CN108676868A - 一组1型糖尿病标志物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一组用于1型糖尿病诊断的标志物，由hsa‑miR‑642a‑3p、hsa‑miR‑320c和hsa‑miR‑1225‑5p这3种miRNA组成；本发明还公开了所述的标志物在制备1型糖尿病诊断试剂盒中的应用，试剂盒中含有定量hsa‑miR‑642a‑3p、hsa‑miR‑320c、hsa‑miR‑1225‑5p表达量的试剂。本发明利用统计学方法，联合多个血清miRNA及临床人口学资料建立1型糖尿病血清miRNA辅助诊断模型，较既往已知单个生物标志物具有更好的诊断支持效能。本发明利用患者循环中miRNA，其表达稳定，易于储存及检测，便于临床应用。

Description

一组1型糖尿病标志物及其应用
技术领域
本发明涉及1型糖尿病诊断技术领域，尤其是一组1型糖尿病标志物及其应用。
背景技术
目前1型糖尿病尚缺乏有效的疾病标志物，早期的筛查与治疗面临巨大挑战。迫切需要寻找新的疾病标志物以提高诊疗效能。
随着微小RNA(microRNA,miRNA)研究的不断深入，其作为新型无创性分子标志物的潜能越来越受到人们的关注。成熟的miRNA是一类由21～23个核苷酸组成的内源性小分子单链非编码RNA，通过与靶mRNA碱基结合，影响mRNA的翻译或稳定性，对基因进行转录后水平的调控。目前已经确认人类基因组可以编码2000余种成熟的miRNA，调节人类近三分之一的基因表达。miRNA的表达具有高度的保守型、时序性及组织特异性，参与调控各种重要的生理及病理过程，miRNA的调节一旦失衡，会导致细胞功能紊乱及疾病的产生。
近年来，研究发现miRNA可能通过囊泡、脂蛋白等载体的协助游离至细胞外，广泛存在于血清、血浆、尿液、唾液等体液中，成为循环miRNA。其在体液中具有良好的稳定性，可以抵御血液RNA酶的破坏，即使在高温、强酸强碱、反复冻融、长期储存等情况下仍能保持稳定，且qRT-PCR技术检测敏感性高。健康男女miRNA表达谱无差异，而不同的疾病有各自独特的miRNA表达谱。这些特性为其可能作为潜在的疾病分子标志物奠定了良好的基础，已在多种肿瘤和非肿瘤疾病的诊断和预后中显示了独特的价值。
目前临床上常用C肽及胰岛自身抗体如谷氨酸脱羧酶抗体(GADA)、锌转运体8抗体(ZnT8A)、胰岛细胞抗体(ICA)等来评估胰岛细胞破坏程度及1型糖尿病的患病风险，但是以此作为疾病的标志物仍存在许多局限性，例如，C肽在胰岛破坏晚期才能反映疾病的特性且缺乏特异性；胰岛自身抗体往往是陆续出现的，时间间隔数月甚至上十年，并非所有患者在诊断时抗体呈阳性，并且许多自身抗体阳性的易感者并不一定发生1型糖尿病等；这些基于蛋白分子的检测在临床常规中检测繁琐、费用昂贵且耗时，应用前景不容乐观。
发明内容
基于上述问题，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一组敏感性高、特异性高的1型糖尿病诊断的标志物。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案包括以下几个方面：
在一个方面，本发明提供了一组用于1型糖尿病诊断的标志物，所述标志物由hsa-miR-642a-3p、hsa-miR-320c和hsa-miR-1225-5p组成。其中，hsa-miR-642a-3p、hsa-miR-320c、hsa-miR-1225-5p指3种microRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～3所示。
优选地，所述诊断采用公式：logit(P)＝0.613+0.174×miR-320c(2-△Ct)-2.199×miR-1225-5p(2-△Ct)+0.09×年龄-0.213×BMI，式中，2-△Ct为该miRNA的相对(内参，例如非编码的U6小核RNA)表达量，BMI为身体质量指数；需要说明的是，根据所述公式，可以界定很多阈值，不同的阈值，具有不同的诊断效能；医生在应用时，可以根据临床情况进行相应的调整；例如，P值大于0.5时，定义为高风险，反之，则为低风险。应当说明的是，采用所述公式可以评估患者患有1型糖尿病的风险高低，但是，并不能确诊该患者是否患有1型糖尿病，还需要通过传统的生化检测以确定患者是否患有1型糖尿病，例如，检测血糖浓度。
