PT1508334E - Extracto solúvel em água a partir de planta do género solanum e o seu processo de preparação, e composição farmacêutica contendo o extracto solúvel em água - Google Patents

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ΕΡ 1 508 334/ΡΤ DESCRIÇÃO "Extracto solúvel em água a partir de planta do género Solanum e o seu processo de preparação, e composição farmacêutica contendo o extracto solúvel em água"

Este invento refere-se a extractos solúveis em água a partir de uma planta do género Solanum, os seus processos de preparação e composições farmacêuticas compreendendo os mesmos. 0 cancro é uma das principais causas de morte de humanos à escala global, e cancro do pulmão, cancro do fígado e cancro da mama são muito comuns. Ainda que o mecanismo de desenvolvimento do cancro não esteja ainda totalmente compreendido, crê-se que o aparecimento de cancro num sujeito pode ser causado por divisão celular anormal e incontrolável que ocorre no referido sujeito (Chen, P.L., et al. (1990), Science, 250, 1576-1580; Finlay, C.A., et al. (1989), Cell, 57, 1083-1093, e Baker, S.J., et al. (1990) Science, 249, 912-915).

Usualmente, o crescimento e a diferenciação celulares num corpo humano ou animal são estritamente controlados por hormonas de crescimento presentes no corpo humano ou animal. Quando as células acumulam no seu interior mutações genéticas causadas por factores intrínsecos e/ou extrínsecos, as referidas células gerarão transmissões de sinais incorrectos, que por sua vez conduzem ao crescimento e à divisão celulares incontroláveis, resultando por isso na formação de células de cancro de modo gradual (Kerr, J.F.R. (1971) J. Pathol., 105, 13-20).

Em anos recentes, investigadores em todo o mundo têm-se empenhado em trabalhos de investigação sobre cancros. No entanto, as terapias do cancro actualmente desenvolvidas e utilizadas não conseguem proporcionar efeitos terapêuticos satisfatórios. Para além de factores pessoais dos pacientes, os efeitos secundários graves de fármacos anti-cancro e a resistência de células de cancro a estes fármacos são os principais problemas encontrados em terapia clínica.

Atendendo ao facto de os medicamentos ocidentais conhecidos utilizados em clínica não conseguirem melhorar 2

ΕΡ 1 508 334/PT eficazmente as actuais terapias para doenças cancerosas, com base nos resultados da investigação sobre o mecanismo de inicio da doença cancerosa, alguns investigadores têm tentado identificar ingredientes activos em medicamentos chineses tradicionais (TCM) ou em ervas que possam ser utilizados para curar ou aliviar os sintomas de cancros. A apoptose é considerada um mecanismo natural que regula o crescimento de celular animal (Martin, S.J. e Green, D.R. (1995), Crit. Rev. Oncol. Hemat., 18, 137-153), e desempenha um papel importante na regulação da morte celular natural, tal como a retracção e absorção do tecido natural que ocorrem durante o processo de crescimento de animais. Para além disso, quando células humanas são danificadas e não podem ser reparadas, a apoptose será iniciada de modo a evitar a formação de células de cancro.

As principais caracteristicas morfológicas da apoptose incluem: formação de corpos apoptóticos, condensação de cromatina e fragmentação de ADN (Arends, M.J. e Wyllie, A.H. (1991) Int. Rev. Exp. Pathol., 32, 223-254; Dive, C., et al. (1992) Biochim. Biophys. Acta 1133, 275-285; e

Darzynkiewicz, Z., et al. (1992) Cytometry, 13, 795-808).

Durante a apoptose, resíduos de células mortas serão rapidamente ingeridos por células vizinhas e macrófagos via fagocitose sem induzir uma resposta inflamatória (Sarraf, F.E. e Bowen, I.D. (1988) Cell Tissue Res. 21, 45-49).

Adicionalmente, quando a variação do ciclo celular é detectada por citometria de fluxo, pode-se observar a presença de um pico sub-Gl (Alzerreca, A. e Hart, G. (1982) Toxicology Lett. 12, 151-155; e Lin, C.N., et al. (1986) J.

Taiwan Pharm. Assoe. 38, 166). Assim, o pico sub-Gl é considerado um marcador típico para identificação de células que estão a sofrer apoptose. É noticiado na literatura que as células se tornarão células de cancro se o seu mecanismo apoptótico estiver fora de controlo (Carson, D.A. e Ribeiro, J.M. (1993) Lancet 341, 1251-1254; e Kaufmann, S.H. (1989) Câncer Res. 49, 5870- 5878). Por este motivo, a apoptose tem-se tornado o tema de estudo em oncologia. Para além disso, é noticiado que a apoptose pode ser induzida por certos fármacos anti-cancro (Wyllie, A.H., et al. (1980) Int. Rev. Cytol. 68, 251-306;

Wyllie, A.H., et al. (1984) J. Pathol. 142, 67-77; Barry, 3 ΕΡ 1 508 334/ΡΤ Μ.Α., et al. (1990) Biochem. Pharmacol., 40, 2353-2362; e Hickman, J.A. (1992) Câncer Metast. Rev., 11, 121-139). Assim, a apoptose aponta um caminho muito importante no desenvolvimento global de fármacos anti-cancro. A utilização de medicamentos chineses tradicionais ou de fitofármacos para tratar doenças tem uma longa história. No presente, muitos investigadores estão a tentar identificar fármacos anti-cancro úteis em medicamentos chineses tradicionais ou em fitofármacos. No entanto, a aplicação de medicamentos chineses tradicionais ou de fitofármacos é ainda baseada em empirismo, e não é suportada por evidência cientifica suficiente. Para além disso, porque a extracção de ingredientes activos, e a dosagem e o controlo de qualidade de medicamentos chineses tradicionais ou de fitofármacos não são abordados cientificamente, os efeitos terapêuticos exibidos pelos medicamentos não são consistentes.

Adicionalmente, a maioria dos ingredientes activos a partir de medicamentos chineses tradicionais ou de fitofármacos é insolúvel em água. Quando material insolúvel em água é administrado oralmente ou injectado em corpos animais, o seu efeito terapêutico pretendido pode não ser atingido devido a dificuldade de absorção. Estas são as principais limitações que impedem o desenvolvimento e a aplicação de medicamentos chineses tradicionais e de fitofármacos. São inúmeras as plantas que podem ser utilizadas como medicamentos. É bem conhecido que muitos inibidores de proteína extraídos a partir de materiais de plantas são utilizados em terapia anti-cancro. Entre estes inibidores de proteína com potencial anti-cancro, constata-se que alcaloides esteróides a partir de uma planta do género Solanum são um fármaco anti-cancro potencial. É conhecido que Solanum incanum L. (também conhecido como Solanum incanum Ruiz. & Pav., Solanum coagulans Forsskal em latim, e bitter apple em inglês) contém glicoalcalóides esteróides (Kuo, K.W., et al. (2000), Biochemical Pharmacology, 60 (12): 1865-73). Adicionalmente, é noticiado que muitas plantas do género Solanum contêm glicoalcalóides esteróides, incluindo, por exemplo, Solanum 4 ΕΡ 1 508 334/ΡΤ indicum, Solanum nigrum, também conhecido como Long Kui em chinês e black nightshade em inglês (Hu, K., et al. (1999), Planta Medica, 65 (1): 35-8), Solanum capsicastrum (conhecido como false Jerusalem cherry em inglês), Solanum xanthocarpum, Solanum melongena (Blankemeyer, J.T., et al. (1998), Food & Chemical Toxicology, 36 (5): 383-9), Solanum coagulans, Solanum tuberosum (Friedman, M., et al. (1996), Journal of Nutrition, 126 (4): 989-99), Solanum sodomeum (conhecido na Austrália como apple of Sodom) , Solanum turburosum, Solanum aculeastrum (Wanyonyi, A.W., et al. (2002), Phytochemistry, 59 (1): 79-84), Solanum lycocarpum (Peters, V.M., et al. (2001), Contraception, 63 (1):53-5), Solanum khasianum (Putalun, W., et al. (2000), Biological & Pharmaceutical Bulletin, 23 (1): 72-5), Solanum suaveolens (Ripperger, H., et al. (1997), Phytochemistry, 46 (7): 1279-82), Solanum uporo (Ripperger, H., et al. (1997), Phytochemistry, 44, (4): 731-4), Solanum abutiloides (Tian, R.H., et al. (1997), Phytochemistry, 44 (4): 723-6), Solanum coccineum (Lorey, S., et al. (1996), Phytochemistry, 41 (6): 1633-5), Solanum unguiculatum (Sarg, T.M., et al. (1995), Pharmacy World & Science, 17 (6): 191-4), Solanum robustum (Ripperger, H. (1995), Phytochemistry 39 (6): 1475-7), Solanum anguivi (Ripperger, H., et al. (1994), Phytochemistry, 37 (6): 1725-7), Solanum platanifolium (Puri, R., et al. (1994), Journal of Natural Products 57 (5): 587-96), Solanum mammosum (Alzerreca, A., et al. (1982), Toxicology Letters, 12 (2-3): 151-5), etc.

