CN117899219A - Htr1d作为靶点用于治疗疼痛-抑郁共病的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种HTR1D作为靶点用于治疗抑郁相关疼痛的药物中的应用，在正常小鼠中，在丘脑室旁核中微量注射Htr1d激动剂可以降低小鼠痛阈值，增加悬尾实验和强迫游泳实验中的不动时间。在CFA诱导的炎性痛‑抑郁共病小鼠中，在丘脑室旁核中微量注射Htr1d拮抗剂可以提高小鼠痛阈值，减少悬尾实验和强迫游泳实验中的不动时间。采用本发明的技术方案，通过采用HTR1D作为靶点进行的冯弗雷实验、悬尾实验和强迫游泳实验的结果表明，Htr1d对于疼痛具有显著的镇痛作用，并能缓解抑郁样行为，对疼痛‑抑郁共病药物，尤其是治疗炎性痛‑抑郁共病药物的开发具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及基础和临床医药技术领域，具体地，涉及一种HTR1D作为靶点用于治疗疼痛-抑郁共病的药物中的应用。
背景技术
慢性疼痛是危害人类健康和严重影响人们生活质量的最常见的临床病症之一，流行病学调查显示，成年人慢性疼痛的发生率高达30％左右。在临床上，慢性疼痛合并抑郁症具有极高的发病率，其发病率约为30％～60％，是普通人群的三倍以上，然而，目前尚缺乏兼具镇痛和抗抑郁作用的有效药物，来用于该共患病症的治疗。因此，探究疼痛相关抑郁发生的全新分子靶点，并基于新靶点开发疼痛-抑郁共病的治疗药物具有重要意义。
5-羟色胺(5-HT)是由吲哚核团和乙胺两部分合成，属于吲哚胺，结构末端只有一个胺基，其具有的双环吲哚结构区别于儿茶酚胺。5-羟色胺作为自体活性物质，其～90％合成和分布于肠嗜铬细胞，与ATP等物质储存于细胞颗粒内，在刺激因素作用下，5-羟色胺从颗粒内释放到全身血液。5-羟色胺(serotonin，5-HT)是人体中枢神经系统和周围神经系统的主要神经递质之一，其通过结合5-羟色胺受体发挥调控食欲、记忆、认知，情绪调节和成瘾等生理过程，这也使5-羟色胺受体成为抑郁症、精神分裂症、偏头痛等疾病的重要治疗靶点。
5-羟色胺包含12种亚型，目前现有技术中Htr1d基因用于编码5-羟色胺受体1D(HTR1D)，仅有少量研究表明其单核苷酸多态性可能参与偏头痛、焦虑、抑郁的发生。然而通过药理学干预该受体的功能及其对疼痛、抑郁是否具有调控作用目前尚不清楚。
另一方面，丘脑室旁核是丘脑的重要组成部分，是疼痛等感觉信息处理的重要核团。在丘脑室旁核前部表达的5-羟色胺受体亚型中，Htr1d表达较多。但是，丘脑室旁核是否参与疼痛-抑郁共病的发生以及Htr1d在此过程中的作用并不清楚。
基于上述分析，本发明提供了一种HTR1D作为靶点用于治疗疼痛-抑郁共病的治疗药物中，分别注射微量HTR1D激动剂和HTR1D拮抗剂进行动物试验，分析5-羟色胺受体1D在疼痛-抑郁共病治疗中的作用，从而为疼痛-抑郁共病的药物的靶向治疗提供指导。
发明内容
针对现有技术存在的技术问题，本发明公开了一种HTR1D作为靶点用于治疗疼痛-抑郁共病的治疗药物中的应用，以5-羟色胺受体1D可作为治疗疼痛-抑郁共病药物的新靶点，将以HTR1D激动剂GR-46611或HTR1D拮抗剂BRL-15572应用于治疗疼痛-抑郁共病的药物中。
为实现上述目的，本发明提供了一种HTR1D作为靶点在制备预治疗疼痛-抑郁共病的药物中的应用。
优选地，包括以HTR1D作为靶点，HTR1D激动剂为GR-46611。
优选地，所述HTR1D激动剂注射小鼠的丘脑室旁核内，单次注射所述Htr1d激动剂GR-46611可用于降低正常小鼠疼痛阈值，且不引起抑郁样行为的产生。
优选地，所述HTR1D激动剂的浓度为0.6nM，剂量为1μL。
优选地，包括以HTR1D作为靶点，Htr1d拮抗剂为BRL-15572。
