CN107583051A - 一种治疗阿尔茨海默病的microRNA及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术和医学领域，具体涉及一种治疗阿尔茨海默病的microRNA及其应用。本发明经过广泛而深入的研究，首次揭示了microRNA‑146a的上调对于缓解或治疗阿尔茨海默病具有显著的效果，且本发明中所表达的microRNA‑146a靶在阿尔茨海默动物模型及人的大脑试样中共同进行高表达，是在没有实验误差的情况下所选择的实质性的治疗靶。因此，microRNA‑146a可以作为阿尔茨海默病的新的治疗靶点。
Description
技术领域
本发明属于生物技术和医学领域，具体涉及一种治疗阿尔茨海默病的microRNA及其应用。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer‘s Disease，AD)是发生于老年和老年前期的一种渐进性的神经退行性疾病，并且是老年人中最常见的痴呆性疾病，其病理特点是淀粉样蛋白在细胞外沉着和细胞内封入神经纤维缠结(NFT)的增加。目前，对阿尔茨海默病没有治疗方法。阿尔茨海默病的主要分子机制包括错折叠蛋白质、氧化损伤、炎症性损伤及能源衰竭。炎症反应在AD发生发展中的作用一直是其发病机制研究的热点，持续存在的慢性炎症反应可能是形成患者病理特征形成及其病程发展的诱因之一。炎症反应是Aβ沉积引起的继发性反应，也是导致神经元退行性变的重要因素之一。而目前研究指向β样淀粉蛋白(Amyloid-β，Aβ42)在脑内沉积对神经细胞的毒性是AD发病的关键因素(Huang Y,MuckeL.Alzheimermechanisms and therapeutic strategies.Cell.2012367(148),1204-1222)。当Aβ42在细胞外形成聚集体后，可通过激活脑内的“免疫细胞”-小胶质细胞的表面受体刺激小胶质细胞释放一系列炎症相关因子如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)等，诱导阿尔茨海默病的慢性炎症反应，导致神经细胞受损，加重病情的发展，引起持续的慢性炎症反应，同时炎性因子的异常释放又可以反作用于APP的代谢，加速Aβ的生成，而过量释放的炎症因子又会进一步激活胶质细胞释放炎症因子，形成正反馈回路的恶性循环，进一步加重炎症反应，最终加重了AD的病程发展。通过抑制Aβ对小胶质细胞的激活而引发的炎症反应，可间接减少Aβ对神经元的损伤，缓解AD的症状(AziziG,MirshafieyA.Thepotential role of proinflammatory and anti inflammatory cytokines inAlzheimer disease pathogenesis.Immunopharmacol Immunotoxicol.2012,34(6):881-95)。
微小RNA(micro RNA，简称miRNA)是一类短序列、非编码、具有调控功能的单链小分子RNA，长约18～24nt。关于miRNA的最早报道是1993年Lee等报道的在秀丽线虫(C.elegants)体内发现的一种呈时间特异性表达的小分子RNA，即可调节线虫发育的lin-4(Lee，R.C.等，The C.elegansheterochronic gene lin-4encodes small RNAs withantisense complementarity to lin-14.Cell.1993，75：843 854)。2000年，Reinhart等(Reinhart，B.J.等，The 21-nucleotide let-7RNAregulates developmental timing inCaenorhabditis elegans.Nature.2000，403：901906)又发现不同时期表达的let-7。到目前，公用miRNA数据库中已收录了数百种人类miRNA序列，其中三分之二已被实验证实。中枢神经系统中也有自己独特的miRNA，参与神经系统疾病的生理、病理及生物反馈过程，如神经细胞发育、胶质细胞增生、神经细胞凋亡及坏死等。众所周知，几个miRNA，例如，miR-8，9/9*或133b对神经退化进行干预(Karres et al.，2007Kim et al.，2007；Packer et al.，2008)。对于阿尔茨海默病的研究而言，几个miRNA的表达变化及它们对阿尔茨海默病的干预也是众所周知的(Maes et al.，2009；Hebert and De Strooper，2009)。虽然，此类研究扩大了对阿尔茨海默病的理解，但miRNA的对阿尔茨海默病的直接治疗用途还未进行尝试。
