CN113774127B - 血清细胞外囊泡miR-503-5p在制备2型糖尿病发病的诊断试剂盒中的应用 - Google Patents

血清细胞外囊泡miR-503-5p在制备2型糖尿病发病的诊断试剂盒中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了血清细胞外囊泡分子标志物hsa‑miR‑503‑5p在制备2型糖尿病诊断试剂盒中的应用，本发明阐述了血清细胞外囊泡miR‑503‑5p含量增加，与2型糖尿病发病进程中胰岛素抵抗的加重，以及β细胞功能损伤导致血糖稳态被破坏疾病发生的过程密切相关，为2型糖尿病的诊断及分型治疗提供了强有力的分子生物学基础，具有深远的临床意义和推广价值。

Description

血清细胞外囊泡miR-503-5p在制备2型糖尿病发病的诊断试 剂盒中的应用
技术领域
本发明涉及分子诊断技术领域，具体涉及到血清细胞外囊泡miR-503-5p作为2型糖尿病标志物及其应用。
背景技术
2型糖尿病(Type 2diabetes,T2D)是一种以慢性高血糖为主要特征的全身性代谢紊乱综合征。在健康成年个体中，机体血糖稳态的维持需要胰岛和外周组织共同维持，当血糖升高时胰岛β细胞分泌胰岛素作用于外周组织，促进外周组织吸收和利用葡萄糖使血糖降低；当β细胞出现功能障碍或胰岛素作用减弱就会导致血糖稳态被破坏，促进2型糖尿病的发生。临床研究表明，在糖尿病发病前胰岛素抵抗就持续存在，而β细胞能够代偿胰岛素抵抗分泌过量胰岛素，一旦β细胞失去代偿能力，就会使患者出现高血糖症状，即发生糖尿病。因此，寻找一种在糖尿病发病前即稳定存在，并且具有显著作用的分子标志物，对2型糖尿病的防治具有重要的临床意义。
MicroRNA(miRNA)是一种短链非编码小分子RNA，长度约为20-24个核苷酸，其经典作用方式是与靶基因mRNA的3’-非编码区(3’-UTR)结合，通过促进靶基因mRNA降解或抑制其翻译，实现基因转录后水平的调控作用。多种细胞都能合成miRNA，而某些miRNA能被直径为30-150nm的具有磷脂双分子层的分泌型囊泡样小体，即细胞外囊泡包裹并分泌至胞外。当细胞外囊泡进入细胞间质，可以被临近的受体细胞吸收，或随体液运输到远端作用于不同的细胞。细胞外囊泡的磷脂双分子层能够保护其包裹的内容物，使细胞外囊泡中的分子不容易被破坏，能相对稳定地存在于体液中，因此细胞外囊泡携带的miRNA可以作为理想的疾病生物标志物。
血液是机体组织与细胞间信号交流的重要信使，疾病发生时多种类型细胞分泌的细胞外囊泡携带miRNA进入血液，为疾病的体液检测提供了新的思路。目前尚未有研究报道miR-503-5p表达和2型糖尿病之间的关系。
发明内容
本发明提供血清细胞外囊泡miR-503-5p作为2型糖尿病发病的分子标志物的应用。本申请研究发现胰岛β细胞中miR-503-5p表达增加不仅能够被分泌出去，经血液循环进入外周组织造成胰岛素抵抗，还能损伤β细胞功能。我们收集了病理模型鼠、健康成年人及糖尿病人血清细胞外囊泡，经绝对定量PCR检测其中miR-503-5p的含量，结合小鼠的发病进程，认为miR-503-5p是2型糖尿病发病早期就存在的分子标志物。
具体地，本发明提供血清细胞外囊泡分子标志物hsa-miR-503-5p在制备2型糖尿病诊断试剂盒中的应用，其中hsa-miR-503-5p的序列如SEQ ID NO.1所示：
GGGGUAUUGUUUCCGCUGCCAGG。
所述2型糖尿病诊断试剂盒为定量检测hsa-miR-503-5p表达量的试剂盒。
具体地，所述试剂盒为实时荧光绝对定量PCR检测试剂盒。
进一步的，本发明的另一目的是提供hsa-miR-503-5p的特异性逆转录引物，引物序列如SEQ ID NO.2所示：
5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATCCTGGCAG-3’。
本发明的另一目的是提供实时荧光绝对定量PCR检测hsa-miR-503-5p的特异性引物，引物序列如SEQ ID NO.3和4所示：
