CN111973631A - 牙髓间充质干细胞在制备阿尔茨海默病治疗药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及牙髓间充质干细胞在阿尔茨海默病治疗中的应用。本发明通过试验研究，首次发现移植牙髓间充质干细胞可以抑制脑部慢性炎症，并在一定程度上改善其学习记忆能力以及运动能力，且可以减少海马各区小胶质细胞的数量，有效治疗阿尔茨海默病。

Description

牙髓间充质干细胞在制备阿尔茨海默病治疗药物中的用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及牙髓间充质干细胞在制备阿尔茨海默病治疗药物中的用途。

背景技术

阿尔茨海默病(AD)是一种难以预防和治愈的神经退行性疾病，给老年人及其家属带来严重的经济和生活负担。AD多发于70岁以上的老人，主要病理特征为脑内β淀粉样蛋白异常聚集形成的老年斑、Tau蛋白过度磷酸导致的神经元内纤维缠结、脑区不同程度萎缩。AD的致病机理非常复杂，迄今为止，AD的发病机制众说纷纭，具体机制尚不明确。目前，临床用于治疗AD的药物主要是非竞争性N-甲基-D-天冬氨酸受体拮抗剂和胆碱酯酶抑制剂，但现有药物只能延缓AD的发病进程，对于中重度患者也没有治疗作用。目前认为，β淀粉样蛋白的异常堆积及Tau蛋白的过度磷酸化是AD发展的主要原因。随着针对清除β淀粉蛋白药物研发的失败，一些新的关于AD发病机制的科学研究也在开展中。

人口老龄化是中国乃至全世界无法回避的事实，AD等老年性疾病引发的社会问题已然非常严峻，近期根据AD其相关发病机制研发的治疗药物在临床阶段相继宣告失败，而合理有效的临床药物依然空缺。因此寻找一种有效的AD治疗药物及手段是在目前来看是极为紧迫的。

发明内容

为了解决现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于，提供牙髓间充质干细胞在制备阿尔茨海默病治疗药物中的应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明的的第一方面，提供了牙髓间充质干细胞用于制备阿尔茨海默病治疗药物的用途。