将miRNA与其它大分子物质有效地输送到中枢神经系统(Central nervoussystem，CNS)，是众多CNS疾病治疗药物发挥作用所面临的挑战，但不幸的是，血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)可能限制了治疗CNS疾病的药物进入。据统计，有近98％的大分子药物不能通过BBB。现研究有几种可以通过BBB的方法，包括化学和生物药系统、BBB破坏，分子木马和微粒载药系统等。鼻腔给药是近几年来新发现的一种CNS给药途径，目前已引起许多神经专家的关注。经鼻给药是一种可以绕过BBB直接进入脑内的无创给药方法。多项研究表明，大分子物质可以经鼻腔注入后通过嗅觉传导通路进入脑组织，而血药浓度并无升高，嗅觉传导通路为不能透过BBB的大分子蛋白药物提供了直接进入CNS的无创给药途径,这也为CNS提高治疗药物浓度，增加药效提供了方便。动物研究证实一些神经营养因子如BDNF，CNTF，NT-4等能通过鼻腔给药这条途径快速准确地到达CNS治疗部位，发挥疾病作用(Boudreau R L,Rodriguez-Lebron E,Davidson B L.RNAi medicine for the brain:progresses and challenges.Hum Mol Genet,2011,20(R1):R21-R27)。
发明内容
为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种治疗阿尔茨海默病的microRNA及其应用。
为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供miR-146a上调剂在制备用于预防、缓解或治疗阿尔茨海默病的药物中的用途。
进一步地，所述预防、缓解或治疗阿尔茨海默病的药物至少具有以下功用之一：抑制TLR4通路下游蛋白表达，减轻炎症反应，缓解阿尔茨海默病发病严重程度。
进一步地，所述miR-146a上调剂是指提高miR-146a水平的物质。
具体的，所述提高miR-146a水平可以采用各种化学、物理、生物的方法。包括但不限于：
(1)调节miR-146a代谢通路以提高miR-146a表达水平；
(2)于中枢神经系统内直接增加miR-146a水平。
可将miR-146a或miR-146a模拟物进入中枢神经系统内直接增加中枢神经系统内miR-146a水平。
调节miR-146a代谢通路可以是采用miR-146a激动剂来提高miR-146a的活性或促进miR-146a转录或表达，从而上调miR-146a水平。
本发明实施例已证实于中枢神经系统内直接增加miR-146a水平可缓解或治疗阿尔茨海默病。而基于现有技术可知，前述调节miR-146a代谢通路的方法可上调miR-146a水平。由此可推知，前述调节miR-146a代谢通路的方法亦可获得可缓解或治疗阿尔茨海默病的效果，进而认为这些方法亦可缓解或治疗阿尔茨海默病。
因此，miR-146a上调剂可以是miR-146a、miR-146a模拟物或miR-146a激动剂。
如本发明一些实施方式所例举的，miR-146a模拟物的正向序列如SEQ ID NO.1所示。
所述预防、缓解或治疗阿尔茨海默病的药物必然包括miR-146a上调剂，并以miR-146a上调剂作为前述功用的有效成分。
所述预防、缓解或治疗阿尔茨海默病的药物中，发挥前述功用的有效成分可仅为miR-146a上调剂，亦可包含其他可起到类似功用的分子。
亦即，miR-146a上调剂为所述预防、缓解或治疗阿尔茨海默病的药物的唯一有效成分或有效成分之一。
所述预防、缓解或治疗阿尔茨海默病的药物可以为单成分物质，亦可为多成分物质。
所述预防、缓解或治疗阿尔茨海默病的药物的形式无特殊限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。
所述预防、缓解或治疗阿尔茨海默病的药物主要针对的对象为哺乳动物，如啮齿类动物、灵长类动物等。
本发明的第二方面，提供了一种预防、缓解或治疗阿尔茨海默病的方法，为向对象施用miR-146a上调剂。
所述对象可以为哺乳动物。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或人。
所述对象可以是罹患阿尔茨海默病的患者或者期待预防或缓解阿尔茨海默病的个体。
miR-146a上调剂可以在接受阿尔茨海默病治疗前、中、后向对象施用。
本发明的第三方面，提供一种预防、缓解或治疗阿尔茨海默病的药物，包括有效剂量的miR-146a上调剂。
