CN110295227A - 基于hsa-miR-320a的糖尿病早期预警和/或诊断试剂盒的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明“基于hsa‑miR‑320a的糖尿病早期预警和/或诊断试剂盒的制备方法”,属于分子医药及代谢性疾病的诊断、预防和治疗领域。用于诊断和/或早期预警糖尿病的生物标志物包括:含有hsa‑miR‑320a在内的序列片段;所述hsa‑miR‑320a如SEQ ID No.1所示。所述用于诊断和/或早期预警糖尿病的试剂盒包括用于定量检测所述的生物标志物的试剂。测定本发明的生物标志物和/或采用本发明的试剂盒可高效准确地诊断出糖尿病,并进行相应的糖尿病早期预警与风险评估。
Description
技术领域
本发明属于分子医药及代谢性疾病的诊断、预防和治疗领域,具体涉及一种基于hsa-miR-320a的糖尿病早期预警和/或诊断试剂盒的制备方法。
背景技术
microRNA(miRNA,miR)是一类新近发现的来源于内源性发夹结构转录本的长度大约为22个核苷酸的内源性小分子非编码单链RNA,通过与靶mRNA的3’非翻译区(3’untranslated region,3’UTR)特异性结合,促进靶mRNA降解,或者抑制靶mRNA翻译,降低编码蛋白质水平,从而实现对基因转录后的表达调控。miRNA与机体的多种疾病联系紧密,包括神经退行性疾病、心脏病、肾病以及肿瘤等。近年来的研究发现,miRNA在糖脂代谢、胰岛素抵抗调控中均有着重要作用。
糖尿病(diabetic mellitus,DM)是严重威胁人类生命健康的重大疾病,目前其全球患病率为4.4%-17.9%,给患者和社会带来了沉重的负担。根据流行病学统计,2011年全球糖尿病患者人数已达3.7亿,其中80%在发展中国家,当年全球共有460万人死于糖尿病,当年全球糖尿病的医疗花费高达4650亿美元。在我国,近30年来糖尿病患病率显著增加。2013年,最新的流行病学调查研究警示,我国成年人糖尿病患病率为11.6%(约1.1亿),糖尿病前期的患病率高达50.1%(约4.9亿)。
90%以上的糖尿病患者为2型糖尿病,是由胰岛素抵抗和β-细胞功能衰竭等引起的严重糖脂代谢紊乱的状态,并最终导致心脑血管系统和肾脏等多种严重并发症甚至死亡。已有的研究表明,胰岛素抵抗是由多种遗传及环境因素相互作用所导致的糖脂代谢紊乱,包括胰岛素信号传导通路缺陷、胰岛素作用靶点表达异常、与其他激素系统的交叉作用及其他代谢通路失衡等。然而其具体病理生理机制和分子信号网络还远未被完全认识和阐明。目前,糖尿病的药物治疗策略多基于纠正糖脂代谢紊乱,包括促进胰岛素分泌(磺脲类、格列奈类、DPP-4 抑制剂)和通过其他机制降糖的药物(双胍类、TZDs、α-糖苷酶抑制剂)。即使患者接受包括注射胰岛素在内的治疗方案,仍只有40%的患者血糖控制良好,而且,糖尿病所致的代谢障碍不能得到有效纠正,因此亟待研发新的治疗措施。另一方面,糖尿病的病因和危险因素并未完全阐明,因此需要寻找新的危险因素和采用更加有效的风险评估方法。
作为重要的内源性调控因子,miRNA广泛参与动植物体内的信号传导途径调控。尽管 miRNA的调控机制尚未完全阐明,已有的研究资料表明miRNA在糖脂代谢调控中起到重要作用,不仅可以作为糖尿病的新型诊断标志物,还参与调控糖尿病胰岛素抵抗及其并发症的发生发展。一系列研究发现,与对照人群相比,糖尿病患者外周血循环miRNA表达谱具有显著差异。miRNA-375在胰岛β细胞中特异性表达,并且能通过PI3K/PDK1/PKB等通路参与调控胰岛素的分泌,而miR-375敲除小鼠呈现出糖脂代谢紊乱的表型。全身或胰岛特异性高表达let-7b将导致糖耐量受损及胰岛素分泌减少。高糖状态下,miR-503在内皮细胞中表达增高,并通过Cdc25A和CCNE1介导参与糖尿病血管功能的调控。
RNA干扰技术作为具有突破性临床应用前景的生物技术,从出现开始的短短数年间就有多个产品进入临床试验,获得了巨大的成功。如发明专利201210069179.7中所披露,本发明的申请人在前期研究工作中发现miR-320a在动脉粥样硬化性疾病中具有预测作用,并研究确定了miR-320a的反义序列anti-miR-320a在动脉粥样硬化性疾病中的治疗作用。但本领域尚未发现miR-320a与糖尿病的关系,现有技术在糖尿病的分子诊断和分子治疗方面也缺乏行之有效的产品或药物。
发明内容
本发明正是基于上述本领域的空白和需求,在原创基础工作上进一步确定了miR-320a在糖尿病疾病风险预测中的作用;还有miR-320a参与糖代谢调控及糖尿病发展的作用及 anti-miR-320a在糖尿病中的治疗作用。本发明提供了一种内源性的非编码小RNA的新医药用途,更具体地说涉及microRNA-320a(hsa-miR-320a)及其反义核苷酸序列hsa-anti-miR-320a 在糖尿病的风险评估、预防和治疗中的用途。本发明还涉及能调控人类miR-320a的重组腺相关病毒重组体(rAAV-miR-320a/rAAV-anti-miR-320a)的构建和制备方法,更具体地说涉及 hsa-miR-320a及反义序列anti-hsa-miR-320a的克隆及分别包含hsa-miR-320a和 anti-hsa-miR-320a的重组腺相关病毒重组体的包装制备方法,和所述的重组腺相关病毒重组体的药学用途。
