CN113797204B - 小檗胺在制备治疗阿尔兹海默症药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了小檗胺在制备治疗阿尔兹海默症药物中的应用。本发明具体涉及盐酸小檗胺在阿尔兹海默症治疗中的应用，表明了盐酸小檗胺显著地改善阿尔茨海默症小鼠的病理特征，提高阿尔茨海默症小鼠的学习记忆能力，对阿尔茨海默症具有一定的治疗作用。

Description

小檗胺在制备治疗阿尔兹海默症药物中的应用

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及小檗胺在制备治疗阿尔兹海默症药物中的应用。

背景技术

阿尔茨海默症(Alzheimer’s Disease，AD)，是世界上最常见的痴呆症，影响到全球多达3500万人。在临床上，老年人中更为常见，主要特征是患者表现出不同程度的记忆力和认知能力衰退。目前，我国人口老龄化的问题越来越严重，AD的发生严重威胁着老年人的身心健康。所以，对AD的预防和治疗已经引起了科学界的重视。当前，临床上只有有限的几种药物用于缓解AD的发展。

随着研究的不断深入，AD的发病机制也在逐步明确，针对阿尔茨海默症发生的早期学说已逐渐被证实。主要包括：细胞过度氧化使神经元受到损伤的氧化应激假说；Aβ的大量产生及聚集可导致复杂的病理级联反应，最终导致阿尔茨海默症等神经退行性病变的发生的β淀粉样多肽级联假说；过多的Aβ有可能导致Tau蛋白的过磷酸化，最终导致Tau蛋白与微管结合能力的降低从而引起细胞骨架的不稳定，从而形成神经原纤维缠结，引起神经细胞的损害及死亡的Tau蛋白假说；神经胶质细胞会释放白细胞介素-1β(IL-1β)，白细胞介素-6(IL-6)，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，白细胞介素-8(IL-8)，转化生长因子-β(TGF-β)等炎症因子，这会进一步激活未活化的神经胶质细胞，使炎症反应更加剧烈并损伤神经元，也使Aβ聚集进一步扩大炎症反应的炎症反应假说，神经血管假说以及代谢假说等。基因水平上的突变及其它感染性的病因，血脑屏障受损等都可以导致疾病的发生。

由于此前AD不可治愈，治疗倾向于缓解AD的症状以及减少退行性神经病变和细胞死亡。通过乙酰胆碱酯酶抑制剂来提高大脑中乙酰胆碱的水平。一些治疗目的在于降低大脑功能所受侵害时间。非甾体抗炎药可减少由AD引起的神经炎症反应。抗病毒治疗可能减少主要由疱疹病毒，丙肝病毒等引起的与AD相关的病毒感染。锥体细胞病变，过度活化的小胶质细胞以及小胶质细胞的聚集也是AD的重要病理特征。

小檗胺，结构式如(I)所示，和莲心碱均为双苄基异喹啉类生物碱，是广泛存在于小檗属植物中的一种具有多种药理活性的天然产物。且盐酸小檗胺作为市面上较为成熟的制剂，已在临床上得到了广泛的应用，但是小檗胺用于治疗阿尔兹海默症还未见报道。

发明内容

基于以上发病机制及相关病理特征，本发明的目的是初步探讨盐酸小檗胺是否与莲心碱一样能够抑制钙蛋白酶的表达，从而提高硒蛋白SelK的表达，发挥一定的抗阿尔茨海默症的作用，以便为AD的药物治疗和预防提供新的理论依据，造福更多的AD患者。

