CN110585241A - 一种能治疗阿尔茨海默病的间充质干细胞制剂及其应用 - Google Patents

一种能治疗阿尔茨海默病的间充质干细胞制剂及其应用 Download PDF

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张福强
付学奇
姜金兰
张竞天
王宇翔
牛涵
宋佳玥
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Abstract

本发明提供了一种能治疗阿尔茨海默病的间充质干细胞制剂及其应用，所述间充质干细胞为人的脐带血间充质干细胞，本发明所使用的脐带血间充质干细胞作为治疗阿尔茨海默病制剂的原料进行制备，其通过与聚多巴胺修饰四氧化三铁纳米粒子结合，给药至阿尔茨海默病模型小鼠体内，显著改善了小鼠记忆能力，为阿尔茨海默病的药物开发提供了新方法。

Description

一种能治疗阿尔茨海默病的间充质干细胞制剂及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体为一种能治疗阿尔茨海默病的间充质干细胞制剂及其应用。
背景技术
间充质干细胞是干细胞家族中一种具有分化成为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞的多种分化潜能的细胞亚群，并且经过连续传代及冻存后仍具有多向分化潜能。目前，由于间充质干细胞具有较强的分化潜能及可自体移植等优点，已被广泛用于干细胞治疗药物的研发。阿尔茨海默病是一种具有隐匿性和进行性的神经退行性疾病，其多发于中老年人群并且长久以来对于中老年人群的正常生活都有着很大的诟病。而目前世界上对于阿尔茨海默病的治疗方法大多仅限于预防与延缓病情。纳米生物材料在近年来都被试图用作新药的开发，原因在于其具有很好的生物相容性以及高度靶向性。四氧化三铁纳米生物材料在与细胞孵育培养后，表现出了比较好的生物相容性。针对以上所述，那么如何发明出一种能治疗阿尔茨海默病的间充质干细胞制剂及其应用，这成为我们需要解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能治疗阿尔茨海默病的间充质干细胞制剂及其应用，解决了背景技术中所提出的问题。
为解决上述问题，本发明提供如下技术方案：一种能治疗阿尔茨海默病的间充质干细胞制剂及其应用，包括以下应用方法，
S1、提取小鼠的脐带血间充质干细胞并培养；
S2、制备聚多巴胺修饰的四氧化三铁纳米粒子并用以后续实验；
S3、种植人神经母细胞瘤细胞于六孔培养板中，加入OA对细胞进行凋亡诱导，以此对细胞系进行间充质干细胞的trans-well诱导，使用CCK-8试剂盒检测细胞生存情况，使用间充质干细胞进行trans-well的SH-SY5Y细胞系相较未进行trans-well的细胞系死亡数量减少；
S4、种植人神经母细胞瘤细胞于六孔培养板中，加入OA对细胞进行凋亡诱导，以此对细胞系进行间充质干细胞的trans-well诱导，利用western-
blot检测细胞内蛋白水平表达情况，使用间充质干细胞进行trans-well的细胞系相较未进行trans-well的细胞系蛋白表达水平更趋正常；
S5、将间充质干细胞以及经四氧化三铁纳米材料修饰过的间充质干细胞使用细胞荧光染色材料进行染色，后通过尾静脉将药物注射于阿尔茨海默病模型小鼠体内，通过使用荧光成像系统对染色细胞进行定位，相较于正常的MSC细胞，经过四氧化三铁纳米材料修饰的MSC细胞更多的聚集于脑部，表明四氧化三铁纳米材料具有良好的靶向性；
S6、将间充质干细胞与四氧化三铁纳米生物材料于同一培养皿中孵育，后通过尾静脉将干细胞药物注射于阿尔茨海默病模型鼠中，通过western-blot实验检测小鼠脑部各种标志性蛋白的表达情况，干细胞药物处理能明显改善阿尔茨海默病模型小鼠脑内TAU、BDNF、APP、SYN等蛋白的表达水平；
S7、利用水迷宫实验平台对完成注射周期的小鼠进行行为学测试，通过检测小鼠到达固定隐藏平台的时间分析其记忆能力，注射间充质干细胞的模型鼠相较未注射干细胞的小鼠到达隐藏平台的时间短且能表现出更强的记忆能力，说明间充质干细胞对阿尔茨海默病模型小鼠的记忆能力有很明显的改善作用；
