CN117007818B - S1pr1作为靶点在开发或制备用于预防慢性疼痛相关记忆损伤疾病的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种S1PR1作为靶点在开发或制备用于预防慢性疼痛相关记忆损伤疾病的药物中的应用。本发明首次提出S1PR1是预防慢性疼痛相关记忆损伤发生的药物靶点；经实验显示，S1PR1激动剂对于慢性疼痛引起的记忆损伤具有显著的预防作用，对今后慢性疼痛与记忆损伤共病发生的防治药物开发具有重要意义。
Description
技术领域
本发明具体涉及S1PR1(即：1-磷酸鞘氨醇受体1型受体)作为靶点在开发或制备用于预防慢性疼痛相关记忆损伤疾病的药物中的应用，属于生物医药技术领域。
背景技术
慢性疼痛是危害人类健康和严重影响人们生活质量的最常见的临床病症之一，目前全球慢性疼痛的患病率约为34％。越来越多的临床资料表明，慢性疼痛患者往往伴有认知功能障碍，表现为注意力下降、记忆力减退和信息处理速度下降等。其中，记忆功能受疼痛影响较大，但二者共病的具体机制尚不清楚。这不仅严重影响患者日常的工作生活，也给家庭、社会带来了沉重的负担。因此，研究慢性疼痛状态下，记忆损伤发生的病理机制以及提供相应的预防策略显得尤为重要。
1-磷酸鞘氨醇受体(sphingosine 1-phosphate receptor，S1PR)是一种G蛋白偶联受体，有五种亚型(S1PR1-5)，介导由1-磷酸鞘氨醇(S1P)传递的信号到胞内，参与多种生理功能的调控。S1PR1是大脑中最丰富表达的亚型，在阿尔兹海默症中，S1P/S1PR1信号通路的激活可以改善学习和记忆功能。海马是大脑中与痛觉调制和学习记忆相关的重要脑区，海马由CA1-3区和齿状回(DG)区构成。海马齿状回区表达丰富的S1PR1，参与海马新生神经元发生，然而海马齿状回区S1PR1是否参与慢性疼痛相关记忆损伤的发生以及S1PR1在此过程中的作用并不清楚。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种S1PR1作为靶点在开发或制备用于预防慢性疼痛相关记忆损伤疾病的药物中的应用，以克服现有技术的不足。
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
本发明实施例提供了S1PR1作为靶点在开发或制备用于预防慢性疼痛相关记忆损伤疾病的药物中的应用。
本发明实施例还提供了S1PR1或其编码基因的调节剂在制备预防慢性疼痛相关记忆损伤疾病的药物中的应用。
本发明实施例还提供了一种用于预防慢性疼痛相关记忆损伤疾病的药物组合物，其包括：S1PR1或其编码基因的调节剂，以及药学上可接受的载体。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明首次提出S1PR1是预防慢性疼痛相关记忆损伤发生的药物靶点；经实验显示，S1PR1激动剂对于慢性疼痛引起的记忆损伤具有显著的预防作用，对今后慢性疼痛与记忆损伤共病发生的防治药物开发具有重要意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1a-图1b为本发明一典型实施方案中慢性疼痛相关记忆损伤动物模型的热痛及机械痛阈值图；
图2a-图2b为本发明一典型实施方案中慢性疼痛相关记忆损伤小鼠在Y-maze新异臂中停留的时间百分比和移动距离百分比；
图3a-图3b为本发明一典型实施方案中慢性疼痛相关记忆损伤小鼠在水迷宫测试中的上台时间和在目标象限中停留的时间百分比；
图4a-图4b为本发明一典型实施方案中慢性疼痛相关记忆损伤小鼠海马齿状回中S1PR1的表达量图；
图5为本发明一典型实施方案中在慢性疼痛相关记忆损伤小鼠海马齿状回中连续注射S1PR1激动剂SEW2871后的热痛阈值图；
图6a-图6b为本发明一典型实施方案中在慢性疼痛相关记忆损伤小鼠海马齿状回中连续注射S1PR1激动剂SEW2871后在Y-maze新异臂中停留的时间百分比和移动距离百分比图；
