KR100703596B1

KR100703596B1 - 연수추출물 또는 그로부터 분리한캠프페롤-3-글루쿠로나이드를 함유하는 고지혈증의 예방 및치료용 조성물

Info

Publication number: KR100703596B1
Application number: KR1020050105469A
Authority: KR
Inventors: 최재수; 김문호; 정유정
Original assignee: 부경대학교 산학협력단
Priority date: 2005-11-04
Filing date: 2005-11-04
Publication date: 2007-04-06

Abstract

본 발명은 연수 (Nelumbo nucifera stamen) 추출물 또는 그로부터 분리된 화합물인 캠프페롤-3-글루쿠로나이드 (Kaempferol 3-O-β-D-glucuronide)를 유효성분으로 함유하는 고지혈증의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 연수 추출물 또는 그로부터 분리된 화합물인 캠프페롤-3-글루쿠로나이드는 혈중 총콜레스테롤 및 중성지질 함량을 유의적으로 감소시킴으로서 항고지혈 효과를 나타내므로, 상기 조성물은 고지혈증의 예방 및 치료용 약학조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

연수, 캠프페롤-3-글루쿠로나이드, 고지혈증, 총콜레스테롤, 중성지질, 약학 조성물.

Description

연수추출물 또는 그로부터 분리한 캠프페롤-3-글루쿠로나이드를 함유하는 고지혈증의 예방 및 치료용 조성물 {Composition comprising kaempferol-3-Ο-β-Ｄ-glucuronide or the stamen extract of Nelumbo nucifera for preventing or treating hyperlipidemia}

본 발명은 연수 추출물 또는 그로부터 분리된 캠프페롤-3-글루쿠로나이드 (Kaempferol 3-O-β-D-glucuronide)를 함유하는, 고지혈증의 예방 및 치료용 약학조성물에 관한 것이다.

고지혈증은 혈액 속의 지질성분이 보통이상으로 증가된 상태 (Kim JK, 임상지질학, pp241-270, 1995)를 말한다. 혈청지질의 주요 성분은 콜레스테롤, 중성지질, 인지질, 유리지방산 등의 지용성 물질로 구성되어 있으며, 이들 지질 물질 중 어느 것이 주로 증가하느냐에 따라 고콜레스테롤혈증, 고중성지질혈증 등으로 불리운다. 콜레스테롤 및 중성지질의 혈청 내 증가가 고지혈증의 가장 일반적인 원인으로 취급되고 있는데 과다한 지방질의 축척으로 혈액순환장애 및 미세순환부전을 일으키고, 이로 인하여 죽상동맥경화증, 허혈성심질환, 뇌경색, 고혈압, 비만, 당뇨 병 등을 초래할 수 있다 (Schoen FJ et al., Robbins pathologic basis of disease, 5th ed., pp473-484, 1994).

동맥경화의 원인으로서는 여러 가지가 있으나, 혈장 지질, 특히 혈장 콜레스테롤 (cholesterol) 및 중성지질의 상승이 가장 중요한 위험 인자의 하나로 알려져있다.

콜레스테롤은 주로 간에서 생성되며, 지단백 (lipoprotein)이라는 작고 둥근 입자형태로 혈액 중에 존재하게 되는데, 이 지단백이 콜레스테롤을 우리 몸 곳곳으로 운반한다. 지단백에는 저밀도지단백 (low density lipo protein, LDL) 및 고밀도지단백 (high density lipoprotein, HDL) 두 종류가 있으며, 고밀도지단백은 다른 조직에서 간으로 콜레스테롤을 운반하기 때문에 고밀도지단백이 많으면 혈관 등에서 콜레스테롤이 제거되며, 반면 저밀도지단백은 간에서 주로 생성되어 인체의 다른 조직으로 콜레스테롤을 운반하므로 저밀도지단백이 많으면 혈관에 콜레스테롤이 많이 쌓여서 동맥경화가 촉진되며, 혈중 콜레스테롤의 약 70%는 나쁜 콜레스테롤인 저밀도지단백으로 존재한다.