所述牙髓间充质干细胞为现有技术，可通过市购途径获得，也可由本领域技术人员根据具体需要自行制备获得。

一种实施方式中，所述牙髓间充质干细胞可来源于脱落乳牙。

一种实施方式中，所述阿尔茨海默病治疗药物至少具有以下功用之一：

(1)抑制脑部慢性炎症；(2)改善学习记忆能力；(3)改善运动能力；(4)减少海马各区过度激活小胶质细胞的数量。

所述阿尔茨海默病治疗药物必然包括牙髓间充质干细胞，并以牙髓间充质干细胞作为前述功用的有效成分。

所述阿尔茨海默病治疗药物中，发挥前述功用的有效成分可仅为牙髓间充质干细胞亦可包含其他可起到类似功用的分子。

亦即，牙髓间充质干细胞为所述阿尔茨海默病治疗药物的唯一有效成分或有效成分之一。

所述阿尔茨海默病治疗药物形式无特殊限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。

所述阿尔茨海默病治疗药物主要针对的对象为哺乳动物，如啮齿类动物、灵长类动物等。

本发明的第二方面，提供了一种治疗阿尔茨海默病的方法，为向对象施用牙髓间充质干细胞。

所述的对象可以为哺乳动物。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或人。

所述对象可以是罹患阿尔茨海默病的患者或者期待治疗的阿尔茨海默病的个体。

所述牙髓间充质干细胞可以在接受阿尔茨海默病治疗前、中、后向对象施用。

施用时，可采用牙髓间充质干细胞移植的方式。

一种实施方式中，可采用注射方式向对象施用牙髓间充质干细胞。

一种实施方式中，所述注射方式选自静脉注射或者局部注射。

本发明的第三方面，提供一种阿尔茨海默病治疗药物，包括有效剂量的牙髓间充质干细胞。

所述阿尔茨海默病治疗药物必然包括牙髓间充质干细胞，并以牙髓间充质干细胞作为前述功用的有效成分。

所述阿尔茨海默病治疗药物中，发挥前述功用的有效成分可仅为牙髓间充质干细胞亦可包含其他可起到类似功用的分子。

亦即，牙髓间充质干细胞为所述阿尔茨海默病治疗药物的唯一有效成分或有效成分之一。

所述阿尔茨海默病治疗药物形式无特殊限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。

所述阿尔茨海默病治疗药物主要针对的对象为哺乳动物，如啮齿类动物、灵长类动物等。

本发明的第四方面，提供一种阿尔茨海默病联合治疗药物组合物，包括有效量的牙髓间充质干细胞和至少一种其他阿尔茨海默病治疗药物。

所述联合治疗药物组合可以是以下形式中的任意一种：

一)将牙髓间充质干细胞和其他阿尔茨海默病治疗药物分别制成独立的制剂，制剂的剂型可相同或不同，给药途径亦可相同或不同。

当其他阿尔茨海默病治疗药物为抗体时，一般采用胃肠外给药型。当其他阿尔茨海默病治疗药物为化学药物时，给药形式可以比较丰富，可以是胃肠道给药亦可以是非胃肠道给药。一般推荐针对各化学药物的已知给药途径给药。

二)将牙髓间充质干细胞和其他阿尔茨海默病治疗药物配置成复方制剂，在将牙髓间充质干细胞和其他阿尔茨海默病治疗药物采用相同给药途径给药并同时施加时，可采用将两者配置成复方制剂的形式。

本发明的第五方面，提供了一种治疗阿尔茨海默病的方法，为向对象施用有效量的牙髓间充质干细胞以及向对象施用有效量的其他阿尔茨海默病治疗药物和/或向对象实施其他阿尔茨海默病治疗手段。

可以同步地或顺序地给予有效量的牙髓间充质干细胞和至少一种有效量的其他阿尔茨海默病治疗药物。

基于本发明通过试验研究发现，牙髓间充质干细胞可用于治疗阿尔茨海默病，在与牙髓间充质干细胞以外的其他阿尔茨海默病治疗药物联合用药中，至少可以起到疗效相加的效果，进一步增强对于阿尔茨海默病的治疗作用。

本发明的第六方面，提供了牙髓间充质干细胞用于制备抑制脑部慢性炎症的制剂中的用途。

本发明的第七方面，提供了牙髓间充质干细胞用于制备改善学习记忆能力的制剂中的用途。

本发明的第八方面，提供了牙髓间充质干细胞用于制备改善运动能力的制剂中的用途。

本发明的第九方面，提供了牙髓间充质干细胞用于制备减少海马各区过度激活小胶质细胞的数量的制剂中的用途。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明通过试验研究，首次发现移植牙髓间充质干细胞可以抑制脑部慢性炎症，并在一定程度上改善其学习记忆能力以及运动能力，且可以减少海马各区过度激活小胶质细胞的数量，有效治疗阿尔茨海默病。

附图说明

图1：经颅给药乳牙牙髓间充质干细胞对APP/PS1小鼠学习记忆的影响。

图2：静脉给药乳牙牙髓间充质干细胞对APP/PS1小鼠学习记忆的影响。

具体实施方式

干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，间充质干细胞是其中被认为最具有医学价值的干细胞种类。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)作为间质起源的非造血干细胞，其存在于多种人体组织，如骨髓(bone marrow，BM)，脐带(umbilical cord，UC)、脐带血(umbilical cord blood，UCB)、脂肪组织(adipose tissue，AT)、牙髓(dentalpulp、DP)和皮肤。根据不同的组织来源及分离培养方法，MSC由一大类特征和功能各异的细胞亚型所组成。MSC对于主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)I类分子的表达水平较低，并且不表达MHC II类分子和共刺激因子(CD80、CD86、CD40)，因而其免疫原性低，移植排斥风险小。既往研究显示，MSC可在多种炎症状态下介导免疫耐受作用。它们通过细胞间的直接接触以及分泌免疫调节分子，影响先天性和获得性免疫细胞(如T细胞、B细胞、DC、自然杀伤细胞)的发生发育和免疫功能。

口腔来源的MSC作为机体的重要MSC成员，其存在于牙髓、牙周膜、脱落乳牙、根尖乳头和牙囊组织中。牙髓来源的MSC与骨髓来源MSC相比，牙髓MSC异质性低、增殖迅速、型别稳定并无成瘤现象。牙髓MSC可诱导调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)增殖，并抑制DC的分化成熟。据我们查阅中外文献所知，目前牙髓MSC尚未被用于治疗阿尔茨海默病。