本发明提供小檗胺在制备治疗阿尔兹海默症药物中的应用。

进一步的，本发明提供小檗胺在制备减少阿尔兹海默症患者脑海马组织中Aβ斑块形成的药物中的应用。

进一步的，本发明提供小檗胺在制备减少阿尔兹海默症患者脑海马组织中神经元纤维缠结形成的药物中的应用。

进一步的，本发明提供小檗胺在制备减少阿尔兹海默症患者神经细胞病变药物中的应用。

进一步的，本发明提供小檗胺在制备抑制阿尔兹海默症患者脑组织中钙蛋白酶表达药物中的应用。

进一步的，本发明提供小檗胺在制备促进阿尔兹海默症患者脑组织中硒蛋白K的表达药物中的应用。

本发明的有益效果是：小檗胺作为上市药物，属于叔胺碱，呈弱碱性，肠道吸收好，具有安全性高，毒副作用低的优点，且已形成良好的稳定剂型。本发明通过灌胃给药方式，给予对脑定位注射三氯化铝AD小鼠、腹腔注射D-半乳糖和灌胃三氯化铝AD小鼠、APP/PS1双转基因AD小鼠三种AD模型小鼠进行盐酸小檗胺灌胃40天，对各组小鼠学习记忆能力、Aβ斑块的形成、神经元纤维缠结的形成、神经细胞病变等生理生化指标进行测定，取部分脑组织制作石蜡组织切片并通过免疫组织化学染色、甘氨酸镀银染色以及苏木精-伊红染色进行组织变化研究，通过Western blot研究了盐酸小檗胺对三种阿尔茨海默病模型小鼠中calpain及SelK表达的影响。研究表明小檗胺能够显著降低或提升阿尔兹海默症的相关病理指标。本发明为小檗胺提供了一种新的药用用途，缩短了在治疗阿尔兹海默症新药研发的时间，节省了相关新药研发的经费。