本发明的技术方案如下:
本发明一方面提供一种用于诊断和/或早期预警糖尿病的生物标志物,其特征在于,包括:含有hsa-miR-320a在内的序列片段;所述hsa-miR-320a如SEQ ID No.1所示。
所述生物标志物包括:所述hsa-miR-320a。
所述生物标志物为所述hsa-miR-320a。
本发明第二个方面提供一种用于诊断和/或早期预警糖尿病的试剂盒,其特征在于,包括用于定量检测所述的生物标志物的试剂。
所述试剂盒包括用于定量检测hsa-miR-320a的试剂。
所述用于定量检测hsa-miR-320a的试剂包括所述hsa-miR-320a的特异性引物对。
所述特异性引物对为商购获得的引物产品miRQ0000510-1-1。该引物产品miRQ0000510-1-1购自广州锐博生物公司。
所述用于定量检测hsa-miR-320a的试剂还包括逆转录试剂;和/或逆转录PCR试剂;
优选地,所述逆转录试剂包括:RT Primer Mix、2×TS reaction buffer、RNasefree H2O、 TS enzyme;
进一步优选地,所述逆转录PCR试剂包括:2×SYBR Green Mix、RNase free H2O。
所述定量检测指荧光定量PCR检测;
最优选地,所述试剂盒包括:miR-320a逆转录引物、miR-320a real-time PCR引物F、 miR-320a real-time PCR引物R、SYBR Green I、TS reaction enzyme、TS reactionbuffer、DEPC ddH2O。
本发明的第三个方面提供所述的生物标志物在制备糖尿病诊断试剂方面的应用。
本发明的第四个方面提供一种用于防治糖尿病的药物,其特征在于,所述药物的药效成分以hsa-miR-320a为药物靶点,且通过结合、和/或捕获、和/或降解、和/或下调表达所述hsa-miR-320a起到所述防治糖尿病的药效;所述hsa-miR-320a如SEQ ID NO.1所示。
所述药物的药效成分包括可降解、和/或下调表达所述hsa-miR-320a的物质;优选为可下调表达所述hsa-miR-320a的物质。
所述药物的药效成分包含与hsa-miR-320a反义互补的序列片段anti-hsa-miR-320a;
优选地,所述反义互补指所述anti-hsa-miR-320a与所述hsa-miR-320a的全长或部分序列呈反向互补的长度为15-25个碱基的序列片段。
所述药物的药效成分为可表达与hsa-miR-320a反义互补的序列片段anti-hsa-miR-320a的重组质粒。
所述药物的药效成分为所述药物的药效成分为重组腺相关病毒质粒 pAAV-D(+)-anti-miR-320a,其表达的序列片段anti-hsa-miR-320a与hsa-miR-320a反义互补。
更具体地,所述pAAV-D(+)-anti-miR-320a是通过将序列如SEQ ID NO.4和SEQ IDNO.5 所示的引物对插入至腺病毒表达载体pAAV-D(+)中构建而得。
所述药物还包括药学上可接受的辅料,和/或,用于缓冲、培养、和/或扩繁所述重组腺相关病毒质粒pAAV-D(+)-anti-miR-320a的试剂。
本发明的第五个方面提供一种防治糖尿病的药物的筛选方法,其特征在于,检测待选物质是否能结合、捕获、降解、和/或下调表达hsa-miR-320a;
优选地,筛选出能使hsa-miR-320a表达水平降低的物质。
本发明的第六个方面提供一种防治糖尿病的药物的制备方法,其特征在于,包括:将降解、和/或下调表达所述hsa-miR-320a的物质;
与hsa-miR-320a反义互补的序列片段anti-hsa-miR-320a;
表达与hsa-miR-320a反义互补的序列片段anti-hsa-miR-320a的重组质粒;和/或,
表达与hsa-miR-320a反义互补的序列片段anti-hsa-miR-320a的重组腺相关病毒质粒作为抗糖尿病药物的活性成分。
所述制备方法还包括:将可表达与hsa-miR-320a反义互补的序列片段anti-hsa-miR-320a 的引物对插入表达载体,从而制备得到可稳定表达与hsa-miR-320a反义互补的序列片段 anti-hsa-miR-320a的重组质粒。
可表达所述与hsa-miR-320a反义互补的序列片段anti-hsa-miR-320a的引物对如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示;所述表达载体为腺相关病毒表达载体pAAV-D(+)。