在另一个方面，本发明提供了上述的标志物在制备1型糖尿病诊断试剂盒中的应用，所述试剂盒中含有定量hsa-miR-642a-3p、hsa-miR-320c和hsa-miR-1225-5p表达量的试剂。其中，定量hsa-miR-642a-3p、hsa-miR-320c和hsa-miR-1225-5p表达量的试剂包括但不限于，例如，hsa-miR-642a-3p、hsa-miR-320c、hsa-miR-1225-5p的荧光定量PCR所用到的相关试剂，比如，相应的逆转录引物，以及逆转录所得cDNA的检测引物等；需要说明的是，逆转录引物和检测引物(其碱基序列不是唯一的，只要能实现逆转录，以及扩增出目的cDNA序列即可)均可交由引物合成公司设计与合成，只要将相应的microRNA的核苷酸序列提交给引物合成公司即可，该流程已经成为成熟的商业化行为。
优选地，所述诊断采用公式：logit(P)＝0.613+0.174×miR-320c(2-△Ct)-2.199×miR-1225-5p(2-△Ct)+0.09×年龄-0.213×BMI，式中，2-△Ct为该miRNA的相对(内参，例如非编码的U6小核RNA)表达量，BMI为身体质量指数；其中，年龄为患者的实际年龄。
在第三个方面，本发明提供一种用于辅助1型糖尿病诊断的方法，包括如下步骤：
(1)检测患者miR-320c和miR-1225-5p表达量；例如，采用逆转录PCR和荧光定量PCR相结合检测；
(2)将上述表达量代入公式：logit(P)＝0.613+0.174×miR-320c(2-△Ct)-2.199×miR-1225-5p(2-△Ct)+0.09×年龄-0.213×BMI，计算得出P值，然后根据P值的大小判断患者患有1型糖尿病风险的高低，其中，2-△Ct为该miRNA的相对(内参，例如非编码的U6小核RNA)表达量，BMI为身体质量指数，年龄指患者的实际年龄。
综上所述，本发明的有益效果为：
1、本发明利用统计学方法，筛选出多个血清miRNA作为1型糖尿病诊断的分子标志物，再结合临床人口学资料建立1型糖尿病血清miRNA诊断的辅助模型，较既往已知单个生物标志物如C肽、胰岛自身抗体等具有更好的诊断支持效能，并弥补了以往诊断标志物敏感性及特异性欠佳的缺陷；
2、本发明利用患者循环中miRNA，其表达稳定，易于储存及检测，便于临床应用，弥补了以往基于蛋白分子的检测在临床常规中检测繁琐、费用昂贵且耗时的缺陷。
附图说明
图1为本发明实施例1～3的试验方法的流程示意图；其中，T1DM表示1型糖尿病，microarrays表示微阵列芯片，miRNA表示微小RNA，QPCR表示实时定量核酸扩增检测，ROC表示受试者工作特征曲线，AUC表示受试者工作特征曲线下面积；
图2为T1DM组与健康对照组6条血清miRNAs在训练队列相对表达水平比较图，其中，利用qRT-PCR技术检测6条miRNAs在血清中的相对表达水平，6条miRNAs的相对表达量(即靶miRNA表达量/内参照表达量，内参照为非编码的U6小核RNA，常用来作为PCR内参)均采用2-△Ct表示；对照表示健康对照组，T1DM表示1型糖尿病组；
图3为miRNA诊断辅助模型对T1DM的诊断ROC曲线(训练队列)；
图4为miRNA诊断模型对T1DM的诊断ROC曲线(验证队列)。
具体实施方式
本发明探讨了中国1型糖尿病患者血清循环miRNA表达情况，并经大样本临床验证，分析其中部分miRNA作为1型糖尿病生物标志物的效能(具有较高敏感性及特异性)，并建立1型糖尿病诊断辅助模型(具体过程的示意图参见图1)。本发明涉及1型糖尿病患者血清miRNA表达谱，以及诊断支持或辅助模型，涉及血清miRNA生物标志物效能，属于医学诊断支持技术领域。
本发明中提供了可用于辅助诊断1型糖尿病患者血清miRNAs特异表达谱，由上调表达的miR-642a-3p、miR-320c和miR-1225-5p构成。
本发明还提供了一种基于血清miRNA(mi-1225-5p及miR-320c)及临床人口学资料建立的1型糖尿病辅助诊断模型，利用以下公式：logit(P)＝0.613+0.174×miR-320c(2-△Ct)-2.199×miR-1225-5p(2-△Ct)+0.09×年龄-0.213×BMI计算，经ROC曲线分析，此模型对1型糖尿病具有较高的诊断支持效能；由于传统1型糖尿病早期标志物anti-GAD抗体在中国人群中阳性率仅50％，因此，此模型在1型糖尿病辅助诊断方面更适于中国人群；并且，mi-1225-5p及miR-320c与胰岛细胞凋亡相关，且其在血清中的改变在血糖升高前出现，进一步说明了二者在1型糖尿病早期辅助诊断(已有1型糖尿病病理改变但血糖尚未升高患者)及病理生理过程中的可能作用。