실제적으로 콜레스테롤은 인체의 기능을 정상적으로 유지시키는 데 필수적인 구성 성분이며, 세포를 만드는데 꼭 필요한 영양소이고, 부신피질 호르몬, 남성 호르몬, 여성 호르몬 등 여러 가지 호르몬의 재료가 되는 성분이며, 담즙을 만드는 재료가 된다. 또한 콜레스테롤은 생체막의 구성성분인 동시에 호르몬 합성의 출발물질로 쓰이는 등 인체에 반드시 필요한 영양소이다. 그러나, 콜레스테롤 과다 섭취시 혈관 내에 축적되어 심장계 질환을 유발하는 것으로 알려져 있으며, 아직까지 는 저콜레스테롤 식이요법 외에는 예방할 수 있는 방법이 없으며, 콜레스테롤 저하제 등의 약품 복용이 효과는 있으나, 콜레스테롤 합성효소의 작용억제에 따른 간 기능 장애와 같은 부작용을 유발하는 등의 이유로 인하여 사용이 극히 제한적이다.

인체 내 혈중 콜레스테롤 저하작용을 하는 것으로 알려진 물질로는 키토산 (chitosan), 피토스테롤 (phytosterol), 이노시톨 (inositol), 펙틴 (pectin) 등이 있으나, 피토스테롤을 제외한 경우 그 효과나 대사 기작이 명확히 밝혀져 있지 않다. 식물성 스테롤인 피토스테롤은 콜레스테롤과의 구조적 유사성으로 인하여, 인체에 해로운 저밀도지단백-콜레스테롤과의 경쟁을 통하여 인체 내 콜레스테롤 흡수 대사를 저해하는 작용 기작이 이미 밝혀져 있고, 식품첨가물로서 미국식품의약국 (FDA)의 승인이 되어 있다.

혈장 콜레스테롤의 상승 원인으로서는 우선 유전적인 질환이 있는데, 이 경우, 위독한 환자에 대해서는 식사요법과 동시에 콜레스테롤 합성저해제, 니코몰 (Nicomol), 클로피브레이트 (Clofibrate), 이온교환수지, 단백동화 스테로이드 등의 약제가 사용되고 있으나, 이들의 약제는 간독성, 위장장해, 발암성 등의 부작용이 있다.

혈장 콜레스테롤 상승의 또 하나의 큰 원인으로서, 근래 달걀, 버터, 육류 등을 대량으로 섭취하는 식생활에 의한 지방의 과잉 섭취를 들 수 있으며, 이것은 젊은 연령층에서도 현저히 나타나고 있다. 식사성의 고콜레스테롤혈증의 경우, 통상 위독한 고콜레스테롤혈증에는 이르지 않으나, 젊은 연령기부터 혈관에 서서히 콜레스테롤이 축적하여 성인에 이르러 동맥경화를 일으키는 것이 문제이며, 고-트 리글리세리드 (triglyceride)혈증과 더불어, 심근경색이나 뇌경색을 초래할 위험성이 있다.

실험적 고지혈증의 병태 모델은 크게 외인성 모델과 내인성 모델로 나누어진다. 외인성 고지혈증 병태모델로는 고콜레스테롤식이 부하에 의한 고콜레스테롤혈증 유발 모델, 즉 비타민D, 콜레스테롤, 올리브유, 옥수수유 등의 투여에 의한 고지혈증 모델이 있고, 내인성 고지혈증 모델로는 과당 (fructose) 투여 및 트리톤 WR-1339 (Triton WR-1339) 투여에 의한 모델 등이 있다 (Ham IH et al., Kor . J. Herbology, 20, pp45-52, 2005). 그중 폴록사머 407 (Poloxamer 407) 는 마취제의 유화제 (Lee HH et al., Korean J. Anesthesiol, 40, pp515-521, 2001), 난용성 약물 용해제 (Choi JY et al., J. Kor . Pharm . Sci., 18, pp240-241, 1988), 피부연고제 (Gill HJ et al., J. Kor . Pharm . Sci., 24, ppS27-S32, 1994 ; Kim KK et al., J. Kor . Pharm. Sci., 28, pp15-23, 1998) 등으로 사용되어지고 있으나, 인체 내 투여시 지질이 증가하며 특히 중성지질이 증가됨으로써 고지혈증을 유발한다. 흰쥐에게 복강으로 폴록사머를 투여하였을 때 혈중 콜레스테롤과 중성지방의 농도가 증가된다고 알려져 있다 (Johnston WK et al., Biochemical Pharmacology, 46, pp1037-1042, 1993 ; Zjumira et al., J. Parenteral Sci . & Tech., 46, pp192-200, 1992). 폴록사머 주입 후 최소 24시간 동안 지방세포 (adipocyte)에서 유리지방산이 생성되며 (Nash VJ et al., Pharmacotherapy, 16, pp10-15, 1996), 리포단백리파제 (lipoprotein lipase, LPL)의 작용을 방해하는 중성지질의 분해속도를 감소시키고 (Stellato C. et al., Br. J. Anaesth., 67, pp751-758, 1991), 혈중 콜 레스테롤과 중성지방이 증가되는데 이는 간에서의 3-히드록시-3-메틸글루타릴 CoA 환원효소(3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA reductase)의 활성을 자극시키기 때문이다 (Wout GZ et al., J. Parenter . Sci . Technol., 46(6), pp192-200, 1992).