进一步地，所述预防、缓解或治疗阿尔茨海默病的药物，包括有效剂量的miR-146a上调剂及药用载体。
所述预防、缓解或治疗阿尔茨海默病的药物必然包括miR-146a上调剂，并以miR-146a上调剂作为前述功用的有效成分。
所述预防、缓解或治疗阿尔茨海默病的药物中，发挥前述功用的有效成分可仅为miR-146a上调剂，亦可包含其他可起到类似功用的分子。
亦即，miR-146a上调剂为所述预防、缓解或治疗阿尔茨海默病的药物的唯一有效成分或有效成分之一。
所述预防、缓解或治疗阿尔茨海默病的药物可以为单成分物质，亦可为多成分物质。
所述预防、缓解或治疗阿尔茨海默病的药物的形式无特殊限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。
所述预防、缓解或治疗阿尔茨海默病的药物主要针对的对象为哺乳动物，如啮齿类动物、灵长类动物等。
本发明的第四方面，提供一种阿尔茨海默病联合治疗药物组合，包括有效剂量的miR-146a上调剂和至少一种其他阿尔茨海默病治疗药物。
所述联合治疗药物组合可以是以下形式中的任意一种：
一)将miR-146a上调剂和其他阿尔茨海默病治疗药物分别制成独立的制剂，制剂的剂型可相同或不同，给药途径亦可相同或不同。
当其他阿尔茨海默病治疗药物为抗体时，一般采用胃肠外给药型。当其他阿尔茨海默病治疗药物为化学药物时，给药形式可以比较丰富，可以是胃肠道给药亦可以是非胃肠道给药。一般推荐针对各化学药物的已知给药途径给药。为了顺利透过血脑屏障，可鼻腔内给药。
二)将miR-146a上调剂和其他阿尔茨海默病治疗药物配置成复方制剂，在将miR-146a上调剂和其他阿尔茨海默病治疗药物采用相同给药途径给药并同时施加时，可采用将两者配置成复方制剂的形式。
本发明的第五方面，提供了一种预防、缓解或治疗阿尔茨海默病的方法，为向对象施用有效量的miR-146a上调剂以及向对象施用有效量的其他阿尔茨海默病治疗药物和/或向对象实施其他阿尔茨海默病治疗手段。
可以同步地或顺序地给予有效量的miR-146a上调剂和至少一种有效量的其他阿尔茨海默病治疗药物。
基于miR-146a为本发明首次发现的阿尔茨海默病治疗靶点，在与miR-146a上调剂以外的其他阿尔茨海默病治疗药物联合用药中，至少可以起到疗效相加的效果，进一步增强对于阿尔茨海默病的治疗效果。
其他阿尔茨海默病治疗药物包括但不限制于：抗体药物、化学药物或靶向型药物等。
所述miR-146a上调剂可以是胃肠道给药或者胃肠外给药。所述其他阿尔茨海默病治疗药物可以胃肠道给药或者胃肠外给药。为了顺利透过血脑屏障，可鼻腔内给药。
本发明的第六方面，提供miR-146a上调剂在制备具有以下任一项或多项作用的药物中的用途：抑制TLR4通路下游蛋白表达，减轻炎症反应。
进一步地，所述TLR4通路下游蛋白选自NF-kB、IRAK1和TRAF6。
本发明的第七方面，提供miR-146a用于筛选预防、缓解或治疗阿尔茨海默病的药物的用途。
miR-146a用于筛选缓解、预防或治疗阿尔茨海默病的药物具体是指将miR-146a作为作用靶标应用于筛选预防、缓解或治疗阿尔茨海默病的药物。
将miR-146a作为作用靶标应用于筛选预防、缓解或治疗阿尔茨海默病的药物具体是指将miR-146a作为作用对象，对候选物质进行筛选，以找到可以提高miR-146a表达的物质作为备选的预防、缓解或治疗阿尔茨海默病的药物。
本发明的第八方面，提供一种筛选预防、缓解或治疗阿尔茨海默病的药物的方法，所述方法包括：
(1)用候选物质处理表达miR-146a的体系；和
(2)检测所述体系中miR-146a的表达；
其中，若所述候选物质可提高miR-146a的表达，则表明该候选物质是预防、缓解或治疗阿尔茨海默病的潜在物质。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明经过广泛而深入的研究，首次揭示了microRNA-146a的上调对于缓解或治疗阿尔茨海默病具有显著的效果，且本发明中所表达的microRNA-146a靶在阿尔茨海默动物模型及人的大脑试样中共同进行高表达，是在没有实验误差的情况下所选择的实质性的治疗靶。因此，microRNA-146a可以作为阿尔茨海默病的新的治疗靶点。
附图说明
图1：鼻腔注射药物透过血脑屏障路径示意图。
图2：3个月龄大c57小鼠，分别经鼻腔注射CY3-miR-146a 0.1nmol，CY3-miR-146a0.5nmol，且在注射后30min、1h、2h、24小时荧光表达情况，两个剂量在各个时间点均有明显cy3标记红色荧光表达，证明经鼻腔注射，CY3-miR-146a有效透过血脑屏蔽。