附图说明

图1-1是构建脑定位注射三氯化铝AD小鼠模型。

图1-2是盐酸小檗胺给药对脑定位注射三氯化铝AD小鼠模型小鼠逃避潜伏期的影响。

图1-3是盐酸小檗胺给药对脑定位注射三氯化铝AD小鼠模型小鼠站台周围时间的影响。

图1-4是盐酸小檗胺给药对脑定位注射三氯化铝AD小鼠模型小鼠穿越站台次数的影响。

图1-5是盐酸小檗胺给药对脑定位注射三氯化铝AD小鼠模型小鼠Aβ斑块形成的影响(免疫组织化学染色结果，200×)。

图1-6是盐酸小檗胺给药对脑定位注射三氯化铝AD小鼠模型小鼠海马锥体细胞的影响(HE染色结果，400×)。

图1-7是盐酸小檗胺给药对脑定位注射三氯化铝AD小鼠模型小鼠神经纤维缠结形成的影响(甘氨酸镀银染色结果，400×)。

图1-8是盐酸小檗胺给药对脑定位注射三氯化铝AD小鼠模型小鼠脑内Calpain蛋白表达的影响；

其中，a:为Calpain蛋白的电泳图，b:为Calpain蛋白表达量的柱状图。

图1-9是盐酸小檗胺给药对脑定位注射三氯化铝AD小鼠模型小鼠脑内SelK蛋白表达的影响；

其中，a:为SelK蛋白电泳图，b:为SelK蛋白表达量的柱状图。

图2-1是盐酸小檗胺给药对腹腔注射D-半乳糖和灌胃三氯化铝AD小鼠模型小鼠逃避潜伏期的影响。

图2-2是盐酸小檗胺给药对腹腔注射D-半乳糖和灌胃三氯化铝AD小鼠模型小鼠站台周围时间的影响。

图2-3是盐酸小檗胺给药对腹腔注射D-半乳糖和灌胃三氯化铝AD小鼠模型小鼠穿越站台次数影响。

图2-4是盐酸小檗胺给药对腹腔注射D-半乳糖和灌胃三氯化铝AD小鼠模型小鼠Aβ斑块形成的影响(免疫组织化学染色结果，200×)。

图2-5是盐酸小檗胺给药对腹腔注射D-半乳糖和灌胃三氯化铝AD小鼠模型小鼠海马锥体细胞的影响(HE染色结果，400×)。

图2-6是盐酸小檗胺给药对腹腔注射D-半乳糖和灌胃三氯化铝AD小鼠模型小鼠神经纤维缠结形成的影响(甘氨酸镀银染色结果，400×)。

图2-7是盐酸小檗胺给药对腹腔注射D-半乳糖和灌胃三氯化铝AD小鼠模型小鼠脑内Calpain蛋白表达的影响；

其中，a:为Calpain蛋白的电泳图，b:为Calpain蛋白表达量的柱状图。。

图2-8是盐酸小檗胺给药对腹腔注射D-半乳糖和灌胃三氯化铝AD小鼠模型小鼠脑内SelK蛋白表达的影响；

其中，a:为SelK蛋白的电泳图，b:为SelK蛋白表达量的柱状图。。

图3-1是盐酸小檗胺给药对APP/PS1双转基因AD小鼠模型小鼠逃避潜伏期的影响。

图3-2是盐酸小檗胺给药对APP/PS1双转基因AD小鼠模型小鼠站台周围时间的影响。

图3-3是盐酸小檗胺给药对APP/PS1双转基因AD小鼠模型小鼠穿越站台次数的影响。

图3-4是盐酸小檗胺给药对APP/PS1双转基因AD小鼠模型小鼠Aβ斑块形成的影响(免疫组织化学染色结果，200×)。

图3-5是盐酸小檗胺给药对APP/PS1双转基因AD小鼠模型小鼠海马锥体细胞的影响(HE染色结果，400×)。

图3-6是盐酸小檗胺给药对APP/PS1双转基因AD小鼠模型小鼠神经纤维缠结形成的影响(甘氨酸镀银染色结果，400×)。

图3-7是盐酸小檗胺给药对APP/PS1双转基因AD小鼠模型小鼠脑内Calpain蛋白表达的影响；

其中，a:为Calpain蛋白的电泳图，b:为Calpain蛋白表达量的柱状图。

图3-8盐酸小檗胺给药对APP/PS1双转基因AD小鼠模型小鼠脑内SelK蛋白表达的影响；

其中，a:为SelK蛋白的电泳图，b:为SelK蛋白表达量的柱状图。

具体实施方式

为了进一步阐明本发明，下面给出一系列实施例，这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

实施例小檗胺在制备治疗阿尔兹海默症药物中的应用

方法：将合格小鼠随机分为脑定位注射三氯化铝AD小鼠模型组、腹腔注射D-半乳糖和灌胃三氯化铝AD小鼠模型组、APP/PS1双转基因AD小鼠模型组、对照组、假手术组(假手术组是针对脑定位注射组进行对照，只进行同样的划开头皮的操作，不进行定位注射)和盐酸小檗胺给药组。给药组给予盐酸小檗胺灌胃40天，40天后通过水迷宫实验探究盐酸小檗胺是否能够对模型小鼠的学习以及记忆能力起到一定的改善作用。同时通过对小鼠的脑组织石蜡切片进行免疫组织化学染色、甘氨酸镀银染色以及苏木精-伊红染色(HE染色)等实验研究了盐酸小檗胺对阿尔茨海默症模型小鼠脑海马组织中Aβ斑块的形成、神经元纤维缠结的形成和神经细胞病变等方面的影响。并通过western blot研究了盐酸小檗胺对3种阿尔茨海默症模型小鼠中calpain及SelK表达的影响。

(一)盐酸小檗胺对脑定位注射三氯化铝AD小鼠的治疗作用研究

阿尔兹海默症小鼠模型的建立：如图1-1，将小鼠麻醉后去除头部毛发，剪开头皮并划开薄膜，至颅骨完整露。将小鼠放在脑定位仪的架子上固定，将进样针装入浓度为2.5％的三氯化铝水溶液。将小鼠前颅作为坐标原点，前颅后3.25mm，旁开2.62mm，颅骨以下3mm作为坐标点，用牙科钻将坐标点处颅骨钻开小孔后，用微量注射泵以1μL/min的速度缓慢注射3μL，注射过程中脑部位置无三氯化铝水溶液渗出。

由图1-2可以看出，小鼠经过四天的水迷宫(逃避潜伏期训练)实验，对照组和假手术组小鼠的逃避潜伏期明显降低，而脑定位注射三氯化铝AD小鼠模型组的小鼠逃避潜伏期基本不变，从训练第二天开始模型组与假手术组逃避潜伏期的差距明显增大。而盐酸小檗胺给药组小鼠的逃避潜伏期与模型组相比明显缩短，接近于对照组和假手术组，第三天至第四天最为明显。说明经过盐酸小檗胺40天的给药后，小鼠的空间记忆能力明显改善。

由图1-3可以看出，在训练后第五天时，脑定位注射三氯化铝AD小鼠模型组小鼠站台周围活动时间明显低于对照组和假手术组，而盐酸小檗胺给药后的小鼠站台周围活动时间明显增加。由图1-4可以看出，在训练后第五天时，脑定位注射三氯化铝AD小鼠模型组的小鼠穿越站台次数明显低于对照组和假手术组，而盐酸小檗胺给药组小鼠穿越站台次数明显增加。说明盐酸小檗胺给药后小鼠学习记忆能力明显增强。

由图1-5可以看出，Aβ免疫组织化学染色结果表明，对照组、假手术组和给药组各组小鼠的海马组织均未见明显的Aβ斑块沉积，而模型组小鼠的海马组织中出现了Aβ斑块，说明盐酸小檗胺可以抑制AD小鼠脑海马组织产生Aβ斑块。

