obstaculizan el desarrollo y la aplicación de las medicinas
tradicionales chinas y las medicinas de hierbas.
Las plantas que se pueden usar como medicinas
son numerosas. Es bien conocido que muchos inhibidores de proteínas
extraídos a partir de materiales de plantas se usan en terapia
anticancerosa. Entre estos inhibidores de proteínas con potencial
anticanceroso, se encontró que los alcaloides esteroidales de una
planta del género Solanum eran un fármaco anticanceroso
potencial.
Se sabe que la Solanum incanum L.
(también denominada Solanum incanum Ruiz & Pav.,
Solanum coagulans Forsskal en latín y bitter apple en
inglés) contiene un glicoalcaloide esteroidal (Kuo, K. W. et
al. (2000) Biochemical Pharmacology 60 (12):
1865-73). Además, se ha publicado que muchas plantas
del género Solanum contienen glicoalcaloides esteroidales,
incluyendo por ejemplo el Solanum indicum, Solanum
nigrum, también conocida como Long Kul en chino y black
nightshade en inglés (Hu, K. et al. (1999) Planta
Medica 65 (1): 35-8), Solanum
capsicastrum (conocida como false Jerusalem cherry en inglés),
Solanum xanthocarpum, Solanum melongena (Blankemeyer,
J. T. et al. (1990) Food & Chemical Toxicology,
36 (5):383-9), Solanum coagulans, Solanum
tuberosum (Friedman, M. et al. (1996), Journal of
Nutrition, 126 (4): 989-99), Solanum
sodomeum (conocida en Australia como manzana de Sodoma),
Solanum turburosum, Solanum aculeastrum (Wanyonyl, A.
W. et al. (2002) Phytochemistry 59 (1):
79-84), Solanum lycocarpum (Peters, V. M.
et al., (2001) Contraception 63 (1):
53-5), Solanum khasianum (Putalun, W. et
al. (2000) Biological & Pharmaceutical Bulletin 23
(1): 72-5), Solanum suaveolens (Ripperger,
H. et al. (1997) Phytochemistry 46 (7):
1279-82), Solanum uporo (Ripperger, H. et
al. (1997) Phytochemistry 44 (4): 731-4),
Solanum abutiloides (Tian, R. H. et al. (1997)
Phytochemistry 44 (4): 723-6), Solanum
coccineum (Lorey, S. et al. (1996) Phytochemistry
41 (6): 1633-5), Solanum unguiculatum (Sarg,
T. M. et al. (1995) Pharmacy World & Science 17
(6): 191-4; Solanum robustum (Ripperger, H.
(1995), Phytochemistry 39 (6): 1475-7),
Solanum anguivi (Ripperger, H. et al. (1994)
Phytochemistry 37 (6): 1725-7), Solanum
platanifolium (Puri, R. et al. (1994) Journal of
Natural Products 57 (5): 587-96, Solanum
mammosum (Alzerreca, A. et al. (1982) Toxicology
Letters 12 (2-3): 151-5),
etc.
Hasta el momento, los alcaloides esteroidales
que se pueden obtener a partir de las plantas mencionadas
anteriormente del género Solanum comprenden, por ejemplo, la
solamargina, la solasonina, la casianina y la solasodina (Chataing,
B. et al. (1998) Planta Medica 64,
31-36 y Weissenberg, M. et al. (1998)
Phytochemistry 47, 203-209). Las estructuras
de la solasonina y la solamargina son las siguientes:
Además, hay estudios que han mostrado que la
solamargina obtenida a partir de varios materiales de plantas es
capaz de inhibir el crecimiento de los siguientes organismos:
parásitos, tales como el Tripanosoma cruzi; insectos, tales
como el Tribolium castaneum (conocido como escarabajo rojo de
la harina) y el Manduca sexta (conocido como gusano cornudo
del tabaco); mohos, tales como el Phoma medicaginis y el
Rhizoctomia solani; y moluscos, tales como el Lymnaea
cubensis y el Biomphalaria glabrata (Chataing, B. et
al. (1998) Planta Medica 64, 31-36;
Fewell, A. M. et al. (1994) Phytochemistry 37,
1007-1011; Lin, C. N. et al. (1990) J.
Nat. Prod. 53, 513-516).
Además, Chun-Nan Lin et
al. han publicado que la solamargina se puede obtener a partir
del fruto de la Solanum incanum y su estructura pertenece a
un glicósido alcaloide esteroidal. Se ha encontrado que el
compuesto protege el hígado del daño inducido por el CCl_{4} y que
inhibe el crecimiento del JTC-26 y de las células
de hematoma PLC/PRF/5 humanas (Lin, C. N. et al. (1986) J.
Natural Prod. 53, 513-516).
Shu-Hui Hsu et al. han
estudiado el mecanismo de citotoxicidad de la solamargina y han
encontrado que la solamargina aumenta la muerte de células, tales
como las células Hep3B y los fibroblastos de piel normal, por vía
de la apóptosis. Particularmente, se ha encontrado que la expresión
genética del receptor I del TNF implicado en el proceso de
apóptosis celular era sobre-regulada por la
solamargina (Hsu, S. H. et al. (1996) Biochem. Biophys.
Res. Comm. 229, 1-5).
Katsuya Fukuhara e Isao Kubohas han publicado
en Phytochemistry, 30 (2): 685-687, 1991, que
los frutos maduros de Solanum incanum se extrajeron con
metanol a temperatura ambiente. A continuación, se eliminó el
disolvente a presión reducida y el residuo se liofilizó para dar un
extracto marrón oscuro. Después, el extracto se puso en suspensión
en agua que contenía metanol (1%). Después de eliminar la porción
insoluble en agua, se repartió la suspensión con
n-hexano, cloroformo, acetato de etilo y agua, y se
obtuvo una fase acuosa con bioactividad. La fase acuosa con
bioactividad así obtenida se sometió subsiguientemente a
cromatografía de rotación locular en contracorriente y a
cromatografía de gota en contracorriente, de forma que se obtuvieron
la solamargina y la solasonina, los dos compuestos principales.
Ke Hu et al. (1999) en Planta
Medica 65, 35-38, han descrito que una hierba
completa seca de Solanum nigrum se mantuvo a reflujo con 75%
de EtOH. Se eliminó el disolvente a vacío para obtener un residuo
marrón que se desengrasó con éter de petróleo para dar un extracto.
El extracto resultante se puso en suspensión en agua y se sometió a
cromatografía en una columna de macrorresina. Hay un compuesto
activo presente en el eluyente de EtOH al 60%. El eluyente de EtOH
al 60% se repartió con H_{2}O y se extrajo con
n-BuOH y el extracto en n-BuOH así
obtenido se sometió a cromatografía en columna de gel de sílice
usando CHCl_{3}-MeOH-H_{2}O
como eluyente y en Sephadex LH-20 usando
MeOH-H_{2}O (60:40) como eluyente, obteniendo
\beta_{2}-solamargina, solamargina y
desgalactotigonina. Sin embargo, en esta publicación no se muestra
como se puede obtener un extracto bioactivo soluble en agua a
partir de la Solanum nigrum.
El documento
EP-0020029-A1 describe que un
material de la planta de Solanum sodomeum, conocida en
Australia como manzana de Sodoma, se extrajo con una disolución
ácida diluida, tal como ácido acético al 2% o 3%, para obtener un
primer extracto ácido (porción sobrenadante) y el residuo sólido se
extrajo a continuación con otro volumen de la disolución ácida
diluida después de ser separado del primer extracto ácido de forma
que se obtuvo un segundo extracto ácido (porción sobrenadante).
Después de combinar el primer y el segundo extractos ácidos se
añadió una base para obtener un precipitado. Se disolvió el
precipitado en etanol en ebullición. Después de eliminar el etanol,
se obtuvo un extracto en forma de polvo fino (denominado BEC 001).
El extracto BEC 001 se separó adicionalmente y se purificó para dar
varios glicoalcaloides, incluyendo solamargina, solasonina y mono-
y di-glicósidos de soladodina.
Aunque el documento
EP-0020029-A1 menciona que se puede
usar H_{2}O como vehículo para el extracto BEC 001, el extracto
se formuló esencialmente con una disolución sulfóxido de dimetilo
(DMSO), parafina, ungüento de zinc, crema de zinc y cetomacrogol
(un tensioactivo) en los ejemplos de trabajo de dicha patente.