图3：Morris水迷宫定位航行训练实验中，与AD小鼠对照组相比，12mAD miR-146a模拟物实验组在第一、三、五天可显著缩短逃避潜伏期(P＜0.05)，结果表明给予miR-146a高表达有效的改善了AD模型小鼠学习记忆能力，特别是在病程中期，*：p<0.05,**p<0.01。
图4：Morris水迷宫定位航行训练实验中，与AD小鼠对照组相比，12mAD miR-146a模拟物实验组在第一、三、五天可显著缩短逃避潜伏期(P＜0.05)，结果表明给予miR-146a高表达有效的改善了AD模型小鼠学习记忆能力，#：p<0.05,##p<0.01。
图5：第六天撤去平台后的空间探索实验中，检测的是各组小鼠对平台的空间探索记忆能力，其中，A：12mAD miR-146a模拟物实验组与AD小鼠对照组的穿越原平台次数显著曾多；B：12mAD miR-146a模拟物实验组、18mAD miR-146a模拟物实验组与AD小鼠对照组相比，原平台所在象限的停留时间明显增加；C：12mAD miR-146a模拟物实验组与AD小鼠对照组相比在平台所在象限的游泳路程百分比之有统计学意义，*：p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。
图6：miR-146a minics(miR-146a模拟物)经鼻腔注入后，用RT-PCR检测各处理组小鼠海马IRAK1，TLR4，NF-kB，TRAF6的表达量差异，其中，A：miR-146a minics(miR-146a模拟物)干预后的12mAD、18mAD与正常对照AD相比，IRAK1蛋白的表达明显降低，****：p<0.0001，B：miR-146a minics(miR-146a模拟物)干预后的12mAD、18mAD与正常对照AD相比，TLR4蛋白的表达各组间表达无明显差异；C：miR-146a minics(miR-146a模拟物)干预后的12mAD、18mAD与正常对照AD相比，TRAF6蛋白的表达明显降低，*：p<0.05，***：p<0.001；D：miR-146a minics(miR-146a模拟物)干预后的12mAD、18mAD与正常对照AD相比，NF-kB蛋白的表达明显降低，**：p<0.01。
具体实施方式
本发明人对治疗阿尔茨海默病的靶分子进行发掘，并为了研发以此为靶的药物而努力。结果，本发明人实质上确认通过miRNA-146a上调剂，例如miRNA-146a模拟物(miR-146a minics)在阿尔茨海默病动物模型脑中高表达，有效的抑制了脑组织中的炎症反应，并恢复记忆力等，来治疗阿尔茨海默病，由此完成本发明。
miR-146a上调剂
指提高miR-146a水平的物质。提高miR-146a水平可以采用各种化学、物理、生物的方法。包括但不限于：
(1)调节miR-146a代谢通路以提高miR-146a表达水平；
(2)于中枢神经系统内直接增加miR-146a水平。
可将miR-146a或miR-146a模拟物进入中枢神经系统内直接增加中枢神经系统内miR-146a水平。
调节miR-146a代谢通路可以是采用miR-146a激动剂来提高miR-146a的活性或促进miR-146a转录或表达，从而上调miR-146a水平。
提高miR-146a的活性是指使miR-146a活性提高。优选地，相比提高前，miR-146a的活性提高至少10％，较佳的提高至少30％，再佳的提高至少50％，更佳的提高70％，最佳的提高至少90％。
促进miR-146a转录或表达是指：使miR-146a高表达，或者提高miR-146a转录活性。
本领域技术人员可以使用常规方法对miR-146a转录或表达进行调控。
优选地，miR-146a转录或表达至少提高至少10％，较佳的提高至少30％，再佳的提高至少50％，更佳的提高70％，最佳的提高至少90％。
miR-146a上调剂制备药物
以miR-146a上调剂为主要活性成分或主要活性成分之一制备药物。通常，药物中除了有效成分外，根据不同剂型的需要，还会包括一种或多种药学上可接受的载体或辅料。
“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。
“药学上可接受的载体或辅料”应当与miR-146a上调剂相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物组合物的效果。可作为药学上可接受的载体或辅料的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醉、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如Tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味。