연 (Nelumbo nucifera Gaertner)은 수련과에 속하는 다년생 수생식물로써, 전 세계에 널리 분포하며, 관상용, 식용 및 약용으로 사용하여 왔으며, 잎, 꽃, 연자육, 연근 등 거의 모든 부분을 식용으로 사용하고 있다 (Luo X. et al., Analytica Chemica Acta, 538, pp129-133, 2005). 전통적으로 잎은 하엽이라 하여 해열, 해독작용에 사용하여 왔으며, 종자와 과육은 강장, 지혈약, 야뇨증, 부인병에 사용하여 왔으며, 뿌리는 해열독, 소어혈, 일체혈증, 요혈, 장출혈 및 지혈에 사용하여 왔다 (김영배, 한약(생약)규격집(KHP), pp500, 2000 ; 김창민, 중약대사전, pp5956-5959, 1998).

연수 (Nelumbo nucifera stamen)는 연꽃 (Nelumbo nucifera)의 수술로서, 여름에 만개시 채취하여 건조한 것을 말한다.

연의 각 부위별 성분으로 알려진 것은, 종자 배아에서는 리엔시닌 (lienesine), 이소리엔시닌 (isoliensinine), 로투신 (lotusine), 네퍼린 (neferine), 프로누시페린 (pronuciferine) 등과 같은 알카로이드 성분이 분리되었으며, 잎에서는 아노나인 (anonaine), 프로누시페린 (pronuciferine), 엔-노르누시페린 (N-nornuciferine), 릴리오데닌 (liriodenine), 디-메틸코쿠라우린 (D-methylcoclaurine), 로에머린 (roemerine), 누시페린 (nuciferine), 오-놀누시페린 (O-nornuciferine), 디엘-아메파빈 (dl-armepavine), 알-코쿠라우린 (R- coclaurine), 에스-놀코쿠라우린 (S-norcoclaurine)과 같은 알카로이드성분과 퀘르세틴 배당체 (quercetin glycosides)와 같은 플라보노이드 화합물등이 동정되었으며, 연근에서는 트립토판 (tryptophan)이, 연수에서는 캠프페롤 배당체 (kaemperol glycosides), 미리세틴 배당체 (myricetin glycosides)등의 플라보노이드 화합물 등이 알려져있다. 생리활성으로는 연자육의 간보호효과와 항산화활성 (Sohn DH et al, Phytomedicine, 10, pp165-169, 2003), 연근의 약리학적 활성으로는 항균활성과 항설사활성, 정신약리학적 활성, 항해열활성, 항균활성, 항진균활성, 항염증활성, 항당뇨활성, 항산화활성 (Mukherjee PK et al, Phytotherapy Research, 9, pp522-524, 1995; Mukherjee PK et al., Journal of Ethnopharmacology, 54, pp63-67, 1996; Mukherjee PK et al., Indian Journal of Experimental Biology, 82, pp274-276, 1996; Mukherjee PK et al., Indian Journal of Pharmacolology, 27, pp262-364, 1995; Mukherjee PK et al., Indian Drugs, 32, pp274-276, 1995; Mukherjee PK et al., Planta Med ., 63, pp367-370, 1995; Lee MW et al, Natural Product Sciences, 7, 107-109, 2001; Hu M and Skibsted LH, Food Chemistry, 76, pp327-333, 2002)을 들 수 있으며, 연잎은 항산화 활성, 항에이즈 활성 (Cho EJ et al, Phytomedicine, 10, pp544-551, 2003 ; Wu MJ et al, The American Journal of Chinese Medicine, 31, pp687-698, 2003; Kashiwada Y et al, Bioorg . Med . Chem ., 13, pp443-448, 2005)을, 연수는 항산화 활성 (Jung HA et al, Arch. Pharm . Res., 26, pp279-285, 2003 ; 한국특허등록 제0514916호, 2005) 등을 가지는 것으로 알려져 있다. 연수로부터 분리된 캠프페롤-3-글루쿠로나이드 (Kaempferol 3-O-β-D- glucuronide)는 이전에 항산화 활성 (Jung HA et al, Arch. Pharm . Res., 26, pp279-285, 2003)등으로 이미 보고된 바가 있다. 그러나 지금까지 연수추출물이나 이에 분리한 캠프페롤 배당체의 고지혈증에 대한 개선효과에 대해서는 알려진 바 없다.