优选地，所述Htr1d拮抗剂注射小鼠的丘脑室旁核内，连续7天注射所述Htr1d拮抗剂，GR-46611可用于提高CFA炎性痛引起的疼痛-抑郁共病小鼠的疼痛阈值，降低悬尾实验和强迫游泳实验中的不动时间。
优选地，所述Htr1d拮抗剂的浓度0.144nM，注射剂量为1μL。
基于上述技术方案，以HTR1D作为靶点，将Htr1d激动剂GR-46611或Htr1d拮抗剂BRL-15572应用于治疗疼痛-抑郁共病的药物中，尤其是，炎性痛-抑郁共病的治疗药物。
本发明技术方案的技术效果：
1.本发明的技术方案采用Htr1d作为疼痛-抑郁共病预防和治疗的药物的靶点，通过在正常小鼠的丘脑室旁核中微量注射Htr1d激动剂可以降低小鼠痛阈值，增加悬尾实验和强迫游泳实验中的不动时间。
2.本发明的技术方案采用Htr1d作为疼痛-抑郁共病预防和治疗的药物的靶点，在CFA诱导的炎性痛-抑郁共病小鼠中，在丘脑室旁核中微量注射Htr1d拮抗剂可以提高小鼠痛阈值，减少悬尾实验和强迫游泳实验中的不动时间。
3.采用本发明技术方案，采用Htr1d作为疼痛-抑郁共病预防和治疗的药物的靶点，Htr1d对于疼痛具有显著的镇痛作用，并能缓解抑郁样行为，对疼痛-抑郁共病药物，尤其是炎性痛-抑郁共病的药物的开发具有重要意义。
附图说明
图1a为本发明一典型实施方案中在正常小鼠丘脑室旁核单次注射Htr1d激动剂GR-46611后的冯·弗雷实验的机械痛阈值柱状图。
图1b为本发明一典型实施方案中在正常小鼠丘脑室旁核单次注射Htr1d激动剂GR-46611后的悬尾实验的不动时间柱状图。
图1a-图1c为本发明一典型实施方案中在正常小鼠丘脑室旁核单次注射Htr1d激动剂GR-46611后的强迫游泳实验的不动时间柱状图。
图2a为本发明一典型实施方案中在正常小鼠丘脑室旁核连续7天注射Htr1d激动剂GR-46611后的冯·弗雷实验的机械痛阈值柱状图。
图2b为本发明一典型实施方案中在正常小鼠丘脑室旁核连续7天注射Htr1d激动剂GR-46611后的悬尾实验的不动时间柱状图。
图2c为本发明一典型实施方案中在正常小鼠丘脑室旁核连续7天注射Htr1d激动剂GR-46611后的强迫游泳实验的不动时间的柱状图。
图3a为本发明一典型实施方案中在炎性痛-抑郁共病小鼠丘脑室旁核单次注射Htr1d拮抗剂BRL-15572后的冯·弗雷实验的机械痛阈值的柱状图。
图3b为本发明一典型实施方案中在炎性痛-抑郁共病小鼠丘脑室旁核单次注射Htr1d拮抗剂BRL-15572后悬尾实验的不动时间的柱状图。
图3c为本发明一典型实施方案中在炎性痛-抑郁共病小鼠丘脑室旁核单次注射Htr1d拮抗剂BRL-15572后的强迫游泳实验的不动时间的柱状图。
图4a为本发明一典型实施方案中在炎性痛-抑郁共病小鼠丘脑室旁核连续7天注射Htr1d拮抗剂BRL-15572后的冯·弗雷实验的机械痛阈值的柱状图。
图4b为本发明一典型实施方案中在炎性痛-抑郁共病小鼠丘脑室旁核连续7天注射Htr1d拮抗剂BRL-15572后的悬尾实验的不动时间的柱状图。
图4c为本发明一典型实施方案中在炎性痛-抑郁共病小鼠丘脑室旁核连续7天注射Htr1d拮抗剂BRL-15572后的强迫游泳实验的不动时间的柱状图。
具体实施方式
使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
本发明提供了一种HTR1D作为靶点在制备预治疗疼痛-抑郁共病的药物中的应用；包括以HTR1D作为靶点，HTR1D激动剂为GR-46611；通过将HTR1D激动剂注射小鼠的丘脑室旁核内，单次注射所述Htr1d激动剂GR-46611可用于降低正常小鼠疼痛阈值，且不引起抑郁样行为的产生。
或，以HTR1D作为靶点，Htr1d拮抗剂为BRL-15572；将Htr1d拮抗剂注射小鼠的丘脑室旁核内，连续7天注射所述Htr1d拮抗剂，GR-46611可用于提高CFA炎性痛引起的疼痛-抑郁共病小鼠的疼痛阈值，降低悬尾实验和强迫游泳实验中的不动时间。