Até ao presente, alcaloides esteróides que podem ser obtidos a partir das plantas supracitadas do género Solanum compreendem, por exemplo, solamargina, solasonina, casianina e solasodina (Chataing, B., et al. (1998), Planta Medica 64, 31-36 e Weissenberg, M., et al. (1998), Phytochemistry 47, 203-209). As estruturas de solasonina e solamargina são como se segue: 5 ΕΡ 1 508 334/ΡΤ

Adicionalmente, estudos têm mostrado que a solamargina obtida a partir de vários materiais de plantas é capaz de inibir o crescimento dos organismos seguintes: parasitas, tais como Trypanosoma cruzi; insectos, tais como Tribolium castaneum (conhecido como gorgulho vermelho da farinha), Manduca sexta (conhecida como bicho do tabaco); bolores, tais como Phoma medicaginis e Rhizoctomia solani; e moluscos, tais como Lymnaea cubensis e Biomphalaria glabrata (Chataing, B., et al. (1998), Planta Medica, 64, 31-36; Fewell, A.M., et al. (1994), Phytochemistry, 37, 1007-1011;

Lin, C.N., et al. (1990), J. Nat. Prod., 53, 513-516).

Adicionalmente, Chun-Nan Lin et al. noticiaram que se pode obter solamargina a partir do fruto de Solanum incanum, e a sua estrutura pertence à dos glicósidos alcaloides esteróides. Constatou-se que o composto protege o fígado de danos induzidos por CCI4, e inibe o crescimento de células JTC-26 e de hepatoma humano PLC/PRF/5 (Lin, C. N. et al. (1986), J. Natural Prod., 53, 513-516).

Shu-Hui Hsu et al. estudaram o mecanismo de citotoxicidade de solamargina e constataram que a solamargina aumenta a morte de células, tais como células 6 ΕΡ 1 508 334/ΡΤ

Hep3B e fibroblásticas de pele normal, por um percurso de apoptose. Particularmente, constatou-se que a expressão génica de receptor I de TNF envolvido no processo de apoptose celular era sobre-regulada por solamargina (Hsu, S. H. et al. (1996), Biochem. Biophys. Res. Comm., 229, 1-5).

Katsuya Fukuhara e Isao Kubohas, em Phytochemistry, 30 (2): 685-687, 1991, noticiaram que frutos maduros de Solanum incanum foram extraídos com metanol à temperatura ambiente. Depois, removeu-se o solvente sob pressão reduzida, e liofilizou-se o resíduo para dar um extracto castanho-escuro. Em seguida, suspendeu-se o extracto em água contendo metanol (1%). Após remoção da porção insolúvel em água, extraiu-se a suspensão com n-hexano, clorofórmio, acetato de etilo e água, e obteve-se uma fase aquosa com bioactividade. Subsequentemente, submeteu-se a fase aquosa com bioactividade assim obtida a cromatografia contracorrente de rotação locular e cromatografia contracorrente de gotículas tal que se obtiveram os dois compostos principais, solamargina e solasonina.

Foi revelado por Ke Hu et al. (1999) em Planta Medica 65, 35-38, que uma erva inteira seca de Solanum nigrum foi levada ao refluxo com EtOH a 75%. Removeu-se o solvente in vacuo para obter um resíduo castanho, que foi desengordurado com éter de petróleo para dar um extracto. Suspendeu-se o extracto resultante em água e submeteu-se a cromatografia numa coluna de macro-resina. Existe um composto activo presente no eluente de EtOH a 60%. Repartiu-se depois o eluente de EtOH a 60% em H20 e extraiu-se com n-BuOH, e submeteu-se o extracto de n-BuOH assim obtido a cromatografia de coluna em sílica gel utilizando CHCl3-MeOH-H20 como eluente e em Sephadex LH-20 utilizando Me0H-H20 (60:40) como eluente, produzindo p2-solamargina, solamargina e desgalactotigonina. No entanto, este artigo não ensinou como se pode obter um extracto bioactivo solúvel em água a partir de Solanum nigrum.

Em EP 0020029 Al divulgou-se que se extraiu um material de planta de Solanum sodomeum, conhecido na Austrália como apple of Sodom, com uma solução ácida diluída, tal como ácido acético a 2% ou 3%, para obter um primeiro extracto ácido (porção sobrenadante), e depois extraiu-se o resíduo sólido com outro volume da solução ácida diluída após, se 7 ΕΡ 1 508 334/ΡΤ separar do primeiro extracto ácido, de modo a produzir um segundo extracto ácido (porção sobrenadante). Após combinar

0 primeiro e o segundo extractos ácidos, adicionou-se uma base para obter um precipitado. Dissolveu-se o precipitado em etanol ebuliente. Após remoção de etanol, obteve-se um extracto em pó fino (referido como BEC 001). O extracto BEC 001 foi ainda separado e purificado para produzir vários glicoalcalóides, incluindo solamargina, solasonina e mono- e di-glicósidos de soladodina.

Embora em EP 0020029 AI se mencionasse que se podia utilizar H20 como transportador para extracto de BEC 001, nos exemplos de trabalho da referida patente, o extracto foi essencialmente formulado com solução de dimetilsulfóxido (DMSO), parafina, pomada de zinco, creme de zinco e cetomacrogol (um tensioactivo).

Adicionalmente, de acordo com US 5958770, glicósidos de solasodina, utilizados na experiência citotóxica in vitro, foram primeiro dissolvidos em DMSO e depois diluídos para dar uma solução em DMSO a 5%. Adicionalmente, os glicósidos de solasodina utilizados na experiência estavam quer na forma de uma mistura (referida como BEC) incluindo solamargina (33%) , solasonina (33%) e di- e mono-glicósido (34%), quer na forma de um componente separado (solamargina, solasonina, uma mistura de di- e mono-glicósido, e as agliconas de solasodina).

Uma vez que os alcaloides esteróides supracitados são insolúveis em água, a destilação com álcool é um método de extracção comum utilizado nas patentes ou nas referências da literatura supracitadas, e as porções extraídas são usualmente dissolvidas num solvente orgânico, i.e. DMSO, para análise. Porque os materiais insolúveis em água não são adequados para injecção directa em corpos animais e podem não ser absorvíveis pelo tracto digestivo durante a administração oral, os efeitos terapêuticos de alcaloides esteróides podem não ser atingidos, limitando por isso a aplicação farmacêutica e o desenvolvimento de alcaloides esteróides. A Requerente constatou que os pós secos de solamargina e/ou solasonina não se podiam de todo dissolver em água sem serem pré-tratados com DMSO, e podem não se dissolver 8 ΕΡ 1 508 334/ΡΤ completamente em água mesmo após serem tratados com DMSO. Especificamente, alcaloides esteróides extraídos utilizando o método revelado em EP 0020029 AI não se podiam dissolver em água destilada. Ainda que solamargina ou solasonina se possam dissolver em água após serem primeiro dissolvidas em DMSO, estas precipitarão se a sua concentração for demasiado elevada (mais de 5 mg/ml) . Adicionalmente, DMSO (>1%) per se tem uma forte citotoxicidade para células, e assim, a sua concentração deverá ser controlada para ser inferior a 5%. Estes factos indicam claramente que a utilização do solvente orgânico DMSO, para dissolver alcaloides esteróides extraídos a partir de uma planta do género Solanum, tem limitações.

Em face ao anterior, no presente, alcaloides esteróides são produzidos principalmente por fabricantes de produtos químicos numa base limitada e de pequena escala, e em lotes individuais, e não existe um processo eficiente para extracção de alcaloides esteróides solúveis em água a partir de uma planta do género Solanum, em grande escala, para utilização comercial. Como tal, a aplicação de alcaloides esteróides no fabrico de medicamentos e fármacos está limitada.

Por conseguinte, no primeiro aspecto, de modo a produzir alcaloides esteróides solúveis em água a partir de uma planta do género Solanum em grande escala, este invento proporciona um extracto solúvel em água a partir de uma planta do género Solanum, compreendendo pelo menos 60%, tal como 60%-90% de solamargina e solasonina, e pode ser dissolvido directamente em água pura ou água com um valor de pH neutro sem adição de qualquer outro solvente e/ou adjuvante de solvente, de modo a formar uma solução aquosa amarelada clara e transparente possuindo uma solubilidade em água na gama de 2 a 20 mg/ml ou superior.

No segundo aspecto, este invento proporciona uma composição farmacêutica compreendendo o extracto solúvel em água como um ingrediente activo para inibição do crescimento de células de tumor/cancro, especialmente células de cancro do fígado, células de cancro do pulmão e células de cancro da mama.

No terceiro aspecto, este invento proporciona um processo para preparação de um extracto solúvel em água a 9 ΕΡ 1 508 334/ΡΤ partir de uma planta do género Solanum, compreendendo os passos de: (a) sujeição de um material a partir de uma planta do género Solanum a um tratamento de extracção utilizando uma solução aquosa ácida com um valor de pH de 3~5, de modo a obter uma solução aquosa; (b) ajustamento do valor de pH da solução aquosa obtida no passo (a) a pH 8~10 com uma base, de modo a formar um precipitado; (c) lavagem do precipitado formado no passo (b) com água, seguida por secagem, de modo a obter um produto seco; (d) mistura do produto seco obtido no passo (c) com clorofórmio, seguida por adição de uma quantidade adequada de um álcool a 100%, de modo a formar uma mistura de clorofórmio-álcool; (e) mistura da mistura de clorofórmio-álcool formada no passo (d) com uma solução de água/álcool possuindo uma razão água:álcool predeterminada, de modo a obter uma mistura contendo uma fase baseada em clorofórmio e uma fase não baseada em clorofórmio; (f) remoção da fase baseada em clorofórmio da mistura obtida no passo (e) , seguida por adição de uma quantidade adequada de água; e (g) obtenção de um sobrenadante a partir da mistura resultante do passo (f), seguida por secagem do sobrenadante, onde o produto seco resultante pode ser dissolvido directamente em água para formar uma solução aquosa amarelada clara e transparente.