Además, según el documento US 5.958.770, los
glicósidos de solasodina usados en el experimento citotóxico in
vitro se disolvieron primero en DMSO y luego se diluyeron para
dar una disolución de DMSO al 5%. Además, los glicósidos de
solasodina empleados en el experimento estaban bien en forma de una
mezcla (denominada BEC) que incluía solamargina (33%), solasonina
(33%) y di- y mono-glicósido (34%) o bien en forma
de un componente separado (solamargina, solasonina, una mezcla de
di- y mono-glicósido y las agliconas de
solasodina).
Como los alcaloides esteroidales mencionados
anteriormente son insolubles en agua, la destilación en alcohol es
un método de extracción habitual usado en las patentes o referencias
mencionadas anteriormente, y las porciones extraídas se disuelven
generalmente en un disolvente orgánico, por ejemplo DMSO, para el
análisis. Debido a que los materiales insolubles en agua no son
adecuados para la inyección directa en cuerpos de animales y pueden
no poderse absorber por el tracto digestivo durante la
administración oral, no se pueden obtener los efectos terapéuticos
de los alcaloides esteroidales, limitando de este modo la aplicación
farmacéutica y el desarrollo de los alcaloides esteroidales.
La Solicitante encontró que los polvos secos de
solamargina y/o solasonina definitivamente no podían ser disueltos
en agua sin haber sido tratados previamente con DMSO y que podían no
disolverse completamente en agua incluso después de haber sido
tratados con DMSO. Específicamente, los alcaloides esteroidales
extraídos usando el método descrito en el documento
EP-0020029-A1 no se podían disolver
en agua destilada. Aunque la solamargina o la solasonina se pueden
disolver en agua después de haberse disuelto primero en DMSO,
precipitarán si su concentración es demasiado elevada (más de 5
mg/ml). Además, el DMSO (> 1%) tiene por sí mismo una toxicidad
grande para las células y, por lo tanto, su concentración debe
controlarse para que sea inferior a 5%. Estos hechos indican
claramente que el uso del disolvente orgánico DMSO para disolver los
alcaloides esteroidales extraídos de una planta del género
Solanum tiene limitaciones.
En vista de lo precedente, en la actualidad los
alcaloides esteroidales se producen principalmente por los
fabricantes químicos en una escala pequeña y limitada y en lotes
individuales y no existe un procedimiento eficaz para extraer los
alcaloides esteroidales solubles en agua de una planta del género
Solanum para su uso comercial a gran escala. Por lo tanto,
la aplicación de los alcaloides esteroidales en la elaboración de
medicamentos y fármacos está limitada.
Consecuentemente, en el primer aspecto, con el
fin de producir alcaloides esteroidales solubles en agua a partir
de una planta del género Solanum a gran escala, esta
invención proporciona un extracto soluble en agua de una planta del
género Solanum que comprende al menos 60%, tal como 60%-90%
de solamargina y solasonina y que puede ser disuelto directamente
en agua pura o en agua con un valor de pH neutro sin adición de
ningún otro disolvente y/o coadyuvante de disolución, de tal manera
que se forma una disolución acuosa amarillenta clara y
transparente, que tiene una solubilidad en agua que varía de 2 a 20
mg/ml o superior.
En el segundo aspecto, esta invención
proporciona una composición farmacéutica que comprende el extracto
soluble en agua como un ingrediente activo para inhibir el
crecimiento de las células tumorales/cancerosas, especialmente las
células del cáncer de hígado, células del cáncer de pulmón y las
células del cáncer de mama.
En el tercer aspecto, esta invención proporciona
un procedimiento para preparar un extracto soluble en agua a partir
de una planta del género Solanum que comprende las etapas
de:
- (a)
- someter un material de una planta del género Solanum a un tratamiento de extracción usando una disolución acuosa ácida con un valor de pH de 3\sim5 de forma que se obtenga una disolución acuosa;
- (b)
- ajustar el valor del pH de la disolución acuosa obtenida en la etapa (a) hasta un pH de 8\sim10 con una base, de manera que se forme un precipitado;
- (c)
- lavar el precipitado formado en la etapa (b) con agua, seguido por secado, de forma que se obtenga un producto seco;
- (d)
- mezclar el producto seco obtenido en la etapa (c) con cloroformo, seguido por adición de una cantidad adecuada de un alcohol al 100%, de manera que se forme una mezcla de cloroformo-alcohol;
- (e)
- mezclar la mezcla de cloroformo-alcohol formada en la etapa (d) con una disolución de agua/alcohol que tenga una relación agua:alcohol predeterminada, de forma que se obtenga una mezcla que contenga una fase con base de cloroformo y una fase con base distinta del cloroformo;
- (f)
- eliminar la fase con base de cloroformo de la mezcla obtenida en la etapa (e), seguido por adición de una cantidad adecuada de agua; y
- (g)
- obtener un sobrenadante de la mezcla resultante de la etapa (f), seguido por secado del sobrenadante, con lo que el producto seco resultante se puede disolver directamente en agua para formar una disolución acuosa amarillenta clara y transparente.
\vskip1.000000\baselineskip
Los objetivos, características y ventajas
anteriores y otros de la presente invención se harán evidentes con
referencia a la siguiente descripción y los modos de realización
preferidos tomados junto con las figuras adjuntas, en las que:
La Figura 1A muestra el espectro de HPLC del
extracto soluble en agua (25 \mug) obtenido a partir de la
Solanum incanum L.
La Figura 1B muestra el espectro de HPLC del
extracto soluble en agua (25 \mug) obtenido a partir de la
Solanum incanum L. combinado con solasonina (5 \mug).
La Figura 1C muestra el espectro de HPLC del
extracto soluble en agua (25 \mug) obtenido a partir de la
Solanum incanum L. combinado con solamargina (5 \mug).
La Figura 2A muestra el espectro de HPLC del
extracto soluble en agua (25 \mug) obtenido a partir de la
Solanum nigrum.
La Figura 2B muestra el espectro de HPLC del
extracto soluble en agua (25 \mug) obtenido a partir de la
Solanum nigrum combinado con solasonina (5 \mug).
La Figura 2C muestra el espectro de HPLC del
extracto soluble en agua (25 \mug) obtenido a partir de la
Solanum nigrum combinado con solamargina (5 \mug).
Las Figuras 3A-3F son los
espectros de HPLC del extracto soluble en agua obtenido a partir de
la Solanum incanum L. con varias concentraciones.
La Figura 4 es un gráfico que indica los
patrones cuantitativos de los componentes principales en el extracto
soluble en agua de la Solanum incanum L. calculados a partir
de los espectros de HPLC de las Figuras 3A-3F.
Las Figuras 5A-5F son los
espectros de HPLC del extracto soluble en agua obtenido a partir de
la Solanum incanum L. para varios valores de pH.
La Figura 6 muestra los resultados comparativos
en el tamaño de partícula de los extractos solubles en agua
obtenidos a partir de la Solanum incanum L. según la presente
invención y los del método del documento
EP-0020029-A1 respectivamente.
Las Figuras 7A y 7B son los espectros de HPLC de
los extractos solubles en agua obtenidos a partir de la Solanum
incanum L. según la presente invención y los del método del
documento EP-0020029-A1, en los que
50 \mug de los extractos solubles en agua obtenidos por los dos
métodos se disuelven en agua, seguido por el análisis por HPLC.
Las Figuras 8A-8C son gráficos
que indican el efecto inhibidor de dosis en serie del extracto
soluble en agua obtenido de la Solanum incanum L. según la
presente invención sobre el crecimiento de las células de cáncer de
hígado, cáncer de pulmón y cáncer de mama humanos.
La Figura 9 es una serie de gráficos que
muestran los resultados de la autorradiografía sobre un biochip que
indica el efecto del extracto soluble en agua obtenido a partir de
la Solanum incanum L. según la presente invención sobre la
regulación genética de las células de cáncer de pulmón, en las que
las muestras de ARN se aislaron a partir de las células de cáncer
de pulmón tratadas con el extracto soluble en agua (100 mg/ml)
obtenido de la Solanum incanum L. durante 2 horas y sometidas
a transcripción inversa usando [^{32}P]-dCTP para
producir ADN-c marcado y el ADN-c
marcado así obtenido se hibrida con fragmentos de ADN sobre la red
de biochip, seguido por autorradiografía en película de rayos X.
La Figura 10 es una serie de fotografías que
muestran los cambios morfológicos de las células de cáncer de
hígado (Línea A), células de cáncer de pulmón (Línea B) y células de
cáncer de mama (Línea C) tratadas con el extracto soluble en agua
obtenido a partir de la Solanum incanum L. según la presente
invención.
