CN107661324B

CN107661324B - 普罗帕酮在制备治疗食管癌药物中的应用

Info

Publication number: CN107661324B
Application number: CN201711021028.3A
Authority: CN
Inventors: 李斌; 郑炜彬; 何庆瑜
Original assignee: Jinan University
Current assignee: Jinan University
Priority date: 2017-10-27
Filing date: 2017-10-27
Publication date: 2019-09-17
Anticipated expiration: 2037-10-27
Also published as: CN107661324A

Abstract

本发明提供了普罗帕酮在医药技术领域中的新用途，即在制备治疗食管癌药物中的应用。本发明首次发现了盐酸普罗帕酮通过干扰线粒体活性从而抑制食管癌细胞的增殖和肿瘤生长，并首次通过动物实验进一步验证了普罗帕酮可显著抑制癌细胞的生长；同时证明了普罗帕酮对正常细胞和动物重要器官都没有明显毒性，选择性好。普罗帕酮是经过国家食品药品监督管理总局批准的临床用药，其药理安全性高，开发利用的前景好，本发明为癌症辅助治疗提供一种新的药物来源。

Description

普罗帕酮在制备治疗食管癌药物中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，特别涉及普罗帕酮在制备治疗食管癌药物中的应用。

背景技术

癌症治疗是当前世界难以攻克的疑难杂症之一，不但难以完全治愈，而且病人的生存期的提高也存在很多困难。其中，食管癌，是我国高发的恶性肿瘤之一，在世界范围内常见癌症排名第八、致死率排名第五的癌症类型(Jemal A,Bray F,Center MM,Ferlay J,Ward E and Forman D.Global cancer statistics.CA Cancer J Clin 2011；61:69-90.)。虽然应对癌症的治疗方案在迅速发展，但是药物毒副作用和耐药性引起的术后复发给治疗带来巨大的挑战。因此新的更安全有效的治疗选择是非常迫切需要的。随着“老药新用”概念的提出(Liu Q.Editorial:Old Drugs Learn New Tricks:Advances andApplications for Drug Repurposing.Curr Top Med Chem 2016；16:3627-3628.)，越来越多医生和科学家认为若能在基础和临床得到验证，即可探究已被普及应用的临床非抗肿瘤药物开发为新的抗癌药物。这既可以节约新药的开发成本和时间，也在药物的物化、药代和安全性得到一定的保证。

盐酸普罗帕酮(Propafenone HCl)，又名心律平，是被广泛应用于临床的ⅠC类抗心律失常药物(Stoschitzky K,Klein W,Stark G,Stark U,Zernig G,Graziadei I andLindner W.Different stereoselective effects of(R)-and(S)-propafenone:clinicalpharmacologic,electrophysiologic,and radioligand binding studies.ClinPharmacol Ther 1990；47:740-746.)，具有强的钠通道阻滞作用，同时也具有一定程度钙通道和β受体阻滞作用(Hancox JC and Mitcheson JS.Inhibition of L-type calciumcurrent by propafenone in single myocytes isolated from the rabbitatrioventricular node.Br J Pharmacol 1997；121:7-14.；Lee JT,Kroemer HK,Silberstein DJ,Funck-Brentano C,Lineberry MD,Wood AJ,Roden DM and WoosleyRL.The role of genetically determined polymorphic drug metabolism in thebeta-blockade produced by propafenone.N Engl J Med 1990；322:1764-1768.)。临其床适用症状有阵发性室上性心动过速，阵发性房颤，室性心律失常等(Stoschitzky K,Stoschitzky G,Lercher P,Brussee H,Lamprecht G and Lindner W.Propafenone showsclass Ic and class II antiarrhythmic effects.Europace 2016；18:568-571.)。然而该药在抑制食管癌增殖生长的作用方面目前无报道，也无相关的专利申请。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供普罗帕酮在医药技术领域中的新用途，即普罗帕酮在制备治疗食管癌药物中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