따라서 본 발명자는 연수에서 고지혈증을 개선하는 새로운 추출물 및 캠프페롤 배당체의 화합물을 분리, 동정한 후 고지혈증에 대한 개선효과를 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 탁월한 고지혈증 개선 활성을 지닌 연수 추출물 또는 이로부터 분리한 캠프페롤-3-글루쿠로나이드 (Kaempferol 3-O-β-D-glucuronide)를 유효성분으로 함유하는 고지혈증의 예방 및 치료에 유용한 약학조성물을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 연수 (Nelumbo nucifera stamen) 추출물 또는 이로부터 분리한 하기 구조식 1로 표기되는 캠프페롤-3-글루쿠로나이드를 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 함유하는 고지혈증의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

(1)

상기 추출물은 조추출물 또는 비극성용매 가용 추출물로서, 조추출물은 물, 에탄올, 메탄올, 부탄올과 같은 저급알콜 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 에탄올에 가용한 추출물을 포함하며, 비극성용매 가용추출물은 디클로로메탄, 클로로포름 또는 에틸 아세테이트로부터 선택된 비극성용매로, 바람직하게는 에틸 아세테이트에 가용한 추출물을 포함한다.

본 발명의 연수 추출물 및 화합물을 함유하는 고지혈증의 치료 및 예방을 위한 약학조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물 또는 화합물을 0.1 내지 50 중량 % 포함한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 연수 조추출물, 비극성용매 가용추출물 및 이로부터 분리되는 플라보노이드류의 화합물은 하기와 같이 수득될 수 있다.

본 발명의 연수 조추출물은 연수를 동결건조 후 마쇄하여 분말화 한 후, 연수 건조 중량의 약 3 내지 20배, 바람직하게는 약 3 내지 5배에 달하는 부피의 물, 메탄올, 에탄올 및 부탄올과 같은 저급 알콜 또는 이들의 약 1:0.1 내지 1:10의 혼합비를 갖는 혼합용매로, 바람직하게는 에탄올로 20 내지 100 ℃, 바람직하게는 20 내지 70 ℃의 추출 온도에서 약 0.5시간 내지 2일, 바람직하게는 1시간 내지 1일 동안 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 추출방법으로 1회 내지 5회, 바람직하게는 3회 연속 추출하여 수득한 후, 감압여과하고 여액을 진공회전농축기로 20 내지 100 ℃, 바람직하게는 40 내지 70 ℃에서 감압 농축하여 물, 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매에 가용한 연수 조추출물을 수득할 수 있다.

상기 연수 조추출물을 물에 현탁한 후, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, n-부탄올 순으로 용매를 이용하여 추출하여 본 발명의 연수 비극성용매 가용추출물, 바람직하게는 에틸아세테이트 가용성 분획물을 수득할 수 있고, 더욱 구체적으로는 연수 조추출물 즉, 연수 에탄올 추출물에 디클로로메탄:물:메탄올을 일정 비율, 바람직하게는 10:9:1로 혼합하여 디클로로메탄 분획물 및 수가용성 분획물을 수득할 수 있고, 다시 상기 수가용성 분획물에 에틸아세테이트를 가하여 에틸아세테이트 가용성 분획물 및 수가용성 분획물을 수득할 수 있고, 마지막으로 상기 수가용성 분획물을 부탄올로 추출하여 부탄올 가용성 분획물과 수가용성 분획물을 수득할 수 있다.

상기 비극성 용매 가용성 분획물에 대하여, 바람직하게는 에틸아세테이트 가용성 분획물을 세파덱스 LH-20 칼럼 크로마토그래피 (Sephadex LH-20 column chromatography)에 적용할 수 있으며, 메탄올로 시간당 일정용량, 바람직하게는 500 ㎖의 속도로 칼럼 크로마토그래피를 수행하여 F1부터 F5까지 5개의 분획물을 수득할 수 있으며, 이 중 F4 분획물을 재결정화 하여 상기 구조식 1로 표시되는 플라보노이드류의 화합물을 분리 및 동정할 수 있다.

본 발명은 연수로부터 조추출물, 비극성용매 가용추출물 및 이로부터 분리되는 플라보노이드류의 화합물을 분리, 정제하는 방법을 제공한다.

