CN115054597B - 卤化ⅱ型聚酮类化合物在干预阿尔茨海默症中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了卤化Ⅱ型聚酮类化合物在干预阿尔茨海默症中的应用，卤化Ⅱ型聚酮类化合物为zunyimycinC，zunyimycinC对AD认知障碍的改善效果，又结合q‑PCR和Westblot发现zunyimycinC降低AD小鼠模型脑组织中神经炎症因子的表达，ZunyimycinC通过降低了AD小鼠模型的神经炎症达到了改善认知障碍的治疗效果。

Description

卤化Ⅱ型聚酮类化合物在干预阿尔茨海默症中的应用

技术领域

本发明属于基因生物医药领域，具体涉及卤化Ⅱ型聚酮类化合物在干预阿尔茨海默症中的应用。

背景技术

阿尔茨海默症(Alzheimer’sdisease，AD)是一种最常见的中枢神经系统退行性疾病，其临床表现以记忆丧失、行为能力减弱、语言能力丢失、认知障碍等为主，给家庭、社会造成沉重的负担。AD发病与多个因素有关，包括家族遗传、β淀粉样蛋白沉积、Tau蛋白过度磷酸化、神经炎症、氧化应激和肠道菌群失调等。现阶段，临床上用于治疗AD的药物有胆碱酯酶抑制剂多奈哌齐、利斯的明、加兰他敏，谷氨酸N-甲基-D-天冬氨酸受体拮抗剂盐酸美金刚及2019年在我国上市的国产靶向脑—肠轴的治疗AD的新药—甘露特钠胶囊(又名GV-971)，这些药物治疗在临床上取得了一定的效果，但无法解决病情不可逆的问题。随着针对Aβ假说的药物临床试验的失败，人们逐渐认识到治疗AD可能需要从其他的角度入手，因而需要进一步研究药物用以治疗AD，ZunyimycinC是一种卤化II型聚酮类化合物，其对阿尔茨海默症小鼠模型的认知障碍有改善作用，值得进一步开发，有可能为AD治疗药物的研发指明方向，给AD患者带来希望。

发明内容

本发明的目的是提供卤化Ⅱ型聚酮类化合物在干预阿尔茨海默症中的应用，对阿尔茨海默症有显著的改善效果。

本发明所采用的技术方案是，卤化Ⅱ型聚酮类化合物在干预阿尔茨海默症中的应用。

本发明的其他特征还在于，

卤化Ⅱ型聚酮类化合物为zunyimycinC。

本发明的有益效果为，通过将卤化Ⅱ型聚酮类化合物用于临床治疗AD，可以改善AD患者的认知障碍，为AD的临床治疗提供了非常高的研究价值。

附图说明

图1为不同剂量zunyimycinC对AD细胞模型预处理不同时间对细胞存活率的影响；

图2(A)为不同剂量zunyimycinC干预AD细胞模型12h对细胞存活率的影响对比图；

图2(B)为不同剂量zunyimycinC干预AD细胞模型24h对细胞存活率的影响对比图；

图2(C)为不同剂量zunyimycinC干预AD细胞模型36h对细胞存活率的影响对比图；

图2(D)为不同剂量zunyimycinC干预AD细胞模型48h对细胞存活率的影响对比图；

图3为中剂量zunyimycinC预防对AD模型小鼠逃避潜伏期的影响折线图；

图4为低剂量zunyimycinC干预对AD模型小鼠逃避潜伏期的影响折线图；

图5为中剂量zunyimycinC干预对AD模型小鼠逃避潜伏期的影响折线图；

图6为高剂量zunyimycinC干预对AD模型小鼠逃避潜伏期的影响折线图；

图7为不同处理组AD模型小鼠原平台所在象限停留时间对比图；

图8为不同处理组AD模型小鼠平台穿越次数对比图；

图9为不同处理组小鼠空间探索实验轨迹图。

具体实施方式

本发明基于卤化Ⅱ型聚酮类化合物zunyimycinC对阿尔茨海默症行为学的分析，下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。

现阶段用于AD的临床药物以治疗症状为主，本发明主要利用Morris水迷宫实验来检测了zunyimycinC对AD小鼠模型行为学的影响，从而推测zunyimycinC对AD认知障碍的改善效果，又结合q-PCR和Westblot发现zunyimycinC降低AD小鼠模型脑组织中神经炎症因子的表达。ZunyimycinC通过降低了AD小鼠模型的神经炎症达到了改善认知障碍的治疗效果。

为了更好的理解本发明的实质，下面将用zunyimycinC对AD模型的干预活性及行为学影响来说明其在AD中的应用。

一、AD细胞模型构建

(1)细胞复苏：从液氮罐中取出PC12细胞冻存管迅速置于37℃水浴锅中融化，1000rpm离心5min。轻轻吸去上清，加入完全培养基使细胞重悬，将重悬的细胞转移至细胞培养皿中，37℃、5％CO2常规培养。