Os objectivos, particularidades e vantagens anteriores, e outros, do presente invento tornar-se-ão evidentes por referência à descrição detalhada seguinte e às concretizações preferidas consideradas em conjunto com os desenhos apensos, nos quais: a Fig. IA mostra o espectro de HPLC do extracto solúvel em água (25 pg) obtido a partir de Solanum incanum L.; a Fig. 1B mostra o espectro de HPLC do extracto solúvel em água (25 pg) obtido a partir de Solanum incanum L. em combinação com solasonina (5 pg); 10 ΕΡ 1 508 334/ΡΤ a Fig. 1C mostra o espectro de HPLC do extracto solúvel em água (25 pg) obtido a partir de Solanum incanum L. em combinação com solamargina (5 pg); a Fig. 2A mostra o espectro de HPLC do extracto solúvel em água (25 pg) obtido a partir de Solanum nigrum; a Fig. 2B mostra o espectro de HPLC do extracto solúvel em água (25 pg) obtido a partir de Solanum nigrum em combinação com solasonina (5 pg) ; a Fig. 2C mostra o espectro de HPLC do extracto solúvel em água (25 pg) obtido a partir de Solanum nigrum em combinação com solamargina (5 pg); as Figs. 3A-3F são espectros de HPLC do extracto solúvel em água obtido a partir de Solanum incanum L. com várias concentrações; a Fig. 4 é um gráfico mostrando os padrões quantitativos dos principais componentes no extracto solúvel em água de Solanum incanum L. estimados a partir dos espectros de HPLC das Figs. 3A-3F; as Figs. 5A-5F são espectros de HPLC do extracto solúvel em água obtido a partir de Solanum incanum L. a vários valores de pH; a Fig. 6 mostra os resultados comparativos no tamanho de partícula dos extractos solúveis em água obtidos a partir de Solanum incanum L. de acordo com o presente invento e segundo o método de EP 0020029 AI respectivamente; as Figs. 7A e 7B são espectros de HPLC dos extractos solúveis em água obtidos a partir de Solanum incanum L. de acordo com o presente invento e segundo o método de EP 0020029 Al, onde se dissolvem em água 50 pg dos extractos solúveis em água obtidos segundo os dois métodos, seguindo-se análise por HPLC; as Figs. 8A-8C são gráficos mostrando o efeito inibidor de dosagens em série do extracto solúvel em água obtido a partir de Solanum incanum L. de acordo com o presente invento no crescimento de células de cancro do fígado, cancro do pulmão e cancro da mama de humano; 11 ΕΡ 1 508 334/ΡΤ a Fig. 9 é um conjunto de gráficos apresentando os resultados de autorradiografia num "gene chip", que mostram o efeito do extracto solúvel em água obtido a partir de Solanum incanum L. de acordo com o presente invento na regulação génica de células de cancro do pulmão, em que se isolaram amostras de ARN a partir das células de cancro do pulmão tratadas com o extracto solúvel em água (100 pg/ml) obtido a partir de Solanum incanum L. durante 2 h, e submeteram-se a transcrição reversa utilizando [32P]-dCTP para produzir ADNc marcado, e hibridiza-se o ADNc marcado assim obtido com fragmentos de ADN no "gene chip array", seguindo-se autorradiografia para película de raios X; a Fig. 10 é um conjunto de fotografias ilustrando alterações morfológicas de células de cancro do fígado (Linha A) , células de cancro do pulmão (Linha B) e células de cancro da mama (Linha C) tratadas com o extracto solúvel em água obtido a partir de Solanum incanum L. de acordo com o presente invento; as Figs. 11A, 11B e 11C são gráficos mostrando alterações no tamanho dos tumores em ratinhos nus aos quais não foi administrado o extracto solúvel em água obtido a partir de Solanum incanum L. de acordo com este invento, aos quais foi administrado oralmente o extracto e aos quais foi administrado intraperitonealmente o extracto, em que cada curva representa a alteração em tamanho do tumor em um ratinho nu; e a Fig. 12 é um gráfico mostrando o efeito inibidor de solasonina e solamargina obtidas a partir de Solanum incanum L. de acordo com o presente invento no crescimento de células de cancro do pulmão de humano.

Este invento proporciona um extracto solúvel em água obtido a partir de uma planta do género Solanum compreendendo alcaloides esteróides que se pode dissolver directamente em água para formar uma solução aquosa clara e transparente, e assim é adequada para o fabrico de medicamentos e fármacos.

Em particular, este invento proporciona um extracto solúvel em água obtido a partir de uma planta do género 12 ΕΡ 1 508 334/ΡΤ

Solanum, que compreende pelo menos 60%, tal como 60% — 90% de solamargina e solasonina, e que pode ser dissolvido directamente em água pura ou água com um valor de pH neutro sem adição de qualquer outro solvente e/ou adjuvante de solvente, de modo a formar uma solução aquosa amarelada clara e transparente possuindo uma solubilidade em água na gama de 2 a 20 mg/ml ou superior.

Este invento proporciona um processo para preparação de um extracto solúvel em água, que compreende os passos de: (a) sujeição de um material de planta de uma planta do género Solanum a um tratamento de extracção utilizando uma solução aquosa ácida com um valor de pH de 3~5, de modo a obter uma solução aquosa; (b) ajustamento do valor de pH da solução aquosa obtida no passo (a) a pH 8~10 com uma base, de modo a formar um precipitado; (c) lavagem do precipitado formado no passo (b) com água, seguida por secagem, de modo a obter um produto seco; (d) mistura do produto seco obtido no passo (c) com clorofórmio, seguida por adição de uma quantidade adequada de a álcool a 100%, de modo a formar uma mistura de clorofórmio-álcool; (e) mistura da mistura de clorofórmio-álcool formada no passo (d) com uma solução de água/álcool possuindo uma razão água:álcool predeterminada, de modo a obter uma mistura contendo uma fase baseada em clorofórmio e uma fase não baseada em clorofórmio; (f) remoção da fase baseada em clorofórmio da mistura obtida no passo (e) , seguida por adição de uma quantidade adequada de água; e (g) obtenção de um sobrenadante a partir da mistura resultante do passo (f), seguida por secagem do sobrenadante, onde o produto seco resultante pode ser dissolvido directamente em água para formar uma solução aquosa amarelada clara e transparente.

Preferivelmente, no passo (a) , o material de planta da planta do género Solanum foi picado num tratamento preliminar.

Preferivelmente, no passo (a) , o material de planta é pelo menos um do fruto, raiz, caule e folha da planta do género Solanum. Numa concretização preferida deste invento, 13 ΕΡ 1 508 334/ΡΤ ο material de planta usado no passo (a) é o fruto da planta do género Solanum. Numa concretização adicional preferida deste invento, o material de planta utilizado no passo (a) é a planta inteira da planta do género Solanum.

Preferivelmente, o extracto solúvel em água é obtido a partir de uma planta do género Solanum que é Solanum incanum L., Solanum indicum, Solanum nigrum, Solanum capsicastrum, Solanum xanthocarpum, Solanum melongena, Solanum coagulans, Solanum tunigrum, Solanum sodomeum, Solanum turburosum, Solanum aculeastrum, Solanum lycocarpum, Solanum khasianum, Solanum suaveolens, Solanum uporo, Solanum abutlloides, Solanum coccineum, Solanum ungulculatum, Solanum robustum, Solanum anguivl, Solanum platanlfollum ou Solanum mammosum ou uma sua combinação.

Numa concretização preferida deste invento, o extracto solúvel em água é obtido a partir de Solanum Incanum L.. Numa concretização adicional preferida deste invento, o extracto solúvel em água é obtido a partir de Solanum nigrum.

Preferivelmente, no passo (a) do processo, a solução aquosa é obtida por realização de centrifugação ou filtração subsequente ao tratamento de extracção.

Preferivelmente, no passo (a) , a solução aquosa ácida utilizada no tratamento de extracção é uma solução aquosa contendo ácido fórmico, ácido acético ou ácido clorídrico.

Preferivelmente, no passo (b) , a base é preferivelmente uma solução aquosa alcalina contendo um hidróxido de metal alcalino ou hidróxido de amónio. Numa concretização preferida deste invento, a solução aquosa alcalina contém hidróxido de amónio. Noutra concretização preferida deste invento, a solução aquosa alcalina contém hidróxido de sódio.

Preferivelmente, no passo (b) do processo, o precipitado é obtido por realização de centrifugação ou filtração subsequente ao ajustamento do valor de pH.

Preferivelmente, no passo (c) do processo, o tratamento de secagem é seleccionado entre o grupo consistindo de 14 ΕΡ 1 508 334/ΡΤ liofilização, secagem por pulverização, evaporação, secagem por calor e uma sua combinação. Numa concretização preferida deste invento, o tratamento de secagem é realizado por liofilização, que é utilizada para melhorar a estabilidade e actividade do ingrediente activo por tratamento a baixa temperatura.

Preferivelmente, no passo (c) do processo, o precipitado formado no passo (b) é lavado com água, centrifugado para remover a base em excesso e suspenso em água destilada, seguindo-se o tratamento de secagem.

No passo (d) do processo, as quantidades de clorofórmio e álcool não são particularmente críticas, desde que o produto seco obtido a partir do passo (c) se possa aí dissolver. Numa concretização preferida deste invento, a quantidade de álcool não é superior à do clorofórmio utilizado no passo (d).