F：5’-ACACTCCAGCTGGGGGGGTATTGTTTCCGC-3’；
R：5’-TGGTGTCGTGGAGTCG-3’。
本发明的另一目的是提供实时荧光绝对定量PCR检测hsa-miR-503-5p的外加标准参照cel-miR-39，其序列如SEQ ID NO.5所示：
UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG
本发明的另一目的是提供cel-miR-39的特异性逆转录引物，引物序列如SEQ IDNO.6所示：
5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATCAAGCTGA-3’。
本发明的另一目的是提供实时荧光绝对定量PCR检测cel-miR-39的特异性引物，引物序列如SEQ ID NO.7-8所示：
F：5’-ACACTCCAGCTGGGTCACCGGGTGTAAATC-3’；
R：5’-TGGTGTCGTGGAGTCG-3’。
作为本发明的重要改进，所述样品来源于血清细胞外囊泡。
本发明发现在糖尿病发病前阶段，高脂喂养的小鼠血清细胞外囊泡中miR-503-5p含量显著增高，虽然此时小鼠的胰岛功能是增强的，但是肝脏和脂肪组织中miR-503-5p的靶基因表达降低，提示血清细胞外囊泡中miR-503-5p含量增加与小鼠的胰岛素抵抗的加重具有密切相关性。而在人血清细胞外囊泡中，检测发现相对于健康成年人你，miR-503-5p在2型糖尿病患者血清细胞外囊泡中含量显著增加，并且miR-503-5p含量增加与患者血糖升高的程度呈正相关。而在人胰岛中过表达hsa-miR-503-5p能造成β细胞糖刺激的胰岛素分泌障碍，说明胰岛中miR-503-5p含量持续增加可能会造成β细胞功能障碍，造成糖尿病的发生。因此，本发明阐述了血清细胞外囊泡miR-503-5p含量增加，与2型糖尿病发病进程中胰岛素抵抗的加重，以及β细胞功能损伤导致血糖稳态被破坏疾病发生的过程密切相关，2型糖尿病的诊断及分型治疗提供了强有力的分子生物学基础，具有深远的临床意义和推广价值。
附图说明
图1显示的是在肥胖和衰老过程中miR-503-5p启动子区甲基化程度降低，其中，图1A是miR-503-5p启动子区甲基化修饰分析，图1B是成年过程中miR-503-5p启动子区甲基化程度逐渐升高，图1C是衰老和糖尿病发生过程中miR-503-5p启动子区甲基化程度会降低；
图2显示的高脂喂养小鼠血糖和血清miR-503-5p的关系，其中，图2A显示的是正常随机饮食(Normal chow diet,NCD)和高脂喂养(High fat diet,HFD)情况下，持续监测的小鼠体重水平，图2B显示的是持续监测的小鼠随即将血糖水平，图2C显示的是高脂喂养4个月时，小鼠的糖耐量检测(IPGTT)；
图3显示的是高脂喂养4个月时小鼠的糖耐量损失的原因，图3A显示的是胰岛素耐量检测(IPITT)，图3B显示的是胰岛素灌注的曲线图，图3C显示的是胰岛灌注后抽提的胰岛素含量的结果；
图4显示的是血清细胞外囊泡miR-503-5p与胰岛素抵抗的关系，图4A是用cel-miR-39标准品制作的标准曲线，4B是NCD和HFD三个月及四个月后小鼠血清细胞外囊泡miR-503-5p的含量，图4C是原代肝细胞和成熟脂肪细胞中分别过表达miR-503-5p后Westernblot检测INSR的表达情况，图4D是小鼠外周组织中INSR的表达检测；
图5显示的是人血清细胞外囊泡miR-503-5p含量与空腹血糖水平的关系，图5A是人类疾病甲基化数据库中检索的糖尿病人血DNA启动子区甲基化水平，图5B是健康成年人、老年人及老年糖尿病人血清细胞外囊泡miR-503-5p含量的绝对定量检测，图5C是人血清细胞外囊泡miR-503-5p含量和空腹血糖水平的相关性分析；
图6显示的血清细胞外囊泡miR-503-5p与胰岛β细胞功能障碍的关系，图6A是在原代人胰岛中过表达miR-503-5p后的胰岛灌注结果，图6B是根据图A计算的曲线下面积用于评估1相和2相胰岛素分泌能力，图6C是灌注后胰岛内胰岛素的总量。