牙髓间充质干细胞用于制备阿尔茨海默病治疗药物

本发明通过试验研究首次证实和发现，牙髓间充质干细胞可用于治疗阿尔茨海默病。因此，牙髓间充质干细胞可用于制备阿尔茨海默病治疗药物。

以牙髓间充质干细胞为主要活性成分或主要活性成分之一制备药物。通常，药物中除了有效成分外，根据不同剂型的需要，还会包括一种或多种药学上可接受的载体或辅料。

“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。

“药学上可接受的载体或辅料”应当与牙髓间充质干细胞相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物组合物的效果。可作为药学上可接受的载体或辅料的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醉、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如Tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味。

本发明中，除非特别说明，药物剂型并无特别限定，可以被制成注射剂、针剂、口服液、片剂、胶囊、滴丸、喷剂等剂型，可通过常规方法进行制备。药物剂型的选择应与给药方式相匹配。

牙髓间充质干细胞联合治疗药物组合和施用方法

所述联合治疗药物组合可以是以下形式中的任意一种：

一)将牙髓间充质干细胞和其他阿尔茨海默病治疗药物分别制成独立的制剂，制剂的剂型可相同或不同，给药途径亦可相同或不同。使用时，可几种药同时使用，也可几种药先后使用。先后给药时，应当在先用药物仍对机体有效的期间内向机体施加其他药物。

二)将牙髓间充质干细胞和其他阿尔茨海默病治疗药物配置成复方制剂，在将牙髓间充质干细胞和其他阿尔茨海默病治疗药物采用相同给药途径给药并同时施加时，可采用将两者配置成复方制剂的形式。

抗体常用的用药方法为静脉注射、静脉滴注或动脉灌注。其用法用量可参考现有技术。

小分子化合物常用的用药方法可以是胃肠道给药或者是胃肠外给药。siRNA、shRNA、抗体则一般采用胃肠外给药。可以是局部给药亦可以为全身给药。

可以同步地或顺序地给予有效量的牙髓间充质干细胞和至少一种有效量的其他阿尔茨海默病治疗药物。

使用时，可将有效量的牙髓间充质干细胞和有效量的其他阿尔茨海默病治疗药物同时使用，也可将有效量的牙髓间充质干细胞和有效量的其他阿尔茨海默病治疗药物先后使用。先后给药时，应当在先用药物仍对生物体有效的期间内向生物体施加其他药物。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

实施例1牙髓间充质干细胞治疗阿尔茨海默病

一、目的

观察乳牙牙髓间充质干细胞对APP/PS1双转基因小鼠学习记忆能力、运动能力、海马CA1区Abeta蛋白表达、海马区TMEM119蛋白表达以及大脑皮质炎症因子(IL-1β、TNF-α和IL-4水平)的影响，评价乳牙牙髓间充质干细胞对APP/PS1双转基因小鼠阿尔茨海默病的治疗作用。

二、方法

1、牙髓间充质干细胞培养及注射液制备

复苏P2代牙髓间充质干细胞种子库细胞，培养基成分为90％的α-MEM和10％FBS，细胞生长至90％汇合率时进行传代，传代2次后得到P4代的牙髓间充质干细胞；细胞生长至80-90％汇合率时用0.25％胰蛋白酶消化收获细胞，经过生理盐水洗涤后，进行细胞计数，根据计数结果用生理盐水将细胞密度调整为4×10⁶/ml，获得细胞注射液，将细胞注射液置于冰上(即2-8℃)保存，并于5h内使用。所获得的乳牙牙髓间充质干细胞注射液，浓度分别为2.5U/mL、1U/mL、0.2U/mL(1U＝1×10⁷)。