폴록사머 407로 고지혈증을 유도한 랫트에서 상기와 같은 공정으로 수득된 연수 추출물 또는 그로부터 분리된 플라보노이드류 화합물의 항고지혈 효과를 측정한 결과, 혈청 총콜레스테롤 및 중성지질 함량을 유의성 있게 강하시켰으므로 고지혈증 예방 및 치료용 약학조성물로 유용하게 이용할 수 있음을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 상기와 같은 방법으로 수득한 연수 추출물 및 그로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 함유하는 고지혈증에 대한 예방및 치료용 약학조성물을 제공한다.

본 발명의 연수 추출물 또는 그로부터 분리된 화합물은 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 사용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.

본 발명의 연수 추출물 및 그로부터 분리된 화합물을 포함하는 약학조성물의 적용량 및 적용방법은 제형 및 사용목적에 따라 다를 수 있다.

또한, 본 발명의 연수 추출물 및 그로부터 분리된 화합물을 포함하는 조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 연수 추출물 및 그로부터 분리된 화합물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비 톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명에 따른 연수 추출물 및 그로부터 분리된 화합물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물은 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제한다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 연수 추출물 및 그로부터 분리된 화합물의 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 0.1 내지 100 mg/㎏의 양을 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다. 또한 그 화합물의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

상기 약학조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular)주사에 의해 투여될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예, 제형예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예, 제형예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예, 제형예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 연수 조추출물의 제조

본 발명에 사용한 연수는 부산의 약재상에서 구입하여 사용하였다. 연수는 동결건조 후 마쇄하여 얻은 분말 2 ㎏에 에탄올 10 ℓ를 넣고 70 ℃에서 일정시간 간격 (12h, 6h, 3h)으로 3회 반복하여 환류냉각추출한 후 여과지 (와트만사, 미국) 를 사용하여 감압여과한 후 수득한 추출물을 진공회전농축기에 적용하여 40 ℃에서 에탄올을 제거한 후 추출된 잔사로서 연수 조추출물 240 g을 수득하였으며, 이중 5 g을 취하여 동물실험을 위한 시료로 사용하였다.

실시예 2. 연수 디클로로메탄 가용추출물의 제조

상기 실시예 1에서 얻은 조추출물을 물 2 ℓ에 녹여 얻은 수가용부 2 ℓ에 디클로로메탄 2 ℓ를 가하여 혼합한 후 3~ 4차례 분획하여 수가용성 분획층 2 ℓ 및 디클로로메탄 가용성 분획물 2 ℓ를 얻은 후, 이 디클로로메탄 가용성 분획물을 건조하여 디클로로메탄 가용추출물 53 g을 수득하였다.

실시예 3. 연수 에틸아세테이트 가용추출물의 제조

상기 실시예 2에서 얻은 수가용성 분획층 2 ℓ에 에틸아세테이트 2 ℓ를 가하여 혼합한 후 3~ 4차례 분획하여 수가용성 분획물 2 ℓ 및 에틸아세테이트 가용성 분획물 2 ℓ를 얻은 후, 이 에틸아세테이트 분획물을 건조하여 에틸아세테이트 가용추출물 21 g을 수득하여 시료로 사용하였으며, 이중 5 g을 취하여 동물실험을 위한 시료로 사용하였다.

실시예 4. 연수 부탄올 가용추출물의 제조

상기 실시예 3에서 얻은 수가용성 분획층 2 ℓ에 부탄올 2 ℓ를 가하여 혼합한 후 3~ 4차례 분획하여 수가용성 분획물 2 ℓ및 부탄올 가용성 분획물 2 ℓ를 얻 은 후, 수가용성 분획물 및 부탄올 가용성 분획물을 건조하여 수가용 추출물 및 부탄올 가용추출물 29 g을 수득하여 시료로 사용하였으며, 이중 5 g을 취하여 동물실험을 위한 시료로 사용하였다.

실시예 5. 플라보노이드류 화합물의 분리

상기 실시예 3의 연수 에틸아세테이트 추출물 21 g을 세파덱스 LH-20 칼럼 크로마토그래피에 적용하였다. 이 때 전개용매로서 메탄올 용매를 사용하였고, 고정상으로는 친유성 세파덱스 LH-20 (Lipophilic Sephadex LH-20, 25-100 μ, Sigma Chem. Co., St. Louis, USA)을 사용하여 시간당 500 ㎖씩 분획을 수행하여 5개의 하부 분획물로 나눈 후, 각각의 분획물의 활성(DPPH, ONOO-)을 측정하여 그중 가장 활성이 뛰어난 F4 분획물을 재결정화 하여, 하기와 같은 무정형 황색분말상의 캠프페롤-3-글루쿠로나이드 (Kaempferol 3-O-β-D-glucuronide) 0.2675 g을 분리하였다.