由图1-6可以看出，对照组和假手术组小鼠的海马锥体细胞形态完整，排列整齐密集，细胞核大而圆，核质明显，细胞分界清楚，未见明显异常。而模型组小鼠的海马锥体细胞外形不规则，核质深染分界模糊，呈现明显的病理特征。给药组小鼠的海马锥体细胞，细胞状态良好，形态规则，细胞核大而圆，胞质分界清晰。说明盐酸小檗胺在一定程度上保护海马锥体神经细胞。

由图1-7可以看出，对照组和假手术组小鼠的海马组织未见神经纤维缠结，而模型组小鼠的海马组织则出现黑褐色神经纤维缠结，盐酸小檗胺给药组小鼠的脑组织海马中同样未见明显的神经纤维缠结。说明盐酸小檗胺可以抑制神经纤维缠结的产生。

由图1-8和图1-9可以看出，对照组和假手术组小鼠的脑组织内的钙蛋白酶Calpain的表达量较低，硒蛋白K含量表达较高，而模型组小鼠的脑组织内Calpain的表达较高，硒蛋白K的含量较低，盐酸小檗胺给药组小鼠的脑组织中的硒蛋白K的表达量虽然没有对照组和假手术组高，但明显要高于模型组小鼠，而Calpain的表达要明显低于模型组。说明盐酸小檗胺可以抑制钙蛋白酶Calpain的表达，从而提高硒蛋白K的表达。

(二)盐酸小檗胺对腹腔注射D-半乳糖和灌胃三氯化铝AD小鼠的治疗作用

由图2-1可以看出，小鼠经过四天的水迷宫(逃避潜伏期训练)实验，模型组小鼠和对照组小鼠相比，虽然都有下降，但模型组小鼠的下降程度明显要比对照组小鼠要缓慢，且从曲线的后端看出有趋于平缓的趋势，说明氯化铝和D-半乳糖联合诱导对小鼠的空间记忆能力造成损伤，给药组小鼠的逃避潜伏期与模型组相比明显缩短，接近与对照组说明盐酸小檗胺对小鼠的空间记忆能力有改善作用。

由图2-2可以看出，在训练后第五天时，腹腔注射D-半乳糖和灌胃三氯化铝AD小鼠模型组小鼠站台周围活动时间明显低于对照组，而盐酸小檗胺给药后的小鼠站台周围活动时间明显增加。由图2-3可以看出，在训练后第五天时，脑定位注射三氯化铝AD小鼠模型组的小鼠穿越站台次数明显低于对照组，而盐酸小檗胺给药组小鼠穿越站台次数明显增加，说明盐酸小檗胺给药后小鼠学习记忆能力明显增强。

由图2-4可以看出，对照组小鼠的海马组织未见Aβ斑块，而模型组小鼠的海马组织中出现了Aβ斑块，在给药组小鼠的脑海马组织中也未见Aβ斑块沉积，说明盐酸小檗胺可以抑制AD小鼠脑海马组织产生Aβ斑块。

由图2-5可以看出，对照组小鼠的海马组织细胞形态完整，排列整齐密集，细胞核大而圆，胞质丰富，未见病变特征。模型组小鼠的海马组织细胞则出现较多病变，细胞分界不规则，细胞核深染固缩。而盐酸小檗胺给药组小鼠的细胞只有少数锥体神经细胞胞核固缩，呈现不规则形态，细胞质稀少。说明盐酸小檗胺可以减轻AD小鼠海马组织的的神经病变。

由图2-6可以看出，对照组小鼠的海马组织神经纤维无明显异常，而模型组小鼠的海马组织中出现了较多的褐色神经纤维缠结，盐酸小檗胺给药组的小鼠海马组织中未见神经纤维缠结。说明盐酸小檗胺具有抑制神经纤维缠结形成的作用。

由图2-7和图2-8可以看出，对照组小鼠的脑组织内硒蛋白K的表达量要明显高于模型组，而钙蛋白酶Calpain的表达明显低于模型组，盐酸小檗胺给药后的小鼠脑组织内的钙蛋白酶的表达低于模型组，硒蛋白K的表达虽然低于对照组，但明显比模型组高。说明盐酸小檗胺可以抑制钙蛋白酶Calpain的表达，从而提高硒蛋白K的表达。