本发明中涉及的试验方法介绍如下：
1、miRNA芯片检测
血清miRNA芯片检测使用Agilent microarray(8*60k，19.0)，AgilentHumanmiRNA芯片V19.0数据库来源于Sanger microRNA数据库(miRBase)19.0版本，覆盖2006个人类相关的miRNA。芯片设计采用了Agilent公司独特的miRNA检测技术，能特异性地检测出成熟的miRNA并能很好地区分高度同源的miRNA分子。
1.1、样品标记与杂交
样品标记及杂交所需要的试剂均包含在miRNA Complete Labeling and HybKit(miRNA完全荧光标记和杂交试剂盒；生产商：安捷伦，货号：5190-0456)，具体的试剂目录如下所示：
10×小牛肠磷酸酶缓冲液(10×Calf Intestinal Phosphatase Buffer)
犊牛小肠碱性磷酸酶(Calf Intestinal Alkaline Phosphatase(CIP))
10×T4 RNA连接酶缓冲液(10×T4RNA Ligase Buffer)
T4 RNA连接酶(T4RNA Ligase)
花青3胞苷二磷酸(Cyanine 3-pCp)
二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide(DMSO))
10X GE封闭剂(10X GE Blocking Agent)
2X Hi-RPM杂交缓冲液(2X Hi-RPM Hybridization Buffer)
去核酸酶水(Nuclease-Free Water)
microRNA Spike-In kit(miRNA加标试剂盒；生产商：安捷伦，货号：5190-1934)包含两种microRNA加标溶液：Labeling Spike-In solution(标记加标溶液)和Hyb Spike-In solution(杂交加标溶液)，用于实验流程中标记反应以及杂交反应的质控。
芯片杂交的操作流程如下：
1)标记反应体系准备
①去磷酸化
a)用DNase/RNase-free水或1×TE(pH7.5)将RNA样品稀释到50ng/l。
b)吸取稀释后的样品2L至洁净的1.5mL离心管中，置于冰上备用。
c)按下表1顺序配制去磷酸化混合溶液：
表1去磷酸化混合溶液的配制
d)取上述混合溶液2L至样品管中，总体积4L，用枪头抽吸混匀。
e)将上述4L混合溶液置于PCR仪中或37℃金属浴中30分钟。此步骤结束后，若不立即进行后续反应，须将样品保存于-80℃以下。
②样品变性
a)于每管样品中添加100％DMSO 2.8L。
b)将上述混合液置于100℃的金属浴中加热5-10分钟。
c)加热反应结束后，将样品管迅速置于冰水浴中，立即行后续反应步骤。
③连接
a)将10×T4RNA Ligase Buffer放于37℃温育，间隔涡旋至沉淀完全溶解后冷却至室温。
b)按下表2配制连接反应混合溶液(使用前配置，配好后须置于冰上，15分钟内使用)：
表2连接反应混合溶液的配制
c)取4.5L上述混合液至一样品管中，总体积11.3L，用枪头抽吸混匀，短暂离心。
d)16℃温育2个小时。反应结束后将样品放于真空浓缩仪中抽干备用(真空浓缩仪的温度设定在45℃-55℃)。
2)10×封闭剂准备
①在冻干的10X×GE封闭剂管内加入去核酸酶水125L，轻轻涡旋使其完全溶解，必要时可置于37℃温育5分钟。
②短暂离心备用，可放置-20℃保存2个月。每次使用时，融化后注意涡旋混匀离心。
3)杂交样品准备
①准备100℃的金属浴。
②抽干的样品重新溶解于去核酸酶水(17L)中，每个样品加入1.0L杂交加标溶液(3rd dilution)。
③每管中加入配好的10×GE封闭剂4.5L。
④每管中加入2×Hi-RPM杂交缓冲液22.5μl，轻轻涡旋混匀。
⑤将上述混合溶液置于100℃的金属浴加热5分钟。
⑥反应结束后将样品转至冰水浴中进行冷却5分钟。
⑦离心收集反应液立即进行后续步骤。
3)杂交混合液准备
①放置在安捷伦精准杂交盒(Agilent SureHyb chamber)底座上正确放置合适的盖片。
②使用移液器将45μl反应液吸于盖片上。
③将芯片点样面朝下缓慢放置于盖片上。
④组装并拧紧SureHyb chamber。
⑤稍晃动组装好的SureHyb chamber，使里面所有气泡可自由移动。
⑥将SureHyb chamber平衡置于杂交炉架子上，设定温度55℃，转速20rpm。
⑦进行杂交20小时。
1.2、芯片的洗涤