具体实施方式
下面将结合附图及实施例对本发明做进一步的详述。
实施例1自然衰老过程中miR-503-5p启动子区甲基化程度的动态变化。
实验方法：利用生物信息学软件Methprimer，检索miR-503-5p上游2500bp的启动子区，分析可能的甲基化修饰位点；提取胚胎期小鼠及老年小鼠的DNA，以及人血浆DNA，利用MSP技术鉴定特异性位点的甲基化程度。
实验结果：如图1所示，在小鼠和人DNA中，miR-503-5p的启动子区存在大量的甲基化修饰(图1A)，甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)显示在miR-503-5p上游-2397bp～-2213bp的甲基化位点，在小鼠出生后具有特异性甲基化产物，说明该位点具有在发育过程中甲基化程度逐渐升高的趋势(图1B)，同样地，我们在人群中的MSP结果显示在自然衰老过程中该位点甲基化程度逐渐降低(图1C)。
实施例2血清细胞外囊泡miR-503-5p含量与2型糖尿病发病进程的关系。
实验动物：雄性C57BL/6J小鼠购自南京大学模式动物所。所有动物实验均获得南京医科大学实验动物管理委员会的许可，所有实验动物均饲养于南京医科大学实验动物中心屏障设施内，在清洁环境中饲养，温度(21±2)℃，湿度(35±2)％，12h:12h昼夜间断照明，自由进食饮水，饮用水为实验动物中心制备的无菌水。
实验方法：我们在小鼠4周龄时进行高脂造模，并持续监测其体重和随机血糖的变化，在发病前后检测血清细胞外囊泡中miR-503-5p的含量，具体地：
1)在高脂喂养期间，每个月监测以此体重和随机血糖；
2)在高脂喂养至16周时，检测到随机血糖升高时，对小鼠进行葡萄糖耐量试验(GTT)实验：小鼠饥饿14-16小鼠后，腹腔注射1g/kg体重葡萄糖后，在0、5、15、30、60、120分钟分别测血糖值；
3)为了明确造成小鼠糖耐量受损的原因，分别进行了胰岛素耐量试验(ITT)实验：小鼠饥饿4-6小时后，腹腔注射1U/kg体重胰岛素后，在第0、15、30、60、120分钟分别测血糖值。
4)提取胰岛进行体外灌注，评价β细胞糖刺激的胰岛素分泌功能；
5)分离小鼠血清细胞外囊泡，通过绝对定量检测其中miR-503-5p的含量；
6)在原代肝脏和成熟脂肪细胞中过表达miR-503-5p检测INSR的表达，并检测高脂喂养小鼠外周组织INSR的表达量。
统计学分析：本实验所有数据均采用均值±标准差(±s)表示，组间差异性分析采用t检验，以P<0.05作为统计学差异参考标准。
实验结果：如图2所示，随着高脂喂养时间的延长，与正常随机饮食(Normal chowdiet，NCD)组相比，HFD(高脂喂养)小鼠的体重及随机血糖相对于同周龄的小鼠都逐渐升高，至高脂喂养12周时随机血糖显著升高达到糖尿病诊断标准(图2，A和B)，糖耐量检测结果也说明小鼠的糖耐量严重受损(图2C)。由于糖耐量反应的是机体葡萄糖清除能力，所以分别进行了ITT和体外胰岛灌注检测，检测结果说明小鼠具有显著的胰岛素抵抗(图3A)，但此时小鼠的胰岛素合成是增加的，胰岛功能是增强的(图3，B和C)。以上结果说明，此时小鼠处于β细胞能部分代偿胰岛素抵抗的2型糖尿病发病早期。于是，我们利用cel-miR-39制作了标准曲线，并检测在小鼠发病前后即高脂喂养12周和高脂喂养16周时血清细胞外囊泡miR-503-5p的含量，经检测发现在发病前miR-503-5p在血清中显著增加(图4，A和B)，并且其含量随发病进程逐渐增加(图4B)，当我们将miR-503-5p过表达至原代肝细胞及成熟脂肪细胞中，发现INSR的表达降低(图4C)，发病的小鼠外周组织中INSR也表达降低(图4D)，以上结果说明肥胖等因素下血清细胞外囊泡中miR-503-5p含量升高，而miR-503-5p能抑制外周组织中INSR的表达，促进胰岛素抵抗的形成，加速2型糖尿病的发生。
实施例3人血清细胞外囊泡miR-503-5p含量与2型糖尿病的关系。