(三)盐酸小檗胺对APP/PS1双转基因AD小鼠的治疗作用

由图3-1可以看出，小鼠经过四天的水迷宫(逃避潜伏期训练)实验，对照组小鼠和给药组小鼠的逃避潜伏期均有明显下降，而模型组小鼠经过训练之后，逃避潜伏期的下降程度不明显，要低于其他两组。说明经过盐酸小檗胺给药后，APP/PS1小鼠的空间记忆能力有了较大的提升。

由图3-2可以看出，经过四天的学习训练，APP/PS1模型组小鼠的站台周围活动时间显著降低，而给药后的小鼠站台周围活动时间显著升高。由图3-3可以看出，经过学习训练后，APP/PS1模型组的穿越站台次数显著低于对照组，而给药后APP/PS1小鼠的穿越站台次数显著升高。说明盐酸小檗胺对于APP/PS1双转基因小鼠的空间学习记忆能力具有较大的提升作用。

由图3-4可以看出，对照组小鼠的海马组织未见Aβ斑块，而APP/PS1模型组小鼠的海马组织中出现Aβ斑块，在给药组小鼠的脑海马组织中也未见Aβ斑块沉积，说明盐酸小檗胺可以抑制AD小鼠脑海马组织产生Aβ斑块。

由图3-5可以看出，对照组小鼠的海马组织细胞形态完整，排列整齐密集，细胞核大而圆，胞质丰富，未见病变特征，APP/PS1模型组小鼠的海马组织细胞则出现较多病变，细胞分界不规则，细胞核深染固缩。盐酸小檗胺给药组小鼠的海马组织细胞只有少数锥体神经细胞胞核固缩，呈现不规则形态，细胞质稀少。说明盐酸小檗按可以减轻AD小鼠海马组织的神经病变。

由图3-6可以看出，对照组小鼠的海马组织神经纤维无明显异常，而APP/PS1模型组小鼠的海马组织中出现了较多的褐色神经纤维缠结。盐酸小檗胺给药组的小鼠海马组织中未见神经纤维缠结。说明盐酸小檗胺具有抑制神经纤维缠结形成的作用。

由图3-7和图3-8可以看出，对照组小鼠的脑组织内硒蛋白K的表达量要明显高于模型组，而钙蛋白酶Calpain的表达明显低于模型组，盐酸小檗胺给药后的小鼠脑组织内的钙蛋白酶的表达低于模型组，硒蛋白K的表达虽然低于对照组，但明显比模型组高。说明盐酸小檗胺可以抑制钙蛋白酶Calpain的表达，从而提高硒蛋白K的表达。

总之，通过对氯化铝脑部注射诱导阿尔茨海默症小鼠模型，氯化铝联合D-半乳糖诱导阿尔茨海默病小鼠模型和APP/PS1双转基因小鼠模型，进行盐酸小檗胺给药后观察小鼠行为学，观察小鼠脑部神经纤维缠结，Aβ斑块沉积等切片的染色结果，以及通过对脑组织的western blot实验，可以得出以下结论：

(1)通过水迷宫实验可以得出结论：盐酸小檗胺对于三种方法诱导出的阿尔茨海默症模型小鼠的空间学习记忆能力具有一定的改善作用。

(2)通过小鼠脑组织石蜡切片的染色实验可以看到，盐酸小檗胺具有减少小鼠海马组织内Aβ和神经纤维缠结，保护海马锥体细胞的作用。

(3)结合蛋白免疫印迹实验的结果，经过分析认为，盐酸小檗胺可能是通过抑制钙蛋白酶的表达，以减少钙蛋白酶对硒蛋白K的降解，从而发挥抗阿尔茨海默症的作用。

Claims (6)

1.小檗胺作为唯一活性成分在制备治疗阿尔兹海默症药物中的应用，其特征在于：所述小檗胺的结构式如（I）所示，

（I）。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：小檗胺作为唯一活性成分在制备减少阿尔兹海默症患者脑海马组织中Aβ斑块形成的药物中的应用。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：小檗胺作为唯一活性成分在制备减少阿尔兹海默症患者脑海马组织中神经元纤维缠结形成的药物中的应用。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：小檗胺作为唯一活性成分在制备减少阿尔兹海默症患者神经细胞病变药物中的应用。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：小檗胺作为唯一活性成分在制备抑制阿尔兹海默症患者脑组织中钙蛋白酶表达药物中的应用。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：小檗胺作为唯一活性成分在制备促进阿尔兹海默症患者脑组织中硒蛋白K的表达药物中的应用。