本发明首次提出Htr1d是疼痛-抑郁共病治疗的药物靶点，在正常小鼠的丘脑室旁核中微量注射Htr1d激动剂可以降低小鼠痛阈值，增加悬尾实验和强迫游泳实验中的不动时间。在CFA诱导的炎性痛-抑郁共病小鼠中，在丘脑室旁核中微量注射Htr1d拮抗剂可以提高小鼠痛阈值，减少悬尾实验和强迫游泳实验中的不动时间。这些结果说明，Htr1d对于疼痛具有显著的镇痛作用，并能缓解抑郁样行为，对今后疼痛-抑郁共病药物的开发具有重要意义。
本发明中所用的雄性C57BL/6J小鼠购自常州卡文斯实验动物有限公司，许可证号SCXK(苏)2021-0013，小鼠可自由饮水与进食。所有的动物管理与处理方案都经徐州医科大学动物伦理委员会批准，所有实验都是按照《管理和使用动物行为道德准则》的建议进行。
所用试剂若无特别说明，均为市售，其中GR-46611(3-[3-[2-二甲基氨基乙基]-1H-吲哚-5-基]-N-[4-甲氧基苄基]丙烯酰胺)购自GlpBio公司(Cas No.185259-85-2)，BRL-15572(4-(3-氯苯基)-ALPHA-(二苯基甲基)-1-哌嗪乙醇二盐酸盐；3-(4-(3-氯苯基)哌嗪-1-基)-1，1-二苯基丙-2-醇)购自GlpBio公司(CAS：1173022-77-9)。
下面通过具体的实施例来进一步详细说明本发明的技术方案。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
在雄性C57BL/6J小鼠的丘脑室旁核埋置导药管
八周的雄性C57BL/6J小鼠(卡文斯，中国江苏)用于颅内给药。动物经1％的戊巴比妥钠(50mg/kg，i.p.)麻醉，头部备皮。随后将小鼠固定于立体定位仪(瑞沃德，中国深圳)，红霉素眼膏涂抹小鼠眼部预防感染，用碘伏对小鼠头顶部进行消毒，并用镊子提起头部皮肤，使用剪刀减去小鼠面积约7x7mm头皮，随后清理小鼠颅骨表面脑膜等结缔组织。调平小鼠颅骨，颅顶水平的判断标准：前后囟高度差和左右对称部分高度差均小于±0.03mm。根据小鼠脑图谱The Mouse Brain in Stereotaxic Coodinates(第二版，George Paxinos和KeithB.J.Frank主编)最终确定丘脑室旁核的坐标(AP：-0.7mm；ML：0mm；DV：-3.2mm；0°)。小鼠在实验前1周植入导管。使用立体定位仪器将24号导管(瑞沃德，中国深圳)植入小鼠颅内。以上步骤结束后，将小鼠从立体定位仪上取下并放置在加温垫上进行术后复苏，待完全苏醒后将小鼠放回动物房继续饲养。
实施例2
完全弗氏佐剂(CFA)诱导的炎症性的炎性痛-抑郁共病模型的建立
动物经1％的戊巴比妥钠(50mg/kg，i.p.)麻醉后，对照组小鼠在左足底注射0.9％NaCl(10μL，Vicmed)，实验组小鼠在左足底注射CFA(10μL，Sigma-Aldrich)诱导炎性疼痛，每隔一周注射一次，连续注射四次建立炎性痛-抑郁共病模型。
实施例3
丘脑室旁核微量注射Htr1d激动剂GR-46611、拮抗剂BRL-15572
分别将GR-46611(CAS：185259-85-2；GlpBio)、BRL-15572(CAS：1173022-77-9；GlpBio)溶解在5％羟丙基-β-环糊精(CAS：128446-35-5；GlpBio)中。使用微量注射泵(瑞沃德，中国深圳)将GR-46611(0.144nM)、BRL-15572(0.144nM)持续缓慢输入小鼠颅内，疼痛行为学测试及抑郁样行为测试在颅内给药后30分钟进行。
实施例4
在小鼠的丘脑室旁核内单次注射Htr1d激动剂GR-46611，具体步骤包括：将预先在丘脑室旁核埋置好导药管的雄鼠分为两组，对其中一组小鼠丘脑室旁核进行微量注射生理盐水(1μL，含5％羟丙基-β-环糊精)，对另外一组小鼠丘脑室旁核进行微量注射Htr1d激动剂GR-46611(0.6nM，1μL)。