S8、利用阿尔茨海默病模型小鼠组织提取RNA，通过反转录获得小鼠cDNA，后利用在线软件设计TAU、BDNF、APP、SYP等蛋白基因的引物，使用Real-time PCR进行基因鉴定。
进一步地，所述间充质干细胞与四氧化三铁纳米生物材料在用于改善小鼠记忆能力，恢复阿尔茨海默病模型小鼠脑内标志性蛋白的正常表达水平作用。
进一步地，步骤S6中，操作过程中注射的细胞数量为1×106个。
进一步地，所述间充质干细胞与四氧化三铁纳米生物材料的共同作用具有抑制APP水解为β-淀粉样蛋白的作用。
进一步地，所述间充质干细胞与四氧化三铁纳米生物材料的共同作用具有修复因阿尔茨海默病所引发的一系列脑源性神经损伤的功能。
进一步地，所述间充质干细胞与四氧化三铁纳米生物材料的共同作用具有恢复突触素、脑源性神经营养因子BDNF、胶质纤维酸性蛋白GFAP以及tau蛋白的正常表达。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明所使用的脐带血间充质干细胞作为治疗阿尔茨海默病制剂的原料进行制备，其通过与聚多巴胺修饰四氧化三铁纳米粒子结合，给药至阿尔茨海默病模型小鼠体内，显著改善了小鼠记忆能力，为阿尔茨海默病的药物开发提供了新方法。
附图说明
图1(1A-1B)为CCK-8方法检测四氧化三铁对细胞模型的毒性影响结果图；
图2(2A-2E)为免疫组化HE染色检测四氧化三铁对小鼠的心、肺、肝、脾、肾毒性影响结果图；
图3为使用CCK-8试剂盒检测细胞生存情况并使用酶标仪进行测定所得的结果图；
图4为western-blot检测各组细胞内APP、BDNF、Tau、Synaptophsin、GFAP、Connexin43蛋白表达量的结果图；
图5为模型小鼠通过尾静脉注射染色细胞后，使用活体成像系统得到的结果图；
图6(6A-6B)为小鼠在7天实训阶段的平均逃避潜伏期趋势图；
图7(7A-7B)为小鼠在7天实训阶段的终平均潜伏时间对比图；
图8(8A-8D)为通过免疫组化实验所得到的各组小鼠(7月龄)脑内BDNF、Tau、APP-CTF、Synaptophsin的表达量对比结果图；
图9(9A-9D)为通过免疫组化实验所得到的各组小鼠(7月龄)脑内BDNF、Tau、APP-CTF、synaptophsin的阳性率统计图；
图10(10A-10D)为通过免疫组化实验所得到的各组小鼠(10月龄)脑内BDNF、Tau、APP-CTF、synaptophsin的阳性率统计图；
图11(11A-11B)为western-blot检测各组小鼠脑内BDNF、Tau、CTF、Synaptophsin、GFAP等蛋白的表达量的结果对比图(A，7月龄；B，10月龄)。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1-11，本实用发明提供一种技术方案：一种能治疗阿尔茨海默病的间充质干细胞制剂及其应用，包括以下应用方法，
S1、提取小鼠的脐带血间充质干细胞并培养；
S2、制备聚多巴胺修饰的四氧化三铁纳米粒子并用以后续实验；
S3、种植人神经母细胞瘤细胞于六孔培养板中，加入OA对细胞进行凋亡诱导，以此对细胞系进行间充质干细胞的trans-well诱导，使用CCK-8试剂盒检测细胞生存情况，使用间充质干细胞进行trans-well的SH-SY5Y细胞系相较未进行trans-well的细胞系死亡数量减少；
S4、种植人神经母细胞瘤细胞于六孔培养板中，加入OA对细胞进行凋亡诱导，以此对细胞系进行间充质干细胞的trans-well诱导，利用western-blot检测细胞内蛋白水平表达情况，使用间充质干细胞进行trans-well的SH-SY5Y细胞系相较未进行trans-well的细胞系蛋白表达水平更趋正常；
S5、将间充质干细胞以及经四氧化三铁纳米材料修饰过的间充质干细胞使用细胞荧光染色材料进行染色，后通过尾静脉将药物注射于阿尔茨海默病模型小鼠体内，通过使用荧光成像系统对染色细胞进行定位，相较于正常的MSC细胞，经过四氧化三铁纳米材料修饰的MSC细胞更多的聚集于脑部，表明四氧化三铁纳米材料具有良好的靶向性；