물질의 성상: 무정형 노란색 분말.

분자식: C₂₁H₁₈O₁₂.

¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 12.48(1H, brs, 5-OH), 8.02(2H, d, J=8.0 Hz),

6.86(2H, d, J=8.0 Hz), 6.36(1H, d, J=2.0 Hz),

6.15(1H, d, J=2.0 Hz), 5.43(1H, d, J=7.2 Hz)

¹³C-NMR (100 MHz, DMSO-d6): 177.4, 171.4, 164.5, 161.1, 160.1, 156.4,

156.4, 133.2, 131.0, 120.7, 115.1, 103.8,

101.3, 98.8, 93.8, 76.1, 75.2, 73.9, 71.8

실험예 1. 폴록사머 407 ( Poloxamer 407)로 유도된 고지혈증 병태 랫트에 대한 연수 비극성 용매 분획물의 고지혈증 개선 효과

폴록사머 407 (Poloxamer 407, BASF Wyandotte Corp., Germany)로 유도된 고지혈증 병태 랫트에 대한 연수 비극성 용매 분획물의 고지혈증 개선 효과를 확인하기 위하여, 실험동물인 체중 120 g 내외의 Sprague-Dawley계 웅성 랫트 (샘타코, 한국)에게 고형사료 (삼양배합사료, 한국)와 물을 충분히 공급하면서 2주 이상 실험실 환경 (온도 22±2 ℃, 습도 55±5 %)에 적응 시킨 후 사용하였다. 200 g 내외에 도달한 랫트에 고지혈증 유발물질 폴록사머 407 (Poloxamer 407)을 400 mg/kg용량으로 생리식염수에 녹여 복강 투여한 후 2시간이 경과하고 나서, 실시예 3 및 4에서 수득한 연수의 에틸아세테이트 및 부탄올 분획물을 각 200, 100 mg/kg 씩 5 % 에탄올을 함유한 생리식염수에 녹여 경구투여하고, 양성대조군인 로바스타틴 (lovastatin, 중외제약, 한국)은 각각 70, 32 mg/kg씩, 음성대조군은 5 % 에탄올을 함유한 생리식염수를 0.5 ㎖ 경구투여 하였다. 최초 경구투여 후 24시간 간격으로 총 3회 투여하고, 최종 투여 후 12시간이 지난 후 혈액을 채취하였다. 채취혈액을 25 ℃에 30분간 방치 후 윈심 분리하여 상등액을 검체로 사용하였다. 검체의 총콜 레스테롤과 중성지질 함량 측정은 시약 키트 (콜레스테자임-브이, 트리글리자임-브이, 신양화학, 한국)를 사용하였다. 총콜레스테롤 및 중성지질 측정은 검체 10 ㎕과 효소시액 1.5 ㎖을 잘 혼합하여 37 ℃ 온수조에서 5분간 가온하여 60분 이내에 시약맹검을 대조로하여 505 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 표준과 시약맹검은 검체 대신에 각각 표준액과 증류수로 대신하였다. 고지혈증 개선 효과는 콜레스테롤과 중성지질의 농도를 하기의 수학식 1 로 구하여 나타냈으며, 평균 ± 표준편차로 나타내었다.

표준액의 농도/표준액의 흡광도 = Factor

Factor × 검체의 흡광도 = 고지혈증 개선 효과 (%)

시료	총콜레스테롤 (㎎/㎗)	중성지질 (㎎/㎗)
정상군	90.0±3.9 (34)	71.4±2.0 (25)
생리식염수 (5% 에탄올 함유)	259.8±3.2 (100)	288.1±7.0 (100)
연수 에틸아세테이트 가용성 분획물 100 mg/kg	186.0±29.7 (72)	209.1±25.3 (73)
연수 에틸아세테이트 가용성 분획물 200 mg/kg	152.9±2.1 (59)	179.1±2.7 (62)
연수 부탄올 가용성 분획물 100 mg/kg	237.8±1.0 (92)	292.4±21.4 (101)
연수 부탄올 가용성 분획물 200 mg/kg	200.7±26.5 (77)	260.6±4.9 (90)
로바스타틴 35 mg/kg	223.4±9.4 (86)	244.9±4.7 (85)
로바스타틴 70 mg/kg	189.7±6.8 (73)	204.6±7.2 (71)