实施例5
在小鼠的丘脑室旁核内连续7天注射Htr1d激动剂GR-46611，具体包括：将预先在丘脑室旁核埋置好导药管的雄鼠分为两组，对其中一组小鼠丘脑室旁核施予连续7天，每天一次微量注射生理盐水(1μL，含5％羟丙基-β-环糊精)，对另外一组小鼠丘脑室旁核施予连续7天，每天一次微量注射Htr1d激动剂GR-46611(0.6nM，1μL)。
实施例6
丘脑室旁核内单次注射Htr1d拮抗剂BRL-15572对CFA炎性痛引起的疼痛-抑郁共病小鼠的疼痛阈值、以及悬尾实验、和强迫游泳实验的不动时间进行分析，具体包括：
将预先在丘脑室旁核埋置好导药管的雄鼠分为四组，并对其中两组小鼠足底注射生理盐水，另外两组小鼠足底注射CFA建立疼痛-抑郁共病模型。对其中两组足底注射生理盐水的一组小鼠丘脑室旁核进行单次微量注射生理盐水(1μL，含5％羟丙基-β-环糊精)，一组小鼠丘脑室旁核进行单次微量注射Htr1d拮抗剂BRL-15572(0.144nM，1μL)；对另外两组模型小鼠其中一组在丘脑室旁核进行单次微量注射生理盐水(1μL，含5％羟丙基-β-环糊精)，一组小鼠丘脑室旁核进行单次微量注射Htr1d拮抗剂BRL-15572(0.144nM，1μL)。
本发明进行动物试验分别采用的实验方法包括冯·弗雷试验、悬尾实验和强迫游泳实验。
其中，具体试验方法分别包括：
1.冯·弗雷试验
通过冯·弗雷试验(机械痛行为学检测)考察小鼠机械痛缩足阈值。具体包括：
分别将每只小鼠单独放置于透明多孔亚克力盒(8cm×8cm×5.5cm)中并放置在底为1cm×1cm孔径的铁丝网上让小鼠适应测试环境。
在测试前适应1小时，用于记录的Von Frey细丝(Stoelting，Illinois，平均对数间隔δ为0.411)规格依次为0.007，0.02，0.07，0.16，0.4，1.0，2和6g。起始强度为0.16g，根据up-down法，小鼠表现为抬足或舔爪时记为疼痛X，不同记为O。
当出现XO或者OX后再测量4次，计算最后一次测量细丝g值的对数值xf，根据后6次测试序列查得κ值，计算50％机械缩足阈值(50％paw withdrawal thresholds，50％PWTs)，50％PWTs＝Power[10，(Xf+kδ)]。
2.悬尾实验
实验前将小鼠置于房间适应12小时，实验时，用胶带将小鼠悬挂在桌面上方约50cm处，胶带放置在距尾尖1cm处以防止小鼠向上攀爬。每只小鼠测试6分钟，使用SMART3.0记录并分析小鼠在后5分钟不动的总时间。不动时间是指小鼠前脚仅有轻微动作或完全不动。
3.强迫游泳实验
实验前将小鼠置于房间适应12小时，实验时，将小鼠置于高30cm、直径15cm的有机玻璃圆筒中，水深为15cm，使小鼠的后爪无法触及圆筒底部。水温保持在25±1℃。每只小鼠在圆筒中放置6分钟，最后4分钟定义为测试阶段。使用SMART3.0记录并分析小鼠不动的总时间。不动时间是指小鼠在水中停止挣扎、呈漂浮状态，或仅用一条腿轻微滑动以保持头部浮在水面。
对上述实验的结果进行数据分析：
所有数值均表示为平均值±标准误(SEM)。使用独立样本t检验和单因素方差分析对数据进行统计分析，并通过柱状图进行表示结果，P＜0.05被认为有统计学意义。
实验结果分析
实施例4中，丘脑室旁核内单次注射Htr1d激动剂GR-46611可降低正常小鼠疼痛阈值，但不能引起抑郁样行为的产生。
结果如图1a所示，在丘脑室旁核注射Htr1d激动剂GR-46611可以显著降低小鼠机械痛阈值。
结果如图1b和图1c所示，但对小鼠在悬尾实验及强迫游泳实验中的不动时间没有影响。
实施例中，丘脑室旁核内连续7天注射Htr1d激动剂GR-46611可降低正常小鼠疼痛阈值，同时导致小鼠出现抑郁样行为。
结果如图2a所示，在丘脑室旁核连续7天注射Htr1d激动剂GR-46611可以显著降低小鼠机械痛阈值；图2b和2c所示的悬尾实验及强迫游泳实验结果显示，在丘脑室旁核连续7天注射Htr1d激动剂GR-46611可以同时增加了小鼠在悬尾实验及强迫游泳实验中的不动时间。