本发明人通过大量的实验发现,糖尿病患者外周血中miR-320a的表达显著增高。进一步,本发明人根据hsa-miR-320a碱基序列,分别设计并合成了表达hsa-miR-320a和反义互补 anti-hsa-miR-320a的序列,并成功分别插入真核表达载体pAAV-D(+)中构成重组质粒 pAAV-D(+)-miR-320a和pAAV-D(+)-anti-miR-320a。之后,将以下三种质粒:1)pXX2、pXX8 或pXX9质粒、2)phelper质粒、3)pAAV-D(+)-miR-320a或pAAV-D(+)-anti-miR-320a质粒,用钙磷共转染法分别转入293细胞包装制备能分别表达hsa-miR-320a和反义互补anti-hsa-miR-320a的三种血清型重组腺相关病毒(rAAV2、rAAV8和rAAV9),经纯化后,real-time PCR法测定滴度。下一步将包装制备的同一血清型的两种重组腺相关病毒(rAAV-miR-320a和rAAV-anti-miR-320a)分别经尾静脉注射至db/db糖尿病小鼠中,发现db/db小鼠的血糖受到明显调控,重组腺相关病毒介导的anti-hsa-miR-320a表达能明显改善 db/db小鼠的升高的血糖,并且改善心脏功能。而hsa-miR-320a则进一步加重db/db小鼠的血糖增高,并恶化心功能。这些结果进一步支持了anti-hsa-miR-320a对糖尿病及其并发症的治疗作用。
具体的,本发明的第一个目的是提供糖尿病患者的外周血miR-320a表达情况,结果显示糖尿病患者外周血中的miR-320a的表达显著升高,这意味着miR-320a可作为一种早期诊断和预测糖尿病的生物标志物。
本发明的第二个目的是在第一个目的的基础上,本发明人通过实验确证miR-320a的反义核苷酸anti-miR-320a对糖尿病具有保护作用,anti-miR-320a可成为一种治疗糖尿病及其并发症的药物。
经临床验证,本发明提供的早期预警/诊断糖尿病的试剂盒的临床诊断正确率达到83%;同时本发明提供的糖尿病防治药物经临床动物初步治疗验证,其有效率达到100%。综上,本发明发现的hsa-miR-320a可以做为一种有效的评估糖尿病风险、用于确诊糖尿病的生物标志物,基于hsa-miR-320a的试剂盒是糖尿病诊断领域的一种利用分子生物学手段的高效、准确的产品。而本发明所述基于hsa-miR-320a的糖尿病防治药物为分子生物学领域治疗糖尿病提供了一种行之有效的、安全的药物,为患者和医疗人员提供了一种糖尿病治疗的新选择。
附图说明
从下面给出的说明结合附图,本发明的上面和其他目的和特征将变得明了。其中:
图1显示了糖尿病患者血糖水平与外周血hsa-miR-320a表达水平的相关性;A.Real-time PCR法检测糖尿病患者外周血中hsa-miR-320a的表达情况;以U6为内参,所采用比较方法为2-△△CT法;B.糖尿病患者空腹血糖值;C.外周血hsa-miR-320a表达与空腹血糖的关联性分析;D.外周血hsa-miR-320a对糖尿病诊断的ROC曲线;其中,**P<0.01与对照组相比(n=200);DM:糖尿病患者;Non-DM:正常对照人群。
图2是显示pAAV-D(+)-miR-320a和pAAV-D(+)-anti-miR-320a的质粒构成。
图3是纯化后的病毒转染细胞后荧光显微镜观察GFP(40X,绿色显示的是转染成功的细胞),其转染效率可达90%以上。
图4是不同microRNA治疗对db/db小鼠空腹血糖的影响,空腹血糖检测显示 rAAV-miR-320a和rAAV-anti-miR-320a可明显调控db/db小鼠的糖代谢(前者促进血糖升高,后者使得血糖降低)。
图5是不同microRNA治疗对db/db小鼠心脏射血分数的影响,心脏超声检测显示rAAV-anti-miR-320a可明显改善db/db小鼠的心脏射血分数;而rAAV-miR-320a则明显降低db/db小鼠的心脏射血分数。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明,本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的,并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是,在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换,但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
生物材料的来源
C57对照小鼠、db/db糖尿病小鼠来自南京模式动物中心;293T细胞购自武汉大学典型物种保藏中心。
下述任一实施例/实验例中所使用的酶、载体、细胞及各类分子生物学实验常规使用的试剂、试剂盒、耗材均可商购获得。
第1组实施例、本发明糖尿病诊断的生物标志物
本组实施例提供一种用于诊断和/或早期预警糖尿病的生物标志物。在本组所有的实施例中,所述生物标志物都具备如下共同特征:所述生物标志物包括:含有hsa-miR-320a在内的序列片段;所述hsa-miR-320a如SEQ ID No.1所示。