Las Figuras 11A, 11B y 11C son gráficos que
muestran los cambios en el tamaño de los tumores en ratones desnudos
a los que se les administró el extracto soluble en agua obtenido a
partir de la Solanum incanum L. según esta invención, a los
que se les administró oralmente el extracto y a los que se les
administró el extracto por vía intraperitoneal, en los que cada
curva representa la variación en el tamaño del tumor en un ratón
desnudo.
La Figura 12 es un gráfico que muestra el efecto
inhibidor de la solasonina y de la solamargina obtenidas de la
Solanum incanum L. según la presente invención sobre el
crecimiento de las células de cáncer de pulmón humanas.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta invención proporciona un extracto soluble
en agua obtenido de una planta del género Solanum que
comprende alcaloides esteroidales que se pueden disolver
directamente en agua para formar una disolución acuosa clara y
transparente y por lo tanto adecuada para la elaboración de
medicamentos y fármacos.
En particular, esta invención proporciona un
extracto soluble en agua obtenido de una planta del género
Solanum que comprende al menos 60%, tal como 60%-90%, de
solamargina y solasonina y que se puede disolver directamente en
agua pura o en agua con un valor de pH neutro, sin añadir ningún
otro disolvente y/o coadyuvante de disolución, de manera que se
forma una disolución acuosa amarillenta clara y transparente que
tiene una solubilidad en agua que varía de 2 a 20 mg/ml o
superior.
Esta invención proporciona un procedimiento para
preparar un extracto soluble en agua que comprende las etapas
de:
- (a)
- someter un material de una planta del género Solanum a un tratamiento de extracción usando una disolución acuosa ácida con un valor de pH de 3\sim5 de forma que se obtenga una disolución acuosa;
- (b)
- ajustar el valor del pH de la disolución acuosa obtenida en la etapa (a) hasta un pH de 8\sim10 con una base, de manera que se forme un precipitado;
- (c)
- lavar el precipitado formado en la etapa (b) con agua, seguido por secado, de forma que se obtenga un producto seco;
- (d)
- mezclar el producto seco obtenido en la etapa (c) con cloroformo, seguido por adición de una cantidad adecuada de un alcohol al 100%, de manera que se forme una mezcla de cloroformo-alcohol;
- (e)
- mezclar la mezcla de cloroformo-alcohol formada en la etapa (d) con una disolución de agua/alcohol que tenga una relación agua:alcohol predeterminada, de forma que se obtenga una mezcla que contenga una fase con base de cloroformo y una fase con base distinta del cloroformo;
- (f)
- eliminar la fase con base de cloroformo de la mezcla obtenida en la etapa (e), seguido por adición de una cantidad adecuada de agua; y
- (g)
- obtener un sobrenadante de la mezcla resultante de la etapa (f), seguido por secado del sobrenadante, con lo que el producto seco resultante se puede disolver directamente en agua para formar una disolución acuosa amarillenta clara y transparente.
\vskip1.000000\baselineskip
Preferiblemente, en la etapa (a), el material de
la planta del género Solanum ha sido triturado en un
tratamiento preliminar.
Preferiblemente, en la etapa (a), el material de
la planta es al menos uno de los frutos, raíces, tallos y hojas de
la planta del género Solanum. En un modo de realización
preferido de esta invención, el material de la planta usado en la
etapa (a) es el fruto de la planta del género Solanum. En un
modo de realización preferido adicional de esta invención, el
material de la planta usado en la etapa (a) es la planta completa
de la planta del género Solanum.
Preferiblemente, el extracto soluble en agua se
obtiene a partir de una planta del género Solanum que es la
Solanum incanum L., Solanum indicum, Solanum
nigrum, Solanum capsicastrum Solanum xanthocarpum,
Solanum melongena, Solanum coagulans, Solanum
tunigrum, Solanum sodomeum, Solanum turburosum,
Solanum aculeastrum, Solanum aculeastrum, Solanum
lycocarpum, Solanum khasianum, Solanum suaveolens, Solanum uporo,
Solanum abutiloides, Solanum coccineum, Solanum
unguiculatum, Solanum robustum, Solanum anguivi,
Solanum platanifolium o Solanum mammosum o una
combinación de ellos.
En un modo de realización preferido de esta
invención, el extracto soluble en agua se obtiene de la Solanum
incanum L. En un modo de realización preferido adicional de esta
invención el extracto soluble en agua se obtiene de la Solanum
nigrum.
Preferiblemente, en la etapa (a) del
procedimiento, la disolución acuosa se obtiene realizando una
centrifugación o filtración subsiguiente al tratamiento de
extracción.
Preferiblemente, en la etapa (a), la disolución
acuosa ácida usada en el tratamiento de extracción es una
disolución acuosa que contiene ácido fórmico, ácido acético o ácido
clorhídrico.
Preferiblemente, en la etapa (b) la base es
preferiblemente una disolución acuosa alcalina que contiene un
hidróxido alcalino o hidróxido de amonio. En un modo de realización
preferido de esta invención, la disolución acuosa alcalina contiene
hidróxido de amonio. En otro modo de realización preferido de esta
invención, la disolución acuosa alcalina contiene hidróxido de
sodio.
Preferiblemente, en la etapa (b) del
procedimiento, el precipitado se obtiene realizando una
centrifugación o filtración subsiguiente al ajuste del valor del
pH.
Preferiblemente, en la etapa (c) del
procedimiento, el tratamiento de secado se elige entre el grupo que
consiste en liofilización, secado por pulverización, evaporación,
secado térmico o una combinación de ellos. En un modo de
realización preferido de esta invención, el tratamiento de secado se
realiza por liofilización que se usa para mejorar la estabilidad y
la actividad del ingrediente activo por tratamiento a baja
temperatura.
Preferiblemente, en la etapa (c) del
procedimiento, el precipitado formado en la etapa (b) se lava con
agua, se centrifuga para eliminar el exceso de base y se pone en
suspensión en agua destilada, seguido por el tratamiento de
secado.
En la etapa (d) del procedimiento, las
cantidades de cloroformo y alcohol no son particularmente críticas,
con tal de que el producto seco obtenido en la etapa (c) se pueda
disolver en ellas. En un modo de realización preferido de esta
invención, la cantidad de alcohol no es mayor que la de cloroformo
usada en la etapa (d).
Preferiblemente, en las etapas (d) y (e) del
procedimiento, el alcohol se elige entre el grupo que consiste en
metanol, etanol, alcohol propílico y una combinación de ellos. En un
modo de realización preferido de la presente invención, el alcohol
usado en las etapas (d) y (e) es metanol.
Preferiblemente, en la disolución de
agua/alcohol usada en la etapa (e), el contenido en agua no es menor
que el contenido en alcohol. Más preferiblemente, la relación entre
el agua y el alcohol es 1:1.
Preferiblemente, en la etapa (f) del
procedimiento, la fase basada en cloroformo en la mezcla obtenida en
la etapa (e) se elimina realizando una centrifugación o una
filtración.
Preferiblemente, en la etapa (g) del
procedimiento, el sobrenadante se obtiene centrifugando o filtrando
la mezcla resultante en la etapa (f).
Preferiblemente, en la etapa (g) del
procedimiento, el tratamiento de secado se elige entre el grupo que
consiste en liofilización, secado por pulverización, evaporación,
concentración a presión reducida o secado térmico o una combinación
de cualquiera de ellos. En un modo de realización preferido, el
tratamiento de secado realizado en la etapa (g) comprende
concentración a presión reducida y liofilización.
Si se desea, el producto seco obtenido en la
etapa (g) se puede volver a disolver en agua, seguido por
centrifugación y tratamiento de secado.
El extracto según esta invención se puede
disolver directamente en agua corriente o en agua estéril de manera
que se forme una disolución amarillenta clara y transparente.
Consecuentemente, el extracto obtenido según esta invención es
verdaderamente un extracto soluble en agua.
El extracto soluble en agua de la presente
invención se puede obtener típicamente a partir del procedimiento
de la presente invención como se ha definido anteriormente.
Preferiblemente comprende al menos 60%, tal como 60%-90% de
solamargina y solasonina. Además, la Solicitante ha encontrado que
algunos factores pueden afectar al contenido y la proporción de
solasonina y solamargina en el extracto soluble en agua obtenido
usando el procedimiento de esta invención. Estos factores incluyen
las especies de la planta del género Solanum y la/las
parte/partes de la planta usadas en el procedimiento de extracción,
así como los tipos de alcohol y base usados.