图7a-图7b为本发明一典型实施方案中在慢性疼痛相关记忆损伤小鼠海马齿状回中连续注射S1PR1激动剂SEW2871后在水迷宫测试中的上台时间和在目标象限中停留的时间百分比图；
图8a-图8b为本发明一典型实施方案中在慢性疼痛相关记忆损伤小鼠海马齿状回中连续注射S1PR1激动剂SEW2871后的S1PR1的表达量图。
具体实施方式
鉴于现有技术的缺陷，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案，下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
具体的，作为本发明技术方案的一个方面，其所涉及的是S1PR1作为靶点在开发或制备用于预防慢性疼痛相关记忆损伤疾病的药物中的应用。
在一些优选实施方案中，所述药物至少能够预防慢性疼痛小鼠出现记忆损伤。
在一些优选实施方案中，所述慢性疼痛相关记忆损伤疾病作用于小鼠模型时，小鼠的海马齿状回中S1PR1的表达量会下降。
在一些优选实施方案中，所述药物至少能够抑制慢性疼痛相关记忆损伤小鼠海马齿状回中S1PR1表达量的下降。
本发明实施例的另一个方面还提供了S1PR1或其编码基因的调节剂在制备预防慢性疼痛相关记忆损伤疾病的药物中的应用。
在一些优选实施方案中，所述调节剂选自特异性促进S1PR1或其编码基因的小分子化合物。
进一步地，所述调节剂包括S1PR1激动剂，且不限于此。
本发明实施例的另一个方面还提供了一种用于预防慢性疼痛相关记忆损伤疾病的药物组合物，其包括：S1PR1或其编码基因的调节剂，以及药学上可接受的载体。
在一些优选实施方案中，所述调节剂选自特异性促进S1PR1或其编码基因的小分子化合物。
进一步地，所述调节剂包括S1PR1激动剂，且不限于此。
本发明首次提出S1PR1是预防慢性疼痛相关记忆损伤发生的药物靶点；经实验显示，在慢性神经病理性疼痛(CCI术后21天)小鼠中，有约50％的小鼠会出现记忆损伤，且S1PR1的表达量下降，而在慢性神经病理性疼痛发生时(CCI术后7天)，在海马齿状回连续给予S1PR1激动剂14天可以改善CCI 21天小鼠在Y-maze和水迷宫行为学测试中的表现，且S1PR1的表达量未出现下调，这些结果说明，S1PR1激动剂对于慢性疼痛引起的记忆损伤具有显著的预防作用，对今后慢性疼痛与记忆损伤共病发生的防治药物开发具有重要意义。
下面结合若干优选实施例及附图对本发明的技术方案做进一步详细说明，本实施例在以发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
下面所用的实施例中所采用的实验材料，如无特殊说明，均可由常规的生化试剂公司购买得到。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本实施例的相关实验结果及分析如下：
一、实验步骤
实验动物：
本实施例所用的雄性C57BL/6J小鼠购自常州卡文斯实验动物有限公司，许可证号SCXK(苏)2021-0013。小鼠可自由饮水与进食。所有的动物管理与处理方案都经徐州医科大学动物伦理委员会批准。所有实验都是按照《管理和使用动物行为道德准则》的建议进行。
试剂：SEW2871购自阿拉丁公司(Aladdin，Cas No.256414-75-2)，DMSO购自阿拉丁公司(Aladdin，Cas No.67-68-5)。
实施例1：CCI神经病理性疼痛模型的建立
动物经1％的戊巴比妥钠(50mg/kg，i.p.)麻醉后，使用碘伏对术区进行消毒，使用眼科剪在小鼠左股骨中1/3处垂直剪开长约1cm的皮肤，之后用玻璃分针钝性分离出坐骨神经，使用3根4-0缝线对坐骨神经进行疏松结扎，缝线间隔1cm，最后逐层缝合，并使用红霉素软膏对创口进行消毒。术后将小鼠放置于加热毯上待其完全苏醒后放回常住笼。
实施例2：热痛行为学检测
我们使用足底痛觉测量仪(IITC Life Science Inc，CA)测量小鼠热缩足潜伏期(Paw withdrawal latencies，PWLs)。小鼠被放置在玻璃板上的透明多孔亚克力盒(8×8×5.5cm)中，房间安静且温度维持在23±2℃，在测试前适应1小时。使用机器辐射光源产热刺激左后爪的足底表面。从开灯到缩爪或舔爪的时间记录为缩足潜伏期。通过调节辐射光强度将基础PWLs设置在9-15秒内。辐射在20秒时自动切断以避免过热使组织损伤。测量5次重复/时间点/动物的PWLs，每次测量间隔保持10min以上，记录并分析后3次数据。
