CN103740827A - 胎儿dna芯片及其应用 - Google Patents

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CN103740827A
CN103740827A CN201410013123.9A CN201410013123A CN103740827A CN 103740827 A CN103740827 A CN 103740827A CN 201410013123 A CN201410013123 A CN 201410013123A CN 103740827 A CN103740827 A CN 103740827A
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蔡光伟
梁德杨
陈瑛
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
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Abstract

本发明公开了一种胎儿DNA芯片及其应用。该胎儿DNA芯片包括固相载体和固定在固相载体上的寡核苷酸探针点阵，所述寡核苷酸探针包含对应于125种怀孕期常见胎儿遗传性或出生缺陷型疾病相关基因的寡核苷酸序列，所述125种疾病包括1q21.2缺失或重复、1q41-q42片段缺失等。藉此该胎儿DNA芯片可构建产前遗传学筛查系统。本发明的胎儿DNA芯片具有平行分析和多重分析特点，可同时检测125种疾病相关的遗传变异，致病区间分辨率和疾病检测准确度高，可靠性良好，能够在怀孕早期针对基因拷贝数异常引起的常见遗传病和出生缺陷进行准确预测和分子诊断，适于临床应用，可对患病胎儿进行重点监测和有效干预，有助于进一步降低出生缺陷的发生率。

Description

胎儿DNA芯片及其应用
技术领域
本发明涉及一种基因芯片，特别涉及一种用于产前遗传学筛查的胎儿DNA芯片及其应用。
背景技术
随着“人类基因组计划”的完成，对生命与疾病本质的研究有了重大突破，促进了现代基因检测手段的进步，使人们可以在妊娠早期，对异常胎儿进行染色体畸变和染色体微小异常的产前诊断，防止患儿出生。当前，染色体显带、比较基因组杂交（CGH）和荧光原位分子杂交（FISH）是分析染色体畸变的主要方法。然而，由于出生缺陷儿染色体常存在多重畸变以及亚显微水平的畸变，如先天性心脏病、孤独症、智力低下、先天性多发畸形等常伴有基因组一千到几十兆碱基的基因拷贝数异常，这些遗传物质不平衡在遗传病的发生发展中起着重要作用。染色体显带或CGH受分辨率的限制，难以检测出小于10Mb或1Mb以下的亚显微的异常；FISH技术仅针对某些特定的位点进行检测，缺乏整体性，难以对全基因组进行分析。因此，建立严重出生缺陷和遗传病高通量的早期筛查和诊断的新方法、新技术平台和服务体系，扩大单次检测的病种范围，具有重要的社会和经济意义。
微阵列比较基因组杂交（Microarray-based Comparative GenomicHybridization,aCGH）是近来被临床实验室采用的、具有革命意义的一种检测染色体微小异常的技术平台，其主要原理是：在玻片上以微点阵的形式固定各种探针，组成二维分子排列，然后与已标记的待测生物样本中靶分子杂交，通过激光共聚焦荧光检测系统对芯片进行扫描，对每一个探针上的荧光信号进行检测和分析，从而能够高分辨率地检测出导致遗传病或出生缺陷的基因拷贝数变异（CNV），具有自动化程度高、检测靶分子种类多、效率高、结果客观性强等特点，可实现对生物样品快速、高通量检测和诊断。
目前，市场上基于aCGH技术的商品化产品主要有Agilent公司推出的44K芯片、244K芯片和1M芯片等，其专门用于全基因组范围内基因拷贝数变异（CNV）的检测。但前述44K和244K芯片还存在诸多不足，例如，这些芯片还涵盖了一些非致病性的基因拷贝数变异（CNV）区段，虽然整体探针数较多，但是分布到特定基因（尤其是常见致病性基因）上的探针密度相对较低，不能满足临床样本检测“要求高度的准确性和精密度”的需求。而前述1M芯片虽然涵盖的基因拷贝数变异区段较多，探针密度有一定的提高，但涵盖过多冗余的区间，大大增加了诊断结果的不确定性和临床解释的难度，仍无法很好的满足产前临床检测的需求，尤其是其成本十分昂贵，难以进行大规模应用。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种胎儿DNA芯片，其具有较高的致病区间分辨率和疾病检测准确度，可靠性良好，可检测的病种达到125种，基本覆盖了怀孕期常见的胎儿遗传性疾病和出生缺陷，适合于临床胎儿样本产前检测，且其成本低廉，从而克服了现有技术中的不足。