本发明中，除非特别说明，药物剂型并无特别限定，可以被制成针剂、口服液、片剂、胶囊、滴丸、喷剂等剂型，可通过常规方法进行制备。药物剂型的选择应与给药方式相匹配。
联合治疗药物组合和施用方法
所述联合治疗药物组合可以是以下形式中的任意一种：
一)将miR-146a上调剂和其他阿尔茨海默病治疗药物分别制成独立的制剂，制剂的剂型可相同或不同，给药途径亦可相同或不同。使用时，可几种药同时使用，也可几种药先后使用。先后给药时，应当在先用药物仍对机体有效的期间内向机体施加其他药物。
二)将miR-146a上调剂和其他阿尔茨海默病治疗药物配置成复方制剂，在将miR-146a上调剂和其他阿尔茨海默病治疗药物采用相同给药途径给药并同时施加时，可采用将两者配置成复方制剂的形式。
为了顺利透过血脑屏障，可鼻腔内给药。
可以同步地或顺序地给予有效量的miR-146a上调剂和至少一种有效量的其他阿尔茨海默病治疗药物。
使用时，可将有效量的miR-146a上调剂和有效量的其他阿尔茨海默病治疗药物同时使用，也可将有效量的miR-146a上调剂和有效量的其他阿尔茨海默病治疗药物先后使用。先后给药时，应当在先用药物仍对生物体有效的期间内向生物体施加其他药物。
对本发明的特征及优点进行归纳如下：
(a)作为神经退行性疾病阿尔茨海默病的治疗靶，本发明提供miRNA-146a。
(b)本发明发掘的miRNA-146a靶是在患有阿尔茨海默病动物模型及人类大脑试样中共同实现高表达的靶，是一种在没有实验误差(artifact errors)的情况下选择的实质性治疗靶。
(c)作为miRNA-146a模拟物，本发明的寡核苷酸在以miRNA作为靶的神经退行性疾病阿尔茨海默病的治疗中，首次揭示成功的结果。
(d)本发明的miRNA-146a模拟物，在脑组织中特别是海马高水平表达，通过转录后水平抑制TLR4信号通路下游的TRAF6、IRAK1、TRAF6等蛋白的表达，抑制炎症反应，减轻了AD的病程发展，最终治疗神经退行性疾病阿尔茨海默病。
本发明证实了miR-146a作用于炎症反应过程中的一系列重要靶点，在炎症反应过程中发挥重要作用。可以将miR-146a作为药物组成成分或生物标志物，或将其作为新型药物作用靶点应用miR-146a模拟物或者miR-146a激动剂作为药物组成成分，应用于预防或治疗神经退行性疾病，最优选的是阿尔茨海默病。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
实施例1
【实验材料及实验方法】
【阿尔茨海默病模型】
本实验是受广东医科大学伦理委员会许可后实施的。包括将APP/PS1双转基因小鼠用作阿尔茨海默病转基因模型。小鼠均置于SPF(specific pathogen free)环境中饲养和护理，22℃～26℃，湿度55％～65％，12小时光暗周期条件下饲养，自由获取食物和水源。并将12个月龄或18个月龄的小鼠用于实验。
【给药分组、方式及干预时间】
取12月龄，18月龄APP/PS1小鼠，每一阶段AD正常对照组及WT鼠(c57bl/6J)，共6组，各4只。干预组给予miR-146a mimics经鼻腔注射给药(1nmol)，ad正常对照组及WT鼠，给予等量0.9％生理盐水。隔日给药共1月，共15次。
【Morris水迷宫】
Morris水迷宫(Morris water maze,MWM)为目前最为常用的评价动物学习与记忆的模型，用于测试实验动物对空间位置觉和方向觉(空间定位)的学习记忆能力。Morris水迷宫行为检测系统由圆形水槽、平台以及数据采集系统三部分组成。水槽直径1.2m，高50cm，槽壁上标记四个入水点，对称两点间连线将水槽均分4个象限；将一个直径10cm，高28cm的圆形平台(涂白)固定放置于其中一个象限中，平台项部实验时被淹没，距离水面lcm，水温保持在23℃左右，水中加入二氧化钛白化。Morris水迷宫行为实验主要包括定位航行实验和空间探索实验两部分。定位航行实验用于测量小鼠对水迷宫学习和记忆的能力，共历时4天,每天连续训练4次。训练时每次将小鼠从不同象限边缘中点位置面向池壁放入水中，观察并记录小鼠在90s内找到平台的时间，即为逃避潜伏期。如果小鼠在90s内未能找到平台则人为引导至平台，停留10s后移开，逃避潜伏期记为90s。空间搜索实验用于测量小鼠学会寻找平台后，对平台空间位置记忆的能力。实验第5天时撤除平台，任选其中一个象限将小鼠面向池壁放入水中，记录90s内小鼠穿越平台所在位置次数、在平台所在象限的停留时间及游泳路程百分比。实验过程由数据采集系统进行录像并进行数据分析。
【脑组织的准备】