实施例3：机械痛行为学检测
我们将每只小鼠单独放置于透明多孔亚克力盒(8cm×8cm×5.5cm)中并放置在底为1cm×1cm孔径的铁丝网上让小鼠适应测试环境。在测试前适应1小时，用于记录的VonFrey细丝(Stoelting，Illinois，平均对数间隔δ为0.411)规格依次为0.007，0.02，0.07，0.16，0.4，1.0，2和6g。起始强度为0.16g，根据up-down法，小鼠表现为抬足或舔爪时记为疼痛X，不痛记为O，当出现XO或者OX后再测量4次，计算最后一次测量细丝g值的对数值Xf，根据后6次测试序列查得κ值，计算50％机械缩足阈值(50％paw withdrawal thresholds，50％PWTs)，50％PWTs＝Power[10，(Xf+kδ)]。
实施例4：水迷宫行为学实验
Morris水迷宫由一个直径130cm、高50cm的圆形水池组成，水池被分为4个象限，每个象限贴有一张不同形状贴纸供小鼠定位，其中第四象限中有一直径10cm的圆形平台。水池中装有二氧化钛白色溶液且高于平台约0.5cm，隐藏平台。实验分为两个阶段，训练期与测试期。训练期共持续5天，在训练期内，实验小鼠在行为房适应2h后，实验者将小鼠沿顺时针方向分别从四个象限面对筒壁滑入水内，让其自由寻找平台，小鼠若超过60s未找到平台则由实验者引导其游到平台，小鼠在平台上休息10s后实验者将其收回鼠笼。每两次训练之间间隔半小时。第6天实验对小鼠进行测试，从平台的对角象限放置小鼠，利用水池上方的摄像头及ANY-maze软件(Stoelting Company，Wood Dale，IL)记录小鼠的游泳轨迹与逃逸潜伏期。第7天撤掉平台，将小鼠从对角象限放入水池内，记录小鼠30s内在目标象限停留的时间百分比。
实施例5：Ymaze行为学实验
Y迷宫由3个长30cm、宽6cm、高15cm的空心无盖白色长方体组成，每两个长方体之间的夹角均为120°，三个长方体分别为起始臂、新异臂和探索臂。实验分为两个阶段，训练期与测试期。在训练期间，关闭新异臂，实验小鼠在行为房适应2h后，实验者将小鼠放入起始臂，使其在起始臂与探索臂中自由探索，15min后取出小鼠，1h后，打开新异臂并将小鼠重新放置于起始臂内，利用迷宫上方的摄像头及SMART3.0软件(Pan Lab/San DiegoInstruments)记录小鼠在新异臂内探索的时间与距离百分比。
实施例6：在雄性C57BL/6J小鼠的海马齿状回埋置导药管
八周的雄性C57BL/6J小鼠(卡文斯，中国江苏)用于颅内给药。动物经1％的戊巴比妥钠(50mg/kg，i.p.)麻醉，头部备皮。随后将小鼠固定于立体定位仪(瑞沃德，中国深圳)，红霉素眼膏涂抹小鼠眼部预防感染，碘伏消毒小鼠头顶部，并用镊子提起头部皮肤，使用剪刀减去小鼠面积约7x7mm头皮，随后清理小鼠颅骨表面脑膜等结缔组织。调平小鼠颅骨，颅顶水平的判断标准：前后囟高度差和左右对称部分高度差均小于±0.03mm。根据小鼠脑图谱The Mouse Brain in Stereotaxic Coodinates(第二版，George Paxinos和KeithB.J.Frank主编)最终确定海马齿状回的坐标(AP：-1.3mm；ML：-1.95mm；DV：-2.02mm；0°)。小鼠在实验前1周植入导管。使用立体定位仪器将24号导管(瑞沃德，中国深圳)植入小鼠颅内。以上步骤结束后，将小鼠从立体定位仪上取下并放置在加热垫上进行术后复苏，待完全苏醒后将小鼠放回动物房继续饲养。
实施例7：海马齿状回微量注射S1PR1激动剂SEW2871
将SEW2871(CAS：256414-75-2；Aladdin)溶解在含有0.1％DMSO(Cas No.67-68-5，Aladdin)的生理盐水中。使用微量注射泵(瑞沃德，中国深圳)将SEW2871(0.7mg/kg)持续缓慢输入小鼠颅内，疼痛行为学测试、水迷宫、Y maze行为学测试在颅内连续给药14d后进行。