Preferivelmente, nos passos (d) e (e) do processo, o álcool é seleccionado entre o grupo consistindo de metanol, etanol, propanol, e uma sua combinação. Numa concretização preferida do presente invento, o álcool utilizado nos passos (d) e (e) é metanol.

Preferivelmente, na solução de água/álcool utilizada no passo (e) , o teor em água não é inferior ao teor em álcool. Mais preferivelmente, a razão água para álcool é 1:1.

Preferivelmente, no passo (f) do processo, a fase baseada em clorofórmio na mistura obtida a partir do passo (e) é removida por realização de centrifugação ou filtração.

Preferivelmente, no passo (g) do processo, o sobrenadante é obtido por centrifugação ou filtração da mistura resultante no passo (f).

Preferivelmente, no passo (g) do processo, o tratamento de secagem é seleccionado entre o grupo consistindo de liofilização, secagem por pulverização, evaporação, concentração sob pressão reduzida ou secagem por calor, ou uma combinação de qualquer destes. Numa concretização preferida, o tratamento de secagem realizado no passo (g) compreende concentração sob pressão reduzida e liofilização. 15 ΕΡ 1 508 334/ΡΤ

Se desejado, ο produto seco obtido no passo (g) pode ser de novo dissolvido em água, seguindo-se centrifugação e tratamento de secagem. 0 extracto de acordo com este invento pode ser dissolvido directamente em água potável ou água esterilizada de modo a formar uma solução amarelada clara e transparente. Por conseguinte, o extracto obtido de acordo com este invento é verdadeiramente um extracto solúvel em água. 0 extracto solúvel em água do presente invento é tipicamente obtenível a partir do processo do presente invento como definido acima. Preferivelmente, compreende pelo menos 60% tal como 60%-90% de solamargina e solasonina. Para além disso, a Requerente constatou que certos factores poderão afectar o teor e proporção de solasonina e solamargina no extracto solúvel em água obtido utilizando o processo deste invento. Estes factores incluem a espécie da planta do género Solanum e a parte/partes da planta utilizadas no processo de extracção, bem como os tipos de álcool e base utilizados.

Por exemplo, no extracto solúvel em água produzido a partir do fruto maduro de Solanum incanum L., o teor de solamargina é superior ao de solasonina de acordo com a análise por HPLC. Além disso, comparado com solução básica de NH40H a 33%, no extracto solúvel em água obtido utilizando solução básica de NaOH 10 M como a base no passo (b), o teor em solamargina é inferior ao teor em solasonina.

Adicionalmente, os teores de solasonina e solamargina no extracto solúvel em água obtido utilizando etanol no passo (d) são cerca de 50% do obtido utilizando metanol.

Adicionalmente, o extracto obtido a partir do fruto não maduro (cor verde-escura) de Solanum nigrum tem teores mais elevados de solasonina e solamargina, enquanto o fruto maduro (cor púrpura-escura) e outras partes da planta têm teores mais baixos. Os teores de solasonina e solamargina no extracto a partir de Solanum nigrum são diferentes dos teores no extracto obtido a partir de Solanum incanum L. Deste modo, um perito na especialidade pode preparar um extracto solúvel em água desejado seleccionando uma espécie adequada da planta do género Solanum e utilizando uma parte ou partes adequadas da planta, em conjunto com condições de operação apropriadas. 16 ΕΡ 1 508 334/ΡΤ

Numa concretização preferida deste invento, a solução aquosa utilizada no passo (a) para realizar o tratamento de extracção contém ácido acético, a solução básica utilizada no passo (b) para formar o precipitado contém hidróxido de amónio, e o álcool utilizado nos passos (d) e (e) é metanol.

Preferivelmente, o extracto solúvel em água compreende pelo menos 75% de solamargina e solasonina. A razão de solasonina para solamargina no extracto solúvel em água está preferivelmente numa gama de 0,3:1,0 a 1,0:0,6, e está mais preferivelmente numa gama de 0,4:1,0 a 0,9:1,0. Numa concretização preferida deste invento, a razão de solasonina para solamargina no extracto solúvel em água é cerca de 0,7:1,0.

Preferivelmente, o extracto está numa forma de partículas solúveis em água com um tamanho de nanopartícula. Mais preferivelmente, o extracto está numa forma de partículas solúveis em água com um tamanho de partícula inferior a 1 pm. O extracto solúvel em água de acordo com este invento tem provado ter um efeito inibidor no crescimento de células de tumor/cancro, em particular células de cancro do fígado, células de cancro do pulmão e células de cancro da mama. Para além disso, solasonina e solamargina obtidas a partir do extracto solúvel em água de acordo com o presente invento demonstraram também este efeito inibidor. Por isso, é de esperar que o extracto solúvel em água preparado de acordo com o presente invento, e solasonina e solamargina aí contidas, possam encontrar aplicação na preparação de uma composição anti-tumor ou anti-cancro.

Assim, este invento proporciona também uma composição farmacêutica que compreende um extracto solúvel em água de acordo com este invento, ou solasonina e solamargina obtidas a partir do extracto solúvel em água. Solasonina e solamargina purificadas a partir do extracto solúvel em água podem também ser dissolvidas directamente em água.

Opcionalmente, a composição farmacêutica de acordo com este invento compreende adicionalmente um transportador 17

ΕΡ 1 508 334/PT farmaceuticamente aceitável que é geralmente usado em tecnologia de fabrico de fármacos. O transportador farmaceuticamente aceitável compreende um ou mais reagentes, incluindo, por exemplo, água, solução salina, solução tampão, desintegrante, ligante, excipiente, lubrificante e retardador de absorção. A composição farmacêutica de acordo com este invento pode ser administrada por via parentérica ou oral numa formulação adequada, que inclui solução ou suspensão aquosa esterilizada, pó esterilizado, comprimido, cápsula, creme, pomada, etc. A composição farmacêutica de acordo com este invento é preferivelmente formulada para ser adequada para injecção, tal como injecção aquosa, pó para injecção, produto de liofilização para injecção, etc.

Opcionalmente, a composição farmacêutica deste invento pode ser administrada sozinha ou em combinação com um fármaco anti-tumor/anti-cancro adicional, e.g., mitomicina, adriamicina, actinomicina, cis-platina, etc. A quantidade e o intervalo de dosagem da composição farmacêutica de acordo com este invento estão dependentes dos factores seguintes: gravidade da doença a ser tratada, via de administração e o peso, idade, estado de saúde e resposta do sujeito a ser tratado. Em geral, a composição farmacêutica de acordo com este invento é administrada oralmente ou parentericamente numa dosagem diária 2-6 mg/kg numa forma de dosagem única ou numa forma de múltiplas dosagens separadas. 0 presente invento será ilustrado em detalhe por referência aos exemplos seguintes que são apresentados apenas para ilustração e não se pretende que limitem o âmbito do presente invento.

Exemplo 1. Preparação do extracto solúvel em água

Trituraram-se 500 g de fruto maduro de Solanum incanum L. subsequentemente à adição de 1000 ml de água pura. À mistura aquosa resultante, adicionou-se gota a gota ácido acético a 99,5% para ajustar o valor de pH a 4,0, seguindo-se agitação à temperatura ambiente durante 12 h. Por centrifugação da mistura aquosa, obteve-se um sobrenadante e 18 ΕΡ 1 508 334/ΡΤ adicionou-se a este, gota a gota, solução básica de NH40H a 33% para ajustar o valor de pH do sobrenadante a 9,0, e formou-se um precipitado. Obteve-se o precipitado por realização de centrifugação a 4500 rpm (Beckman Coulter, Avanti J-25, JA-14 Rotor), e removeu-se a solução básica residual ai presente por lavagem do precipitado com água, seguida por centrifugação a 4500 rpm. Suspendeu-se o precipitado assim obtido em água destilada e submeteu-se a liofilização (Virtis, Freezemobile 12ES) para obter 5 g de pó seco. O pó seco foi grandemente suspenso em solução aquosa, e não pode ser dissolvido directamente em água ou apenas pode ser dissolvida uma sua quantidade muito pequena.

Para preparação de um extracto que se pode dissolver directamente em água, dissolveram-se 2 g do pó seco em 50 ml de clorofórmio em grau de reagente, seguindo-se a adição de 40 ml de metanol a 100% e agitação para formar uma suspensão uniforme. Obteve-se um sobrenadante por centrifugação a 4500 rpm ou filtração. Adicionaram-se 70 ml de solução de metanol:água (1:1) ao sobrenadante e misturou-se bem. Centrifugou-se a mistura obtida a 12000 rpm durante 10 min. Tomou-se o sobrenadante resultante, e adicionaram-se a este 120 ml de água destilada e agitou-se bem. Entretanto, o sobrenadante ficou turvo. Centrifugou-se adicionalmente o sobrenadante a 12000 rpm durante 10 min de modo a remover o precipitado. Submeteu-se o sobrenadante resultante a concentração sob pressão reduzida a 55°C para remover o metanol, seguindo-se liofilização para obter pós seco. 0 pó seco obtido nesta etapa pode ser dissolvido directamente em água destilada para formar uma solução amarelada clara e transparente. Se existir ainda algum precipitado, este pode ser removido por centrifugação a 12000 rpm durante 10 min, e o sobrenadante resultante pode ser submetido directamente a liofilização para produzir o pó seco solúvel em água sem realização do passo de concentração sob pressão reduzida.