本发明的另一目的在于提供所述胎儿DNA芯片的应用方法。
为实现前述发明目的，本发明采用了如下技术方案：
一种胎儿DNA芯片，包括固相载体和固定在固相载体上的寡核苷酸探针点阵，其中，所述寡核苷酸探针包含对应于125种怀孕期常见胎儿遗传性和出生缺陷型疾病相关基因的寡核苷酸序列，所述125种疾病包括1q21.2缺失或重复、1q41-q42缺失、2p15p16.1缺失症候群、2q22.3缺失症候群、2q37缺失、3q29缺失症候群、5q21.1-q31.2缺失症候群、7q11.23重复、8p23.1缺失症候群、9p部分单体性综合症、9q34.3缺失症候群、10q22.3-q23.31缺失、11q11-q13.3重复、15q24片段缺失、16p11.2-p12.1缺失、17p11.2重复、17q21.31缺失、18p缺失症候群、18q缺失症候群、22q11.2缺失或重复、22q13.3片段缺失症候群、阿拉吉欧症候群、甲型地中海贫血、亚伯氏症候群、雄性激素不敏感症候群、非倍体变异、天使症候群、安格曼症候群、威尔姆氏肿瘤、无虹膜、性器异常、智能障碍症候群、巨头、多发脂肪瘤和血管瘤综合症、基底细胞痣综合症、贝克威思-威德曼综合症、两极情绪违常/躁狂症、Branchio-Oto-Renal症候群、布鲁顿氏低免疫球蛋白症、短指发育不良及性反转、皮肤症候群、猫眼综合症、恰克-马利-杜斯氏症、CHARGE联合畸形、锁颅骨发育异常症、狄兰吉氏症候群、多发性错构瘤综合症、猫鸣症候群、皮肤松垂症、胱氨酸血症、Dandy-Walker症候群、先天性膈疝、颚心面综合症（DiGeorge综合症）、唐氏综合症、杜兴氏肌肉萎缩症、Dyggve-梅尔基奥尔-克劳森综合症、Feingold综合症、前脑缺损、脆X综合症、甘油激酶缺乏症、Greig头多并指综合症、遗传性压力易感性神经病变、前脑发育畸形症1型、前脑发育畸形症2型、前脑发育畸形症3型、前脑发育畸形症4型、前脑发育畸形症5型、前脑发育畸形症6型、前脑发育畸形症7型、前脑发育畸形症9型、婴儿期痉挛综合症、雅各布森综合症、joubert氏症候群、卡门氏症候群、促性腺激素分泌不足的低性腺功能症和嗅觉缺失、兰-吉综合症、莱希尼亨症候群、脑白质失养症、平脑症、男性MECP2拷贝数变异、Menkes氏症候群、缅克斯症候群、孟奇病、小眼球合并皮肤缺损、小脑症、先天性心脏病、小眼综合症、垂体发育不全小眼综合症、无脑回畸形、粘多糖贮积症、甲髌骨症候群、肾消耗病/肾结核、努南氏症候群、欧比司症候群、口面指[趾]综合症、帕利斯特-基利安镶嵌综合症、慢性儿童型脑硬化症、着丝粒周缘区域缺失、Potocki-Shaffer综合症、普瑞德威利症候群、Prader-Willi-like表型、瑞特氏症候群、里格尔综合症、鲁宾斯坦-泰比症候群、骶骨/肛肠畸形综合症、萨一邱氏症候群、史密斯-马吉利氏症候群、脑性巨大畸形、索特斯症侯群、裂手裂足症1型、裂手裂足症3型、端粒及近端区缺失综合症、并多指（趾）畸形、血小板过低合并桥骨缺失症候群、Treacher Collins症候群、楚列雀可林斯症候群、毛发-鼻-指（趾）综合症、范德伍兹综合症、瓦登伯革氏症候群、威廉氏症候群、沃夫-贺许宏氏症、X染色体失活、X连锁脏器异位症候群、X连锁淋巴组织增生综合症、Xp11.3缺失伴智障、X连锁鱼鳞病，等等。
进一步的，所述125种疾病相关基因在染色体上分布的区段可参阅http://genome.ucsc.edu/。
进一步的，所述探针至少满足如下设计要求：（1）跳过目标序列中重复的屏蔽区域；（2）与互补基因序列杂交后的解链温度尽可能接近80℃的解链温度；（3）寡核苷酸长度在45-60mer之间；（4）寡核苷酸序列中G+C含量在40-60%之间；（5）寡核苷酸序列中避免有5个以上重复碱基。
前述的“尽可能”应理解为偏差幅度在±5℃以内。
进一步的，所述寡核苷酸探针以阵列方式排布在固相载体上，形成分辨率在1Mb以内的探针微阵列。
进一步的，至少对于其中选定的一种以上寡核苷酸探针而言，其至少在固相载体上重复点样两次，形成均匀分布的探针重复点。另外，大于300个对照探针至少重复5次。