1)加入聚乙二醇辛基苯基醚X-102(Triton X-102)于基因表达洗涤缓冲液(GeneExpression wash buffers)中
①于纸盒中取出试剂瓶，打开内外层盖子。
②使用移液器加入10％的Triton X-102 2ml。
③盖子盖上，颠倒混匀4-5次。
④装上龙头，瓶壁上标明“已加Triton X-102”。
2)Gene Expression Wash Buffer 2预热
①于无菌试剂瓶中加入1升Gene Expression Wash Buffer 2。
②试剂瓶置于37℃水浴过夜。
③玻片染色皿(slide-staining dish)#3置于装水碟中，37℃水浴过夜。
3)设备准备
使用Milli-Q水将实验中所有需用的架子、碟子和磁力棒彻底清洗数次；尽可能在每步洗涤过程中采用同一洗涤碟等器材。
4)洗涤芯片
①具体的洗涤温度和时间如下表3：
表3芯片洗涤
皿编号 洗涤缓冲液 温度 时间
拆解芯片 1 GE洗涤缓冲液1 室温
1st洗涤 2 GE洗涤缓冲液1 室温 5分钟
2nd洗涤 3 GE洗涤缓冲液2 37℃ 5分钟
②将Gene Expression Wash Buffer 1注满于slide-staining dish#1，室温备用。
③将玻片架(slide rack)置于slide-staining dish#2中，注入Gene ExpressionWash Buffer 2漫过slide rack。放入一个磁力棒后将dish放置于磁力搅拌器上。
④将过夜预热的slide-staining dish#3放置于磁力搅拌器上，注入已过夜预热的Gene Expression Wash Buffer 2后打开加热装置，温度控制于37℃。
⑤将hybridization chamber assembly从杂交炉取出，取下芯片与盖片，芯片面朝上，浸于Gene Expression Wash Buffer 1之中，从贴有标签的一头用扁头镊子取下盖片，使其掉入碟中后迅速将芯片置于在slide-staining dish#2里的slide rack中。重复上述步骤，直至其余芯片放置安妥。打开磁力搅拌器，搅拌5分钟(磁力搅拌器转速不应过快)。
⑥待时间结束后，取出放置芯片的slide rack，使用吸水纸控去上面沾有的液体，然后置于slide-staining dish#3中。开启磁力搅拌器搅拌5分钟(温度控制温在37℃)。
⑦待时间结束后，将slide rack取出，使用吸水纸上控去上面沾有的液体，立刻进行后续步骤。
1.3、芯片的扫描
芯片结果采用安捷伦微列阵扫描仪(Agilent Microarray Scanner)(货号：G2565CA，安捷伦科技公司,圣克拉拉,加利福利亚,美国)扫描，软件设置扫描分辨率(Scanresolution)＝3μm(人类)，光电倍增管(PMT)100％，采用特征提取软件(FeatureExtraction software)10.7.1.1(安捷伦科技公司,圣克拉拉,加利福利亚,美国)读取数据，最后采用基因表达数据分析软件(Gene Spring Software)12.6(安捷伦科技公司,圣克拉拉,加利福利亚,美国)进行归一化处理，所用的算法为分位数(Quantile)。
2、miRNA实时定量PCR(qRT-CR)
血清总RNA的抽提采用miRNeasy Serum/Plasma Kit(德国Qiagen公司)，根据试剂盒提供试剂及提取流程进行提取。
2.1、反转录
1)从-80℃冰箱取出RNA，4℃下解冻后在0.2ml PCR管中配制反应溶液，如下表4所示：
表4反转录PCR反应体系
2)将PCR管置于PCR仪，运行程序如下：
16℃ 30分钟；
42℃ 30分钟；
85℃ 5分钟；
4℃∞
2.2、Tagman PCR
1)在0.2ml PCR管中配制反应液，如下表5所示：
表5 Tagman PCR反应体系
2)将反应液加入384孔板中。
3)将384孔板置于7900HT Sequence Detection System中，运行程序如下：
50℃ 2分钟
95℃ 10分钟
95℃ 15秒
60℃ 1分钟
从95℃15秒开始往下反复进行45个循环。
2.3、实时定量PCR数据分析
1)通过一系列参数设定分析，得到不同样本相对于不同基因的Ct值。
2)实验表明，每个模板的Ct值与该模板起始拷贝数的对数存在线性关系，即起始拷贝数越多，Ct值越小。因为比较的是转录水平的差异，通过检测每个样品的管家基因，将目的基因进行归一化。PCR产物的增长形式为2n，如若各种试剂和外部所加条件均理想化，n就表示循环数。所以首先得到ΔCt＝Ct待测基因－Ct管家基因，再转换为原始模板浓度＝2–ΔCt。本实验采用U6为管家基因。