普罗帕酮在制备治疗食管癌药物中的应用。

所述的治疗食管癌的作用机制包括：破坏食管癌细胞线粒体活性从而抑制细胞的增殖和肿瘤生长。

所述的食管癌细胞包括KYSE30、KYSE150和KYSE270等。

所述的治疗食管癌药物中含有普罗帕酮和其药用盐中的至少一种。

所述的药用盐优选为盐酸普罗帕酮。

所述的治疗食管癌药物含有一种或多种药学上可接受的载体或辅料。

所述的辅料优选为缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂或润滑剂。

所述的治疗食管癌药物还包含其他起配伍协同作用的有效成分。

所述的治疗食管癌药物可以采用本领域的常规方法制备成各种剂型，如胶囊、丸剂、片剂、口服液、颗粒剂、酊剂等口服给药的剂型及注射液等口服以外的给药剂型，如针剂等。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1.本发明结合体外与体内实验，首次发现了盐酸普罗帕酮可以通过干扰线粒体活性从而抑制食管癌细胞的增殖和肿瘤生长，效果显著；并且对正常细胞和动物重要器官都没有明显毒性，选择性强。

2.本发明在结合体外细胞实验的基础上，通过构建比细胞实验更接近真实癌症发生环境的动物模型，首次通过裸鼠体内成瘤实验进一步验证了普罗帕酮可抑制癌细胞的生长。

3.盐酸普罗帕酮是经过国家食品药品监督管理总局批准的临床用药，其药理安全性高，开发利用的前景好。本发明提供盐酸普罗帕酮的新应用，为癌症辅助治疗提供一种新的药物来源。

附图说明

图1是盐酸普罗帕酮对食管癌细胞(KYSE30、KYSE150和KYSE270)及正常人食管上皮细胞(SHEE)的增殖活性影响分析图。

图2是盐酸普罗帕酮对食管癌细胞KYSE30、KYSE150和KYSE270克隆形成数影响的结果图。

图3是流式细胞术检测盐酸普罗帕酮诱导食管癌细胞KYSE30、KYSE150和KYSE270线粒体膜电势的结果分析图。

图4是蛋白免疫印迹法检测盐酸普罗帕酮影响食管癌细胞KYSE30、KYSE150和KYSE270的蛋白Bcl-2和Bcl-x的表达水平结果图。

图5是盐酸普罗帕酮对肝癌细胞(Huh7)的增殖活性影响分析图。

图6是实施例2的裸鼠体内皮下成瘤实验结果照片图。

图7是实施例2的肿瘤的生长曲线结果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1盐酸普罗帕酮抑制食管癌细胞增殖的体外实验

(1)将KYSE30细胞、KYSE150细胞和KYSE270细胞(购自DSMZ,Braunschweig,Germany)分别铺于96孔板中，每孔3000个细胞，每个细胞株三块96孔板。待细胞完全贴壁后，将一定浓度梯度(0μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM)的盐酸普罗帕酮处理细胞(即每1mLRPMI1640细胞培养基(购自Life Technologies,Gaithersburg,MD,USA)分别加入1mM盐酸普罗帕酮0μL、2.5μL、5μL、10μL和20μL，再按每孔100μL体积加入对应96孔板)。分别在处理24、48和72小时后用WST-1细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(购自碧云天生物技术有限公司)检测细胞活性。用相同的处理方式作用于人食管上皮细胞SHEE(该细胞已公开记载于现有技术：沈忠英,岑山,蔡维佳,等.人乳头状瘤病毒18型E6和E7基因诱导人胚食管上皮永生化[J].中华实验和临床病毒学杂志,1999(2):121-123.)。

(2)将KYSE30、KYSE150和KYSE270分别铺于6孔板中，每孔3000个细胞。待细胞完全贴壁后，将一定浓度梯度的盐酸普罗帕酮(0μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM)处理细胞(即每1mL细胞培养基分别加入1mM盐酸普罗帕酮0μL、2.5μL、5μL、10μL和20μL，再按每孔2mL体积加入对应6孔板)。待单克隆长成后，用结晶紫染色后统计各个孔的克隆形成数。

(3)食管癌细胞(KYSE30、KYSE150和KYSE270)在0、10和20μM浓度盐酸普罗帕酮处理72小时后，通过线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)(购自碧云天生物技术有限公司)和C6流式细胞仪检测其红色荧光和绿色荧光比值。相同处理条件处理细胞后，通过蛋白免疫印迹法检测线粒体外膜表面的蛋白Bcl-2和Bcl-xL的表达水平。