在具体的实施例中,所述生物标志物包括:所述hsa-miR-320a。
更具体的实施例中,所述生物标志物为所述hsa-miR-320a。
第2组实施例、本发明的糖尿病诊断/早期预警/风险评估试剂盒
本组实施例提供一种用于诊断和/或早期预警糖尿病的试剂盒。本组所有的实施例都具有如下共同特征:所述试剂盒包括用于定量检测第1组实施例任一所述的生物标志物的试剂。
进一步的实施例中,所述试剂盒包括用于定量检测hsa-miR-320a的试剂。
在具体的实施例中,所述用于定量检测hsa-miR-320a的试剂包括所述hsa-miR-320a的特异性引物对。
更具体的实施例中,所述特异性引物对为商购获得的引物产品miRQ0000510-1-1。
在优选的实施例中,所述用于定量检测hsa-miR-320a的试剂还包括逆转录试剂;和/或逆转录PCR试剂;
优选地,所述逆转录试剂包括:RT Primer Mix、2×TS reaction buffer、RNasefree H2O、 TS enzyme;
进一步优选地,所述逆转录PCR试剂包括:2×SYBR Green Mix、RNase free H2O。
一些实施例中,所述定量检测指荧光定量PCR检测;
在另一些优选实施例中,所述试剂盒包括:miR-320a逆转录引物、miR-320a real-time PCR 引物F、miR-320a real-time PCR引物R、SYBR Green I、TS reaction enzyme、TSreaction buffer、 DEPC ddH2O。
第3组实施例、本发明的生物标志物的应用
本组实施例提供第1组实施例任一所述的生物标志物在制备糖尿病诊断试剂方面的应用。
第4组实施例、本发明的糖尿病防治药物
本组实施例提供一种用于防治糖尿病的药物。本组所有的实施例都具备如下共同特征:所述药物的药效成分以hsa-miR-320a为药物靶点,且通过结合、和/或捕获、和/或降解、和/ 或下调表达所述hsa-miR-320a起到所述防治糖尿病的药效;所述hsa-miR-320a如SEQ ID NO.1 所示。
在一些实施例中,所述药物的药效成分包括可降解、和/或下调表达所述hsa-miR-320a的物质;优选为可下调表达所述hsa-miR-320a的物质。
在本组另一些实施例中,所述药物的药效成分包含与hsa-miR-320a反义互补的序列片段 anti-hsa-miR-320a;
在优选的实施例中,所述反义互补指所述anti-hsa-miR-320a与所述hsa-miR-320a的全长或部分序列呈反向互补的长度为15-25个碱基的序列片段。
在另一些优选的实施例中,所述药物的药效成分为可表达与hsa-miR-320a反义互补的序列片段anti-hsa-miR-320a的重组质粒。
在一些具体的实施例中,所述药物的药效成分为所述药物的药效成分为重组腺相关病毒质粒pAAV-D(+)-anti-miR-320a,其表达的序列片段anti-hsa-miR-320a与hsa-miR-320a反义互补。
在更具体的实施例中,所述pAAV-D(+)-anti-miR-320a是通过将序列如SEQ IDNO.4和SEQ ID NO.5所示的引物对插入至腺病毒表达载体pAAV-D(+)中构建而得。
在进一步的实施例中,所述药物还包括药学上可接受的辅料,和/或,用于缓冲、培养、和/或扩繁所述重组腺相关病毒质粒pAAV-D(+)-anti-miR-320a的试剂。
第5组实施例、本发明的糖尿病防治药物的筛选方法
本组实施例提供一种防治糖尿病的药物的筛选方法。本组所有实施例的共同特征如下:所述筛选方法具有如下特点:检测待选物质是否能结合、捕获、降解、和/或下调表达hsa-miR-320a;
在本组优选的实施例中,筛选出能使hsa-miR-320a表达水平降低的物质。
第6组实施例、本发明的糖尿病药物的制备方法
本组实施例提供一种防治糖尿病的药物的制备方法。本组所有的实施例中,所述制备方法都具备如下共同特征:所述制备方法包括:将降解、和/或下调表达所述hsa-miR-320a的物质;与hsa-miR-320a反义互补的序列片段anti-hsa-miR-320a;表达与hsa-miR-320a反义互补的序列片段anti-hsa-miR-320a的重组质粒;和/或,表达与hsa-miR-320a反义互补的序列片段 anti-hsa-miR-320a的重组腺相关病毒质粒作为抗糖尿病药物的活性成分。
在进一步的实施例中,所述制备方法还包括:将可表达与hsa-miR-320a反义互补的序列片段anti-hsa-miR-320a的引物对插入表达载体,从而制备得到可稳定表达与hsa-miR-320a反义互补的序列片段anti-hsa-miR-320a的重组质粒。
在本组具体的实施例中,可表达所述与hsa-miR-320a反义互补的序列片段 anti-hsa-miR-320a的引物对如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示;所述表达载体为腺相关病毒表达载体pAAV-D(+)。