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1 miRNA标志物的筛选
发明人利用血清miRNA芯片Agilent microarray(8*60k，19.0)高通量芯片技术(具体方法见上述miRNA芯片检测方法)筛查6例新诊断的典型T1DM患者与6例年龄性别匹配的健康对照血清miRNA的表达，检测miRNA高达2006条。
结果发现，其中31条miRNA在两组之间存在差异表达，具体结果参见NCBI GeneExpression Omnibus(GSE94649,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)。
根据试验可行性，选取了芯片结果表达上调的3条miRNA(hsa-miR-642a-3p、hsa-miR-320c、hsa-miR-1225-5p)以及表达下调的3条miRNA(hsa-let-7b-5p、hsa-miR-26b-5p、hsa-miR-144-3p)，共6条miRNA扩大样本验证，相应的核苷酸序列如下表6所示:
表6 miRNA核苷酸序列
利用检测特异性高的Tagman实时定量PCR技术(具体参见上述试验方法，其中的逆转录引物和cDNA检测引物由ABI公司设计与合成)检测训练队列(40例新诊断的典型T1DM患者及56例年龄性别匹配健康对照，具体临床特征见表7)血清中这6条miRNA的表达情况。结果发现，3条miRNA(hsa-miR-642a-3p、hsa-miR-320c、hsa-miR-1225-5p)在两组之间均存在显著性差异表达，表现在T1DM患者表达增加，表达趋势与芯片筛选结果一致(见图2)；hsa-let-7b-5p、hsa-miR-26b-5p、hsa-miR-144-3p在两组之间也存在显著性差异表达，但表现为T1DM患者表达增加，此与芯片筛选结果不符。
表7训练队列研究对象临床特征
*P值＜0.05；**胰岛自身抗体GADA，IA－2A or ZnT8A中至少一个阳性，上述自身抗体检测均采用胰岛自身抗体标准化检测项目(IASP)验证方法。
实施例2 1型糖尿病诊断辅助模型
为了判断各靶miRNAs作为T1DM(1型糖尿病)的生物标志物在T1DM诊断预测中的贡献价值并获得最为有效的诊断模型，发明人采用Logistic回归分析联合各靶miRNAs及临床基本资料构建T1DM诊断预测模型，在排除各变量之间的共线性后将hsa-miR-642a-3p、hsa-miR-320c、hsa-miR-1225-5p、hsa-let-7b-5p、hsa-miR-26b-5p、hsa-miR-144-3p这6个靶miRNA血清中的相对表达量(2-△Ct)与年龄、性别、BMI纳入Logistic回归分析。
最后得到方程logit(P)＝0.613+0.174×miR-320c(2-△Ct)-2.199×miR-1225-5p(2-△Ct)+0.09×年龄-0.213×BMI。模型估计采用最大似然法，2＝37.75(P值＝0.000)。其中，hsa-miR-320c、hsa-miR-1225-5p、年龄、BMI四个变量留在方程中，体现了这四个因素在该诊断预测模型中的独立贡献，采用ROC分析该诊断模型对1型糖尿病的诊断效能，得到曲线下面积为0.817(95％置信区间0.731-0.903，P＝0.000，图3)，约登指数最大时，敏感度55％，特异度92.9％，阳性预测值84.6％，阴性预测值74.3％，显示该模型对T1DM及健康人群具有较好的区分能力。
实施例3 1型糖尿病诊断辅助模型的稳定性及可靠性的测试
为了验证上述模型的稳定性及可靠性，发明人对训练队列数据采用留一法(leave-one-out)对该模型进行交互验证(Cross-Validation)，建立函数时依次去掉一例，然后用建立起来的函数对该例进行判别并计算错判率。
最终得出利用miR-320c(2-△Ct)、miR-1225-5p(2-△Ct)、年龄、BMI这四个变量所构建模型的错判率为18.3％，与ROC分析所得结果较为一致，