实验材料：我们收集了江苏省级机关医院体检人群的血液样本，其中健康成年人组的纳入标准为18-40岁无糖尿病及其他疾病史的人群，老年人组的纳入标准为60岁以上无糖尿病史的人群，老年糖尿病人组的纳入标准为60岁以上有糖尿病但无糖尿病并发症的人群。三组人群的具体信息如表1-3所示。
表1健康成年人组信息
编号 性别 年龄 BMI(kg/m<sup>2</sup>) 空腹血糖(mg/dL) 糖尿病史
1 男 37 20.6 96.84 无
2 女 29 22.5 96.12 无
3 女 39 20.4 93.78 无
4 女 21 20.3 87.3 无
5 男 24 23.1 87.12 无
6 男 21 18.7 94.86 无
7 女 21 19.1 80.46 无
8 女 24 19.1 94.68 无
9 女 28 19.3 82.08 无
10 女 28 19.4 84.6 无
11 男 30 19.4 89.46 无
12 男 29 19.5 95.22 无
13 女 31 19.6 85.68 无
14 男 28 19.7 88.92 无
15 男 32 20.3 93.06 无
表2老年人组信息
Figure BDA0003276650870000061
Figure BDA0003276650870000071
表3老年糖尿病人组信息
编号 性别 年龄 BMI(kg/m<sup>2</sup>) 空腹血糖(mg/dL) 糖尿病史
1 女 65 20.6 115.56 有
2 男 80 24.2 114.3 有
3 男 83 23.9 159.66 有
4 男 68 26.2 147.96 有
5 女 73 29.8 111.96 有
6 女 65 25.3 140.4 有
7 男 67 20.1 154.98 有
8 女 67 25.9 207.18 有
9 女 68 27.4 124.74 有
10 女 68 28.4 228.24 有
11 女 76 22.4 154.08 有
12 男 79 23.4 239.22 有
13 女 80 26.4 153.54 有
14 男 81 19.4 179.64 有
15 女 83 28.4 252.36 有
16 男 84 23.1 176.4 有
实验方法：
1)在人类疾病甲基化数据库(http://bio-bigdata.hrbmu.edu.cn/diseasemeth/)，检索并比较健康人及糖尿病患者miR-503-5p启动子区甲基化程度的差异；
2)制作外参标准曲线：用DEPC水溶解广州锐博生物生产的cel-miR-39标准品，10倍梯度稀释得到104、105、106、107、108、109fmol/L的稀释样品；逆转录时所用引物为SEQ IDNO.6，用DEPC水溶解后得到浓度为2μmol/L的原液；每个浓度的标准品取1μl逆转录，逆转录所用试剂盒为TOYOBO公司生产的ReverTra Ace试剂盒，体系如表4所示，逆转录程序为：42℃延伸20min；99℃孵育5min，灭活逆转录酶；4℃冷却5min。逆转录之后，将cDNA 10倍稀释，用SEQ ID NO.7-8的引物进行实时荧光定量PCR，PCR反应所用试剂盒为诺唯赞公司生产的ChamQ SYBR qPCR Master Mix体系如表5所示，定量PCR程序如表6所示，根据检测得到的CT值为纵坐标，以样品浓度的指数减去1为横坐标绘制标准曲线；
表4外参RNA逆转录体系
试剂 体积(10μl体系)
5×逆转录缓冲液 2μl
dNTP 2μl
引物 0.5μl
RNA酶抑制剂 0.5μl
逆转录酶 0.5μl
RNA 1μl
DEPC水 3.5μl
表5实时荧光定量PCR反应体系
Figure BDA0003276650870000081
表6实时荧光定量PCR反应程序
Figure BDA0003276650870000082
3)收集血清：收集捐赠者外周血，采血使用一次性真空采血管，4℃静置30min后以2,000g，4℃离心10分钟，收集上清；10,000g，4℃离心30min后，收集上清至无菌无酶的1.5ml EP管中，每个样本至少需要500μl血清，将获得的血清于-80℃冻存；