(2)种板：细胞培养2-3代，待细胞状态稳定后，将细胞以1×104个/孔铺于96孔板，体积100μL，设6个复孔，于37℃、5％CO2孵育24h。

(3)Aβ25-35处理PC12细胞：加入100μL用完全培养基稀释的Aβ25-35，使其终浓度为10μM、30μM、50μM、70μM，37℃、5％CO2培养6h、12h、24h、36h。

(4)弃去原培养基，每孔加入含5％CCK-8的完全培养基，于37℃孵育4h后取出，震荡混匀，用酶标仪测450nm处吸光度值，计算细胞存活率，确定构建AD细胞模型所需的Aβ25-35最佳浓度(细胞存活率为50％～60％)。

二、ZunyimycinC预处理对PC12细胞的保护作用

(1)PC12细胞于培养瓶中培养至80％～90％融合度后以1×104个/孔铺于96孔板，设6个复孔，37℃、5％CO2孵育24h。

(2)弃去原培养基，加入100μL含zunyimycinC(浓度分别为0μM、5μM、10μM、15μM、20μM)的完全培养基，分别预处理6h、12h、18h、24h。

(3)弃去原培养基，96孔板中加入100μL用完全培养基稀释至70μM的Aβ25-35，37℃、5％CO2培养36h。

(4)加入CCK-8试剂，37℃孵育4h后测定450nm处吸光度值，计算细胞存活率。

三、ZunyimycinC处理Aβ25-35诱导PC12细胞的AD模型细胞

(1)PC12细胞于培养瓶中培养至80％～90％融合度后以1×104个/孔铺于96孔板，设6个复孔，37℃、5％CO2孵育24h。

(2)弃去原培养基，加入100μL用完全培养基稀释至70μM的Aβ25-35，37℃、5％CO2培养36h。

(3)弃去原培养基，加入100μL用完全培养基稀释的zunyimycinC(终浓度分别为：0μM、5μM、10μM、15μM)，于37℃、5％CO2分别培养12h、24h、36h、48h。

(4)加入含5％CCK-8的完全培养基，37℃孵育4h后测定450nm处吸光度值，计算细胞存活率。

四、AD小鼠模型的构建

(1)取出小鼠，1％戊巴比妥钠按0.15mL/20g剂量腹腔注射麻醉小鼠，轻掐鼠尾和脚趾没有明显反应时可进行手术。

(2)小鼠头顶去毛。将其固定于适配器上，轻提鼠尾不掉则固定成功。

(3)小鼠头部用70％乙醇消毒，用镊子夹起头皮沿中缝剪开，暴露头骨，小鼠眼睛涂上红霉素眼膏，将适配器固定于脑立体定位仪上。

(4)打开显示器和微量注射泵控制器，微量注射器中吸入2μg/μL的Aβ42寡聚体，并固定微量注射器。

(5)脑立体定位仪调平后，定位侧脑室(前囟后0.2mm，左右旁开1mm，深2.5mm)，在目标位置接触颅骨表面时停针，排出少许液体标记位置，抬针至较高处。

(6)用手持型颅钻在标记处磨孔，使脑组织暴露。

(7)重新校准，将微量注射器移动至目标脑区并植入脑部。设置微量注射泵参数：体积2.5μL，速度800nL/min，模式调为泵出，开始注射2μg/μL的Aβ42寡聚体。

(8)注射完成后，停针5min，将注射针以0.3mm/min的速度缓慢抬起并完成另一侧注射。缝合头皮，小鼠肌注3万单位青霉素，连续3d，防止感染。

五、小鼠给药

中剂量zunyimycinC预防组先经鼻给药3w，然后侧脑室注射Aβ42造模。正常组不做任何处理。其他组先侧脑室注射Aβ42造模，然后按照分组信息给药。所有经鼻给药组的给药体积均是10μL/只、5μL/侧进行给药，灌胃给药组的给药体积均是0.2mL/只。给药结束后进行Morris水迷宫实验对小鼠行为学进行评价。给药信息见表1所示：

表1小鼠分组信息Tab.1Micegroupinginformation

六、Morris水迷宫空间参考定位实验

(1)向水池中撒入钛白粉，使水池背景色为白色与小鼠的黑色形成对比，便于信号采集。在水池2/3半径和1/2半径之间放置逃生平台，打开水迷宫，使水温保持在22℃。

(2)将造模3d后的小鼠置于水池中，小鼠游泳时间为60s。如果小鼠成功找到平台，则让其在平台上休息10s，如果小鼠没有成功找到平台，则将其引导到平台上，同样休息10s，确保每只动物有相等的时间来观察和获取空间信息。通过动物行为分析系统记录动物上台潜伏期、上台前路程、游泳速度等。