(4)将肝癌细胞Huh7(购自中国科学院细胞库)铺于96孔板中，每孔3000个细胞。待细胞完全贴壁后，将10μM盐酸普罗帕酮处理细胞72h后用WST-1细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(购自碧云天生物技术有限公司)检测细胞活性。其中，用1％DMSO(购自Sigma-Aldrich，USA)处理细胞72h作为对照组。并且进行三次独立生物学重复实验。

结果如图1～5所示。在图1A中，食管癌细胞的增殖活性随着盐酸普罗帕酮浓度的增加而减弱，并且随着处理时间延长，这种影响更加显著；而正常的人食管上皮细胞则几乎不受药物的影响(图1B)。相应的，从图2可知，随着盐酸普罗帕酮浓度增加，食管癌细胞克隆形成数减少。

由图3可知，在盐酸普罗帕酮处理下，红色荧光和绿色荧光比值减少，证明食管癌细胞线粒体膜电势减少，膜表位平衡遭到破坏，线粒体失活从而导致细胞生长能力受到抑制。同时，Bcl-2和Bcl-xL对维持线粒体膜表面平衡起着重要作用，由图4可知，在盐酸普罗帕酮处理下，Bcl-2和Bcl-xL两个蛋白表达量下降，进一步说明盐酸普罗帕酮线粒体膜表位失衡，膜的通透性增加。以上实验结果表明盐酸普罗帕酮可以破坏食管癌细胞线粒体活性从而显著地抑制细胞的增殖。此外，图5反映，盐酸普罗帕酮的处理对肝癌细胞活性并没有显著的抑制效果。

实施例2盐酸普罗帕酮抑制食管癌的肿瘤生长的体内实验

选取21只6周龄、雌性裸小鼠(balb/c-nu/nu)，对照组7只和实验组14只，构建裸鼠皮下成瘤模型：

(1)将食管癌细胞KYSE270重悬于PBS中后与基质胶(Corning Matrigel Matrix,购自Corning,NY,USA)按体积比1:1混合。

(2)实验前进行裸鼠麻醉，通过无痛及有痛刺激来评估麻醉程度，确定裸鼠处于麻醉状态。

(3)用微量注射器取步骤(1)的重悬细胞对裸鼠进行皮下注射，每只裸小鼠需打入5*10⁵个食管癌细胞KYSE270，一共21只。

(4)药物处理：注射KYSE270细胞一周后，开始用腹腔注射的方式给药。本实验共设置3个盐酸普罗帕酮浓度梯度，盐酸普罗帕酮溶解于1x PBS中，分别得到浓度梯度为0mg/kg(对照组)，10mg/kg和20mg/kg的盐酸普罗帕酮溶液，每个浓度梯度给药7只裸鼠，每两天给药一次，每只小鼠一次注射100μL体积对应浓度的盐酸普罗帕酮。每三天测量裸鼠体重和肿瘤的体积。

图6展示了裸鼠体内皮下成瘤实验结果。图7中，肿瘤的生长曲线表明食管癌细胞成瘤能力受到盐酸普罗帕酮的明显抑制，尤其是在接受20mg/kg盐酸普罗帕酮处理后，相对于对照组肿瘤生长的体积减少了69.2％。表明盐酸普罗帕酮可以抑制食管癌的肿瘤生长。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.普罗帕酮在制备治疗食管癌药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的普罗帕酮在制备治疗食管癌药物中的应用，其特征在于，所述的治疗食管癌的作用机制包括：

破坏食管癌细胞线粒体活性从而抑制细胞的增殖和肿瘤生长。

3.根据权利要求1所述的普罗帕酮在制备治疗食管癌药物中的应用，其特征在于：

4.根据权利要求3所述的普罗帕酮在制备治疗食管癌药物中的应用，其特征在于：所述的药用盐为盐酸普罗帕酮。

5.根据权利要求1所述的普罗帕酮在制备治疗食管癌药物中的应用，其特征在于：

6.根据权利要求5所述的普罗帕酮在制备治疗食管癌药物中的应用，其特征在于：

所述的辅料为缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂或润滑剂。

7.根据权利要求1所述的普罗帕酮在制备治疗食管癌药物中的应用，其特征在于：

所述的治疗食管癌药物可以采用本领域的常规方法制备成各种剂型。