2、牙髓MSC移植治疗阿尔茨海默病的疗效研究

2.1实验动物信息

种属和品系：阴性对照为C57BL/6J小鼠，模型组和给药组为APP/PS1双转基因小鼠；

等级：SPF级；

数量和性别：C57BL/6J：18只；APP/PS1小鼠：60只；雌雄均有；

年龄范围：C57BL/6J小鼠为6～8周龄，APP/PS1小鼠为32周龄；

体重范围：C57BL/6J小鼠：20±2g；APP/PS1：25±2g

供应单位：常州卡文斯试验动物有限公司；

动物生产许可证：SCXK(沪)2016-0010：

动物合格编号：No.201913358。

2.2检疫与适应性饲养

所有小鼠接受5天的检疫与适应性饲养。

2.3动物的标记与识别

小鼠到达后单只饲养，挂上笼卡给以临时编号，临时编号作为动物的终身动物号。另外笼卡上标有专题编号、动物号、性别、组别、剂量等信息。

2.4笼具

小鼠饲养于290*178*160mm的塑料鼠盒中，每笼1只。

2.5饲养室的环境条件

温度：20～26℃

最大日温差：≤4℃

相对湿度40～70％

最小换气次数：≥15次/h

光照：自动光照，每12h明暗交替

2.6实验动物饲料

饲料种类：全价营养固性饲料；

生产单位：上海仕林生物科技有限公司；

生产许可证编号：沪饲证(2015)04017；

保存条件：低温、干燥和卫生；

饲喂方法：自由摄取；

饲料检测：每批饲料均有生产商提供的质量合格证明；每年由第三方有资质的专业检测单位对饲料进行1次常规营养成分指标、化学污染物指标、微生物指标检测。

2.7实验动物饮水

种类：反渗透水；

给水方式：饮水瓶自由摄取；

水质检测：每季度检测一次，检测依据参考国家标准GB5749-2006。

2.8试验步骤

动物分组前及处死前进行水迷宫和转棒试验。

经颅给药实验：APP/PS1双转基因小鼠随机分为经颅给药模型组和经颅给药组，C57BL/6J小鼠作为阴性对照组；分组第二天进行脑双侧海马区立体定位给药，阴性对照组和经颅给药模型组给予干细胞制剂溶媒，经颅给药组给予乳牙牙髓间充质干细胞注射液(2.5U/mL)，每侧10μL，共20μL。注射速度：1μL/min，注射坐标(AP：2.3mm，ML：+1.8mm，DV：-2.0mm)。

静脉给药实验：APP/PS1双转基因小鼠随机分为静脉给药模型组、静脉给药高、低剂量组以及阳性对照安理申组。静脉给药模型组、静脉给药高、低剂量组以及阳性对照安理申组，C57BL/6J小鼠作为静脉给药正常对照组。静脉高、低剂量组分别静脉注射1、0.2U/mL的受试细胞注射液，每只200μL，每周1次，共5次；模型对照组或正常对照组同法静脉注射给予溶媒。阳性对照安理申组给予盐酸多奈哌齐2mg/kg，1次/天灌胃给药，雌性于D10(雄性于D24)起改为1mg/kg，给药至4周末。

给药后观察22天处死，取大脑右侧组织固定于10％中性福尔马林，石蜡包埋，切片海马CA1区用于Abeta蛋白免疫组织化学染色，取大脑皮质经液氮速冻后保存于-80℃，用于匀浆检测IL-1β、TNF-α和IL-4水平。处死前2天进行转棒试验和水迷宫定位航行和空间探索试验，转棒试验前训练2天，水迷宫试验前训练5天。

2.9动物分组及给药

表1经颅给药试验动物分组

表2静脉给药试验动物分组

2.10给药相关信息及剂量设计

经颅给药组进行单次双侧海马区(坐标：AP，2.3mm；ML，+1.8mm；DV，-2.0mm)立体定位注射给药，10μL/侧，注射结束后停留3～5min，慢慢拔针；模型对照组和正常对照组按同样方法在双侧海马区立体定位给予干细胞制剂溶媒。

静脉高、低剂量组分别静脉注射1、0.2U/mL的受试细胞注射液，每只200μL，每周1次，共5次；模型对照组或正常对照组同法静脉注射给予溶媒。

阳性对照安理申组给予盐酸多奈哌齐2mg/kg，1次/天灌胃给药，雌性于D10(雄性于D24)起改为1mg/kg，给药至4周末。

2.11数据采集

2.11.1一般观察

单次给药后至处死前观察动物体重、摄食以及大小便情况。

2.11.2转棒实验

于动物分组前及处死前2天进行转棒试验，转速40r/min，记录每只动物跌落时间，转棒试验前训练2天。

2.11.3水迷宫

动物分组前及处死前2天各进行一次定位航行试验和空间探索试验，试验前训练5天。

定位航行试验：用于测量小鼠对水迷宫学习和记忆的能力，试验历时5天。每天训练4次，每次60s，每天4次训练小鼠分别从4个不同的入水点入水，将小鼠面向池壁放入水中，仪器自动记录小鼠寻找并爬上平台的路线图，小鼠从入水到找到水下隐蔽平台并立于其上所需时间(逃避潜伏期)。如果小鼠在60s内未找到平台，需将其引至平台，这时潜伏期以60s计，让小鼠停留10s，再放回笼中。

空间探索试验：用于测量小鼠学会寻找平台后，对平台空间位置记忆的能力。第6天试验时撤去平台，选平台对面象限的同一入水点将小鼠面向池壁放入水中，记录每只小鼠在60s内穿过平台的次数以及在原平台所在象限内逗留的时间和路程百分比。