各组小鼠用10％水合氯醛(按照0.35ml/100g体重)腹腔注射麻醉后，心脏左心室快速灌注4℃预冷的生理盐水，颈部脱臼处死，断头取脑，脑组织沿矢状面一分为二，迅速置于-80℃保存备用，进行后续生化分析。
【RT-PCR法检测NF-kB，IRAK1，TRAF6，TLR4的水平】
(1)总RNA提取：
取小鼠海马组织，加入1000μlTRIzol研磨，使其充分裂解；研磨完毕后，室温条件下静置10min；加入0.2ml氯仿，漩涡震荡仪上震荡20s；室温静置沉淀20min；将离心机温度调至4℃，12000rpm高速离心15min；取出离心管，吸取上清液至新的EP管；加入等体积异丙醇，颠倒混匀；室温静置沉淀20min，将离心机温度调至4℃，12000rpm高速离心15min；弃去上清液，加入1000μl 75％乙醇，用枪头反复吹打洗涤沉淀物；将离心机温度调至4℃，8000rpm高速离心15min；弃去乙醇，室温条件下，使乙醇挥发10min；加入50μl DEPC水(RNA酶抑制剂)溶解RNA沉淀物，放入-80℃冰箱保存；在逆转录前用分光光度计检RNA纯度，标准为OD260/OD280比值在1.8～2.0之间，提示RNA纯度较高，符合实验要求。
(2)逆转录反应
用反转录试剂盒将上述提取的总RNA逆转录为cDNA，按照说明书操作，整个过程均在冰上进行。随后配制逆转录反应试剂，配制完后放入MasterCycler Gradient PCR仪中进行逆转录反应，条件设为37℃15min，85℃5s，结束后，EP管立即进行RT-PCR或放入-20℃冰箱保存。
(3)实时荧光定量PCR
取上述样本，按说明书配置10ul反应体系，引物如表1，过程均在冰上操作反应条件设为：94℃预变性10min，反应40个循环，其中95℃变性45s，60℃退火60s，72℃延伸60s，结束后再72℃延伸10min。。本实验涉及的引物见(表1)。
表1
(4)实时荧光PCR数据处理：
RT-PCR的Ct值为达到阈值的循环周期数，数据用LightCycler 480ⅡDNA扩增仪分析处理，最后，用2-ΔΔCt法整理结果。
【数据分析及统计】
所有统计性分析通过统计产品与服务解决方案(SPSS，Statistical Product andService Solutions)(17.0版,SPSS公司,萨默斯,纽约)来执行。双尾概率p值(two-tailedp-value)小于0.05时，认为统计上才有意义。
【实验结果】
(一)、鼻腔注射：
鼻腔注射药物透过血脑屏障路径示意图如图1所示。
鼻腔注射采用的是miR-146a模拟物，所述miR-146a模拟物的序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：5’-ugagaacugaauuccauggguu-3’。
选取3个月龄大的c57小鼠，分别经鼻腔注射CY3标记的miR-146a模拟物0.1nmol，CY3标记的miR-146a模拟物0.5nmol，且在注射后30min、1h、2h、24小时，麻醉后颈部脱臼处死，断头取脑OTC包埋后-80℃保存，随之行冰冻切片观察免疫荧光。如图2所示，两个剂量在各个时间点均有明显cy3标记红色荧光表达。证明经鼻腔注射，CY3标记的miR-146a模拟物有效透过血脑屏蔽。
CY3标记的miR-146a模拟物也可记为：miR-146a-CY3或CY3-miR-146a。
(二)、Morris水迷宫方法检测对miR-146a AD模型小鼠学习记忆能力的影响
定位航行训练实验中，随着训练时间的增加，各组小鼠的逃避潜伏期逐渐缩短，说明了小鼠对水迷宫模型的学习能力。与AD小鼠对照组相比，12mAD miR-146a模拟物实验组在第一、三、五天可显著缩短逃避潜伏期(P＜0.05)(图3)；18mAD miR-146a模拟物实验组在第三、四天可显著缩短逃避潜伏期(P＜0.05)(图4)这说明AD小鼠的学习记忆能力得到改善；在第六天撤去平台后的空间探索实验中，检测的是各组小鼠对平台的空间探索记忆能力。我们的研究结果表明：12mAD miR-146a模拟物实验组与AD小鼠对照组的穿越原平台次数显著曾多(P＜0.01)(图5A)；12mAD miR-146a模拟物实验组与AD小鼠对照组相比，原平台所在象限的停留时间及游泳路程百分比都明显增加(P＜0.01)(图5B、图5C)；18mAD miR-146a模拟物实验组与AD小鼠对照组相比在平台所在象限的停留时间增加(P＜0.01)(图5B)但原平台所在象限的穿越原平台次数及游泳路程百分比之间的差异都没有统计学意义。结果表明给予miR-146a高表达有效的改善了AD模型小鼠学习记忆能力，特别是在病程中期，晚期也起到一定效果。
(三)、RT-PCR检测结果：