Por ejemplo, en el extracto soluble en agua
producido a partir del fruto maduro de la Solanum incanum L.,
el contenido en solamargina es mayor que el de solasonina según los
análisis de HPLC. Además, en comparación con una disolución básica
de NH_{4}OH al 33%, en el extracto soluble en agua obtenido usando
una disolución básica de NaOH 10M como base en la etapa (b), el
contenido en solamargina es menor que el contenido en solasonina.
Además, los contenidos de solasonina y solamargina en el extracto
soluble en agua obtenido usando etanol en la etapa (d) son
aproximadamente 50% del obtenido usando metanol. Además, el extracto
obtenido del fruto no maduro (color verde oscuro) de la Solanum
nigrum tiene contenidos mayores en solasonina y solamargina,
mientras que el fruto maduro (color púrpura oscuro) y otras partes
de la planta tienen contenidos menores. Los contenidos de
solasonina y solamargina en el extracto de la Solanum nigrum
son diferentes de los del extracto obtenido a partir de la
Solanum incanum L. Por lo tanto, el experto en la técnica
puede preparar un extracto soluble en agua deseado eligiendo las
especies adecuadas de la planta del género Solanum y usando
la parte o partes adecuadas de la planta junto con las condiciones
de operación adecuadas.
En un modo de realización preferido de esta
invención, la disolución acuosa usada en la etapa (a) para realizar
el tratamiento de extracción contiene ácido acético, la disolución
básica usada en la etapa (b) para formar el precipitado contiene
hidróxido de amonio y el alcohol usado en las etapas (d) y (e) es
metanol.
Preferiblemente, el extracto soluble en agua
comprende al menos 75% de solamargina y solasonina.
La relación entre la solasonina y la solamargina
en el extracto soluble en agua está preferiblemente en un intervalo
de 0,3;1,0 a 1,0:0,6 y está más preferiblemente en un intervalo de
0,4:1,0 a 0,9:1,0. En un modo de realización preferido de esta
invención, la relación entre la solasonina y la solamargina en el
extracto soluble en agua es de aproximadamente 0,7:1,0.
Preferiblemente, el extracto está en una forma
de partículas solubles en agua con un tamaño de nanopartículas. Más
preferiblemente, el extracto está en una forma de partículas
solubles en agua con un tamaño de partícula de menos de 1
\mum.
Se ha demostrado que el extracto soluble en agua
según esta invención presenta un efecto inhibidor sobre el
crecimiento de las células tumorales/cancerosas en particular de las
células de cáncer de hígado, las células de cáncer de pulmón y las
células de cáncer de mama. Además, la solasonina y la solamargina
obtenidas a partir de extracto soluble en agua según la presente
invención también han demostrado dicho efecto inhibidor. Por lo
tanto, se espera que el extracto soluble en agua preparado según la
presente invención, y la solasonina y la solamargina que están
contenidas en él, puedan encontrar aplicación en la preparación de
una composición antitumoral o anticancerosa.
Por lo tanto, esta invención también proporciona
una composición farmacéutica que comprende un extracto soluble en
agua según esta invención, o la solasonina y la solamargina
obtenidas a partir del extracto soluble en agua. La solasonina y la
solamargina purificadas a partir del extracto soluble en agua
también se pueden disolver directamente en agua.
Opcionalmente, la composición farmacéutica según
esta invención comprende adicionalmente un vehículo
farmacéuticamente aceptable que sea ampliamente empleado en la
tecnología de elaboración de fármacos. El vehículo farmacéuticamente
aceptable comprende uno o más reactivos, incluyendo, por ejemplo,
agua, disolución salina, disolución tampón, disgregante,
aglomerante, excipiente, lubricante y retardador de la
absorción.
La composición farmacéutica según esta invención
se puede administrar por vía oral o parenteral en una formulación
adecuada que incluye una disolución o suspensión acuosa
esterilizada, polvo esterilizado, comprimidos, cápsulas, cremas,
ungüentos, etc. La composición farmacéutica según esta invención se
formula preferiblemente para ser adecuada para inyección, tal como
una inyección acuosa, polvo para inyección, producto liofilizado
para inyección,
etc.
etc.
Opcionalmente, la composición farmacéutica de
esta invención se puede administrar sola o en combinación con un
fármaco antitumoral/anticanceroso adicional, por ejemplo,
mitomicina, adrianicina, actinomicina, cisplatina, etc.
La cantidad y el intervalo de dosificación de la
composición farmacéutica según esta invención dependen de los
siguientes factores: gravedad de la enfermedad que debe ser tratada,
vía de administración, y el peso, edad, estado de salud y respuesta
del sujeto que debe ser tratado. En general, la composición
farmacéutica según esta invención se administra por vía oral o
parenteral en una dosificación diaria de 2-6 mg/kg
en una forma de dosificación única o una forma de
multi-dosificación separada.
La presente invención se ilustrará en detalle
con referencia a los siguientes ejemplos que se dan únicamente con
el propósito de ilustración y no pretenden limitar el alcance de la
presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Se trituraron 500 g de fruto maduro de
Solanum incanum L. subsiguientemente a la adición de 1.000 ml
de agua pura. A la mezcla acuosa resultante se le añadió gota a
gota ácido acético al 99,5% para ajustar el valor del pH a 4,0,
seguido por agitación a temperatura ambiente durante 12 horas. Se
obtuvo un sobrenadante centrifugando la mezcla acuosa y se le
añadió gota a gota una disolución básica de NH_{4}OH al 33% para
ajustar el valor del pH del sobrenadante a 9,0 y se formó un
precipitado. El precipitado se obtuvo centrifugando a 4.500 rpm
(Beckman Coulter, Avanti J-25, rotor
JA-14), y la disolución básica residual presente en
él se eliminó lavando el precipitado con agua, seguido por
centrifugación a 4.500 rpm. El precipitado así obtenido se puso en
suspensión en agua destilada y se sometió a liofilización (Virtis,
Freezemobile 12ES) para dar 5 g de polvo seco. El polvo seco se
puso ampliamente en suspensión en disolución acuosa y no se pudo
disolver directamente en agua o solo se pudo disolver una pequeña
cantidad de él.
Para la preparación de un extracto que se pueda
disolver directamente en agua, se disolvieron 2 g del polvo seco en
50 ml de cloroformo de grado reactivo, seguido por adición de 40 ml
de metanol al 100% y agitación para formar una suspensión uniforme.
Se obtuvo un sobrenadante por centrifugación a 4.500 rpm o
filtración. Se añadieron 70 ml de una disolución de metanol:agua
(1:1) al sobrenadante y se mezcló bien. La mezcla obtenida se
centrifugó a 12.000 rpm durante 10 minutos. Se retiró el
sobrenadante resultante y se le añadieron 120 ml de agua destilada
y se agitó bien. Mientras tanto el sobrenadante se volvió turbio. El
sobrenadante se centrifugó adicionalmente a 12.000 rpm durante 10
minutos para eliminar el precipitado. El sobrenadante resultante se
sometió a concentración a presión reducida a 55ºC para eliminar el
metanol, seguido por liofilización para obtener un polvo seco.
El polvo seco obtenido en esta etapa se puede
disolver directamente en agua destilada para formar una disolución
amarillenta clara y transparente. Si todavía hay algún precipitado,
se puede eliminar por centrifugación a 12.000 rpm durante 10
minutos y el sobrenadante resultante se puede someter directamente a
liofilización para dar el polvo seco soluble en agua sin realizar
la etapa de concentración a presión reducida.
En general, se pueden extraer 800 mg de polvo
seco soluble en agua a partir de 500 g de fruto de Solanum
incanum L. Por análisis por HPLC, se observó que los componentes
principales del polvo seco soluble en agua eran solamargina y
solasonina, siendo el contenido en solamargina mayor que el de
solasonina (véanse el ejemplo 2 y la Figura 1A).
Alternativamente, en el procedimiento de
preparación mencionado anteriormente, el fruto se puede sumergir en
1.000 ml de una disolución acuosa de ácido acético al 3% o 5% y ser
triturado. Además, en lugar de realizar la etapa de agitar la
mezcla acuosa a temperatura ambiente durante 12 horas, la mezcla
acuosa formada se puede agitar a 50ºC durante 5 horas, o a 80ºC
durante 2 horas. Alternativamente, se puede usar una disolución
acuosa de hidróxido de sodio como sustituto de la disolución acuosa
de NH_{4}OH.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usó cromatografía líquida de alta resolución
(HPLC) para determinar los componentes principales del extracto
soluble en agua obtenido mediante el procedimiento de la presente
invención.