进一步的，所述寡核苷酸探针在固相载体上的排布顺序至少满足如下要求：对照探针占比大于1%，探针间的间距一般大于200bp，探针效能分，其平均值大于0.75（利用eArray网站中Genomic Tiling功能计算），重复探针的数量大于300个，重复次数为2-5次，优选为5次。更具体的，还可将这些探针在空白芯片上的有序排列组合，包括其名称、序列、位置、种类、排布方式等保存在“设计文件”（design file）中。
进一步的，所述固相载体上至少还分布有阴性对照点和阳性对照点。这些对照探针占比大于1%。
进一步的，所述固相载体包括玻片，当然亦可为业界习用的其它载体，如高分子材料基质等。
一种产前遗传学筛查系统，包括：
前述胎儿DNA芯片，
至少用以扫描与待检样品反应后的所述胎儿DNA芯片，并采集相应探针杂交信号的图像处理单元，以及，
至少用以处理所述探针杂交信号，并输出筛查结果的数据处理单元，
其中，所述数据处理单元内还包含用以将每一探针杂交信号与相应染色体区段进行定位关联的设计文件（design file）。
一种胎儿DNA芯片读取方法，包括：
将待检样品和参照样本与前述胎儿DNA芯片上的探针竞争性杂交；
以图像处理单元扫描与采集所述胎儿DNA芯片上呈现的探针杂交信号；
以及，以数据处理单元处理所述探针杂交信号，并输出筛查结果，
其中，所述数据处理单元内还包含用以将每一探针杂交信号与相应染色体区段进行定位关联的设计文件
一种产前遗传学筛查方法，包括：
将经过标记物标记的待检样品及参照样本与前述胎儿DNA芯片上的探针竞争性杂交，之后，利用图像处理单元扫描与采集杂交反应后芯片上相应探针杂交信号，其后将探针杂交信号输入数据处理单元，并依据预存的设计文件，将探针杂交信号与相应染色体区段进行定位关联，实现对待检样品是否存在致病性的拷贝数变异进行自动化判断，并输出筛查结果。
在一更为具体的实施例中，利用前述产前遗传学筛查系统进行产前遗传学筛查的过程可以包括：将分别经过Cy3和Cy5荧光染料标记的待检样本及参照样本与前述胎儿DNA芯片上的探针竞争性杂交，之后，利用图像处理单元扫描与采集杂交反应后芯片上相应探针杂交信号，其后将探针杂交信号输入数据处理单元，并依据预存的设计文件，将探针杂交信号与相应染色体区段进行定位关联，实现对待检样品的分析，并输出筛查结果。
与现有技术相比，本发明至少具有如下优点：
（1）去除了部分已知常见的没有致病性的或未知临床意义的CNV探针，可以减少背景噪，使检测数据更易于后期分析，同时，去除了未知临床意义的CNV，从而避免了未知临床意义的CNV带来的临床解释困难的问题，例如，医生无法跟患者解释和交代病情的尴尬；
（2）增加了跟疾病相关的探针的密度，大大提高了致病区间的分辨率，例如，分辨率可高达950bp，同时还可提高疾病检测的准确度，换言之，若多个探针同时异常，其提示疾病的可靠程度也随之增加；
（3）将检测的病种定位在怀孕期常见的胎儿遗传性疾病和出生缺陷上，增加种类达到125种，因此更加适合于临床胎儿样本产前检测；
（4）从成本上比，本发明的胎儿DNA芯片比Agilent公司商品化的244K和1M的芯片低，但其对产前胎儿样本的异常检出能力超过了244K的精度，某些区域的分辨率甚至也超过了1M的芯片。
附图说明
图1是本发明一典型实施例中胎儿DNA芯片与Agilent商品化244K芯片探针的检测探针密度对比图，其中，A为采用Agilent公司市售的244K芯片对一例21-三体样本检测的结果；B为采用本发明芯片对同一样本检测的结果，其探针密度较高。
图2a是本发明一典型实施例中胎儿DNA芯片与Agilent商品化244K芯片的信噪比情况比较图，其中，A为采用Agilent公司市售的244K芯片对一例21-三体样本检测的结果；B为采用本发明芯片对同一样本检测的结果，其上导致背景噪的探针都被去除了；
图2b是图2a的局部放大图；
图3是本发明又一典型实施例中胎儿DNA芯片（44K，A所示）与Agilent公司的商品化芯片(B所示)、Affymetrix公司及Illumina公司的SNP芯片（C所示）的比较图。“竖线”标示探针的位置及数量，本发明的胎儿DNA芯片覆盖到致病区的探针分布较为均匀而且密集。
图4是本发明一较佳实施方式中胎儿DNA芯片的使用方法流程图。
具体实施方式