为了进一步验证上述模型对T1DM的诊断预测效能及其可靠性，发明人随机收取另一独立的验证队列人群血清标本(新诊断T1DM33例与年龄性别匹配健康对照29例，具体临床特征见表7)，将训练队列所建模型logit(P)＝0.613+0.174×miR-320c(2-△Ct)-2.199×miR-1225-5p(2-△Ct)+0.09×年龄-0.213×BMI应用于验证队列，将验证队列每位患者的miR-320c、miR-1225-5p、年龄及BMI带入诊断模型计算的出logit(P)值，并利用ROC分析计算其在验证队列中对1型糖尿病的诊断效能曲线下面积AUC＝0.804(95％置信区间0.688-0.921，P＝0.000，图4)，约登指数最大时敏感性87.9％，特异性69.2％，阳性预测值78.4％，阴性预测值81.8％。由此，说明该模型在验证队列中同样对T1DM具有较好的判别能力。
表7验证队列研究对象临床特征
*P值＜0.05；**胰岛自身抗体GADA，IA－2AorZnT8A中至少一个阳性，上述自身抗体检测均采用胰岛自身抗体标准化检测项目(IASP)验证方法。
综合上述实施例1～3的结果可以判断，本发明的辅助诊断模型具有较好的稳定性和可靠性，对于区分T1DM患者及健康人群具有较好的判别辅助能力。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大学附属第三医院（中山大学肝脏病医院）
<120> 一组1型糖尿病标志物及其应用
<130> 2018
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<400> 1
agacacauuu ggagagggaa cc 22
<210> 2
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人
<400> 2
aaaagcuggg uugagagggu 20
<210> 3
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<400> 3
guggguacgg cccagugggg gg 22
<210> 4
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<400> 4
ugagguagua gguugugugg uu 22
<210> 5
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人
<400> 5
uucaaguaau ucaggauagg u 21
<210> 6
<211> 86
<212> RNA
<213> 智人
<400> 6
uggggcccug gcugggauau caucauauac uguaaguuug cgaugagaca cuacaguaua 60
gaugauguac uaguccgggc accccc 86

Claims (5)

1.一组用于1型糖尿病诊断的标志物，其特征在于，所述标志物由hsa-miR-642a-3p、hsa-miR-320c和hsa-miR-1225-5p组成。
2.根据权利要求1所述的标志物，其特征在于，所述诊断采用公式：logit(P)＝0.613+0.174×miR-320c(2-△Ct)-2.199×miR-1225-5p(2-△Ct)+0.09×年龄-0.213×BMI，式中，2-△Ct为该miRNA的相对表达量，BMI为身体质量指数。
3.权利要求1所述的标志物在制备1型糖尿病诊断试剂盒中的应用，其特征在于，所述试剂盒中含有定量hsa-miR-642a-3p、hsa-miR-320c和hsa-miR-1225-5p表达量的试剂。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述诊断采用公式：logit(P)＝0.613+0.174×miR-320c(2-△Ct)-2.199×miR-1225-5p(2-△Ct)+0.09×年龄-0.213×BMI，式中，2-△Ct为该miRNA的相对表达量，BMI为身体质量指数。
5.用于辅助1型糖尿病诊断的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)检测患者miR-320c和miR-1225-5p表达量；
(2)将上述表达量代入公式：logit(P)＝0.613+0.174×miR-320c(2-△Ct)-2.199×miR-1225-5p(2-△Ct)+0.09×年龄-0.213×BMI，计算出P值，然后根据P值的大小判断患者患有1型糖尿病风险的高低，其中，2-△Ct为该miRNA的相对表达量，BMI为身体质量指数，年龄指患者的实际年龄。
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