Metodologías:
En este ejemplo la cromatografía líquida de alta
resolución (HPLC) empleada se realizó con un modelo 1100 de Agilent
Technologies (Waldbronn, Alemania), con una columna de LiChroCART
250-4 Lichropher 100 RP-18e (5
\mum) y un tamaño de 250 mm x 4 mm; se usó 60% de acetonitrilo/40%
de agua bidestilada (pH = 2,8) como fase móvil; y el caudal fue de
1 ml/min. Las muestras patrones de solasonina y solamargina usadas
en este experimento fueron proporcionados por el profesor
Chun-Nan Lin, Departamento de Farmacia, Universidad
Médica Kaohsiung, y las dos muestras patrones se obtuvieron según
el procedimiento de purificación descrito por Gan, K. H., Lin, C.
N. y Won, S. J. (1989) Journal of Natural Products 56,
15-21.
\newpage
Se disolvieron en agua pura cantidades adecuadas
de los extractos solubles en agua, preparados a partir de los
frutos de Solanum incanum L y Solanum nigrum según el
método del Ejemplo 1, y se sometieron al análisis por HPLC en las
condiciones siguientes:
1.- El extracto soluble de Solanum incanum
L. (25 \mug), el extracto soluble en agua de Solanum
incanum L. (25 \mug) combinado con solasonina (5 \mug) y el
extracto soluble en agua de Solanum incanum L. (25 \mug)
combinado con solamargina (5 \mug);
2.- El extracto soluble de Solanum nigrum
(25 \mug), el extracto soluble en agua de Solanum nigrum
(25 \mug) combinado con solasonina (10 \mug) y el extracto
soluble en agua de Solanum nigrum (25 \mug) combinado con
solamargina (10 \mug); y
3.- Los extractos solubles en agua de Solanum
incanum L. en cantidades de 50 \mug, 40 \mug, 30 \mug, 20
\mug, 10 \mug y 5 \mug, respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Resultados:
La Figura 1A muestra un espectro de HPLC del
extracto soluble en agua del fruto de Solanum incanum L. En
comparación con el tiempo de retención mostrado en las Figuras 1B y
1C, se observa que el primer pico en la Figura 1A corresponde a la
solasonina y el segundo corresponde a la solamargina, y que el
contenido de solamargina es mayor que el de solasonina.
Con respecto a las Figuras
2A-2C, los espectros de HPLC mostraron que el
extracto soluble en agua del fruto de la Solanum nigrum
también dio dos picos que corresponden a la solasonina y la
solamargina. Sin embargo, la diferencia entre el extracto soluble
en agua del fruto de la Solanum nigrum y el de la Solanum
incanum reside en que, en el de la Solanum nigrum, el
contenido en solasonina era superior que el de la solamargina.
Además, como se muestra en las Figuras
1A-1C y en las Figuras 2A-2C, el
extracto soluble en agua según la invención no incluía solasodina y
obviamente era diferente del extracto descrito en el documento
EP-0020029-A1.
Las Figuras 3A-3C son los
espectros de HPLC del extracto soluble en agua de la Solanum
incanum L. en las cantidades de 75 \mug, 50 \mug, 40
\mug, 30 \mug, 20 \mug y 10 \mug respectivamente. Se
encontró que los valores de los picos de los dos componentes
principales del extracto soluble en agua de la Solanum incanum
L. fluctuaban en proporción con las concentraciones del extracto
soluble en agua.
Como la proporción de solasonina y solamargina,
se puede estimar por integración automática usando un programa de
ordenador (Agilent ChemStation Integrator Algorithm) según el
espectro de elución del HPLC. Si en el espectro aparece una forma
de pico puntiaguda o redondeada, dicha variación puede ser debida a
factores de madurez del fruto o a la estación. En función de 26
experimentos repetidos, se encontró que el extracto soluble en agua
de la Solanum incanum L. tenía una relación entre la
solasonina y la solamargina en el intervalo de aproximadamente
0,3:1,0 a aproximadamente 1,0:1,0 y principalmente en el intervalo
de 0,4:1,0 a 0,9:1,0.
A partir de los resultados experimentales, la
Solicitante encontró que el extracto soluble en agua según esta
invención consiste esencialmente en al menos 60% a 95%
(preferiblemente más de 75%) de solasonina y solamargina.
La Solicitante también encontró que el contenido
y proporción de solasonina y solamargina variaba con la
concentración del extracto soluble en agua usado en el análisis de
HPLC con una relación lineal. La Figura 4 es un gráfico que muestra
las curvas de calibración representadas usando una regresión lineal,
en las que a siete concentraciones de los extractos solubles en
agua de la Solanum incanum L. se les sometió al análisis por
HPLC por triplicado y los valores, media \pm desv. est., se
calcularon a partir de la integral del área de pico por HPLC de los
dos componentes principales. El resultado mostrado en la Figura 4
indica claramente que los valores de los picos de solasonina y
solamargina aumentaron y disminuyeron en una relación lineal con la
concentración del extracto soluble en agua. Por lo tanto, los dos
componentes, solasonina y solamargina, pueden ser utilizados como
un componente indicativo para el control de calidad del extracto
soluble en agua según esta invención.
Además, la solamargina y la solasonina capaces
de ser disueltas directamente en agua pueden purificarse
adicionalmente a partir del extracto soluble en agua de esta
invención usando las condiciones de HPLC mencionadas
anteriormente.
\newpage
Metodologías:
Con el fin de determinar la influencia del pH en
la elución del extracto soluble en agua, se preparó el extracto
soluble en agua (40 \mug) de la Solanum incanum L. usando
el método del Ejemplo 1 y se sometió al análisis por HPLC usando el
mismo equipo que en el Ejemplo 2 con las siguientes condiciones de
HPLC:
- 1.
- Columna: LiChroCART 250-4 Lichropher 100 RP-18e (5 \mum), 250 mm x 4 mm; y
- 2.
- Fase móvil: 60% de acetonitrilo/40% de agua bidestilada; pH ajustado a 2,3, 2,5, 2,8, 3,0 y 3,2.
\vskip1.000000\baselineskip
Resultados:
Las Figuras 5A-5E muestran los
espectros de HPLC del extracto soluble en agua de la Solanum
incanum L. a diferentes valores del pH. Como se muestra, el
tiempo de retención del componente principal del extracto soluble
en agua se retrasó al aumentar el valor del pH de la fase móvil.
Aunque los perfiles de elución cambiaron ligeramente, el perfil de
los picos de los dos componentes se mantuvo.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo se realizó para comparar la
diferencia en el tamaño de partícula entre el extracto soluble en
agua de la Solanum incanum L. preparado usando el método de
esta invención y el obtenido usando el método descrito en el
Ejemplo 2 del documento
EP-0020029-A1.
Metodologías:
Se disolvieron respectivamente 50 mg del
extracto soluble en agua preparado a partir de la Solanum incanum
L. según esta invención y 50 mg del extracto preparado a partir
de la Solanum incanum L. según el método descrito en el
Ejemplo 2 del documento
EP-0020029-A1 en 50 ml de agua
destilada y se sometieron a un análisis del tamaño de partícula
usando un analizador de tamaño de partícula (Beckman Coulter LS 230,
Coulter Corporation, Miami, Estados Unidos).
Resultados:
Con referencia a la Figura 6, el tamaño medio de
partícula del extracto preparado a partir de la Solanum incanum
L. según el método descrito en el Ejemplo 2 del documento
EP-0020029-A1 fue de 238,2 \mum y
la distribución de tamaños de partícula estaba en el intervalo de
1,8 \mum a 1.500 \mum, y había una gran cantidad de precipitado
insoluble en la disolución acuosa (véase la Figura 6A). Por el
contrario, el tamaño medio de partícula del extracto preparado a
partir de la Solanum incanum L. según esta invención fue de
0,418 \mum y la distribución de tamaños de partícula estaba en el
intervalo de 0,28 \mum a 0,65 \mum (véase la Figura 6B). El
extracto según esta invención se puede disolver completamente en
agua.
\vskip1.000000\baselineskip
Este experimento ejemplo se realizó para
comparar la diferencia en la solubilidad en agua entre el extracto
soluble en agua de la Solanum incanum L. preparado usando el
método de esta invención y el obtenido usando el método descrito en
el Ejemplo 2 del documento
EP-0020029-A1.
Metodologías:
Se disolvieron en 2 ml de agua 5 mg del extracto
soluble en agua preparado a partir de la Solanum incanum L.
según esta invención y 5 mg del extracto preparado a partir de la
Solanum incanum L. según el método descrito en el Ejemplo 2
del documento EP-0020029-A1
respectivamente y se centrifugaron a 12.000 rpm para obtener un
sobrenadante. Se tomaron 20 \mul de sobrenadante y se sometieron a
análisis por HPLC según el procedimiento descrito en el ejemplo 2
de esta invención.