Em geral, podem-se extrair 800 mg de pó seco solúvel em água a partir de 500 g do fruto de Solanum incanum L.. Por análise de HPLC, observou-se que os principais componentes do pó seco solúvel em água eram solamargina e solasonina, em que o teor de solamargina era superior ao teor de solasonina (ver Exemplo 2 e Fig. IA). 19 ΕΡ 1 508 334/ΡΤ

No processo de preparação acima mencionado, alternativamente, o fruto pode ser imerso em 1000 ml de solução aquosa de ácido acético a 3% ou 5% e picado.

Adicionalmente, em vez de realizar o passo de agitação da mistura aquosa à temperatura ambiente durante 12 h, a mistura aquosa formada pode ser agitada a 50 °C durante 5 h, ou a 80°C durante 2 h. Alternativamente, pode-se utilizar solução aquosa de hidróxido de sódio como um substituto para a solução aquosa de NH40H.

Exemplo 2. Identificação dos componentes do extracto solúvel em água

Utilizou-se cromatografia liquida de alta eficiência (HPLC) para determinar os principais componentes do extracto solúvel em água obtido a partir do processo do presente invento.

Metodologias:

Neste exemplo, a cromatografia liquida de alta eficiência (HPLC) utilizada foi um modelo 1100 da Agilent Technologyies (Waldbronn, Alemanha), com uma coluna de LiChroCART 250-4 Lichropher 100 RP-18e (5 pm) , e um tamanho de 250 mm χ 4 mm; como fase móvel utilizou-se 60% de acetonitrilo/40% água redestilada (pH =2,8); e o caudal foi 1 ml/min. Os espécimes padrão de solasonina e solamargina utilizados nesta experiência foram fornecidos pelo Professor Chun-Nan Lin, Departamento de Farmácia, Universidade Médica de Kaohsiung, e os dois espécimes padrão foram obtidos de acordo com o procedimento de purificação revelado em Gan, K.H., Lin, C.N. e Won, S.J. (1993), Journal of Natural Products 56, 15-21.

Dissolveram-se quantidades adequadas dos extractos solúveis em água, preparados a partir dos frutos de Solanum incanum L. e Solanum nigrum de acordo com o método do Exemplo 1, em água pura e submeteram-se a análise de HPLC de acordo com as condições seguintes: 1. O extracto solúvel em água de Solanum incanum L. (25 pg) , o extracto solúvel em água de Solanum incanum L. (25 pg) em combinação com solasonina (5 pg), e o extracto 20 ΕΡ 1 508 334/ΡΤ solúvel em água de Solanum incanum L. (25 yg) em combinação com solamargina (5 yg) ; 2. O extracto solúvel em água de Solanum nigrum (25 yg), o extracto solúvel em água de Solanum nigrum (25 yg) em combinação com solasonina (10 yg) , e o extracto solúvel em água de Solanum nigrum (25 yg) em combinação com solamargina (10 yg); e 3. Os extractos solúveis em água de Solanum incanum L. em quantidades de 50 yg, 40 yg, 30 yg, 20 yg, 10 yg e 5 yg, respectivamente.

Resultados: A Fig. IA mostra um espectro de HPLC do extracto solúvel em água a partir do fruto de Solanum incanum L.. Em comparação com o tempo de retenção apresentado nas Figs. 1B e 1C, é de notar que o primeiro pico na Fig. IA corresponde a solasonina e o segundo corresponde a solamargina, e que o teor de solamargina é superior ao teor de solasonina.

Por referência às Figs. 2A-2C, os espectros de HPLC mostraram que o extracto solúvel em água a partir do fruto de Solanum nigrum deu também dois picos que correspondem a solasonina e solamargina. Contudo, a diferença entre o extracto solúvel em água a partir do fruto de Solanum nigrum e o de Solanum incanum reside no facto de, no Solanum nigrum, o teor de solasonina ser superior ao teor de solamargina.

Adicionalmente, como se mostra nas Figs. 1A-1C e Figs. 2A-2C, o extracto solúvel em água de acordo com este invento não incluiu solasodina, e era obviamente diferente do extracto revelado na EP 0 020 029 AI.

As Figs. 3A-3F são espectros de HPLC do extracto solúvel em água a partir de Solanum incanum L. nas quantidades de 75 yg, 50 yg, 40 yg, 30 yg, 20 yg e 10 yg, respectivamente. Verificou-se que os valores de pico dos dois componentes principais do extracto solúvel em água de Solanum incanum L. flutuarão proporcionalmente às concentrações do extracto solúvel em água. 21 ΕΡ 1 508 334/ΡΤ

No que se refere à proporção de solasonina e solamargina, esta pode ser estimada por integração automática utilizando um programa de computador (Agilent ChemStation Integrator Algorithm) de acordo com o espectro de eluição de HPLC. Se aparece no espectro um pico de forma aguçada ou arredondada, esta variação pode ser devida a factores de maturidade do fruto e da estação. Com base em 26 experiências repetidas, verificou-se que o extracto solúvel em água de Solanum incanum L. tem uma razão de solasonina para solamargina na gama de cerca de 0,3:1,0 a cerca de 1,0:1,0, e sobretudo na gama de 0,4:1,0 a 0,9:1,0. A partir dos resultados experimentais, a Requerente verificou que o extracto solúvel em água de acordo com este invento consiste essencialmente de pelo menos 60% a 95% (preferivelmente mais de 75%) de solasonina e solamargina. A Requerente verificou também que o teor e a proporção de solasonina e solamargina variaram com a concentração do extracto solúvel em água utilizado na análise de HPLC numa relação linear. A Fig. 4 é um gráfico mostrando curvas de calibração traçadas utilizando regressão linear, em que se submeteram sete concentrações dos extractos solúveis em água de Solanum incanum L. a análise de HPLC em triplicado, e calcularam-se os valores, médias ± DP, a partir do integral da área do pico de HPLC dos dois componentes principais. O resultado apresentado na Fig. 4 mostrou claramente que os valores de pico de solasonina e solamargina subiram e caíram numa relação linear com a concentração do extracto solúvel em água. Deste modo, os dois componentes, solasonina e solamargina, podem ser utilizados como um componente indicador para controlo de qualidade do extracto solúvel em água de acordo com este invento.

Adicionalmente, solamargina e solasonina susceptíveis de serem dissolvidos directamente em água podem ser ainda purificados a partir do extracto solúvel em água deste invento utilizando a condição de HPLC supramencionada. 22 ΕΡ 1 508 334/ΡΤ

Exemplo 3. 0 efeito de pH na eluição do extracto solúvel em água

Metodologias:

De modo a determinar a influência do pH na eluição do extracto solúvel em água, submeteu-se o extracto solúvel em água (40 yg) de Solanum incanum L. preparado utilizando o método do Exemplo 1 a análise de HPLC utilizando o mesmo equipamento utilizado no Exemplo 2 sob a condição de HPLC seguinte: 1. Coluna: LiChroCART 250-4 Lichropher 100 RP-18e (5 ym), 250 mm x 4 mm; e 2. Fase móvel: 60% de acetonitrilo/40% de água redestilada, pH ajustado a 2,3, 2,5, 2,8, 3,0 e 3,2.

Resultados:

As Figs. 5A-5E mostram os espectros de HPLC do extracto solúvel em água a partir de Solanum incanum L. sob diferentes valores de pH. Como se mostra, o tempo de retenção do principal componente do extracto solúvel em água foi retardado pelo aumento no valor de pH da fase móvel.

Embora os perfis de eluição se alterassem ligeiramente, o perfil de pico dos dois componentes era ainda mantido.

Exemplo 4. Comparação em tamanho de partícula do extracto solúvel em água

Este exemplo foi realizado para comparar a diferença em tamanho de partícula entre o extracto solúvel em água a partir de Solanum incanum L. preparado utilizando o método deste invento e o obtido utilizando o método revelado no

Exemplo 2 de EP 0020029 AI.

Metodologias:

Dissolveram-se 50 mg do extracto solúvel em água preparado a partir de Solanum incanum L. de acordo com este invento e 50 mg do extracto preparado a partir de Solanum incanum L. de acordo com o método revelado no Exemplo 2 de EP 0020029 Al, respectivamente, em 50 ml de água destilada, e submeteram-se a uma análise do tamanho de partícula utilizando um analisador de tamanho de partícula (Beckman

Coulter LS 230, Coulter Corporation, Miami, E.U.A.). 23 ΕΡ 1 508 334/ΡΤ

Resultados :

Por referência à Fig. 6, o tamanho médio de partícula do extracto preparado a partir de Solanum incanum L. de acordo com o método revelado no Exemplo 2 de EP 0 020 029 AI era 238,2 pm e a distribuição de tamanho de partícula estava num intervalo de 1,8 pm a 1500 pm, e existia uma grande quantidade de precipitado insolúvel na solução aquosa (ver Fig. 6A) . Pelo contrário, o tamanho médio de partícula do extracto solúvel em água preparado a partir de Solanum incanum L. de acordo com este invento era 0,418 pm e a distribuição de tamanho de partícula estava num intervalo de 0,28 pm a 0,65 pm (ver Fig. 6B) . O extracto de acordo com este invento pode ser completamente dissolvido em água.

Exemplo 5. Comparação em solubilidade do extracto solúvel em água

Esta experiência de exemplo foi realizada para comparar a diferença em solubilidade em água entre o extracto solúvel em água a partir de Solanum incanum L. preparado utilizando o método deste invento e o obtido utilizando o método revelado no Exemplo 2 de EP 0020029 Al.