生命科学领域的研究人员悉知，在人类基因组中包含有30亿个碱基，而迄今已经发现7000多种致病基因，因此，若要实现全部致病基因的临床诊断，其在现有技术条件下是极难实现的。这就意味着，在当前，为满足临床应用的需求，则需要从中选择哪些序列优先放置到芯片上。
一般而言，选择要被芯片涵盖的序列的常规途径包括：一、根据临床经验来决定需要囊括哪些常见病种和致病区间或致病基因；二、通过前期试验验证，选择那些误差较小、信号较正常的探针序列。
迄今业界的研究人员也没有能够达成这样的目的，即，选择出合适的序列，并藉此形成芯片，继而在临床实现产前遗传学筛查，并取得较为理想的筛查结果。例如，尽管前述Agilent公司推出的商业化44K芯片、244K芯片和1M芯片等在一定程度上也能够实现对某些病种的筛查，但其存在前述的诸多缺陷，如背景噪高、精密度低或成本高昂等。
鉴于这种现状，本案发明人经大量的临床实践和研究，提出了本发明的胎儿DNA芯片，其在增加特异性和准确度、降低成本效益比、提高检出率具有很大优势，适用于产前遗传学筛查，具有较大的临床应用价值。
本发明的胎儿DNA芯片包括固相载体和固定在固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包含对应于125种怀孕期常见胎儿遗传性和出生缺陷型疾病相关基因的寡核苷酸序列，所述125种疾病包括1q21.2缺失或重复、1q41-q42缺失、2p15p16.1缺失症候群、2q22.3缺失症候群、2q37缺失、3q29缺失症候群、5q21.1-q31.2缺失症候群、7q11.23重复、8p23.1缺失症候群、9p部分单体性综合症、9q34.3缺失症候群、10q22.3-q23.31缺失、11q11-q13.3重复、15q24片段缺失、16p11.2-p12.1缺失、17p11.2重复、17q21.31缺失、18p缺失症候群、18q缺失症候群、22q11.2缺失或重复、22q13.3片段缺失症候群、阿拉吉欧症候群、甲型地中海贫血、亚伯氏症候群、雄性激素不敏感症候群、非倍体变异、天使症候群、安格曼症候群、威尔姆氏肿瘤、无虹膜、性器异常、智能障碍症候群、巨头、多发脂肪瘤和血管瘤综合症、基底细胞痣综合症、贝克威思-威德曼综合症、两极情绪违常/躁狂症、Branchio-Oto-Renal症候群、布鲁顿氏低免疫球蛋白症、短指发育不良及性反转、皮肤症候群、猫眼综合症、恰克-马利-杜斯氏症、CHARGE联合畸形、锁颅骨发育异常症、狄兰吉氏症候群、多发性错构瘤综合症、猫鸣症候群、皮肤松垂症、胱氨酸血症、Dandy-Walker症候群、先天性膈疝、颚心面综合症（DiGeorge综合症）、唐氏综合症、杜兴氏肌肉萎缩症、Dyggve-梅尔基奥尔-克劳森综合症、Feingold综合症、前脑缺损、脆X综合症、甘油激酶缺乏症、Greig头多并指综合症、遗传性压力易感性神经病变、前脑发育畸形症1型、前脑发育畸形症2型、前脑发育畸形症3型、前脑发育畸形症4型、前脑发育畸形症5型、前脑发育畸形症6型、前脑发育畸形症7型、前脑发育畸形症9型、婴儿期痉挛综合症、雅各布森综合症、joubert氏症候群、卡门氏症候群、促性腺激素分泌不足的低性腺功能症和嗅觉缺失、兰-吉综合症、莱希尼亨症候群、脑白质失养症、平脑症、男性MECP2拷贝数变异、Menkes氏症候群、缅克斯症候群、孟奇病、小眼球合并皮肤缺损、小脑症、先天性心脏病、小眼综合症、垂体发育不全小眼综合症、无脑回畸形、粘多糖贮积症、甲髌骨症候群、肾消耗病/肾结核、努南氏症候群、欧比司症候群、口面指[趾]综合症、帕利斯特-基利安镶嵌综合症、慢性儿童型脑硬化症、着丝粒周缘区域缺失、Potocki-Shaffer综合症、普瑞德威利症候群、Prader-Willi-like表型、瑞特氏症候群、里格尔综合症、鲁宾斯坦-泰比症候群、骶骨/肛肠畸形综合症、萨一邱氏症候群、史密斯-马吉利氏症候群、脑性巨大畸形、索特斯症侯群、裂手裂足症1型、裂手裂足症3型、端粒及近端区缺失综合症、并多指（趾）畸形、血小板过低合并桥骨缺失症候群、Treacher Collins症候群、楚列雀可林斯症候群、毛发-鼻-指（趾）综合症、范德伍兹综合症、瓦登伯革氏症候群、威廉氏症候群、沃夫-贺许宏氏症、X染色体失活、X连锁脏器异位症候群、X连锁淋巴组织增生综合症、Xp11.3缺失伴智障、X连锁鱼鳞病，等等。
其中，所述125种疾病相关基因在染色体上分布的区段如前所述。
进一步的讲，本发明中前述探针设计应遵循以下原则：（1）跳过重复的屏蔽区域（2）解链温度(Tm)尽可能接近80℃的解链温度（3）探针长度在45-60mer之间（4）探针的G+C含量40-60%之间；（5）避免有5个以上重复碱基。