(3)实验结束后从水池中取出小鼠，用干毛巾擦拭小鼠身体，在电暖器旁烘干，放回原笼。

(4)每天在同样的时间段训练小鼠4次，每次将小鼠从不同的象限放入，两次训练之间间隔15～20min，连续训练5d。

(5)第6d撤除平台，将小鼠从原平台所在象限的对角象限放入水池中，让其在水池中游泳60s，系统记录小鼠的运动轨迹和游泳信息(平台穿越次数、原平台所在象限停留时间)。

zunyimycinC不同浓度、不同时间点的预处理对Aβ25-35诱导AD细胞模型的保护效应。如图1所示，结果显示10μM和15μM的zunyimycinC的曲线基本重合，6h、12h时AD细胞模型的存活率达130％，在18h和24h时AD细胞模型的存活率在100％。5μM的zunyimycinC在6h和12h时AD细胞模型的存活率在115％左右，在18h和24h时折线与10μM和15μM的折线重合，存活率在100％左右。20μM的zunyimycinC在折线前半部分与5μM的折线重合，即二者在6h和12h这两个时间点细胞存活率一致，均为115％左右，而在18h和24h时，20μM的细胞存活率明显下降，分别为80.6％、75.3％。

不同浓度zunyimycinC处理对AD模型细胞的细胞存活率影响对比图，0μM表示不经zunyimycinC处理组，即模型组；如图2(A)-(D)所示，代表造模后zunyimycinC处理的不同时间，A为12h，B为24h，C为36h，D为48h。*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001；****P＜0.0001。结果显示，在AD细胞模型中加入zunyimycinC后，细胞的存活率影响不大(P＞0.05，差异没有统计学意义)，而利用15μMzunyimycinC处理12h和48h之后，AD细胞模型的细胞存活率反而低于模型组(P＜0.05，差异有统计学意义)。表明zunyimycinC不能逆转Aβ25-35对PC12细胞已造成的损伤。

统计各组连续5d逃避潜伏期数值，如表2所示：注：单位：秒(s)。

表2统计各组逃避潜伏期数值统计表

如图3至图6是各组连续5d训练的逃避潜伏期折线图，图中看出高剂量干预组在第1～2d的潜伏期与正常组相似，但在第3～5d的潜伏期逐渐接近模型组。其余组潜伏期折线趋势差不多，逃避潜伏期介于正常组与模型组之间，说明这些干预组小鼠的认知能力正处于恢复期。

各组小鼠在原平台所在象限的停留时间，如图7所示，图中1为中剂量zunyimycinC预防组；2为低剂量zunyimycinC干预组；3为中剂量zunyimycin C干预组；4为高剂量zunyimycinC干预组；Model为模型组；Control为正常组。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。结果显示，模型组小鼠在原平台所在象限的停留时间为18.08s±4.52s，比正常组小鼠的停留时间28.65s±3.71s要短，且差异具有统计学意义(P＜0.05)。高剂量干预组在原平台所在象限的停留时间为15.88s±6.50s，低于模型组。预防组、低剂量干预组和中剂量干预组小鼠在原平台所在象限停留时间介于模型组和正常组之间，说明这些小鼠都处于恢复过程中。

各组小鼠在空间探索实验中的平台穿越次数，如图8所示，结果显示，低剂量干预组的平台穿越次数4±1.78、高剂量干预组平台穿越次数3.42±0.97均比模型组的平台穿越次数1.14±1.06多，差异具有统计学意义(P＜0.05)。其余组的平台穿越次数均多于模型组少于正常组，说明这些组均处于恢复中。

不同组小鼠在空间探索实验中的轨迹如图9所示，两个黑点分别代表小鼠游泳起点位置和终点位置。1为中剂量zunyimycinC预防组；2为低剂量zunyimycinC干预组；3为中剂量zunyimycinC干预组；4为高剂量zunyimycin C干预组；Model：模型组；Control：正常组。图中看出正常组、预防组、低剂量干预组和中剂量干预组小鼠在原平台位置活动较为频繁。模型组和高剂量干预组小鼠在水池中随意运动没有规律，在原平台所在象限停留时间也不长。

综合小鼠的逃避潜伏期、平台穿越次数、原平台所在象限及小鼠的运动轨迹的结果发现中剂量zunyimycinC预防和低剂量zunyimycinC干预使AD模型小鼠的学习记忆障碍得到了改善；低剂量zunyimycinC预处理减轻Aβ25-35对PC12细胞的损伤；高剂量zunyimycinC干预不能改善AD模型小鼠的学习记忆障碍。

Claims (1)

1.卤化Ⅱ型聚酮类化合物在制备治疗阿尔茨海默症药物中的应用，所述卤化Ⅱ型聚酮类化合物为zunyimycin C。