Metodologias:

Dissolveram-se 5 mg do extracto solúvel em água preparado a partir de Solanum incanum L. de acordo com este invento e 5 mg do extracto preparado a partir de Solanum incanum L. de acordo com o método revelado no Exemplo 2 de EP 0020029 Al, respectivamente, em 2 ml de água destilada, e centrifugaram-se a 12000 rpm para obter um sobrenadante. Tomaram-se 20 pl de sobrenadante e submeteram-se a análise de HPLC de acordo com o procedimento revelado no Exemplo 2 deste invento.

Resultados:

As Figs. 7A e 7B são gráficos que mostram, respectivamente, a solubilidade em água do extracto preparado a partir de Solanum incanum L. de acordo com o método revelado no Exemplo 2 de EP 0020029 Al (Fig. 7A) e do extracto solúvel em água preparado a partir de Solanum incanum L. de acordo com este invento (Fig. 7B) . Como se 24 ΕΡ 1 508 334/ΡΤ mostra, ο extracto solúvel em água preparado a partir de Solanum incanum L. de acordo com este invento tem melhor solubilidade em água. É evidente a partir dos Exemplos anteriores e das Figuras que, em comparação com o extracto preparado utilizando um método convencional, o extracto solúvel em água preparado a partir da planta do género Solanum de acordo com este invento se pode dissolver de facto em água para formar uma solução aquosa clara e transparente. Isto pode ser devido ao facto de o extracto solúvel em água, preparado a partir da planta do género Solanum de acordo com este invento, ter um tamanho de nanopartícula, particularmente, inferior a 1 pm. Deste modo, é de esperar que o extracto solúvel em água preparado a partir de uma planta do género Solanum de acordo com este invento seja adequado para utilização na preparação de um medicamento compreendendo alcaloides esteróides, especialmente um medicamento para tratamento do cancro.

Por conseguinte, de modo a provar a bioactividade do extracto solúvel em água preparado a partir de uma planta do género Solanum de acordo com este invento, testou-se o extracto solúvel em água de Solanum incanum L. preparado no Exemplo 1 deste invento no que se refere ao efeito farmacológico.

Experiência farmacológica 1

Actividade anti-cancro do extracto solúvel em água in vitro

De modo a determinar se o extracto solúvel em água obtido a partir da planta do género Solanum de acordo com este invento tem ou não actividade anti-cancro, utilizaram-se as principais células de cancro de Hep3B, H441 e MCF-7 como alvos analíticos, em que Hep3B e H441 foram compradas na American Type Culture Collection (ATCC, P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108 E.U.A.) e MCF-7 foi comprada na Food Industry Research and Development Institute (331 Shih-Pin Road, Hsinchu, 300 Taiwan R.O.C.).

Metodologias:

Hep3B foi incubada em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), enquanto H441 e MCF-7 foram incubadas em 25 ΕΡ 1 508 334/ΡΤ RPMI-1640, ambos os meios contendo 10% de soro fetal de bovino e 40 mg/L de gentamicina. A citotoxicidade de células de cancro foi determinada utilizando o ensaio de sal de tetrazólio (MTS, Mosmann. T., 1983, Immmunol. Meth.r 65, 55-63), que foi realizado para a determinação colorimétrica da viabilidade celular de acordo com os procedimentos do fabricante (CellTiter 96™ AQ, Promega, Madison, E.U.A.).

Semearam-se as células a lxlO4 células/poço numa placa de 96 poços e incubou-se numa incubadora com 5% de CO2 a 37°C durante pelo menos 16 h. Dissolveu-se o extracto solúvel em água a partir de Solanum incanum L. em água estéril para injecção para dar diferentes concentrações de teste, que foram adicionadas a cada meio de incubação de células de cancro no poço, e deixou-se reagir durante 12 h. Adicionaram-se depois 20 μΐ de MTS a cada poço, e deixou-se a solução reagir durante 3 h. Após a reacção estar completa, determinou-se a absorvância em cada poço a 490 nm utilizando o leitor ELISA 312e, Bio-TEK. Cada valor foi expresso como a média ± DP de três experiências.

Resultados:

As Figs. 8A-8C são gráficos mostrando o efeito do extracto solúvel em água preparado a partir de Solanum incanum L. de acordo com este invento na inibição do crescimento de Hep3B, H441 e MCF-7. Observou-se que o extracto solúvel em água preparado a partir de Solanum incanum L. de acordo com este invento inibiu eficazmente o crescimento destas células de cancro.

Experiência farmacológica 2

Determinação do efeito de extracto solúvel em água preparado a partir de Solanum incanum L. de acordo com este invento no mecanismo de regulação génica em células de cancro do pulmão utilizando "gene chip"

De forma a compreender o efeito do extracto solúvel em água preparado a partir de Solanum incanum L. de acordo com este invento na regulação génica em células de cancro, de modo a marcar o caminho no desenvolvimento e pesquisa no tratamento do cancro e para auxiliar na pesquisa de factores 26 ΕΡ 1 508 334/ΡΤ carcinogénicos e no desenvolvimento de um medicamento anti-cancro eficaz, esta experiência foi realizada para determinar o efeito de regulação do extracto solúvel em água deste invento por tecnologia "gene chip".

Nesta experiência, utilizou-se um "gene chip array" disponível comercialmente (SuperArray Inc., Bethesda, MD, E.U.A.) para determinar o efeito do extracto solúvel em água preparado a partir de Solanum incanum L. de acordo com este invento na regulação génica em células de cancro H441.

Em primeiro lugar, isolaram-se as amostras de ARN a partir de células de cancro tratadas durante 2 h com o extracto solúvel em água (100 pg/ml) preparado a partir de Solanum incanum L. de acordo com este invento e a partir de células de cancro não tratadas com o extracto (grupo de controlo). Geraram-se ADNc marcados por realização de transcrição reversa utilizando [32P]-dCTP, que poderão ser utilizados como sonda para hibridização com fragmentos de ADN no "gene chip array" (SuperArray Inc., Bethesda, MD, E.U.A.). O "gene chip array" reagido foi exposto a película de raios x utilizando autorradiografia.

Resultados:

Por referência à Fig. 9, após H441 ser tratada com o extracto solúvel em água preparado a partir de Solanum incanum L. de acordo com este invento durante duas horas, a expressão génica de receptor de factor de necrose de tumor I (TNFR-I) e de factor 1 associado a receptor de TNF (TRAF-1), positivamente associados com a morte de células de cancro, estava sobre-regulada, enquanto a expressão génica de inibidor de proteína de apoptose 2 (IAP-2) e de inibidor de apoptose 4 (API-4), que inibem a morte celular, estava sub-regulada devido à influência do extracto. Assim, pode-se observar que o extracto solúvel em água preparado a partir de Solanum incanum L. de acordo com este invento é capaz de iniciar a expressão génica de TNFR-I e TRAF-1.

Experiência farmacológica 3

Efeito do extracto solúvel em água preparado a partir de Solanum incanum L. de acordo com este invento no ciclo celular das células de cancro 27 ΕΡ 1 508 334/ΡΤ

Utilizou-se citometria de fluxo ("FACScan"; Becton Dickinson Corp.) para determinar a alteração de ciclo celular de células de cancro antes e após as células serem tratadas com o extracto solúvel em água preparado a partir de Solanum incanum L. de acordo com este invento.

Metodologias:

Primeiramente, após incubação de lxlO6 células de cancro em placa de 35 mm durante 16 h, adicionou-se o extracto solúvel em água (30 pg/ml) preparado a partir de Solanum incanum L. de acordo com este invento a cada placa e deixou-se reagir durante 0, 1, 3, 5 e 8 h. Decorridos os tempos de reacção respectivos, digeriram-se as células com tripsina lx e recolheram-se o sobrenadante e meio. Transferiu-se o sobrenadante contendo células para um tubo de centrifugadora de 15 ml e centrifugou-se a 1000 rpm durante 5 minutos para obter o sedimento. Após adicionar 300 μΐ de PBS lx e misturar bem, transferiram-se 300 μΐ de suspensão de células para um microtubo, e fixaram-se em 700 μΐ de álcool absoluto. Deixaram-se as células fixadas em repouso no frigorífico a 4°C durante pelo menos 30 minutos e centrifugou-se a 4°C, 1200 rpm durante 5 min. Após centrifugação, obteve-se um sobrenadante e misturou-se bem. Adicionaram-se ao sobrenadante 445 μΐ de solução de PBS lx e misturou-se bem, seguindo-se a adição de 5 μΐ de RNase (10 mg/ml) para digerir o ARN. Permearam-se as células com 50 μΐ de Triton-X100 a 10% e incubaram-se numa incubadora a 37°C durante 1 h, seguindo-se centrifugação. Tomou-se um sobrenadante e misturou-se bem com 495 μΐ de solução de PBS. Coraram-se as células com 5 μΐ de iodeto de propídio (5 mg/ml) no escuro a 4°C durante 15-30 min, seguindo-se filtração e análise.

Determinação do ciclo celular:

Suspenderam-se bem as células aderentes ao filtro em solução de PBS lx e introduziram-se num citómetro de fluxo (Beckman-Coulter FACScan) com 100 células/s. Analisaram-se de uma vez 10000 células. Fizeram-se passar as células através de poros com um raio de 75 pm para produzir sinais de impulso de corrente proporcionais ao volume de células. Excitaram-se as células por um feixe laser de iões árgon a 488 nm para emitir fluorescência. Utilizaram-se os dados 28 ΕΡ 1 508 334/ΡΤ obtidos para analisar o teor em ADN em combinação com software Winmdi de modo a determinar o ciclo celular.