实验例1.糖尿病患者外周血miRNA检测
1.收集200例糖尿病患者和200例正常对照人群外周血。取材后,室温3,500rpm离心6min,取上层血浆,保存于-80℃冰箱。每0.25ml外周血血浆中加入1ml TRIZOL LS(Invitrogen公司),提取RNA,RNasey Mini Kit(Qiagen)处理样品。使用ND-1000检测RNA质量。
2.采用广州锐博公司miRNA检测试剂盒对hsa-miR-320a的表达进行real-timePCR检测:
miRNAs逆转录:
逆转录引物(RT Primer Mix)配置:
miRNA RT Primer 1μl
U6RT Primer 1μl
RNase free H2O 78μl
逆转录反应体系:
RNA template 2μg
RT Primer Mix 4μl
RNase free H2O up to 19μl
以上体系混匀后,瞬时离心,70℃孵育10min后,冰育2min,再加入以下试剂:
2×TS reaction buffer 25μl
TS enzyme 2.5μl
RNase free H2O 3.5μl
逆转录反应程序:
42℃60min,70℃10min;停止后4℃备用,产物保存于-20℃。
miRNAs real-time PCR:
反应体系:2×SYBR Green Mix 9μl
RT product 2μl
miRNA Forward Primer 2μl(购自广州锐博生物科技有限公司)
miRNA Reverse Primer 2μl(购自广州锐博生物科技有限公司)
RNase-free H2O 5μl
反应程序:
95℃30sec--(95℃10sec--60℃20sec--70℃1sec)×40cycles--Melting Curve
结果显示:糖尿病患者外周血中hsa-miR-320a的表达水平增高(图1A),空腹血糖也明显增高(图1B),且hsa-miR-320a的表达水平与空腹血糖水平呈正相关性(图1C)。hsa-miR-320a 可用于诊断糖尿病(图1D)。
aaaagcuggguugagagggcga hsa-miR-320a的序列(SEQ ID NO.1)。
实验例2.制备检测糖尿病风险评估的试剂盒
试剂盒成分:检测试剂盒包括用于扩增miR-320a的特异性逆转录引物及real-time PCR引物对一套;用于扩增对照RNA(U6)的特异性逆转录引物及real-time PCR引物对一套及相关试剂,成分和含量如下(100次),保存于-20度:
以上试剂均由各来源公司提供,已经商品化。具体检测方法及相关反应参数参照实施例1。
实验例3、本发明糖尿病早期预警/诊断试剂盒的准确性验证:
本领域目前常用的糖尿病诊断方法是空腹血糖检测及OGTT实验,采集100例事先经该方法确诊已是糖尿病患者的血液样品,再利用本发明第1组实施例任一实施例所提供的生物标志物和/或第2组实施例任一实施例所提供的糖尿病早期预警/诊断试剂盒进行分子检测,检测结果的诊断标准为:miR-320a的表达量高于50nmol/L则确诊为糖尿病;最终结果发现,共有83 例糖尿病患者的血液样品中的miR-320a的表达量高于50nmol/L,说明本发明的糖尿病早期预警/诊断试剂盒的准确性为83%。
实验例4.重组腺相关病毒的构建
1.插入片段合成
依据hsa-miR-320a的碱基序列(图2),分别设计并合成表达hsa-miR-320a及反向互补 anti-hsa-miR-320a的两条反向互补链,并用TE溶解。
表达hsa-miR-320a的引物对:
hsa-miR-320a-Sense:
5`agctttcgccctctcaacccagcttttttcaagagaaaaagctgggttgagagggcgaccgc 3`(SEQ ID NO.2)
hsa-miR-320a-Antisense:
3`aagcgggagagttgggtcgaaaaaagttctct ttttcgacccaactctcccgctggcgccgg 5`(SEQ ID NO.3)
表达anti-hsa-miR-320a的引物对:
anti-hsa-miR-320a-Sense:
5`agctt aaaagctgggttgagagggcgattcaagagatcgccctctcaacccagcttttccgc 3`(SEQ ID NO.4)
anti-hsa-miR-320a-Antisense:
3`attttcgacccaactctcccgctaagttctctagcgggagagttgggtcgaaaaggcgccgg 5`(SEQ ID NO.5)
2.按照说明书中体系及温度进行反应:
Nuclease-Free Water 36μl
Annealing Buffer for DNA Oligos(5X) 10μl
DNA oligo A(50μM) 2μl
DNA oligo B(50μM) 2μl
90℃3min,37℃1hr,4℃保存。
3.载体酶切
采用BamH I和Not I对真核表达载体pAAV-D(+)在37℃下双酶切2hr,体系如下:
10×K Buffer 1μl
BSA 1μl
BamH I 1μl
Not I 1μl
pAAV-D(+) 2μl
ddH2O 14μl
4.琼脂糖凝胶电泳胶回收
用1%的琼脂糖电泳凝胶电泳双酶切产物,然后使用TaKaRa公司琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0回收双酶切产物,具体操作步骤如下:
1.制作1×TAE缓冲液琼脂糖凝胶,然后对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳;
2.在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶;
3.称量胶块重量,计算胶块体积,切碎胶块;
4.向胶块中加入3倍体积的胶块融化液DR-I Buffer,75℃加热融化胶块;
5.向胶块融化液中加入DR-I Buffer量的1/2体积量的DR-II Buffer,均匀混合。当分离小于400bp的DNA片段时,应在此溶液中再加入终浓度为20%的异丙醇;
6.将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上;
7.将上述操作5的溶液转移至Spin Column中,12,000rpm离心1min,弃滤液;
8.将500μl的Rinse A加入Spin Column中,12,000rpm离心30sec,弃滤液;
9.将700μl的Rinse B加入Spin Column中,12,000rpm离心30sec,弃滤液;
10.重复操作步骤9;
11.将Spin Column安置于Collection Tube上,12,000rpm离心1min;
12.将Spin Column安置于新的1.5ml的离心管上,在Spin Column膜的中央处加入25μl的 60℃预热的Elution Buffer,室温静置1min;
13. 12,000rpm离心1min洗脱DNA。
5.载体连接
1.用T4连接酶连接回收的pAAV-D(+)载体和合成的DNA片段,按照下述反应体系16℃孵育过夜:
2.全量(25μl)加入至100μl DH5α感受态细胞中,冰中放置30min;
3. 42℃加热45sec后,再在冰中放置1min;
4.加入500μl无抗生素LB培养基,37℃100rpm振荡培养60min;
5.在Amp+的LB平板培养基上培养,挑选白色单克隆菌落鉴定。
6.质粒小提
挑取单克隆菌落,加入到3ml Amp+的LB液体培养基中,37℃280rpm振荡培养过夜。使用北京全式金公司EasyPure Plasmid MiniPrep Kit提取质粒,具体操作步骤如下:
1.取1.5ml过夜培养的细菌10,000g离心1min,尽量吸尽上清;
2.加入250μl无色溶液RB(含RNase A),震荡悬浮细菌沉淀;
3.加入250μl蓝色溶液LB,温和地上下翻转混合4-6次,使菌体充分裂解,形成蓝色透亮的溶液;
4.加入350μl黄色溶液NB,轻轻混合5-6次,直至形成紧实的黄色凝集块,室温静置2min;
5. 15,000g离心5min,小心吸取上清加入吸附柱中;
6. 15,000g离心1min,弃流出液;
7.加入650μl溶液WB,15,000g离心1min,弃流出液;
8. 15,000g离心2min,彻底去除残留的WB;
9.将吸附柱置于新Ep管中,在柱中央加入20μl 70℃预热的EB,室温静置1min;
10. 10,000g离心1min,洗脱DNA,洗脱出的DNA于-20℃保存。
7.质粒鉴定
采用双酶切和测序对所构建的质粒进行鉴定,得到真核表达质粒pAAV-D(+)-miR-320a和 pAAV-D(+)-anti-miR-320a,其结构如图3所示。
8.质粒大提
准备1L的无菌锥形瓶,加入300ml无菌LB培养基,加氨苄青霉素溶液至终浓度为100μg/ml。分别加入50μl所需质粒(pXX2、pXX8或pXX9;phelper;pAAV-D(+)、 pAAV-D(+)-miR-320a或pAAV-D(+)-anti-miR-320a),280rpm,37℃过夜培养。按照OMEGA公司 Endo-Free Plasmid Maxi Kit说明书操作,提取质粒,具体步骤如下:
1.室温下5000g离心10min收集细菌;
2.弃培养基,加入10ml Solution I/RNase A混合液,漩涡震荡完全重悬;
3.重悬混合液中加入10ml Solution II,轻轻颠倒混匀10-15次后,室温放置2min;
4.加入5ml冰浴的Buffer N3,并温和颠倒数次至形成白色絮状沉淀;
5.将HiBind柱套在收集管中,加入5ml Buffer GPS,室温静置3-10min,5,000g离心5min,弃滤液,将柱子重新放回收集管中;
6.将细菌裂解液倒入针筒过滤器中,静置2min,插入并推动活塞,收集过滤的裂解液;
7.过滤裂解液中加入1/10体积的ETR,颠倒7-10次后,冰浴10min;