상기 실험 결과, 표 1에 나타낸 바와 같이 연수 에틸아세테이트 가용성 분획물 200 mg/kg 처리군에서 총콜레스테롤과 중성지질농도가 각각 41, 38 %의 개선효과를 나타내었고, 이는 대조약물인 로바스타틴 70 mg/kg 처리군 (27, 29 %)보다 더욱 탁월한 효과였다. 연수 에틸아세테이트 가용성 분획물 100 mg/kg 처리군에서 총콜레스테롤과 중성지질농도가 각각 28, 27 %의 개선효과를 나타내었고, 이는 대조약물인 로바스타틴 35 mg/kg 처리군 (14, 15 %)보다 더 좋은 결과이다. 연수 부탄올 가용성 분획물 200 mg/kg 처리군에서 총콜레스테롤과 중성지질농도가 각각 23, 10 %의 개선 효과를 보였다. 이는 연수 부탄올 가용성 분획물과 비교하여 연수 에틸아세테이트 가용성 분획물이 더욱 탁월한 콜레스테롤 및 중성지질 저하 물질을 다량 함유하고 있음을 나타내는 것이다.

실험예 2. 폴록사머 407 ( Poloxamer 407)로 유도된 고지혈증 병태 랫트에 대한 연수 에틸아세테이트 가용성 분획물에서 분리된 캠프페롤 -3- 글루쿠로나이드 (Kaempferol 3- O -β-D- glucuronide )의 고지혈증 개선효과

고지혈증 병태 랫트에 대한 상기 실시예 5에서 수득된 화합물 1의 고지혈증 개선 효과를 확인하기 위하여, 상기 실험예 1과 같은 방법으로 실시하여, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

하기 표 2에 나타낸 바와 같이, 캠프페롤-3-글루쿠로나이드 (kaemperol-3-O-β-D-glucuronide, 화합물 1) 20 mg/kg 처리군은 음성대조군과 비교하였을 때, 총콜레스테롤과 중성지질농도가 각각 31, 23 %의 개선효과를 나타내었고, 이는 양성대조군인 로바스타틴 35 mg/kg 처리군 (14, 15 %)보다 더 효과적이었다. 캠프페롤-3-글루쿠로나이드(kaemperol-3-O-β-D-glucuronide)는 단일 화합물로서 탁월한 고지혈증 개선효과를 나타냈다.

시료	총콜레스테롤 (㎎/㎗)	중성지질 (㎎/㎗)
정상군	90.0±3.9 (34)	71.4±2.0 (25)
생리식염수 (5% 에탄올 함유)	259.8±3.2 (100)	288.1±7.0 (100)
캠프페롤-3-글루쿠로나이드 10 mg/kg	212.7±5.8 (82)	247.5±2.7 (86)
캠프페롤-3-글루쿠로나이드 20 mg/kg	178.9±2.4 (69)	223.0±1.8 (77)
로바스타틴 35 mg/kg	223.4±9.4 (86)	244.9±4.7 (85)
로바스타틴 70 mg/kg	189.7±6.8 (73)	204.6±7.2 (71)

비교예 1. 폴록사머 407 ( Poloxamer 407)로 유도된 고지혈증 병태 랫트에 대한 연수, 연잎 및 연근 에탄올 조추출물의 고지혈증 개선 효과

폴록사머 407 (Poloxamer 407)로 유도된 고지혈증 병태 랫트에 대한 연 (Nelumbo nucifera Gaertner)의 연수, 연잎 및 연근 에탄올 조추출물의 고지혈증 개선 효과를 확인하기 위하여, 상기 실험예 1과 같은 방법으로 실시하여, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

하기 표 3에 나타난 것처럼, 연수, 연잎 및 연근의 모든 에탄올 조추출물에서 고지혈증 개선 효과를 나타내었다. 연수 에탄올 조추출물 1000, 500 ㎎/㎏, 연잎 에탄올 조추출물 1000, 500 ㎎/㎏, 연근 에탄올 조추출물 1000 ㎎/㎏ 처리군은 총콜레스테롤에서 각각 50, 38, 41, 37, 44 %, 중성지질에서는 44, 37, 39, 37, 31 %의 개선효과를 보였다. 이는 대조약물인 로바스타틴 70 ㎎/㎏ 처리군 (27, 29 %)보다 탁월한 개선 효과이며, 이중 연수 에탄올 조추출물에서 개선효과가 가장 유의적이었다.