依据前述原则，本领域技术人员可以使用业界悉知的各类方式，并结合人类全基因序列，实现探针的设计。
其中，人类全基因序列可从NCBI等公共数据库得到。
作为其中一种可选的实施方式，可以使用Agilent公司eArray在线软件（https://earray.chem.agilent.com）进行基因组叠瓦式设计目标区探针。
作为其中另一种可选实施方式，亦可使用eArray软件直接从安捷伦公司超过2800万个CGH探针库中查找筛选符合目的基因区域的探针组。
本案发明人实践发现，依据前述原则设计的探针的有效性均可被良好验证。
进一步的，通过将前述的寡核苷酸探针以阵列方式排布在固相载体上，形成探针微阵列，从而获得胎儿DNA芯片。
另外，所述胎儿DNA芯片还可包含阴性和阳性对照点和探针重复点来确保结果的可靠性。
其中的探针重复点系通过将选定的寡核苷酸探针至少在固相载体上重复点样两次到五次而形成。
又及，为便于探知胎儿DNA芯片上每一探针与待检样本中特定序列完全结合与否，在待检样本和参照样本上分别连接Cy3和Cy5荧光染料，从而直观的获得探针信号。
进一步的，在本发明中，还可依据设定规则将每一选定探针分布在胎儿DNA芯片上的选定位置，再通过检测与记录在芯片上的每一选定位置的探针与相应标准样品进行杂交反应时所释放的标准探针信号，从而可将芯片的每一位置所释放的探针信号与相应染色体区段定位关联，进而可以获得相应的计算软件可读形式的设计文件。
继而，在对待检样品进行检测时，通过将待检样品与胎儿DNA芯片上的探针杂交反应时所释放的探针信号与前述设计文件中的标准探针信号进行比对，即可获知其指示的相应染色体区段信息。
进一步的，所述寡核苷酸探针在固相载体上的排布顺序至少满足如下要求：对照探针占比大于1%，探针间的间距一般大于200bp，探针效能分，其平均值大于0.75（利用eArray网站中Genomic Tiling功能计算），重复探针的数量大于300个，重复次数为2-5次，优选为5次，这些探针在空白芯片上的有序排列组合，其名称、序列、位置、种类、排布方式等可保存在“设计文件”（design file）中。
在本发明的一具体应用方案中，本发明探针合成、芯片制作、实验检测及结果分析可通过如下过程实现，即：
根据设计好的探针序列，委托Agilent公司采用SurePrint寡核苷酸喷墨打印技术在经过处理的玻片表面上直接原位合成。芯片打印完成后即可构成高密度的DNA微阵列，同时还在玻片上均匀设置阴性、阳性对照点和探针重复点。最后，将干燥的胎儿DNA芯片放回洁净的芯片盒中避光真空保存备用。
在本发明的一可行实施方案中，藉由该胎儿DNA芯片，可构建一种产前遗传学筛查系统，其可以包括：
前述胎儿DNA芯片，
至少用以扫描与待检样品反应后的所述胎儿DNA芯片，并采集相应探针杂交信号的图像处理单元，以及，
至少用以处理所述探针杂交信号，并输出筛查结果的数据处理单元，
其中，所述数据处理单元内还包含用以将每一探针杂交信号与相应染色体区段进行定位关联的设计文件。
相应的产前遗传学筛查方法可以包括：
将经过标记物标记的待检样品及参照样本与前述胎儿DNA芯片上的探针竞争性杂交，之后，利用图像处理单元扫描与采集杂交反应后芯片上相应探针杂交信号，其后将探针杂交信号输入数据处理单元，并依据预存的映射文件，将探针杂交信号与相应染色体区段进行定位关联，实现对待检样品的分析，并输出筛查结果。
本发明的提供的胎儿DNA芯片具有平行分析和多重分析特点，可同时检测125种疾病相关的基因拷贝数变异，能够在怀孕早期针对异常表型胎儿进行常见遗传病和出生缺陷准确预测和评估，实现对患病胎儿进行重点监测和有效干预，进一步减低出生缺陷的发生率。
关于本发明中芯片的基础制作工艺等，还可参考如下文献：
1.Leung TY,Vogel I,Lau TK,Chong W,Hyett JA,Petersen OB,Choy KW.“Identification of submicroscopic chromosomal aberrations in fetuses withincreased nuchal translucency and apparently normal karyotype”，《Ultrasound ObstetGynecol》,2011Sep;38(3):314-9.