2.11.4免疫组化

动物处死后取右侧大脑组织保存于10％中性福尔马林，石蜡包埋，切片海马CA1区用于Abeta蛋白免疫组织化学染色，切片海马区进行TMEM119免疫组化染色以及TUNEL染色。

2.11.5免疫调节因子检测

动物处死后取大脑皮质经液氮速冻后，保存于-80℃，用于匀浆检测IL-1β、TNF-α和IL-4水平。

2.11.6取材

动物于给药22天后安乐死，取右侧大脑保存于10％中性福尔马林。

2.12数据处理和统计分析

所有数据均以

表示，采用统计软件SPSS22.0进行统计分析。两组比较采用两独立样本t检验。多组间比较采用单因素方差分析，方差齐采用LSD-t检验进行组间两两比较，方差不齐则用两样本t检验或Kruskal-Wallis检验。P＜0.05，表示有显著统计学差异。

3、试验结果

3.1、乳牙牙髓间充质干细胞对APP/PS1小鼠运动能力的影响

给药前，与阴性对照组比较，模型组和经颅给药组的转棒跌落时间显著下降(p﹤0.05)；给药后，与模型组比较，给药组转棒跌落时间有上升的趋势，没有显著性差异。与给药前比较，阴性对照组、模型组以及给药组的转棒跌落时间分别提高6.0％、8.1％和26.5％，统计结果如表3。

表3乳牙牙髓间充质干细胞对转棒跌落时间的影响

备注：与阴性对照组比较，*，p﹤0.05，**，p﹤0.01。

3.2、乳牙牙髓间充质干细胞对APP/PS1小鼠学习记忆能力的影响

经颅给药水迷宫空间探索实验结果显示，与经颅给药模型组比较，经颅给药组小鼠其在平台象限逗留的时间和路程百分比延长，有极显著性差异(p﹤0.01)。阴性对照组、经颅给药对照组和经颅给药高剂量组小鼠的学习记忆改善率分别为26.2％、9.1％和29.1％。统计结果如表4、5、图1。

表4经颅给药乳牙牙髓间充质干细胞对APP/PS1小鼠学习记忆的影响

备注：与经颅给药模型组比较，**，p﹤0.01。

表5经颅给药乳牙牙髓间充质干细胞对APP/PS1小鼠学习记忆改善率的影响

静脉给药空间探索试验中，与静脉给药模型组比较，静脉给药高、低剂量组小鼠Ⅳ象限路程、时间百分比显著多于静脉给药模型组(p<0.05)，站台穿越次数也有多于静脉给药模型组的趋势(p＝0.071)，提示静脉给药高、低剂量组小鼠的学习记忆能力显著强于静脉给药模型组。静脉给药高、低剂量组各指标与安理申组比较无统计学差异。统计结果如表6、图2。

表6静脉给药乳牙牙髓间充质干细胞对APP/PS1小鼠学习记忆的影响

注：^#p<0.05，与静脉给药正常对照组比较，方差分析LSD检验；

^&p<0.05，与静脉给药模型组比较，方差分析LSD检验；

^A p＝0.071，与静脉给药模型组比较，惠特尼U检验。

3.3、乳牙牙髓间充质干细胞对APP/PS1小鼠大脑皮质免疫调节因子的影响

取小鼠大脑皮质进行匀浆，检测促炎因子IL-1β、前炎性因子TNF-α以及抗炎因子IL-4的水平，结果见表7，与阴性对照组比较，模型组小鼠大脑皮层IL-1β和TNF-α水平显著升高(p﹤0.01，p﹤0.01)，IL-4水平显著降低(p﹤0.01)；与模型组比较，给药组小鼠大脑皮层IL-1β水平有降低的趋势，但没有显著性差异，而TNF-α水平显著降低(p﹤0.01)，另外IL-4水平也出现显著升高(p﹤0.01)。结果表明APP/PS1双转基因小鼠脑部存在慢性炎症，而乳牙牙髓间充质干细胞对其脑部炎症有抑制作用。