시료	총콜레스테롤 (㎎/㎗)	중성지질 (㎎/㎗)
정상군	88.9±10.0 (35)	80.4±4.1 (27)
생리식염수 (5% 에탄올 함유)	254.0±3.8 (100)	287.2±4.5 (100)
연수 에탄올 조추출물 500 mg/kg	158.8±5.0 (62)	182.4±5.6 (63)
연수 에탄올 조추출물 1000 mg/kg	128.6±5.7 (50)	167.2±5.8 (56)
연잎 에탄올 조추출물 500 mg/kg	160.6±6.4 (63)	182.6±6.2 (63)
연잎 에탄올 조추출물 1000 mg/kg	149.1±3.9 (59)	175.9±5.2 (61)
연근 에탄올 조추출물 500 mg/kg	172.4±6.8 (68)	217.5±8.1 (76)
연근 에탄올 조추출물 1000 mg/kg	142.1±7.1 (56)	197.3±7.8 (69)
로바스타틴 35 mg/kg	223.4±9.4 (86)	244.9±4.7 (85)
로바스타틴 70 mg/kg	189.7±6.8 (73)	204.6±7.2 (71)

비교예 2. 폴록사머 407 ( Poloxamer 407)로 유도된 고지혈증 병태 랫트에 대한 연자육 조추출물과 화합물 나린진의 고지혈증 개선 효과

폴록사머 407 (Poloxamer 407)로 유도된 고지혈증 병태 랫트에 대한 연 (Nelumbo nucifera Gaertner)의 연자육 조추출물과 화합물 나린진 (naringin ; Sigma Chem. Co., St. Louis, USA)의 고지혈증 개선 효과를 확인하기 위하여, 상기 실험예 1과 같은 방법으로 실시하여, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

하기 표 4에 나타난 것처럼, 연자육 에탄올 조추출물 처리군이 가장 탁월한 고지혈증 개선 효과를 나타내었다. 연자육 에탄올 조추출물 1000, 500 ㎎/㎏ 처리군은 총콜레스테롤에서 각각 43, 34 %, 중성지질에서는 32, 33 %의 개선효과를 보였다. 이는 대조약물인 로바스타틴 70 ㎎/㎏ 처리군 (25, 25 %)보다 탁월한 개선 효과이며, 화합물 나린진 20 mg/kg 처리군에서는 총콜레스테롤과 중성지질농도가 각각 6, 7 % 정도의 낮은 개선 효과를 보였다.

시료	총콜레스테롤 (㎎/㎗)	중성지질 (㎎/㎗)
정상군	97.9±10.0 (35)	79.8±5.1 (27)
생리식염수 (5% 에탄올 함유)	279.6±7.9 (100)	295.6±7.0 (100)
연자육 에탄올 조추출물 500 mg/kg	186.1±5.2 (66)	199.0±8.2 (67)
연자육 에탄올 조추출물 1000 mg/kg	161.2±5.2 (57)	170.6±13.2 (58)
나린진 10 mg/kg	272.7±7.1 (97)	291.4±8.6 (98)
나린진 20 mg/kg	264.4±7.9 (94)	275.4±6.0 (93)
로바스타틴 35 mg/kg	250.9±7.0 (89)	267.4±4.0 (85)
로바스타틴 70 mg/kg	211.5±12.0 (75)	224.6±10.9 (75)

하기에 상기 약학조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

실시예 5의 캠프페롤-3-글루쿠로나이드 20 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

실시예 5의 캠프페롤-3-글루쿠로나이드 10 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

실시예 5의 캠프페롤-3-글루쿠로나이드 10 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

실시예 5의 캠프페롤-3-글루쿠로나이드 10 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

Na₂HPO₄,12H₂O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

실시예 5의 캠프페롤-3-글루쿠로나이드 20 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

본 발명의 연수 추출물 또는 그로부터 분리된 캠프페롤-3-글루쿠로나이드 (Kaempferol 3-O-β-D-glucuronide) 화합물은 동맥경화증과 밀접한 관계가 있는 고지혈증에 대한 개선 효과를 보이므로, 고지혈증 및 동맥경화증의 예방 및 치료를 위한 약학조성물로써 사용할 수 있다.

Claims

연수 (Nelumbo nucifera stamen) 에틸아세테이트 가용 추출물을 유효성분으로 포함하는 고지혈증의 예방 및 치료용 약학조성물.
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제 1항에 있어서, 상기 추출물은 조성물 총중량에 대하여 0.1 내지 50 중량 %로 포함됨을 특징으로 하는 약학조성물.
연수 (Nelumbo nucifera stamen) 에틸아세테이트 가용 추출물로부터 분리한 하기 일반식 (1)로 표기되는 캠프페롤-3-글루쿠로나이드를 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 함유하는 고지혈증의 예방 및 치료용 약학조성물:

(1)