Resultados: A Tabela 1 mostra as alterações de ciclo celular de Hep3B, H441 e MCF-7 tratadas com o extracto solúvel em água preparado a partir de Solanum incanum L. de acordo com este invento, em que uma elevação do pico sub-Gl mostrou que as células de cancro estavam a sofrer apoptose induzida pelo extracto solúvel em água.

Como se mostra na Tabela 1, o pico sub-Gl do ciclo celular em células de cancro aumentou drasticamente em 1 h, e aumentou com um aumento no tempo de reacção. As células de cancro morreram de ruptura de membrana celular como resultado de dosagens elevadas do extracto. Foi assim mostrado que extracto solúvel em água preparado a partir de Solanum incanum L. de acordo com este invento pode iniciar o mecanismo de apoptose dos três tipos de células de cancro.

Tabela 1. Efeito do extracto solúvel em água preparado a partir de Solanum incanum L. de acordo com este invento no ciclo celular de Hep3B, H441 e MCF-7

Sub-Gl G0/G1 S G2/M Tempo (h) Células de médía±DP cancro do figado médía±DP % média±DP % média±DP % 0 5,5±0,2 100 58,8±0,3 100 17,4±0,3 100 18,0+0,5 100 1 38,3±0,6 246 31,9±0,9 64 15,1±0,1 87 14,6+0,4 81 3 69,5±0,4 446 15,4±0,3 31 9,9±0,2 57 5,6+0, 2 31 5 90,7±0,7 581 4,3±0,3 9 3,6±0,7 21 1,5+0,2 8 8 Células de 99,1±0,1 cancro do 635 pulmão 0,6±0,1 1 0,3±0,0 2 0,1+0,0 1 0 9,4±0,2 100 43,3±0,3 100 7, 1 + 0,1 100 40,8+0,1 100 1 46,5±1,7 441 23,6±0,4 54 11,8+0,1 168 18,5+1,2 45 3 61,8±0,7 660 13,1±1,4 30 9,8 + 0, 7 139 15,0+0,7 36 5 96,6±0,2 1030 2,3±0, 1 5 0,8 + 0,0 11 0,4 + 0,0 1 8 Células de 9 7,2±0,6 cancro da 1037 mama 1,9±0,4 4 0,4+0,4 6 0,4 + 0,5 1 0 2,9±0,6 100 66,8±12 100 13,1+0,6 100 18,2+0,4 100 1 12,0±0,8 441 71,2±0,4 107 6r 4±0r 6 49 10,7+1,0 59 3 77,1±0,4 2633 18,7±1,0 27 2,4+0,3 18 1,3 + 0,2 7 5 92,0±0,3 3141 6,8±0,3 10 0,8 + 0,0 6 0,4 + 0,0 2 8 97,1±0,4 3313 2,5±0,3 4 0,2 + 0,0 2 0,2 + 0,1 1

Experiência farmacológica 4

Efeito do extracto solúvel em água preparado a partir de Solanum incanum L. de acordo com este invento na morfologia de células de cancro

Para investigar as alterações morfológicas das células de cancro induzidas pelo extracto solúvel em água preparado a partir de Solanum incanum L. de acordo com este invento, as morfologias das células de cancro coradas com 29 ΕΡ 1 508 334/ΡΤ hematoxilina foram inspeccionadas utilizando microscopia óptica.

Metodologias:

Primeiramente, uma quantidade adequada de células de cancro do fígado, células de cancro do pulmão e células de cancro da mama, que foram tratadas com o extracto solúvel em água (30 pg/ml) de Solanum incanum L. de acordo com este invento durante 1, 3, 5 e 8 h, foi centrifugada num Cytospin a 800 rpm durante 10 min para obter lâminas com células. Fixaram-se as células em paraformaldeído a 4% durante 30 min e coraram-se com hematoxilina, seguindo-se remoção do corante em excesso por etanol absoluto a 70%, 80%, 90%, 95% e 100%. Colocaram-se as lâminas com células em xileno para tratamento de desidratação e cobriram-se por uma lamela de cobertura e um meio de montagem. As alterações de morfologia celular foram observadas utilizando microscopia óptica (Olympus CX-40) a 400X e registadas.

Resultados: A Fig. 10 mostra as alterações morfológicas de células de cancro de humano antes e após as células serem tratadas com o extracto solúvel em água (30 pg/ml), preparado a partir de Solanum incanum L. de acordo com este invento, durante 1, 3, 5 e 8 h, em que a linha A refere-se a Hep3B, a linha B refere-se a H441 e a linha C refere-se a MCF-7. Utilizaram-se as células não tratadas com o extracto como um grupo de controlo, e as setas assinalam as alterações morfológicas típicas de células.

Como se mostra na Fig. 10, observaram-se redução dos núcleos, condensação de cromatina e presença de corpos apoptóticos nas células de cancro após estas serem tratadas com o extracto solúvel em água preparado a partir de Solanum incanum L. de acordo com este invento durante 1 hora. Ao mesmo tempo, as alterações morfológicas das células de cancro tornaram-se cada vez mais óbvias com o decorrer do tempo de reacção até as membranas celulares finalmente se romperem.

Uma vez que pico sub-Gl, condensação de cromatina e presença de corpos apoptóticos são características de 30

ΕΡ 1 508 334/PT apoptose, os resultados apresentados neste ensaio e no ensaio farmacológico 3 mostram claramente que o extracto solúvel em água preparado a partir de Solanum incanum L. de acordo com este invento pode iniciar o mecanismo de apoptose em células de cancro para induzir a morte celular.

Experiência farmacológica 5

Efeito anti-cancro do extracto solúvel em água preparado a partir de Solanum incanum L. de acordo com este invento in vi vo

Para confirmar o efeito anti-cancro do extracto solúvel em água a partir de Solanum incanum L. de acordo com este invento in vivo, utilizaram-se ratinhos nus como o modelo animal in vivo.

Metodologias:

Primeiramente, implantaram-se 2xl07 células H441 no flanco posterior dos ratinhos nus, BABL/c-nu-nu (8 semanas de idade, cerca de 20-25 g) por injecção subcutânea. Após o tumor se formar, este começou a crescer (cerca de 10 dias) , os ratinhos nus com tumor foram dispostos aleatoriamente em grupos de 6-7 ratinhos.

Aos ratinhos nus no grupo de injecção administraram-se intraperitonealmente 220 pg de extracto solúvel em água dissolvidos em água utilizando uma agulha de 0,8 mm uma vez ao dia. Continuou-se a injecção durante 3 dias e descontinuou-se durante 4 dias. Pesaram-se os ratinhos de dois em dois dias e mediu-se o tamanho de tumor utilizando um micrómetro. Prosseguiu-se com o curso de tratamento seguinte, e continuou-se a observação durante mais de dois meses. 0 volume de tumor foi calculado como o produto do comprimento χ largura x (altura/2). A cada ratinho nu no grupo de ratinhos de administração oral, administrou-se oralmente o extracto solúvel em água (600 pg) por um alimentador uma vez ao dia. Continuou-se a alimentação durante 5 dias e descontinuou-se durante 2 dias. Registaram-se o peso dos ratinhos nus e o tamanho de tumor do modo anterior. Continuou-se a administração e a observação durante mais de dois meses. 0 volume de tumor foi também calculado do modo anterior. 31 ΕΡ 1 508 334/ΡΤ

Resultados :

As Figs. 11A, 11B e 11C respect ivamente mostram as alterações em tamanho de tumor nos ratinhos nus, em que a Fig. 11A mostra a alteração em tamanho do tumor nos ratinhos do grupo de controlo (6 ratinhos nus) aos quais não foi administrado o extracto solúvel em água obtido a partir de Solanum incanum L. de acordo com este invento; a Fig. 11B mostra a alteração em tamanho de tumor no grupo de administração oral (7 ratinhos nus); e a Fig. 11C mostra a alteração no tamanho de tumor no grupo de injecção (7 ratinhos nus).

Como se mostra nas Figs. 11A, 11B e 11C, verificou-se que o tamanho do tumor nos ratinhos do grupo de controlo, aos quais não se administrou o extracto solúvel em água obtido a partir de Solanum incanum L. de acordo com este invento, aumentou rapidamente, quase seis vezes o tamanho original após 1 mês. No entanto, nos ratinhos nus aos quais se administrou oralmente o extracto solúvel em água obtido a partir de Solanum incanum L. de acordo com este invento, os tumores retrairam-se grandemente ou desapareceram. Ainda que os tumores aumentassem ligeiramente de tamanho nalguns casos, a taxa de crescimento foi bastante mais lenta em comparação com o grupo de controlo. Tal como para os ratinhos nus aos quais se administrou intraperitonealmente o extracto solúvel em água obtido a partir de Solanum incanum L. de acordo com este invento, os tumores em todos os ratinhos retraíram-se ou desapareceram. Os resultados mostram que a administração oral ou intraperitoneal do extracto solúvel em água, obtido a partir de Solanum incanum L. de acordo com este invento, foi eficaz no retardamento do crescimento do tumor implantado em ratinhos nus, reduzindo o seu tamanho, e mesmo eliminando o mesmo, e que o efeito era melhor no grupo de administração intraperitoneal do que no grupo de administração oral.

Experiência farmacológica 6

Efeito anti-cancro de solasonina e solamargina adicionalmente purificadas a partir do extracto solúvel em água de Solanum incanum L. de acordo com este invento in vivo 32 ΕΡ 1 508 334/ΡΤ

Utilizou-se a experiência para estudar a bioactividade de solasonina e solamargina purificadas a partir do extracto solúvel em água de Solanum incanum L. de acordo com este invento utilizando HPLC.