实施例6结果显示，在小鼠的丘脑室旁核内单次注射Htr1d拮抗剂BRL-15572对CFA炎性痛引起的疼痛-抑郁共病小鼠的疼痛阈值、悬尾实验中的不动时间无影响，但可减少强迫游泳中的不动时间。
结果如图3a和图3b所示，在小鼠丘脑室旁核单次注射Htr1d拮抗剂BRL-15572对模型鼠的机械痛阈值(图3a)和悬尾实验中的不动时间(图3b)没有影响，但在图3c中可见，在小鼠丘脑室旁核单次注射Htr1d拮抗剂BRL-15572，可以显著降低模型鼠在强迫游泳实验中的不动时间。
4.丘脑室旁核内连续7天注射Htr1d拮抗剂BRL-15572不仅可提高CFA炎性痛引起的疼痛-抑郁共病小鼠的疼痛阈值，还可降低悬尾实验和强迫游泳实验中的不动时间。
将预先在丘脑室旁核埋置好导药管的雄鼠分为四组，分别包括对其中两组小鼠足底注射生理盐水，另外两组小鼠足底注射CFA建立炎性痛-抑郁共病模型。
具体包括，对其中两组足底注射生理盐水的小鼠，一组小鼠丘脑室旁核施予连续7天，每天一次微量注射生理盐水(1μL，含5％羟丙基-β-环糊精)，另一组小鼠丘脑室旁核施予连续7天，每天一次微量注射Htr1d拮抗剂BRL-15572(0.144nM，1μL)。
对另外两组CFA建立炎性痛-抑郁共病模型的小鼠，其中一组小鼠在丘脑室旁核施与连续7天，每天一次微量注射生理盐水(1μL，含5％羟丙基-β-环糊精)，另一组小鼠在丘脑室旁核施予连续7天，每天一次微量注射Htr1d拮抗剂BRL-15572(0.144nM，1μL)。
参阅图4a所示，在丘脑室旁核连续7天注射Htr1d拮抗剂BRL-15572可显著提高模型鼠的机械痛阈值。
参阅图4b和图4c，采用上述实验方法，在小鼠丘脑室旁核连续7天注射BRL-15572，可以明显地降低悬尾实验和强迫游泳实验中的不动时间。
以上仅为本发明的优选实施例而已，其并非因此限制本发明的保护范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，通过常规的替代或者能够实现相同的功能在不脱离本发明的原理和精神的情况下对这些实施例进行变化、修改、替换、整合和参数变更均落入本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种HTR1D作为靶点在制备预治疗疼痛-抑郁共病的药物中的应用。
2.根据权利要1所述的应用，其特征在于，包括以HTR1D作为靶点，HTR1D激动剂为GR-46611。
3.根据权利要2所述的应用，其特征在于，所述HTR1D激动剂注射小鼠的丘脑室旁核内，单次注射所述Htr1d激动剂GR-46611可用于降低正常小鼠疼痛阈值，且不引起抑郁样行为的产生。
4.根据权利要2所述的应用，其特征在于，所述HTR1D激动剂的浓度为0.6nM，剂量为1μL。
5.根据权利要1所述的应用，其特征在于，包括以HTR1D作为靶点，Htr1d拮抗剂为BRL-15572。
6.根据权利要5所述的应用，其特征在于，将所述Htr1d拮抗剂注射小鼠的丘脑室旁核内，所述Htr1d拮抗剂可用于提高CFA炎性痛引起的疼痛-抑郁共病小鼠的疼痛阈值，降低悬尾实验和强迫游泳实验中的不动时间。
7.根据权利要6所述的应用，其特征在于，所述Htr1d拮抗剂的浓度0.144nM，注射剂量为1μL。
8.根据权利要7所述的应用，其特征在于，所述Htr1d拮抗剂在小鼠的丘脑室旁核内连续7天注射。
9.一种疼痛-抑郁共病的药物，至少包括Htr1d激动剂GR-46611或Htr1d拮抗剂BRL-15572。
10.如权利要求9所述的疼痛-抑郁共病的药物，其特征在于，包括治疗炎性痛-抑郁共病的药物。
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