2.陈瑛蔡光伟，“采用微阵列-比较基因组杂交进行产前诊断的局限性和困难”，《中华医学遗传学杂志》，2011年第1期，p47-51.
3.Chen Y,Mao J,Sun Y,Zhang Q,Cheng HB,Yan WH,Choy KW,Li H.“Anovel mutation of GATA4in a familial atrial septal defect”,《Clin Chim Acta》，2010Nov11;411(21-22):1741-5.
4.Chan L,Choy K,Leung T,Lau T.“Prenatal diagnosis by array-comparativegenomic hybridization”，《Expert Opin Med Diagn》，2009Nov;3(6):649-57.
参阅图5，在本发明的一较为优选的实施方案中，一种DNA胎儿芯片的使用方法可以包括如下步骤：
1.热裂解
将待测样本基因组DNA（gDNA）和参照样本的gDNA各1μg加入0.5mL离心管中，补足去离子水（dH2O）至20.2μL，加5μL随机引物（Random Primers），95℃孵育3分钟，立即置冰上冷却。
2.荧光标记
（1）配制标记混合体系，如下：
成分 体积（μL）
5×缓冲液 10.0
10×dNTP 5.0
Cy3（对照样本）或Cy5（待测样本）(1mM) 3.0
Exo-klenow片段 1.0
合计 19.0
（2）每个反应管中加19μL标记体系，使总体积为50μL，振荡混匀，短暂离心；
（3）在热循环仪上孵育37℃2小时，65℃10分钟；
（4）将标记好的DNA置冰上，注意避光。
3.标记后清洗
（1）将过滤柱放置于2.0mL离心管中，每个过滤柱中加430μL1×TE（PH8.0）；
（2）将标记好的gDNA分别加入对应的过滤柱中，小心吹打均匀；
（3）室温下14000g离心10分钟，倒掉离心下来的液体；
（4）每个过滤柱中加480μL1×TE；
（5）室温下14000g离心15分钟，弃掉离心下来的液体；
（6）将过滤柱倒置在新的2.0mL离心管中；
（7）室温下1000g离心1分钟，收集反应溶液；
（8）若体积<24μL，用TE补足至24μL；
（9）若体积大于所需体积，则将溶液重新转移至过滤柱中，14000g离心5分钟；
（10）每个样本取1.5μL，在NanoDrop1000上检测浓度与质量；
（11）计算标记和清洗后的产量和有效活力(Specific Activity)。
4.标记后gDNA的杂交前准备
（1）使用前将10×封闭液在室温预热1小时
（2）按下列比例配制体系：
成分 体积（μL）
Cy5和Cy3标记的gDNA混合物 39
人Cot-1DNA(1.0mg/mL) 5
Agilent10×封闭液 11
Agilent2×杂交缓冲液 55
合计 110
（3）振荡混匀，短暂离心，
（4）95℃避光孵育3分钟，
（5）立即转移至37℃水浴避光孵育30分钟，
（6）6000g离心1分钟
5.微阵列杂交
慢慢将样本杂交混合液加于胶圈内区域中央，小心盖上上盖，迅速套上固定夹，保证所有气泡都可移动。将组合好的固定夹放入65℃杂交炉，杂交24小时。
6.洗片
（1）芯片室温下在洗液1中洗5分钟，
（2）37℃的洗液2中洗1分钟，
（3）将芯片放入玻片夹，并锁紧。
7.扫描和数据提取
（1）将玻片夹放入安捷伦高分辨率微阵列扫描仪系统（AgilentG2565CA），采用Workbench7.0软件进行芯片扫描。
（2）设置：
Scan region:Scan Area(61×21.6mm)
Scan resolution(un):5
Dye Channel:Red&Green
Green PMT:100%
Red PMT:100%
（3）采用FE extraction软件进行数据提取，将保存的().GIF图片文件拖入左栏，选择Grid Template Browser、FE Protocol Browser、QC Metric Set Browser进行数据提取。采用CytoGenomic软件（V2.7.1.0）进行数据分析。