\newpage
Resultados:
Las Figuras 7A y 7B son gráficos que muestran
respectivamente la solubilidad en agua del extracto preparado a
partir de la Solanum incanum L. según el método descrito en
el Ejemplo 2 del documento
EP-0020029-A1 (Figura 7A) y del
extracto soluble en agua preparado a partir de la Solanum incanum
L. según esta invención (Figura 7B). Como se muestra, el
extracto soluble en agua preparado a partir de la Solanum incanum
L. según esta invención tiene mejor solubilidad en agua.
En los Ejemplos y Figuras anteriores es evidente
que, en comparación con el extracto preparado usando un método
convencional, el extracto soluble en agua preparado a partir de la
planta del género Solanum según esta invención se puede
disolver de hecho en agua para formar una disolución acuosa clara y
transparente. Esto puede ser debido al hecho de que el extracto
soluble en agua preparado a partir de la planta del género
Solanum según esta invención tiene un tamaño de partícula de
nanopartículas, particularmente menor que 1 \mum.
Consecuentemente, se espera que el extracto soluble en agua
preparado a partir de una planta del género Solanum según
esta invención es adecuado para usarlo en la preparación de un
medicamento que comprende alcaloides esteroidales, especialmente un
medicamento para el tratamiento del cáncer.
Consecuentemente, con el fin de demostrar la
bioactividad del extracto soluble en agua preparado a partir de una
planta del género Solanum según esta invención, se analizó el
efecto farmacológico del extracto soluble en agua de la Solanum
incanum L. preparado en el Ejemplo 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Experimento farmacológico
1
Con el fin de determinar si el extracto soluble
en agua obtenido a partir de la planta del género Solanum
según esta invención tiene actividad anticancerosa, se usaron las
células cancerosas principales Hep3B, H441 y MCF-7
como dianas analíticas, donde las Hep3B y H441 se obtuvieron de la
American Type Culture Collection (ATCC, P. O. Box 1549, Manassas,
Va 20108, Estados Unidos) y las MCF-7 se obtuvieron
del Food Industry Research and Development Institute (331
Shih-Pin Road, Hsinchu, 300 Taiwan R. O. C.).
Metodologías:
Se incubaron las células Hep3B en medio de Eagle
modificado por Dulbecco (DMEM), mientras que las H441 y las
MCF-7 se incubaron en RPMI-1640,
ambos medios contenían 10% de suero fetal bovino y 40 mg/l de
gentamicina.
La citotoxicidad de las células cancerosas se
determinó usando el ensayo con sal de tetrazolio (MTS, Mosmann, T.
1983, Immunol. Meth. 65, 55-63) que se
realizó mediante determinación colorimétrica de la viabilidad
celular según el procedimiento de fabricante (CellTiter 96^{TM}
AQ, Promega, Madison, Estados Unidos).
Las células se sembraron a 1x10^{4}
células/pozo en una placa de 96 pozos y se incubaron en un incubador
con 5% de CO_{2} a 37ºC durante al menos 16 horas. El extracto
soluble en agua de la Solanum incanum L. se disolvió en agua
para inyección estéril para dar diferentes concentraciones de ensayo
que se añadieron a cada medio de incubación de las células
cancerosas en el pozo y se dejó que reaccionara durante 12 horas. A
continuación, se añadieron 20 \mul de METS a cada pozo y se dejó
que la disolución reaccionara durante 3 horas. Después de finalizar
la reacción, se determinó la absorbancia en cada pozo a 490 nm
usando un lector de ELISA 312e, Bio-TEK. Cada valor
se expresó como media \pm desv. est. de tres experimentos.
Resultados:
Las Figuras 8A-8C son gráficos
que muestran el efecto del extracto soluble en agua preparado a
partir de la Solanum incanum L. según esta invención en la
inhibición del crecimiento de las células Hep3B, H441 y
MCF-7. Se observó que el extracto soluble en agua
preparado a partir de la Solanum incanum L. según esta
invención inhibió efectivamente el crecimiento de estas células
cancerosas.
\vskip1.000000\baselineskip
Experimento farmacológico
2
Con el fin de comprender el efecto del extracto
soluble en agua preparado a partir de la Solanum incanum L.
según esta invención sobre la regulación genética en células
cancerosas de forma que se abra un camino en el desarrollo y la
investigación del tratamiento del cáncer y de ayudar en la búsqueda
de factores carcinogénicos y el desarrollo de un medicamento
anticanceroso eficaz, este experimento se realizó para determinar el
efecto regulador del extracto soluble en agua de esta invención
mediante tecnología de biochip.
En este experimento, se usó una red de biochips
disponible comercialmente (SuperArray Inc., Bethesda, MD, Estados
Unidos) para determinar el efecto del extracto soluble en agua
preparado a partir de la Solanum incanum L. según esta
invención sobre la regulación genética de células cancerosas
H441.
En primer lugar, se aislaron las muestras de ARN
de las células cancerosas tratadas durante 2 horas con extracto
soluble en agua (100 mg/ml) preparado a partir de la Solanum
incanum L. según esta invención y de las células cancerosas no
tratadas con el extracto (grupo de control). Se generaron los ADNc
marcados realizando una transcripción inversa usando
[^{32}P]-dCTP que se puede usar como sonda para la
hibridación con fragmentos de ADN sobre la red de biochips
(SuperArray Inc., Bethesda, MD, Estados Unidos). La red de biochips
después de la reacción se expuso en una película de rayos X
mediante autorradiografía.
Resultados:
Con respecto a la Figura 9, después de que las
células H441 se trataron con el extracto soluble en agua preparado
a partir de la Solanum incanum L. según esta invención
durante dos horas, la expresión del receptor 1 del factor de
necrosis tumoral (TNFR-1) y se sobrerreguló el
factor 1 asociado al receptor del TNF (TRAF-1)
asociado positivamente con la muerte de las células cancerosas,
mientras que la expresión genética de la proteína inhibidora de la
apóptosis 2 (IAP-2) y el inhibidor de la apóptosis 4
(API-4) que inhibe la muerte celular se
infrarregula debido a la influencia del extracto. Por lo tanto, se
puede observar que el extracto soluble en agua preparado a partir
de la Solanum incanum L. según esta invención es capaz de
iniciar la expresión genética del TNFR-1 y del
TRAF-1.
\vskip1.000000\baselineskip
Experimento farmacológico
3
Se usó citometría de flujo ("FACScan";
Becton Dickinson Corp.) para determinar el cambio del ciclo celular
de las células cancerosas antes y después de que las células se
trataran con el extracto soluble en agua preparado a partir de la
Solanum incanum L. según esta invención.
Metodologías:
En primer lugar, después de incubar 1x10^{6}
células cancerosas en una placa de 35 mm durante 16 horas, el
extracto soluble en agua (30 \mug/ml) preparado a partir de la
Solanum incanum L. según esta invención se añadió a cada
placa y se dejó que reaccionara durante 0, 1, 3, 5, y 8 horas.
Cuando finalizaron los respectivos tiempos de reacción, las células
se tripsinizaron con 1xtripsina y se recogieron el sobrenadante y el
medio. El sobrenadante que contenía las células se transfirió en un
tubo de centrífuga de 15 ml y se centrifugó a 1.000 rpm durante 5
minutos para obtener el precipitado. Después de añadir 300 \mul de
1xPBS y mezclar bien, se transfirieron 300 \mul de suspensión
celular en un microtubo y se fijó en 700 \mul de alcohol absoluto.
Se dejó que las células fijadas permanecieran en un refrigerador a
4ºC durante al menos 30 minutos y se centrifugaron a 4ºC a 1.200
rpm durante 5 minutos. Después de centrifugación, se obtuvo un
sobrenadante y se mezcló bien. Se le añadieron al sobrenadante 445
\mul de disolución de 1xPBS y se mezcló bien, seguido por adición
de 5 \mul de ARN-asa (10 mg/ml) para digerir el
ARN. Las células se permeabilizaron con 50 \mul de
Tritón-X-100 al 10% y se incubaron
en un incubador a 37ºC durante 1 hora, seguido por centrifugación.
Se retiró un sobrenadante y se mezcló bien con 495 \mul de
disolución de PBS. Las células se tiñeron con 5 \mul de yoduro de
propidio (5 mg/ml) en oscuridad a 4ºC durante 15-30
minutos, seguido por filtración y análisis.