8. 42℃水浴5min后,室温5,000g离心5min,转移上清液至新离心管,加入0.5倍体积无水乙醇,混匀后室温静置2min;
9.转移混合液至已激活HiBind柱中,室温5,000g离心5min,弃去滤液;
10.将结合柱重新装回收集管,加入10ml HB Buffer,室温5,000g离心5min,弃去滤液;
11.将结合柱重新装回收集管,加入15ml DNA Wash Buffer,室温5,000g离心5min,弃去滤液;
12.重复上一步骤;
13.弃去滤液,结合柱重新装回收集管,6,000g离心15min;
14.取出结合柱,65℃干燥10min;
15.结合柱装入新离心管,加入70℃预热的1-3ml Endotoxin free ElutionBuffer,室温静置 2min后,6,000g离心5min以洗脱DNA。
9.rAAV介导的病毒包装
293T细胞(人源胚胎肾上皮细胞)生长至90%,钙磷转染前1-2hr,每个培养皿换新鲜培养基(含血清)12-15ml,在50ml离心管内先加入氯化钙(CaCl2),再加入质粒,形成Ca-DNA 混合液,充分混匀,向Ca-DNA混合液中缓慢滴加2XHEBS BUFFER,形成Ca-DNA-P混合液,一边加2XHEBS一边振荡离心管,充分混匀形成钙磷颗粒。8-12hr后,换18-20ml无血清培养基,72hr后,吸弃培养基,用PBS洗3遍,每个培养皿中加入Tris+NaCl(pH 8.5)1ml,用刮匙刮取细胞,收集于干净离心管,-80℃冻存。
10.病毒纯化
将冻存于-80℃的细胞取出,在37℃解冻溶解,反复冻融4次,8,000g离心15min,将上清放至干净离心管,弃细胞沉淀。
用-20℃预冷的无水乙醇与rAAV以3:1的体积比充分混匀,-20℃冰箱放置2hr后,4℃, 13,000rpm离心15min,弃上清;乙醇挥发后,加入相应体积Tris+NaCl(pH 8.5)溶解沉淀。用Millipore小滤器(0.22μm)过滤。
11.病毒滴度测定
样品处理:rAAV病毒液 40μl
蛋白酶K(20mg/ml) 5μl
55℃,反应1hr;
酚:氯仿:异戊醇 45μl
4℃,12,000g离心5min回收水相;
氯仿 45μl
4℃,12,000g离心5min回收水相。
Real-time PCR:
Primer 1(10μm)0.4μl
Primer 2(10μm)0.4μl
SYBR Green I Mix 10μl
ddH2O 8.2μl
Template 1μl
95℃30sec---(95℃5sec---60℃5sec---72℃20sec)×40个循环---MeltingCurve
12.病毒转染效率
纯化后的病毒转染至293T细胞48小时后,荧光显微镜观察被转染细胞比例,其转染效率可达90%以上(图4)。
实验例5.以rAAV9型表达hsa-miR-320a/hsa-anti-miR-320a的重组腺相关病毒为例检测其对糖尿病及并发症的治疗作用
1.db/db小鼠血糖检测:
我们采用12周龄的C57对照和db/db糖尿病小鼠,通过尾静脉分别注射rAAV-miR-320a和 rAAV-anti-miR-320a,病毒滴度1×1011PFU/每只,至实验终点(12周后)时采尾静脉血法,试纸法检测db/db小鼠的空腹血糖,结果显示:db/db糖尿病小鼠血糖较C57对照小鼠明显升高。 rAAV-miR-320a处理可明显促进血糖更为增高,而rAAV-anti-miR-320a处理可明显降低升高的血糖(图5)。
2.db/db小鼠心功能检测:
实验终点时采用心脏超声检测db/db小鼠心功能,方法如下:
使用仪器为配有30MHz高频探头的超声仪。在使用异氟烷麻醉小鼠后,将小鼠仰卧放置于检测平台,沿小鼠胸骨旁左室乳头肌水平短轴和长轴切面采集左室二维图像,同时在二维图像引导下分别获取5个以上连续心动周期M型超声影像,根据采集的影像使用软件分析结果,得到心脏超声检测心脏血流动力学指标,经相关软件分析后计算出下列指标:包括心率 (Heart rate,HR)、左室舒张期内径(Left Ventricular Internal Dimension,diastole,LVIDd)、左室收缩期内径(Left Ventricular Internal Dimension,systole,LVIDs)、左室后壁舒张期厚度 (Left Ventricular Posterior Wall,diastole,LVPWd)、左室后壁收缩期厚度(Left Ventricular Posterior Wall,systole,LVPWs)、室间隔舒张期厚度(Interventricular septal thickness,diastole, IVSd)、室间隔收缩期厚度(Interventricular septal thickness,systole,IVSs)、射血分数(Ejection Fraction,EF)以及缩短分数(Fractional Shortening,FS)等。