S6、将间充质干细胞与四氧化三铁纳米生物材料于同一培养皿中孵育，后通过尾静脉将干细胞药物注射于阿尔茨海默病模型鼠中，通过western-blot实验检测小鼠脑部各种标志性蛋白的表达情况，干细胞药物处理能明显改善阿尔茨海默病模型小鼠脑内TAU、BDNF、APP、SYN等蛋白的表达水平；
S7、利用水迷宫实验平台对完成注射周期的小鼠进行行为学测试，通过检测小鼠到达固定隐藏平台的时间分析其记忆能力，注射间充质干细胞的模型鼠相较未注射干细胞的小鼠到达隐藏平台的时间短且能表现出更强的记忆能力，说明间充质干细胞对阿尔茨海默病模型小鼠的记忆能力有很明显的改善作用；
S8、利用阿尔茨海默病模型小鼠组织提取RNA，通过反转录获得小鼠cDNA，后利用在线软件设计TAU、BDNF、APP、SYP等蛋白基因的引物，使用Northern-Blot进行基因鉴定。
所述间充质干细胞与四氧化三铁纳米生物材料在用于改善小鼠记忆能力，恢复阿尔茨海默病模型小鼠脑内标志性蛋白的正常表达水平作用。
步骤S6中，操作过程中注射的细胞数量为1×106个。
所述间充质干细胞与四氧化三铁纳米生物材料的共同作用具有抑制APP水解为β-淀粉样蛋白的作用。
所述间充质干细胞与四氧化三铁纳米生物材料的共同作用具有修复因阿尔茨海默病所引发的一系列脑源性神经损伤的功能。
所述间充质干细胞与四氧化三铁纳米生物材料的共同作用具有恢复突触素、脑源性神经营养因子BDNF、胶质纤维酸性蛋白GFAP以及tau蛋白的正常表达。
实施例
本发明所用的主要材料如下：
双胆碱酸蛋白浓度测定试剂盒；SDS-PAGE凝胶制备试剂；总RNA提取试剂盒、gDNA及cDNA提取试剂盒(TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA SynthesisSuperMix)、10×DNA Loading Buffer、Trans 15K DNA Marker；2×PCR Taq MasterMix；anti-synaptophysin；anti-presenilin 1、二抗Anti-mouse、二抗Anti-rabbit；anti-GFAP(GA5)、anti-Tau(Tau46)、anti-presenilin 1(D39D1)；anti-BDNF；DiO细胞膜荧光探针绿色、CCK-8试剂盒。
首先地,本发明使用了trans-well小室，通过CCK-8检测了间充质干细胞对经OA诱导的神经母细胞瘤细胞的治愈作用，具体步骤如下：
先接种SH-SY5Y细胞于6孔板中；
再在细胞未贴壁时将细胞分为4组，一组为+MSC，二组为SH control，三组为SH+OA，四组为SH+OA，24h后+MSC。以上细胞间的共培养都是利用trans-well小室来实现。
然后加入CCK-8试剂，37℃孵育2h后利用酶标仪测量吸光度；
所使用的OA药物浓度为30nM,
对上述四组细胞进行了western-blot检测，检测结果表明间充质干细胞对经OA诱导的神经母细胞瘤细胞具有理想的治愈作用。
将间充质干细胞种植于100mm培养板中培养至细胞长满平板，使用血细胞计数板对培养平板内的细胞进行计数，结果显示每个培养平板含有约4×106个干细胞。此数量的细胞可用于接下来的实验。
按照3×106cell/ml加入50μg/ml四氧化三铁纳米材料，37℃细胞培养箱内孵育24h。孵育完成后的细胞与正常MSC细胞首先进行细胞计数，后按照每100mm dish加入1ml胰蛋白酶进行消化，将细胞转移至新的EP管中，1000r/min，5min离心，去上清并按照2.4×106cell/0.1ml PBS进行加入PBS缓冲液，混匀，供小鼠注射时使用；
将阿尔茨海默病模型小鼠通过尾静脉注射的方式进行给药处理。详细分组情况如下：
将40只6月龄阿尔茨海默病模型小鼠分为4组(每组10只，每隔10天注射一次，连续注射4次)：
第一组，对照组，注射0.9％NaCl溶液；
第二组，注射MSC细胞；