Determinación del ciclo celular:
Las células que se adhirieron al filtro se
pusieron bien en suspensión en disolución de 1xPBS y se introdujeron
en el dispositivo de citometría de flujo
(Beckman-Coluter FACScan) a 100 células/segundo. Se
analizaron 10.000 células a la vez. Las células pasaron a través de
poros de 75 \mum de radio para producir señales de pulso de
corriente proporcionales al volumen de las células. Las células se
excitaron con un haz láser de ión argón a 488 nm para emitir
fluorescencia. Los datos obtenidos se usaron para analizar el
contenido de ADN en combinación con un programa de Winmdi para
determinar el ciclo celular.
Resultados:
La tabla 1 muestra los cambios del ciclo celular
de las células Hep3B, H441 y MCF-7 tratadas con el
extracto soluble en agua preparado a partir de la Solanum
incanum L. según esta invención, en la que el aumento del pico
sub-G1 indica que las células cancerosas estaban
experimentando apóptosis inducida por el extracto soluble en
agua.
Como se observa en la tabla 1, el pico
sub-G1 del ciclo celular en las células cancerosas
aumentó drásticamente en 1 hora y aumentó con un aumento en el
tiempo de reacción. Las células cancerosas murieron por ruptura de
la membrana celular como resultado de las dosis elevadas del
extracto. Por lo tanto, se ha demostrado que el extracto soluble en
agua preparado a partir de la Solanum incanum L. según esta
invención puede iniciar el mecanismo de apóptosis de los tres tipos
de células cancerosas.
Experimento farmacológico
4
Para investigar los cambios morfológicos de las
células cancerosas inducidos por el extracto soluble en agua
preparado a partir de la Solanum incanum L. según esta
invención, se estudiaron por microscopia óptica las morfologías de
las células cancerosas teñidas con hematoxilina.
Metodologías:
En primer lugar, una cantidad adecuada de
células de cáncer de hígado, células de cáncer de pulmón y células
de cáncer de mama que se habían tratado con el extracto soluble en
agua (30 \mug/ml) de la Solanum incanum L. según esta
invención durante 1, 3, y 8 horas, se centrifugó en citospina a 800
rpm durante 10 minutos para obtener portamuestras para citología.
Las células se fijaron en 4% de paraformaldehído durante 30 minutos
y se tiñeron con hematoxilina, seguido por eliminación del exceso de
colorante con 70%, 80%, 90% y 100% de alcohol absoluto. Los
portamuestras para citología se colocaron en xileno para el
tratamiento de deshidratación y se cubrieron con un cubreobjetos y
un medio de fijación. Los cambios en la morfología celular se
observaron por microscopia óptica (Olympus CX-40) a
400x y se registraron.
Resultados:
La Figura 10 muestra los cambios morfológicos de
las células cancerosas humanas antes y después de que las células
se trataran con el extracto soluble en agua (30 \mug/ml) preparado
a partir de la Solanum incanum L. según esta invención
durante 1, 3, 5 y 8 horas, en la que la línea A corresponde a las
células Hep3B, la línea B corresponde a las células H441 y la línea
C corresponde a las células MCF-7. Las células no
tratadas con el extracto se usaron como grupo de control y las
flechas indican los cambios morfológicos típicos de las
células.
Como se muestra en la Figura 10, se observó
reducción nuclear, condensación de la cromatina y presencia de
cuerpos apoptóticos en las células cancerosas después de que fueran
tratadas con el extracto soluble en agua preparado a partir de la
Solanum incanum L. según esta invención durante 1 hora. Al
mismo tiempo, los cambios morfológicos de las células cancerosas se
hicieron más y más evidentes con el aumento del tiempo de reacción
hasta que las membranas celulares finalmente se rompieron.
Como el pico sub-G1, la
condensación de la cromatina y la presencia de cuerpos apoptóticos
son características de la apóptosis, los resultados mostrados en
este análisis y en el ensayo farmacológico 3 indican claramente que
el extracto soluble en agua preparado a partir de la Solanum
incanum L. según esta invención puede iniciar el mecanismo de
la apóptosis en células cancerosas para inducir la muerte
celular.
\vskip1.000000\baselineskip
Experimento farmacológico
5
Para confirmar el efecto anticanceroso del
extracto soluble en agua de la Solanum incanum L. según esta
invención in vivo, se usaron ratones desnudos como modelo
animal in vivo.
Metodologías:
En primer lugar, se implantaron 2x107 células
H441 en el costado posterior del ratón desnudo,
BABL/c-nu-nu (8 meses de edad,
aproximadamente 20-25 g) por inyección subcutánea.
Después de que se formara el tumor comenzó a crecer
(aproximadamente 10 días) y los ratones desnudos con tumor se
dispusieron aleatoriamente en grupos de 6-7
ratones.
A los ratones desnudos del grupo de
administración por inyección se les administraron por vía
intraperitoneal 220 \mug del extracto soluble en agua disuelto en
agua usando una aguja de 0,8 mm una vez al día. La inyección se
continuó durante 3 días y se interrumpió durante 4 días. Los ratones
se pesaron cada dos días y se midió el tamaño del tumor usando un
micrómetro. Se realizó el siguiente tratamiento y se continuó la
observación durante dos meses. El volumen del tumor se calculó como
el producto longitud x anchura x (altura/2).
A cada ratón desnudo en el grupo de
administración oral se le administró oralmente el extracto soluble
en agua (600 \mug) mediante una línea de alimentación una vez al
día. La alimentación prosiguió durante 5 días y se interrumpió
durante 2 días. Se registraron el peso del ratón desnudo y el tamaño
del tumor de la misma forma que anteriormente. La administración y
la observación prosiguieron durante dos meses. El volumen del tumor
también se calculó de la misma forma que anteriormente.
Resultados:
Las Figuras 11A, 11B y 11C muestran
respectivamente los cambios en el tamaño del tumor en los ratones
desnudos, donde la Figura 11A muestra el cambio en el tamaño del
tumor en los ratones del grupo de control (6 ratones desnudos) a
los que no se les administró el extracto soluble en agua obtenido a
partir de la Solanum incanum L. según esta invención; la
Figura 11B muestra el cambio en tamaño del tumor en el grupo con
administración oral (7 ratones desnudos); y la Figura 11C muestra
el cambio en el tamaño del tumor en el grupo con inyección (7
ratones desnudos).
Como se muestra en las Figuras 11A, 11B y 11C,
se encontró que el tamaño del tumor en los ratones del grupo de
control a los que no se les administró el extracto soluble en agua
obtenido a partir de la Solanum incanum L. según esta
invención aumentó rápidamente, casi seis veces el tamaño original
después de 1 mes. Sin embargo, los tumores en los ratones desnudos
a los que se les administró oralmente el extracto soluble en agua
obtenido a partir de la Solanum incanum L. según esta
invención se redujeron en gran parte o desaparecieron. Aunque el
tumor aumentó en algunos ligeramente en tamaño, la tasa de
crecimiento fue mucho más lenta en comparación con el grupo de
control. En cuanto a los ratones desnudos a los que se les
administró intraperitonealmente el extracto soluble en agua
obtenido a partir de la Solanum incanum L. según esta
invención, los tumores en todos los ratones se redujeron o
desaparecieron. Estos resultados demuestran que la administración
oral o intraperitoneal del extracto soluble en agua obtenido a
partir de la Solanum incanum L. según esta invención fue
eficaz para retrasar el crecimiento del tumor implantado en ratones
desnudos, reduciendo su tamaño e incluso eliminándolo, y que el
efecto fue mejor en el grupo con administración intraperitoneal que
en el grupo con administración oral.
\newpage
Experimento farmacológico
6
El experimentó se usó para estudiar la
bioactividad de la solasonina y la solamargina purificadas a partir
del extracto soluble en agua de la Solanum incanum L. según
esta invención usando HPLC.
Metodologías:
Según el procedimiento de HPLC descrito en el
Ejemplo 2, los dos compuestos, solasonina y solamargina, que
también pueden disolverse directamente en agua, se separaron y
purificaron adicionalmente a partir del el extracto soluble en agua
de la Solanum incanum L. según esta invención.
Se determinó la citotoxicidad mediante el ensayo
MTS con sal de tetrazolio descrito en el Ensayo Farmacológico 1. Se
trataron las células H441 con varias dosis de solasonina y de
solamargina purificadas a partir del extracto soluble en agua de la
Solanum incanum L. según esta invención durante 12 horas,
seguido por determinación colorimétrica de la viabilidad celular
según el procedimiento del fabricante (CellTiter 96^{TM} AQ,
Promega, Madison, Estados Unidos). Los datos se indicaron como
media \pm desv. est. de tres experimentos.