4)分离血清细胞外囊泡：取400μl血清于新的无菌无酶的1.5ml EP管中，加入1/10体积的Invitrogen公司生产的Exosome Isolation Reagent细胞外囊泡提取试剂，温和的颠倒混匀后，4℃孵育10min；
5)细胞外囊泡富集：将混匀的液体4℃，12,000g离心1min，弃上清收集沉淀；
6)血清细胞外囊泡中RNA提取：用Ambion公司生产的TRIZOL试剂提取，在细胞外囊泡沉淀中加入1ml TRIZOL试剂，涡旋至沉淀漂浮后将样本至于4℃静音混匀仪溶解2h至沉淀消失；在样本中加入10μl浓度为105fmol/L的cel-miR-39标准品，再中加入200μl的三氯甲烷，剧烈振荡15s，冰浴静置10min，4℃，12,000g离心15min，取上层水相约450μl至新的无菌无酶的1.5ml EP管中；加入等体积的异丙醇温和混匀后，冰浴静置10min，4℃，12,000g离心15min，弃上清；加入1ml的75％乙醇(DEPC水稀释)，温和的颠倒混匀后，4℃，12,000g离心5min，弃上清；4℃，12,000g离心1min，用移液枪吸弃多余的液体，将样本至于通风橱干燥5min，加入10μl的DEPC水溶解样本；酶标仪检测RNA浓度和纯度，浓度应在200-500ng/μl，吸光度260/280比值应在1.8-2.1之间；
7)样本中miR-503-5p含量检测：取1μl样品，用序列为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5的引物逆转录样品，逆转录体系如表7所示，程序同步骤2)中所注；逆转录完成后，将cDNA10倍稀释，用SEQ ID NO.3-4和SEQ ID NO.7-8的引物进行实时荧光定量PCR，定量PCR步骤及程序同步骤2)中所注，分别检测样本中的miR-503-5p和cel-miR-39的CT值，并根据标准曲线计算miR-503-5p和cel-miR-39的检测值，将检测值除以4得到检测浓度，将cel-miR-39的检测浓度除以105fmol/L得到系数，将该系数乘以miR-503-5p的检测浓度，即为样本中miR-503-5p的真实含量。
表7 RNA逆转录体系
Figure BDA0003276650870000091
Figure BDA0003276650870000101
统计学分析：本实验所有数据均采用均值±标准差(±s)表示，组间差异性分析采用t检验，以P<0.05作为统计学差异参考标准。
实验结果：如图5所示，在2型糖尿病患者中miR-503-5p的启动子区甲基化程度降低(图5A)。而依据上述标准品浓度制作的标准曲线斜率符合线性方程的要求(图4，A)。
依据上述实验方法，分别检测了健康成年人(44.35±4.28fmol/L)、老年人(61.38±5.68fmol/L)及老年糖尿病人(86.02±10.64fmol/L)血清外泌中的miR-503-5p含量(图5，B)，发现在自然年龄增长过程中血清细胞外囊泡中miR-503-5p含量显著增加，而在老年糖尿病患者血清细胞外囊泡中miR-503-5p含量进一步增多；我们对老年人和老年糖尿病人的空腹血糖水平和血清细胞外囊泡miR-503-5p含量进行相关性分析，发现细胞外囊泡miR-503-5p含量与空腹血糖水平呈正相关(图5，C)，即当机体血清细胞外囊泡miR-503-5p含量增加时空腹血糖也升高。以上结果说明，在糖尿病患者中miR-503-5p启动子区的甲基化程度是降低的，而自然衰老是miR-503-5p表达增加的触发因素，并且血清细胞外囊泡中miR-503-5p含量的增加与患者血糖的升高正相关。
实施例4miR-503-5p在人胰岛β细胞功能障碍中的作用。
实验材料：分别获得三组原代胰岛分别来自三个健康成年人，捐赠者的具体信息如表7所示：
表7胰岛捐赠者基本信息
Figure BDA0003276650870000102
Figure BDA0003276650870000111