Metodologias:

De acordo com o procedimento de HPLC descrito no Exemplo 2, os dois compostos, solasonina e solamargina, que podem do mesmo modo ser dissolvidos directamente em água, foram adicionalmente separados e purificados a partir do extracto solúvel em água de Solanum incanum L. de acordo com este invento.

Determinou-se a citotoxicidade pelo ensaio de sal de tetrazólio MTS revelado em Ensaio farmacológico 1. Trataram-se células H441 com várias dosagens de solasonina e solamargina, purificadas a partir do extracto solúvel em água de Solanum incanum L. de acordo com este invento, durante 12 h, seguindo-se determinação colorimétrica da viabilidade celular de acordo com o procedimento do fabricante (CellTiter 96™ AQ, Promega, Madison, E.U.A.). Os dados foram expressos como média ± DP a partir de três experiências.

Resultados: A Fig. 12 mostra que o crescimento de células de cancro do pulmão de humano pode ser eficazmente inibido por solasonina e solamargina purificadas a partir do extracto solúvel em água de Solanum incanum L. de acordo com este invento. Como mostrado, solasonina e solamargina purificadas a partir do extracto solúvel em água de Solanum incanum L. de acordo com este invento têm actividades anti-cancro notáveis.

Em resumo, a Requerente obteve com sucesso um extracto solúvel em água a partir de uma planta do género Solanum, estabeleceu condições para análise cientifica durante extracção do extracto solúvel em água e obteve os seus compostos activos tal que é possível o controlo de qualidade eficaz. Para além disso, o extracto solúvel em água de acordo com este invento provou possuir as actividades de inibição do crescimento de células de cancro e de iniciação 33 ΕΡ 1 508 334/ΡΤ 33 ΕΡ 1 508 334/ΡΤ de células de cancro, solúvel em água deste crescimento de células cancro. do mecanismo apoptótico mostram que o extracto potencial na inibição do na detecção de células de

Lisboa, 2010-04-28

Estes factos invento tem de cancro e

Claims (33)

1. ΕΡ 1 508 334/ΡΤ 1/5 REIVINDICAÇÕES 1. Extracto solúvel em água a partir de uma planta do género Solanum que compreende pelo menos 60% de solamargina e solasonina.
2. 2. Extracto solúvel em água de acordo com a reivindicação 1, que é extraído a partir de uma planta do género Solanum que é Solanum incanum L., Solanum indicum, Solanum nlgrum, Solanum capslcastrum, Solanum xanthocarpum, Solanum melongena, Solanum coagulans, Solanum tunigrum, Solanum sodomeum, Solanum turburosum, Solanum aculeastrum, Solanum lycocarpum, Solanum khasianum, Solanum suaveolens, Solanum uporo, Solanum abutiloides, Solanum coccineum, Solanum unguiculatum, Solanum robustum, Solanum anguivi, Solanum platanifolium ou Solanum mammosum ou uma combinação de qualquer destes.
3. 3. Extracto solúvel em água de acordo com a reivindicação 2, que é extraído a partir de Solanum incanum L.
4. 4. Extracto solúvel em água de acordo com a reivindicação 2, que é extraído a partir de Solanum nlgrum.
5. 5. Extracto solúvel em água de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, que está na forma de partículas solúveis em água com um tamanho de partícula inferior a 1 ym.
6. 6. Processo para preparação de um extracto solúvel em água a partir de uma planta do género Solanum, processo que compreende: (a) sujeição de um material a partir de uma planta do género Solanum a um tratamento de extracção utilizando uma solução aquosa ácida com um valor de pH de 3~5, de modo a obter uma solução aquosa; (b) ajustamento do valor de pH da solução aquosa obtida no passo (a) a pH 8~10 com uma base, de modo a formar um precipitado; (c) lavagem do precipitado formado no passo (b) com água, seguida por secagem, de modo a obter um produto seco; (d) mistura do produto seco obtido no passo (c) com clorofórmio, seguida por adição de uma quantidade adequada ΕΡ 1 508 334/ΡΤ 2/5 de um álcool a 100%, de modo a formar uma mistura de clorofórmio-álcool; (e) mistura da mistura de clorofórmio-álcool formada no passo (d) com uma solução de água/álcool possuindo uma razão água:álcool predeterminada, de modo a obter uma mistura contendo uma fase baseada em clorofórmio e uma fase não baseada em clorofórmio; (f) remoção da fase baseada em clorofórmio da mistura obtida no passo (e) , seguida por adição de uma quantidade adequada de água; e (g) obtenção de um sobrenadante a partir da mistura resultante do passo (f), seguida por secagem do sobrenadante, onde o produto seco resultante pode ser dissolvido directamente em água para formar uma solução aquosa.
7. 7. Processo de acordo com a reivindicação 6, em que no passo (a) , o material de planta da referida planta do género Solanum foi cortado num tratamento preliminar.
8. 8. Processo de acordo com a reivindicação 6 ou 7, em que no passo (a), o material de planta é pelo menos um do fruto, raiz, caule ou folha da referida planta do género Solanum.
9. 9. Processo reivindicações 6 a planta é a planta Solanum. de acordo com qualquer uma das 8, em que no passo (a), o material de inteira da referida planta do género
10. 10. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 9, em que no passo (a), o material a partir de uma planta do género Solanum é a partir de Solanum incanum, L., Solanum indicum, Solanum nigrum, Solanum capsicastrum, Solanum xanthocarpum, Solanum melongena, Solanum coagulans, Solanum tunigrum, Solanum sodomeum, Solanum turburosum, Solanum aculeastrum, Solanum lycocarpum, Solanum khasianum, Solanum suaveolens, Solanum uporo, Solanum abutiloides, Solanum coccineum, Solanum unguiculatum, Solanum robustum, Solanum anguivi, Solanum platanifolium ou Solanum mammosum ou uma combinação de qualquer destes. ΕΡ 1 508 334/ΡΤ 3/5
11. 11. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 10, em que no passo (a) a solução aquosa é obtida por realização de centrifugação subsequente ao tratamento de extracção.
12. 12. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 11, em que no passo (a) a solução aquosa ácida no tratamento de extracção é uma solução aquosa contendo ácido fórmico, ácido acético ou ácido clorídrico.
13. 13. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 12, em que no passo (b) a base é uma solução aquosa alcalina contendo um hidróxido de metal alcalino ou hidróxido de amónio.
14. 14. Processo de acordo com a reivindicação 13, em que no passo (b) a base é uma solução aquosa alcalina contendo hidróxido de sódio.
15. 15. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 14, em que no passo (b) o precipitado é obtido por realização de centrifugação subsequente ao ajustamento do valor de pH.
16. 16. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 15, em que no passo (c) o tratamento de secagem é liofilização, secagem por pulverização, evaporação ou secagem por calor ou uma combinação de qualquer destes.
17. 17. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 16, em que no passo (c) o produto seco é obtido por lavagem do precipitado formado no passo (b) com água e suspensão do precipitado lavado em água, seguida por liofilização.
18. 18. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 17, em que nos passos (d) e (e) o álcool é metanol, etanol ou propanol ou uma combinação de qualquer destes.
19. 19. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 18, em que no passo (f) a remoção da fase baseada em clorofórmio é realizada por centrifugação. ΕΡ 1 508 334/ΡΤ 4/5
20. 20. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 19, em que no passo (g) o tratamento de secagem é liofilização, secagem por pulverização, evaporação ou secagem por calor ou uma combinação de qualquer destas.
21. 21. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 20, em que o produto resultante do passo (g) está na forma de partículas solúveis em água com um tamanho de nanopartícuias.
22. 22. Processo de acordo com a reivindicação 21, em que o produto resultante do passo (g) está na forma de partículas solúveis em água com um tamanho de partícula inferior a 1 pm.
23. 23. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 22, em que o produto resultante do passo (g) compreende pelo menos 60% de solasonina e solamargina.
24. 24. Processo de acordo com a reivindicação 23, em que o produto resultante do passo (g) compreende pelo menos 75% de solasonina e solamargina.
25. 25. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 24, em que o produto resultante do passo (g) tem uma razão de solasonina para solamargina na gama de 0,3:1,0 a 1,0:0,6.
26. 26. Processo de acordo com a reivindicação 25, em que o produto resultante do passo (g) tem uma razão de solasonina para solamargina na gama de 0,4:1,0 a 0,9:1,0.
27. 27. Processo de acordo com a reivindicação 25 ou 26, em que o produto resultante do passo (g) tem uma razão de solasonina para solamargina de cerca de 0,7:1,0.
28. 28. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 27, em que o produto resultante do passo (g) tem uma solubilidade em água na gama de 2 a 20 mg/ml ou superior.
29. 29. Extracto solúvel em água obtenível por um processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 28. ΕΡ 1 508 334/ΡΤ 5/5
30. 30. Composição farmacêutica que compreende um extracto solúvel em água de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 ou 29 e, opcionalmente, um transportador ou diluente farmaceuticamente aceitável.
31. 31. Extracto solúvel em água de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 ou 29 para utilização na inibição do crescimento de células de tumor/cancro.
32. 32. Utilização de um extracto solúvel em água de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 ou 29 no fabrico de um medicamento para utilização na inibição do crescimento de células de tumor/cancro.
33. 33. Utilização de acordo com a reivindicação 32 no tratamento de um cancro. Lisboa, 2010-04-28