结果显示:与C57对照小鼠相比,db/db小鼠心脏收缩功能明显受损。rAAV-anti-miR-320a 处理可明显改善db/db小鼠受损的心脏功能,而rAAV-miR-320a处理可明显加重已损伤的db/db 小鼠的心脏功能。
实验例6、本发明的糖尿病防治药物的动物临床治疗验证
本发明针对数百只患有糖尿病的小鼠采用本发明的糖尿病防治药物进行了糖尿病治疗, 治疗前每只糖尿病小鼠的症状包括:血糖高,糖尿病并发症,例如,心脏收缩功能受损等。
所述糖尿病治疗具体为:采用本发明第4组任一实施例所提供的糖尿病防治药物,和/或,第5组任一实施例所提供筛选方法筛选得到的糖尿病防治药物,和/或,第6组任一实施例所提供的制备方法制备得到的糖尿病防治药物,在db/db小鼠12周龄时通过尾静脉注射一次,病毒滴度1×1011PFU/只,12周后,检测每只小鼠的血糖及心脏收缩功能,发现全部的糖尿病小鼠经上述治疗后血糖显著降低、心脏收缩功能显著改善(每只小鼠的治疗前后具体的对比数值图表类似于图4、图5所示的结果,为节约篇幅,本文不再一一罗列),这表明,本发明的糖尿病防治药物的动物临床治疗的有效率为100%。同时,半年后追踪观察上述所有注射药物的小鼠,无一出现异常或其它副作用,同时血糖保持稳定,各并发症症状半年内没有再出现。
序列表
<110> 华中科技大学同济医学院附属同济医院
<120> 基于hsa-miR-320a的糖尿病早期预警和/或诊断试剂盒的制备方法
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aaaagcuggg uugagagggc ga 22
<210> 2
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agctttcgcc ctctcaaccc agcttttttc aagagaaaaa gctgggttga gagggcgacc 60
gc 62
<210> 3
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aagcgggaga gttgggtcga aaaaagttct ctttttcgac ccaactctcc cgctggcgcc 60
gg 62
<210> 4
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agcttaaaag ctgggttgag agggcgattc aagagatcgc cctctcaacc cagcttttcc 60
gc 62
<210> 5
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
attttcgacc caactctccc gctaagttct ctagcgggag agttgggtcg aaaaggcgcc 60
gg 62
Claims (10)
1.用于诊断和/或早期预警糖尿病的生物标志物,其特征在于,包括:含有hsa-miR-320a在内的序列片段;所述hsa-miR-320a如SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述的生物标志物,其特征在于,包括:所述hsa-miR-320a。
3.根据权利要求1或2所述的生物标志物,其特征在于,为所述hsa-miR-320a。
4.用于诊断和/或早期预警糖尿病的试剂盒,其特征在于,包括用于定量检测权利要求1-3任一所述的生物标志物的试剂。
5.根据权利要求4所述的试剂盒,其特征在于,包括用于定量检测hsa-miR-320a的试剂。
6.根据权利要求5所述的试剂盒,其特征在于,所述用于定量检测hsa-miR-320a的试剂包括所述hsa-miR-320a的特异性引物对。
7.根据权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,所述特异性引物对为商购获得的miRQ0000510-1-1。
8.根据权利要求5或6所述的试剂盒,其特征在于,所述用于定量检测hsa-miR-320a的试剂还包括逆转录试剂;和/或逆转录PCR试剂;
优选地,所述逆转录试剂包括:RT Primer Mix、2×TS reaction buffer、RNase freeH2O、TS enzyme;
进一步优选地,所述逆转录PCR试剂包括:2×SYBR Green Mix、RNase free H2O。
9.根据权利要求4-8任一所述的试剂盒,其特征在于,所述定量检测指荧光定量PCR检测;
最优选地,所述试剂盒包括:miR-320a逆转录引物、miR-320a real-time PCR引物F、miR-320areal-time PCR引物R、SYBR Green I、TS reaction enzyme、TS reactionbuffer、DEPC ddH2O。
10.权利要求1-3任一所述的生物标志物在制备糖尿病诊断试剂方面的应用。
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