应用情况及实验数据
1.参阅图1所示系本发明一典型实施例中胎儿DNA芯片与Agilent商品化244K芯片探针的检测探针密度对比图，其中，A为采用Agilent公司市售的244K芯片对一例21-三体样本检测的结果，在UBE3A基因（斜向显示）覆盖区域上有13个探针，B为采用本发明芯片对同一样本检测的结果，在UBE3A基因覆盖区域上有30个探针，并且去掉了基因边缘的4个探针，从而增加了基因内有效探针数目并减少了非编码区序列探针。
2.再参阅图2a-图2b所示是本发明一典型实施例中胎儿DNA芯片与Agilent商品化244K芯片的信噪比情况比较图，其中，A为采用Agilent公司市售的244K芯片对一例21-三体样本检测的结果，在21号染色体16.1-16.8Kb覆盖区域内探针过多，几十个冗余的探针堆积在这个区域，同时还有一些用黑圈标出的背景噪很高的探针，这些探针的存在大大影响了对该区域拷贝数的判读，B为采用本发明芯片对同一样本检测的结果，在该覆盖区域上探针数目合理，间距适当，并且基本都在三拷贝判读区间。从而增加了结果判读的准确性并大大减低了背景噪。
3.又及，参阅图3所示系本发明又一典型实施例中胎儿DNA芯片（44K，A所示）与Agilent公司的7款商品化芯片(CGH1×1M、CRD1×1M、CGH2×40K、CGH4×180K、CGH8×60K、CNV2×400K、CGH1×244K，B所示)、Affymetrix公司的2款SNP芯片(SNP6.0和SNP6.0SV)及Illumina公司的4款芯片(1M-duo、Cyto-12、660W-Q、Omni1-Q)（C所示）的比较图，其中，以Charcot-Marie-Tooth病1A型(致病基因为PMP22)为例，本实施例的胎儿DNA芯片全面覆盖疾病致病基因位点，而且从基因的起始到终止区间，探针相对均匀分布。
4.2010-2012年采用本发明胎儿DNA芯片共检测700多份样本，在82例（约占11.6%）中检测到的致病性CNV。
表12010-2012年间704例样本进行胎儿DNA芯片检测结果列表
Figure BDA0000456004990000141
但需要指出的是，以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明。

Claims (8)

1.一种胎儿DNA芯片，包括固相载体和固定在固相载体上的寡核苷酸探针点阵，其特征在于，所述寡核苷酸探针包含对应于125种怀孕期常见胎儿遗传性和出生缺陷型疾病相关基因的寡核苷酸序列，所述125种疾病包括1q21.2缺失或重复、1q41-q42缺失、2p15p16.1缺失症候群、2q22.3缺失症候群、2q37缺失、3q29缺失症候群、5q21.1-q31.2缺失症候群、7q11.23重复、8p23.1缺失症候群、9p部分单体性综合症、9q34.3缺失症候群、10q22.3-q23.31缺失、11q11-q13.3重复、15q24片段缺失、16p11.2-p12.1缺失、17p11.2重复、17q21.31缺失、18p缺失症候群、18q缺失症候群、22q11.2缺失或重复、22q13.3片段缺失症候群、阿拉吉欧症候群、甲型地中海贫血、亚伯氏症候群、雄性激素不敏感症候群、非倍体变异、天使症候群、安格曼症候群、威尔姆氏肿瘤、无虹膜、性器异常、智能障碍症候群、巨头、多发脂肪瘤和血管瘤综合症、基底细胞痣综合症、贝克威思-威德曼综合症、两极情绪违常/躁狂症、Branchio-Oto-Renal症候群、布鲁顿氏低免疫球蛋白症、短指发育不良及性反转、皮肤症候群、猫眼综合症、恰克-马利-杜斯氏症、CHARGE联合畸形、锁颅骨发育异常症、狄兰吉氏症候群、多发性错构瘤综合症、猫鸣症候群、皮肤松垂症、胱氨酸血症、Dandy-Walker症候群、先天性膈疝、颚心面综合症、唐氏综合症、杜兴氏肌肉萎缩症、Dyggve-梅尔基奥尔-克劳森综合症、Feingold 