Resultados:
La Figura 12 muestra que el crecimiento de las
células de cáncer de pulmón humanas puede ser inhibido eficazmente
con la solasonina y la solamargina purificada a partir del extracto
soluble en agua de la Solanum incanum L. según esta
invención. Como se muestra, la solasonina y la solamargina
purificadas a partir del extracto soluble en agua de la Solanum
incanum L. según esta invención presentan actividades
anticancerosas notables.
En resumen, la Solicitante ha obtenido con éxito
un extracto soluble en agua a partir de una planta del género
Solanum, ha establecido las condiciones para el análisis
científico durante la extracción del extracto soluble en agua y ha
obtenido sus compuestos activos de forma que sea posible un control
de calidad efectivo. Además, se ha demostrado que el extracto
soluble en agua según esta invención presenta actividades de
inhibición del crecimiento de las células cancerosas y de
iniciación del mecanismo apoptótico de las células cancerosas.
Estos hechos indican que el extracto soluble en agua de esta
invención tiene los potenciales de inhibir el crecimiento de las
células cancerosas y de detectar las células cancerosas.
Claims (33)
1. Un extracto soluble en agua de una planta del
género Solanum que comprende al menos 60% de solamargina y
de solasonina.
2. El extracto soluble según la reivindicación
1, que se extrae de una planta del género Solanum que es la
Solanum incanum L., Solanum indicum, Solanum
nigrum, Solanum capsicastrum Solanum xanthocarpum,
Solanum melongena, Solanum coagulans, Solanum
tunigrum, Solanum sodomeum, Solanum turburosum,
Solanum aculeastrum, Solanum lycocarpum, Solanum
khasianum, Solanum suaveolens, Solanum uporo, Solanum abutiloides,
Solanum coccineum, Solanum unguiculatum, Solanum
robustum, Solanum anguivi, Solanum platanifolium
o Solanum mammosum o una combinación de cualquiera de
ellas.
3. El extracto soluble en agua según la
reivindicación 2 que se extrae de la Solanum incanum L.
4. El extracto soluble en agua según la
reivindicación 2 que se extrae de la Solanum nigrum.
5. El extracto soluble en agua según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 que está en forma de
partículas solubles en agua con un tamaño de partícula menor que 1
\mum.
6. Un procedimiento para preparar un extracto
soluble en agua de una planta del género Solanum, cuyo
procedimiento comprende:
- (a)
- someter un material de una planta del género Solanum a un tratamiento de extracción usando una disolución acuosa ácida con un valor de pH de 3\sim5 de forma que se obtenga una disolución acuosa;
- (b)
- ajustar el valor del pH de la disolución acuosa obtenida en la etapa (a) hasta un pH de 8\sim10 con una base, de manera que se forme un precipitado;
- (c)
- lavar el precipitado formado en la etapa (b) con agua, seguido por secado, de forma que se obtenga un producto seco;
- (d)
- mezclar el producto seco obtenido en la etapa (c) con cloroformo, seguido por adición de una cantidad adecuada de un alcohol al 100%, de manera que se forme una mezcla de cloroformo-alcohol;
- (e)
- mezclar la mezcla de cloroformo-alcohol formada en la etapa (d) con una disolución de agua/alcohol que tenga una relación agua:alcohol predeterminada, de forma que se obtenga una mezcla que contenga una fase con base de cloroformo y una fase con base distinta del cloroformo;
- (f)
- eliminar la fase con base de cloroformo de la mezcla obtenida en la etapa (e), seguido por adición de una cantidad adecuada de agua; y
- (g)
- obtener un sobrenadante de la mezcla resultante de la etapa (f), seguido por secado del sobrenadante, con lo que el producto seco resultante se puede disolver directamente en agua para formar una disolución acuosa.
\vskip1.000000\baselineskip
7. El procedimiento según la reivindicación 6,
en el que en la etapa (a), el material de dicha planta del género
Solanum ha sido triturado en un tratamiento preliminar.
8. El procedimiento según la reivindicación 6 ó
7, en el que en la etapa (a) el material de la planta es al menos
uno del fruto, la raíz, el tallo o la hoja de dicha planta del
género Solanum.
9. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 8, en el que en la etapa (a) el material de la
planta es la planta completa de dicha planta del género
Solanum.
10. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 9, en el que en la etapa (a) el material de
una planta del género Solanum es de Solanum incanum
L., Solanum indicum, Solanum nigrum, Solanum
capsicastrum Solanum xanthocarpum, Solanum melongena,
Solanum coagulans, Solanum tunigrum, Solanum
sodomeum, Solanum turburosum, Solanum aculeastrum,
Solanum lycocarpum, Solanum khasianum, Solanum suaveolens,
Solanum uporo, Solanum abutiloides, Solanum coccineum,
Solanum unguiculatum, Solanum robustum, Solanum
anguivi, Solanum platanifolium o Solanum mammosum
o una combinación de cualquiera de ellas.
11. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 10, en el que en la etapa (a) la disolución
acuosa se obtiene realizando una centrifugación subsiguiente al
tratamiento de extracción.
12. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 11, en el que en la etapa (a) la disolución
acuosa ácida en el tratamiento de extracción es una disolución
acuosa que contiene ácido fórmico, ácido acético o ácido
clorhídrico.
13. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 12, en el que en la etapa (b) la base es una
disolución acuosa alcalina que contiene un hidróxido alcalino o
hidróxido de amonio.
14. El procedimiento según la reivindicación 13,
en el que en la etapa (b) la base es una disolución acuosa alcalina
que contiene hidróxido de sodio.
15. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 14, en el que en la etapa (b) el precipitado
se obtiene realizando una centrifugación subsiguiente al ajuste del
valor del pH.
16. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 15, en el que en la etapa (c) el tratamiento
de secado es liofilización, secado por pulverización, evaporación o
secado térmico o una combinación de cualquiera de ellos.
17. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 16, en el que en la etapa (c) el producto seco
se obtiene lavando el precipitado formado en la etapa (b) con agua y
poniendo en suspensión el precipitado lavado en agua, seguido por
liofilización.
18. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 17, en el que en las etapas (d) y (e) el
alcohol es metanol, etanol o alcohol propílico o una combinación de
cualquiera de ellos.
19. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 18, en el que en la etapa (f) la eliminación
de la fase con base de cloroformo se realiza por centrifugación.
20. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 19, en el que en la etapa (g) el tratamiento
de secado es liofilización, secado por pulverización, evaporación o
secado térmico o una combinación de cualquiera de ellos.
21. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 20, en el que el producto resultante de la
etapa (g) está en forma de partículas solubles en agua con un tamaño
de nanopartículas.
22. El procedimiento según la reivindicación 21,
en el que el producto resultante de la etapa (g) está en forma de
partículas solubles en agua con un tamaño de partícula menor de 1
\mum.
23. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 22, en el que el producto resultante de la
etapa (g) comprende al menos 60% de solasonina y solamargina.
24. El procedimiento según la reivindicación 23,
en el que el producto resultante de la etapa (g) comprende al menos
75% de solasonina y solamargina.
25. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 24, en el que el producto resultante de la
etapa (g) tiene una relación entre la solasonina y la solamargina
que varía de 0,3:1,0 a 1,0:0,6.
26. El procedimiento según la reivindicación 25,
en el que el producto resultante de la etapa (g) tiene una relación
entre la solasonina y la solamargina que varía de 0,4:1,0 a
0,9:1,0.
27. El procedimiento según la reivindicación 25
ó 26, en el que el producto resultante de la etapa (g) tiene una
relación entre la solasonina y la solamargina de aproximadamente
0,7:1,0.
28. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 27, en el que el producto resultante de la
etapa (g) tiene una solubilidad en agua que varía de 2 a 20 mg/ml o
superior.
29. Un extracto soluble en agua que se puede
obtener por un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 28.
30. Una composición farmacéutica que comprende
un extracto soluble en agua según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5 ó 29 y, opcionalmente, un vehículo o
diluyente farmacéuticamente aceptable.
31. Un extracto soluble en agua según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 ó 29 para usarlo para
inhibir el crecimiento de las células tumorales/cancerosas.
32. Uso de un extracto soluble en agua según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 ó 29 en la elaboración de
un medicamento para usarlo para inhibir el crecimiento de las
células tumorales/cancerosas.
33. Uso según la reivindicación 32 en el
tratamiento de un cáncer.
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