第三组，注射四氧化三铁纳米粒子标记的间充质干细胞；
第四组，野生型小鼠。
将40只9月龄阿尔茨海默病模型小鼠分为4组(每组10只，每隔10天注射一次，连续注射4次)：
第一组，对照组，注射0.9％NaCl溶液；
第二组，注射MSC细胞；
第三组，注射四氧化三铁纳米粒子标记的间充质干细胞；
第四组，野生型小鼠。
在实现注射周期前需要进行荧光成像以确定药物确实到达损伤部位，配置终浓度为10μM的DIO细胞膜荧光探针，将已经过离心的细胞与细胞荧光染料混合孵育30min。赋予完成后经尾静脉将已经染色的细胞药物注射于小鼠体内，并通过腹腔将7％的水合氯醛按照0.5ml/100g的比例注射入小鼠体内使其麻醉。使用荧光成像系统观察染色细胞的聚集情况。
通过荧光成像实验发现，相比较仅注射间充质干细胞的小鼠，四氧化三铁纳米粒子标记的间充质干细胞能够更明显地聚集于病症处(图5，活体成像对比图)；
完成注射周期后，开始进行水迷宫实验，对小鼠记忆能力进行评估。
水迷宫实验具体步骤如下：
本实验以10天为一周期，前三天为适应阶段，后7天为实训阶段。
适应阶段时：将隐蔽平台高于水面1cm，小鼠面壁放入水中游泳适应环境，记录小鼠登上平台所需时间，即逃避潜伏期(latency),若120s后小鼠未找到平台，则将其引导至平台。无论小鼠是否找到平台，均允许其在平台上停留30s，实验结束将小鼠擦干放回鼠笼。共训练4次。
实训阶段时：每天每只大鼠进行4次训练。平台隐藏于水面下1cm，随机将大鼠从4个入水点面壁放入水中，记录逃避潜伏期。若120s后大鼠未找到平台，将其引导至平台并停留30s。
实验的结果评价标准为实训阶段中小鼠找到平台的平均逃避潜伏期以及终平均潜伏时间。
通过对实训阶段各组小鼠的平均逃避潜伏期进行分析发现，各组小鼠的逃避潜伏期随着训练日程的增加逐渐缩短，在经过一定次数训练后均表现出了一定的记忆能力，参阅图6。通过对各组小鼠的终平均潜伏时间进行分析发现，注射了间充质干细胞的小鼠以及注射了经四氧化三铁纳米粒子标记的间充质干细胞的小鼠(MSC+)相较正常的AD模型鼠记忆能力均有很好的恢复。而相较于仅注射间充质干细胞的小鼠，四氧化三铁纳米粒子标记的间充质干细胞能够对小鼠的记忆能力起到更好的恢复作用，参阅图7。
水迷宫实验后，需解剖小鼠取其脑部，用于后续实验研究。
通过腹腔将7％水合氯醛注射于小鼠体内致其死亡，取小鼠脑部组织，横切脑部，取顶叶及额叶部分组织用于免疫组化实验，其余脑部组织用于western-blot及Real-timePCR。
用于免疫组化的组织需使其浸泡于4％多聚甲醛中固定48小时以上。本发明所得到的免疫组化数据包括以下蛋白：
(1)脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)
(2)Tau蛋白
(3)突触素(synaptophsin)
(4)APP
通过对免疫组化的结果进行分析，对比发现相较于正常的AD模型鼠，注射了间充质干细胞经四氧化三铁纳米粒子标记的间充质干细胞的小鼠在脑源性神经营养因子(BDNF)及突触素的表达量上有明显的增加，而在Tau蛋白及APP-CTF的表达量上有明显的降低，参阅图8；
对免疫组化的对比图进行阳性率统计，更直观地对上述结果进行解释，参阅图9，图10；
将剩余的脑部组织用于western-blot。
Western-blot实验具体步骤如下：
(1)将分离的脑部组织放入组织裂解缓冲液中，使用超声破碎仪将脑部组织彻底破碎。
(2)取少量的样品液，使用蛋白浓度测定试剂盒测量样品蛋白浓度，根据测得的浓度数据计算上样量。
(3)向剩余的样品液中加入1/3体积的4×Sample Buffer，沸水浴中煮样7min，冷却。
(4)配置适当浓度的丙烯酰胺凝胶，待其凝固后根据计算所得的上样量进行上样。
(5)经过SDS-PAGE电泳后转膜印记，封闭，一抗4℃过夜孵育。
(6)洗膜5次，每次8min，室温孵育二抗2h，洗膜后用ECL显色。