综合症、前脑缺损、脆X综合症、甘油激酶缺乏症、Greig头多并指综合症、遗传性压力易感性神经病变、前脑发育畸形症1型、前脑发育畸形症2型、前脑发育畸形症3型、前脑发育畸形症4型、前脑发育畸形症5型、前脑发育畸形症6型、前脑发育畸形症7型、前脑发育畸形症9型、婴儿期痉挛综合症、雅各布森综合症、joubert氏症候群、卡门氏症候群、促性腺激素分泌不足的低性腺功能症和嗅觉缺失、兰-吉综合症、莱希尼亨症候群、脑白质失养症、平脑症、男性MECP2拷贝数变异、Menkes氏症候群、缅克斯症候群、孟奇病、小眼球合并皮肤缺损、小脑症、先天性心脏病、小眼综合症、垂体发育不全小眼综合症、无脑回畸形、粘多糖贮积症、甲髌骨症候群、肾消耗病/肾结核、努南氏症候群、欧比司症候群、口面指/趾综合症、帕利斯特-基利安镶嵌综合症、慢性儿童型脑硬化症、着丝粒周缘区域缺失、Potocki-Shaffer 综合症、普瑞德威利症候群、Prader-Willi-like 表型、瑞特氏症候群、里格尔综合症、鲁宾斯坦-泰比症候群、骶骨/肛肠畸形综合症、萨一邱氏症候群、史密斯-马吉利氏症候群、脑性巨大畸形、索特斯症侯群、裂手裂足症1型、裂手裂足症3型、端粒及近端区缺失综合症、并多指/趾畸形、血小板过低合并桥骨缺失症候群、Treacher Collins症候群、楚列雀可林斯症候群、毛发-鼻-指/趾综合症、范德伍兹综合症、瓦登伯革氏症候群、威廉氏症候群、沃夫-贺许宏氏症、X染色体失活、X连锁脏器异位症候群、X连锁淋巴组织增生综合症、Xp11.3缺失伴智障、X连锁鱼鳞病。
2.根据权利要求1所述的胎儿DNA芯片，其特征在于，所述寡核苷酸探针至少满足如下设计要求：（1）跳过目标序列中重复的屏蔽区域；（2）与互补基因序列杂交后的解链温度尽可能接近80℃的解链温度；（3）寡核苷酸长度在45-60mer之间；（4）寡核苷酸序列中G+C含量在40-60%之间；（5）寡核苷酸序列中避免有5个以上重复碱基。
3.根据权利要求1所述的胎儿DNA芯片，其特征在于，所述寡核苷酸探针以阵列方式排布在固相载体上。
4.根据权利要求1或3所述的胎儿DNA芯片，其特征在于，至少对于其中选定的一种寡核苷酸探针而言，其至少在固相载体上重复点样两次，形成均匀分布的探针重复点，并且，所述固相载体上至少还均匀分布有阴性对照点和阳性对照点。
5.根据权利要求1或3所述的胎儿DNA芯片，其特征在于，所述寡核苷酸探针在固相载体上的排布顺序至少满足如下要求：对照探针占比大于1%，探针间的间距大于200bp，探针效能分的平均值大于0.75，重复探针的数量大于300个，重复次数为2-5次。
6.一种产前遗传学筛查系统，其特征在于，包括：
权利要求1-5中任一项所述的胎儿DNA芯片，
至少用以扫描与待检样品反应后的所述胎儿DNA芯片，并采集相应探针杂交信号的图像处理单元，以及，
至少用以处理所述探针杂交信号，并输出筛查结果的数据处理单元，
其中，所述数据处理单元内还包含用以将每一探针杂交信号与相应染色体区段进行定位关联的设计文件。
7.一种胎儿DNA芯片读取方法，其特征在于，包括：
将待检样品和参照样本与权利要求1-5中任一项所述的胎儿DNA芯片上的探针竞争性杂交；
以图像处理单元扫描与采集所述胎儿DNA芯片上呈现的探针杂交信号；
以及，以数据处理单元处理所述探针杂交信号，并输出筛查结果，
其中，所述数据处理单元内还包含用以将每一探针杂交信号与相应染色体区段进行定位关联的设计文件。
8.一种产前遗传学筛查方法，其特征在于，包括：
将经过标记物标记的待检样品及参照样本与权利要求1-5中任一项所述的胎儿DNA芯片上的探针竞争性杂交，之后，利用图像处理单元扫描与采集杂交反应后芯片上相应探针杂交信号，其后将探针杂交信号输入数据处理单元，并依据预存的设计文件，将探针杂交信号与相应染色体区段进行定位关联，实现对待检样品是否存在致病性的拷贝数变异进行自动化判断，并输出筛查结果。
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