结果表明，发现miR-146a minics(miR-146a模拟物)干预后的12mAD、18mAD与正常对照AD相比，IRAK1，NF-kB，TRAF6蛋白的表达明显降低(P＜0.01)(图6)，有统计学意义，证明miR-146a minics(miR-146a模拟物)确实可以抑制TLR4通路下游蛋白表达，减轻炎症反应，缓解阿尔茨海默病发病严重程度。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
序列表
<110> 广东医科大学附属医院
<120> 一种治疗阿尔茨海默病的 microRNA 及其应用
<130> 173425
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ugagaacuga auuccauggg uu 22
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaagggctca tgaccacagt ccat 24
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcattgtcgt accaggaaat gagctt 26
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctgacctgag ccttctggac 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gcaggctatt gctcatcaca 20
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gctgtggcac cgatacct 18
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gctacaccca cccacagagt 20
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gatggttgtg tgtgtctg 18
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
agacacccca gcagctaaga 20
Claims (10)
1.miR-146a上调剂在制备用于预防、缓解或治疗阿尔茨海默病的药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述miR-146a上调剂是指提高miR-146a水平的物质。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述miR-146a上调剂选自miR-146a、miR-146a模拟物或miR-146a激动剂。
4.一种预防、缓解或治疗阿尔茨海默病的方法，为向对象施用miR-146a上调剂。
5.一种预防、缓解或治疗阿尔茨海默病的药物，包括有效剂量的miR-146a上调剂。
6.一种阿尔茨海默病联合治疗药物组合，包括有效剂量的miR-146a上调剂和至少一种其他阿尔茨海默病治疗药物。
7.一种预防、缓解或治疗阿尔茨海默病的方法，为向对象施用有效量的miR-146a上调剂以及向对象施用有效量的其他阿尔茨海默病治疗药物和/或向对象实施其他阿尔茨海默病治疗手段。
8.miR-146a上调剂在制备具有以下任一项或多项作用的药物中的用途：抑制TLR4通路下游蛋白表达，减轻炎症反应。
9.miR-146a用于筛选预防、缓解或治疗阿尔茨海默病的药物的用途。
10.一种筛选预防、缓解或治疗阿尔茨海默病的药物的方法，所述方法包括：
(1)用候选物质处理表达miR-146a的体系；和
(2)检测所述体系中miR-146a的表达；
其中，若所述候选物质可提高miR-146a的表达，则表明该候选物质是预防、缓解或治疗阿尔茨海默病的潜在物质。
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| WO2010151640A2 (en) * | 2009-06-24 | 2010-12-29 | Board Of Regents Of The University Of Nebraska | Compositions and methods for the diagnosis and treatment of inflammatory disorders and fibrotic disease |
-
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