数据分析：
所有数值均表示为平均值±标准误(SEM)。使用单因素方差分析对数据进行统计分析。P＜0.05被认为有统计学意义。
二、实验结果
1.慢性疼痛相关记忆损伤小鼠海马齿状回中S1PR1表达下降。
将雄性C57BL/6J小鼠分为两组：假手术组(Sham组)、坐骨神经慢性缩窄性损伤(CCI)组(CCI组)，在CCI术后21天，对小鼠隔天依次进行痛行为测试、Y-maze行为学测试和水迷宫行为学测试。如图1a-图1b所示，与Sham组相比，CCI组小鼠的热痛及机械痛阈值均显著降低；在Y-maze行为学测试中(图2a-图2b)，与Sham组相比，CCI组小鼠在新异臂中停留的时间百分比和移动距离百分比均显著减少；在水迷宫行为学测试中(图3a-图3b)，与sham组相比，CCI组小鼠的上台时间增加，在目标象限中停留的时间百分比减少。将两组小鼠脱颈处死后，取海马齿状回组织进行蛋白提取，利用Western blot对S1PR1进行定量分析。在慢性疼痛伴记忆损伤小鼠中，S1PR1表达量显著降低(图4a-图4b)。
2.在小鼠慢性疼痛发生时，海马齿状回注射S1PR1激动剂SEW2871可以预防慢性疼痛小鼠出现记忆损伤。
对预先在海马齿状回埋置好导药管的雄鼠分为四组，两组为sham组，两组为CCI组。在CCI术后7天，对sham组中的一组小鼠海马齿状回进行微量注射生理盐水(Sham+Vehicle组)，另外一组小鼠海马齿状回进行微量注射S1PR1激动剂SEW2871(0.7mg/kg)(Sham+SEW2871组)；对CCI组中的一组小鼠海马齿状回进行微量注射生理盐水(CCI+Vehicle组)，另外一组小鼠海马齿状回进行微量注射SEW2871(0.7mg/kg)(CCI+SEW2871组)。微量注射连续进行14天，在CCI术后21天时，对四组小鼠进行痛行为学测试、Y-maze行为学测试和水迷宫行为学测试。如图5、图6a-图6b、图7a-图7b所示，SEW2871对小鼠疼痛行为没有影响，而可以防止疼痛引起的记忆损伤产生。随后，将四组小鼠脱颈处死，取海马齿状回组织进行蛋白提取，利用Western blot对S1PR1进行定量分析，发现连续注射S1PR1激动剂SEW2871后，与对照组相比，CCI组小鼠海马齿状回S1PR1的表达无显著变化(图8a-图8b)，这些结果说明在小鼠慢性疼痛发生时，海马齿状回注射S1PR1激动剂SEW2871可以预防慢性疼痛小鼠出现记忆损伤。
此外，本案发明人还参照前述实施例，以本说明书述及的其它原料、工艺操作、工艺条件进行了试验，并均获得了较为理想的结果。
应当理解，本发明的技术方案不限于上述具体实施案例的限制，凡是在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落于本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.S1PR1作为靶点在开发或制备用于预防慢性疼痛相关记忆损伤疾病的药物中的应用，其特征在于：所述药物至少能够预防慢性疼痛小鼠出现记忆损伤。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述慢性疼痛相关记忆损伤疾病作用于小鼠模型时，小鼠的海马齿状回中S1PR1的表达量会下降。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述药物至少能够抑制慢性疼痛相关记忆损伤小鼠海马齿状回中S1PR1表达量的下降。
4.S1PR1或其编码基因的调节剂在制备预防慢性疼痛相关记忆损伤疾病的药物中的应用，其特征在于：所述调节剂选自特异性促进S1PR1或其编码基因的小分子化合物；所述药物至少能够预防慢性疼痛小鼠出现记忆损伤。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述调节剂包括S1PR1激动剂。
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