表7乳牙牙髓间充质干细胞对APP/PS1小鼠大脑皮层免疫调节因子的影响

备注：与阴性对照组比较，**，P＜0.01；与模型组比较，##，P＜0.01。

3.4、乳牙牙髓间充质干细胞对APP/PS1小鼠脑部TMEM119蛋白的影响

TMEM119蛋白免疫组化结果如表8，与对照组比较，模型组小鼠海马DG区、CA3、CA2以及CA1区的TMEM119蛋白都略有升高；模型组比较，给药组小鼠海马各区TMEM119蛋白均出现一致的降低趋势。TMEM119作为小胶质细胞的标志物，小胶质细胞在AD发展中具有双向作用，生理条件下的小胶质细胞可以清除脑部废物，病理条件下过度激活的小胶质细胞会促进脑部炎症，引发神经细胞损伤，从而促进AD的发展。

表8乳牙牙髓间充质干细胞对APP/PS1小鼠大脑海马区TMEM119表达的影响

4、结论

如上所述，转棒实验结果显示，给药后，与阴性对照组比较，模型组和给药组的跌落时间显著降低(p﹤0.05)；而与模型组比较，给药组的跌落时间延长；与给药前比较，阴性对照组、模型组以及给药组的跌落时间分别延长6.0％、8.1％和26.5％。

经颅给药水迷宫空间探索实验结果显示，给药后，与阴性对照组比较，经颅给药模型组和经颅给药组小鼠逃避潜伏期延长，穿台次数减少，在原平台象限停留时间和路程百分比缩短，其中经颅给药模型组在原平台象限停留时间和路程百分比缩短有显著性差异(p﹤0.05)；与经颅给药模型组比较，经颅给药组小鼠逃避潜伏期有降低的趋势，且在原平台象限停留时间和路程百分比增加，有显著性差异。

静脉给药水迷宫空间探索实验结果显示，与静脉给药模型组比较，静脉给药高、低剂量组小鼠Ⅳ象限路程、时间百分比显著多于静脉给药模型组(p<0.05)，站台穿越次数也有多于静脉给药模型组的趋势(p＝0.071)，提示静脉给药高、低剂量组小鼠的学习记忆能力显著强于静脉给药模型组。

免疫调节因子检测结果显示，与阴性对照组比较，模型组IL-1β和TNF-α水平显著升高(p﹤0.01，p﹤0.01)，且IL-4水平显著降低(p﹤0.01)；与模型组比较，给药组IL-1β有降低的趋势，而TNF-α水平显著降低(p﹤0.01)，同时IL-4水平显著升高(p﹤0.01)。

TMEM119蛋白免疫组化结果显示，与对照组比较，模型组小鼠海马各区(DG、CA3、CA2、CA1)TMEM119蛋白表达有升高的趋势，而与模型组比较，给药组小鼠海马各区TMEM119蛋白均出现下降的趋势。TMEM119作为小胶质细胞的标志物，表明乳牙牙髓间充质干细胞对APP/PS1小鼠脑部海马区小胶质细胞的数量或者激活有一定的抑制作用。

结论：乳牙牙髓间充质干细胞可以抑制APP/PS1双转基因小鼠脑部慢性炎症，并在一定程度上改善其学习记忆能力以及运动能力，且可以减少海马各区过度激活小胶质细胞的数量。给药组与模型组在行为学试验中有出现显著性差异。

综上所述，本发明通过试验证实：牙髓MSC移植对阿尔茨海默病的治疗有效。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

Claims (10)

1.牙髓间充质干细胞用于制备阿尔茨海默病治疗药物的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，牙髓间充质干细胞为所述阿尔茨海默病治疗药物的唯一有效成分或有效成分之一。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述阿尔茨海默病治疗药物至少具有以下功用之一：(1)抑制脑部慢性炎症；(2)改善学习记忆能力；(3)改善运动能力；(4)减少海马各区过度激活的小胶质细胞数量。

4.一种治疗阿尔茨海默病的方法，为向对象施用牙髓间充质干细胞。

5.一种阿尔茨海默病治疗药物，包括有效剂量的牙髓间充质干细胞。

6.一种阿尔茨海默病联合治疗药物组合物，包括有效量的牙髓间充质干细胞和至少一种其他阿尔茨海默病治疗药物。

7.一种治疗阿尔茨海默病的方法，为向对象施用有效量的牙髓间充质干细胞以及向对象施用有效量的其他阿尔茨海默病治疗药物和/或向对象实施其他阿尔茨海默病治疗手段。

8.牙髓间充质干细胞用于制备抑制脑部慢性炎症的制剂中的用途。

9.牙髓间充质干细胞用于制备改善学习记忆能力和/或运动能力的制剂中的用途。

10.牙髓间充质干细胞用于制备减少海马各区过度激活小胶质细胞的数量的制剂中的用途。

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