实验方法：为了研究miR-503-5p在胰岛β细胞糖刺激的胰岛素分泌功能中的作用，我们在原代人胰岛中过表达miR-503-5p，48h后进行葡萄糖灌注实验。检测方法为，依次用葡萄糖浓度为0mM、20mM、0mM的KRB(Kreb’s buffer)溶液灌注胰岛，灌注的时间分别为6min、25min、6min，KRB溶液的灌注速率均为125μl/min，收样并检测糖刺激的胰岛素释放量。
统计学分析：本实验所有数据均采用均值±标准差(±s)表示，组间差异性分析采用t检验，以P<0.05作为统计学差异参考标准。
实验结果：如图5所示，在人胰岛中分别过表达NC和miR-503-5p后，在糖浓度为0mM时，两组胰岛释放胰岛素的速率相当(图6，A)。在糖浓度为20mM时，过表达miR-503-5p的胰岛糖刺激的胰岛素分泌量显著降低(图6，B)，而根据曲线下面积计算的1相和2相胰岛素分泌量评价，发现miR-503-5p高表达后主要损伤β细胞2相胰岛素分泌能力。在抽提灌注后剩余胰岛中的胰岛素含量后，发现与对照组相比，miR-503-5p过表达并不影响胰岛中胰岛素的合成(图6，C)。以上结果说明，在人胰岛中miR-503-5p表达增加，不影响胰岛素的合成，但损伤糖刺激的2相胰岛素分泌能力。
实施例5血清细胞外囊泡分子标志物hsa-miR-503-5p检测试剂盒。
本发明的试剂盒包括：血清细胞外囊泡提取单元，即Invitrogen公司生产的Exosome Isolation Reagent细胞外囊泡提取试剂；血清细胞外囊泡中RNA提取单元，即Ambion公司生产的TRIZOL试剂；反转录系统，即RNA酶抑制剂、逆转录酶及SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.6序列所示的引物；相对定量系统，即诺唯赞公司生产的ChamQ SYBR qPCRMaster Mix。
本发明的试剂盒的使用步骤如下：
(1)获取来源于被检测者的外周血；
(2)分离血清细胞外囊泡并富集；
(3)血清细胞外囊泡中RNA提取；
(4)样本中miR-503-5p含量检测；
(5)根据本专利提供的参考值，对受检者2型糖尿病进展进行预测。
上述详细步骤可参考实施例3的步骤。
本发明发现，在自然年龄增加过程中miR-503-5p启动子区甲基化程度降低，利用肥胖诱导的2型糖尿病小鼠模型以及老年人群样本，发现肥胖和自然年龄衰老是启动子区甲基化程度降低后，miR-503-5p表达增加的主要原因。此外，在肥胖小鼠随机血糖升高前即2型糖尿病发病前，小鼠血清细胞外囊泡中miR-503-5p的含量即显著增加，并且可能被运输至肝脏和脂肪组织中，通过靶向抑制肝脏和脂肪细胞中INSR的表达，促进胰岛素抵抗，加速2型糖尿病的发生。
本发明发现，在人群中同样存在血清细胞外囊泡miR-503-5p的含量增加与血糖水平升高正相关的现象，说明在人体血清中miR-503-5p含量增加与2型糖尿病的发生密切相关，通过人原代胰岛的实验证实，除胰岛素抵抗外，miR-503-5p还能造成糖刺激的胰岛素分泌功能受损。根据人群的检测结果统计，发现当人血清细胞外囊泡miR-503-5p含量超过61.38±5.68fmol/L时，机体可能已发生胰岛素抵抗和β细胞功能损伤；当含量接近86.02±10.64fmol/L时，机体空腹血糖超过2型糖尿病标准规定的7mmol/L，因此血清中miR-503-5p的含量可以作为2型糖尿病发病的分子标志物。
本发明阐述了血清细胞外囊泡miR-503-5p含量增加，与2型糖尿病发病进程中胰岛素抵抗的加重，以及β细胞功能损伤导致血糖稳态被破坏疾病发生的过程密切相关，2型糖尿病的诊断及分型治疗提供了强有力的分子生物学基础，具有深远的临床意义和推广价值。
序列表
<110> 南京医科大学
<120> 血清细胞外囊泡miR-503-5p在制备2型糖尿病发病的诊断试剂盒中的应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> RNA