通过使用Western-blot检测各组小鼠脑内蛋白的表达量，分析间充质干细胞以及经四氧化三铁纳米粒子标记的间充质干细胞对AD模型小鼠的治疗作用。结果表明，经注射干细胞药物后，AD模型小鼠脑内BDNF、synaptophsin、GFAP、APP以及connexin 43的表达量均上升，而Tau蛋白与CTF的表达量则有所降低，参阅图11，说明间充质干细胞对AD小鼠有明显的治疗作用。
以上结果表明，间充质干细胞对阿尔茨海默病模型小鼠具有良好的治疗作用，而通过加入四氧化三铁纳米材料对间充质干细胞进行标记能够有效提高间充质干细胞的靶向性以及治疗效果。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点,对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (6)

1.一种能治疗阿尔茨海默病的间充质干细胞制剂及其应用，其特征在于：包括以下应用方法，
S1、提取小鼠的脐带血间充质干细胞并培养；
S2、制备聚多巴胺修饰的四氧化三铁纳米粒子并用以后续实验；
S3、种植人神经母细胞瘤细胞于六孔培养板中，加入OA对细胞进行凋亡诱导，以此对细胞系进行间充质干细胞的trans-well诱导，使用CCK-8试剂盒检测细胞生存情况，使用间充质干细胞进行trans-well的SH-SY5Y细胞系相较未进行trans-well的细胞系死亡数量减少；
S4、种植人神经母细胞瘤细胞于六孔培养板中，加入OA对细胞进行凋亡诱导，以此对细胞系进行间充质干细胞的trans-well诱导，利用western-blot检测细胞内蛋白水平表达情况，使用间充质干细胞进行trans-well的SH-SY5Y细胞系相较未进行trans-well的细胞系蛋白表达水平更趋正常；
S5、将间充质干细胞以及经四氧化三铁纳米材料修饰过的间充质干细胞使用细胞荧光染色材料进行染色，后通过尾静脉将药物注射于阿尔茨海默病模型小鼠体内，通过使用荧光成像系统对染色细胞进行定位，相较于正常的MSC细胞，经过四氧化三铁纳米材料修饰的MSC细胞更多的聚集于脑部，表明四氧化三铁纳米材料具有良好的靶向性；
S6、将间充质干细胞与四氧化三铁纳米生物材料于同一培养皿中孵育，后通过尾静脉将干细胞药物注射于阿尔茨海默病模型鼠中，通过western-blot实验检测小鼠脑部各种标志性蛋白的表达情况，干细胞药物处理能明显改善阿尔茨海默病模型小鼠脑内TAU、BDNF、APP、SYN等蛋白的表达水平；
S7、利用水迷宫实验平台对完成注射周期的小鼠进行行为学测试，通过检测小鼠到达固定隐藏平台的时间分析其记忆能力，注射间充质干细胞的模型鼠相较未注射干细胞的小鼠到达隐藏平台的时间短且能表现出更强的记忆能力，说明间充质干细胞对阿尔茨海默病模型小鼠的记忆能力有很明显的改善作用；
S8、利用阿尔茨海默病模型小鼠组织提取RNA，通过反转录获得小鼠cDNA，后利用在线软件设计TAU、BDNF、APP、SYP等蛋白基因的引物，使用Real-time PCR进行基因鉴定。
2.根据权利要求1所述的一种能治疗阿尔茨海默病的间充质干细胞制剂及其应用，其特征在于：所述间充质干细胞与四氧化三铁纳米生物材料在用于改善小鼠记忆能力，恢复阿尔茨海默病模型小鼠脑内标志性蛋白的正常表达水平作用。
3.根据权利要求1所述的一种能治疗阿尔茨海默病的间充质干细胞制剂及其应用，其特征在于：步骤S6中，操作过程中注射的细胞数量为1×106个。
4.根据权利要求1所述的一种能治疗阿尔茨海默病的间充质干细胞制剂及其应用，其特征在于：所述间充质干细胞与四氧化三铁纳米生物材料的共同作用具有抑制APP水解为β-淀粉样蛋白的作用。
5.根据权利要求1所述的一种能治疗阿尔茨海默病的间充质干细胞制剂及其应用，其特征在于：所述间充质干细胞与四氧化三铁纳米生物材料的共同作用具有修复因阿尔茨海默病所引发的一系列脑源性神经损伤的功能。
6.根据权利要求1所述的一种能治疗阿尔茨海默病的间充质干细胞制剂及其应用，其特征在于：所述间充质干细胞与四氧化三铁纳米生物材料的共同作用具有恢复突触素、脑源性神经营养因子BDNF、胶质纤维酸性蛋白GFAP以及tau蛋白的正常表达。
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