<213> hsa-miR-503-5p的核苷酸序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gggguauugu uuccgcugcc agg 23
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> hsa-miR-503-5p的特异性逆转录引物(Artificial Sequence)
<400> 2
ctcaactggt gtcgtggagt cggcaatcct ggcag 35
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> hsa-miR-503-5p的正向引物(Artificial Sequence)
<400> 3
acactccagc tgggggggta ttgtttccgc 30
<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> hsa-miR-503-5p的反向引物(Artificial Sequence)
<400> 4
tggtgtcgtg gagtcg 16
<210> 5
<211> 22
<212> RNA
<213> cel-miR-39的核苷酸序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ucaccgggug uaaaucagcu ug 22
<210> 6
<211> 35
<212> DNA
<213> el-miR-39的特异性逆转录引物(Artificial Sequence)
<400> 6
ctcaactggt gtcgtggagt cggcaatcaa gctga 35
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> cel-miR-39的正向引物(Artificial Sequence)
<400> 7
acactccagc tgggtcaccg ggtgtaaatc 30
<210> 8
<211> 16
<212> DNA
<213> cel-miR-39的反向引物(Artificial Sequence)
<400> 8
tggtgtcgtg gagtcg 16

Claims (3)

1.血清细胞外囊泡分子标志物hsa-miR-503-5p在制备2型糖尿病的早期诊断试剂盒中的应用，其特征在于，所述hsa-miR-503-5p的序列如SEQ ID NO.1所示，其中，hsa-miR-503-5p导致胰岛β细胞功能障碍和胰岛素抵抗；所述试剂盒为实时荧光绝对定量PCR检测试剂盒；所述hsa-miR-503-5p的特异性逆转录引物序列如SEQ ID NO.2所示；所述试剂盒定量检测hsa-miR-503-5p的特异性引物为：
F：5’-ACACTCCAGCTGGGGGGGTATTGTTTCCGC-3’；
R：5’-TGGTGTCGTGGAGTCG-3’；所述试剂盒的外加标准参照为cel-miR-39，其序列如SEQID NO.5所示；所述cel-miR-39的特异性逆转录引物序列如SEQ ID NO.6所示；定量PCR检测cel-miR-39的特异性引物为：
F：5’-ACACTCCAGCTGGGTCACCGGGTGTAAATC-3’；
R：5’-TGGTGTCGTGGAGTCG-3。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括逆转录试剂和定量检测试剂，其中，逆转录试剂包括逆转录酶、缓冲液、dNTPs、DEPC水、RNA酶抑制剂及特异性逆转录引物；定量检测试剂包括荧光探针、Taq酶和定量引物。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒的检测样品来源于血清细胞外囊泡。
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